Introdução: A exposição crônica a diferentes tipos de dieta altera o metabolismo hipotalâmico e mesolímbico, podendo causar alterações no comportamento alimentar do indivíduo. O BDNF, fator de crescimento neuronal, pode atuar na modulação do comportamento alimentar tanto em vias hedônicas quanto homeostáticas. O objetivo do estudo foi investigar como o BDNF atua na modulação do comportamento alimentar em vias homeostáticas e hedônicas em ratas fêmeas com diferentes perfis metabólicos. Materiais e métodos: Ratas Wistar fêmeas adultas randomizadas por peso foram divididas em: dieta controle (C) contendo 22% de proteína e 4% de lipídios; dieta hipoproteica (LP) 8% de proteína ou dieta hiperlipídica (HF) 45% de lipídios, ad libitum, por 5 semanas, sendo o consumo medido a cada 72 horas e o peso semanalmente. O trabalho foi dividido em duas partes. Na primeira parte, após as 5 semanas de dieta os animais ficaram em jejum por 4 horas e foram expostos ao alimento doce (Froot Loops®), previamente pesado, por 1 hora, a fim de verificar o consumo de alimento palatável em ratas com diferentes perfis metabólicos. Imediatamente após coletou-se sangue e cérebro, assim como, o peso da gordura abdominal foi mensurado. Na segunda parte do estudo, após as 5 semanas de dieta, os animais ficaram durante 7 dias no BioDAQ®, um sistema computadorizado de análise do comportamento alimentar, para avaliar o consumo da dieta habitual em ratas com diferentes perfis metabólicos. O consumo foi mensurado através de mordidas (diferença de 0,1 g na balança) e refeições (conjunto de porções por um tempo igual ou menor a 15 min, porções são mordidas ininterruptas). No dia 10 foi realizado o teste de preferência alimentar no qual o animal poderia escolher entre a dieta habitual (dieta que eles receberam por 5 semanas) ou a dieta hipersacarídica (HP) (contendo 34% lipídios, 30,2% carboidratos, 14% proteínas, 20% sacarose), com duração de 20 horas. Após 1 semana, foi coletado sangue, cérebro e mensurada a gordura abdominal. Foi realizado western blotting para tirosina hidroxilase (TH) e fosfo- tirosina hidroxilase (pTH) no núcleo accumbens, STAT3 e fosfo-STAT3 (pSTAT3) no hipotálamo. Adicionalmente, foi mensurado BDNF no soro, no núcleo do trato solitário (NTS), área tegmentar ventral (VTA) e glicemia no soro. Resultados: Nas 5 semanas de tratamento, em relação ao ganho de peso dos animais não houve diferenças significativas entre os grupos, não houve interação, apenas apresentaram efeito do tempo (p< 0,001). A gordura abdominal foi maior nas ratas HF (p= 0,002) e LP (p= 0,023) em relação aos controles. Os animais que receberam dieta HF comeram menos gramas de Froot Loops® do que os animais controle (p= 0,003). Durante a habituação ao BioDAQ® não houve diferença significativa no consumo de dieta entre os grupos. Na análise do comportamento alimentar no BioDAQ®, comparando os grupos controle versus hiperlídica (C x HF), animais HF tiveram o tamanho da refeição (g) (p=0,049), número de porções (p= p< 0,001), tamanho da refeição ciclo escuro (p= 0,002), número de porções ciclo escuro (p < 0,001) menor do que os controles e tamanho da porção ciclo escuro (p=0,006) maior do que os controles. Na análise do comportamento alimentar, comparando os grupos controle versus hipoproteica (C x LP) foram encontradas diferenças significativas nos seguintes parâmetros: média do tamanho da porção (g) (p= 0,004), média do tamanho da porção no ciclo claro (g) (p= 0,042), média do tamanho da refeição no ciclo escuro (g) (p= 0,035), média do tamanho da porção no ciclo escuro (g) (p= 0,006). Em todos os parâmetros os animais LP tiveram uma média maior do que os animais controle. No teste de preferência alimentar, os animais HF apresentaram uma média inferior aos animais controle nos seguintes parâmetros: consumo de dieta hipersacarídica (Kcal) (p= 0,034), número de refeições de dieta hipersacarídica (p= 0,016), número de porções de dieta hipersacarídica (p= 0,001). Os animais HF apresentaram médias superiores aos animais C em relação ao tamanho da porção de dieta hipersacarídica (g) (p= 0,023), PMI (intervalo entre refeições) total de dieta hipersacarídica (p= 0,022), saciedade total de dieta hipersacarídica (p= 0,008). Durante o teste de preferência alimentar comparando-se controle versus hipoproteica (C x LP), os animais (LP) apresentaram o consumo de dieta hipersacarídica (kcal) (p= 0,030) e o número de porções de dieta hipersacarídica (p= 0,003) menor que os animais controles. Os animais LP apresentaram saciedade total de dieta hipersacarídica (p= 0,046) maior do que os controles. Não houve diferenças significativas nos níveis de glicemia no soro entre os grupos. Os animais HF apresentaram as médias de pSTAT3 maior do que os controles (p= 0,013) e fosfo-tirosina hidroxilase menor do que os controles (p= 0,05). Os animais LP apresentaram STAT3 menor do que os animais controle (p= 0,035) e tiveram resultados de BDNF próximos da significância (p=0,053), tendo apresentado uma média inferior aos animais controle. Conclusões: A exposição aos diferentes tipos de dieta muda os padrões de alimentação bem como a estrutura corpórea. Tanto animais expostos a dieta HF quanto a LP apresentam alterações compatíveis com um estado de pré-resistência à leptina. O BDNF parece modular as vias homeostáticas e hedônicas do comportamento alimentar, no entanto mais estudos são necessários para entendermos melhor esses mecanismos. / Introduction: The chronic exposure to different types of diet modifies the hypothalamic and mesolimbic metabolism, what can lead to changes in the individual feeding behavior. BDNF, a neuronal growing factor, can act modulating feeding behavior in hedonic as well as in homeostatic pathways. The aim of this study was to investigate how BDNF acts modulating feeding behavior regarding hedonic and homeostatic pathways in female rats with different metabolic profiles. Materials and methods: Female adult Wistar rats randomized by weight were divided in: control diet (C) with 22% of protein and 4% of lipids; low-protein diet (LP) with 8% of protein or high fat diet (HF) with 45% of lipids, ad libitum, for 5 weeks, with the diet consumption verified every 72 hours and the weight verified weekly. The study was divided in two parts. In the first part, after 5 weeks receiving diet, animals were submitted to 4 hours of fasting and then were exposed to sweet food (Froot Loops®), previously weighted, for 1 hour to verify the palatable food consumption in rats with different metabolic profiles. Immediately after, blood and brain were collected and the abdominal fat weight was verified. In the second part of the study, after 5 weeks receiving diet, the animals were submitted to the BioDAQÒ, a computer system of feeding behavior analyses, to evaluate the habitual diet consumption in rats with different metabolic profiles for 7 days. The consumption was measured through bites (0.1g of difference in the scale) and meals (a group of portions for a period of time less or equal than 15min, portions are uninterrupted bites). On day 10 the food preference test was done and the animals could choose between the habitual diet (the one they have received for 5 weeks) and the high sucrose palatable diet (HP) (with 34% of lipids, 30.2% of carbohydrates, 14% of protein, 20% of sucrose) for a period of 20 hours. After one week, blood and brain were collected and abdominal fat was measured. Western blotting was used to verify the content of tyrosine hydroxylase (TH) and phospho-tyrosine hydroxylase (pTH) in the nucleus accumbens, STAT3 and phospho-STAT3 (pSTAT3) in the hypothalamus. Additionally, BDNF was measured in the serum, in the solitary tract nucleus (NTS) and in the ventral tegmental area (VTA) and glycemia was also verified. Results: Considering the 5 weeks of treatment regarding animals weight gain there was no significant difference between groups and no interaction, only an effect of time (p<0.001). Abdominal fat was higher in HF (p=0.002) and LP (p=0.023) rats comparing to controls. Animals that received HF diet ate less grams of Froot Loopsâ than controls (p=0.003). During the habituation to the BioDAQÒ no significant difference was seen in the consumption of the diet between the groups. When analyzing feeding behavior in the BioDAQÒ, comparing control against high fat groups (C x HF), HF animals had a decrease in the size of the meal (g) (p=0.049), number of portion (p<0.001), meal size in the dark phase (p=0.002), number of portions in the dark phase (p<0.001) compared to controls while the size of the portion in the dark phase (p=0.006) was bigger than controls. Analyzing feeding behavior comparing control against low-protein groups (C x LP) a significant difference was observed in the following parameters: average of the size of the portion (g) (p=0.004), average of the size of the portion in the light phase (g) (p=0.042), average of the size of the meal in the dark phase (g) (p=0.035), average of the size of the portion in the dark phase (g) (p=0.006). LP animals showed a higher average than controls in all parameters. In the food preference test, HF animals showed a lower average than controls in the following parameters: consumption of high sucrose palatable diet (Kcal) (p=0.034), number of meals of high sucrose palatable diet (p=0.016), number of portions of high sucrose palatable diet (p=0.001). HF animals showed higher averages than controls regarding the size of the portion of the high sucrose palatable diet (g) (p=0.023), total PMI (post interval meal) of high sucrose palatable diet (p=0.022) and total satiety of high sucrose palatable diet (p=0.008). In the food preference test comparing controls against low-protein groups (C x LP), LP animals showed a lower consumption of high sucrose palatable diet (Kcal) (p=0.030) and a lower number of portions of high sucrose palatable diet (p=0.003) than control animals. LP animals showed total satiety of high sucrose palatable diet (p=0.046) bigger than controls. There was no significant difference in the glycemia levels between groups. HF animals had pSTAT3 averages higher than controls (p=0.013) and phospho-tyrosine hydroxylase lower than controls (p=0.05). LP animals showed STAT3 lower than control animals (p=0.035) and had BDNF results close to the significance (p=0.053), showing a lower average than control animals. Conclusion: The exposure to different types of diets changes the feeding patterns as well as the body structure. Animals exposed to HF diet as well as those exposed to LP diet showed changes related to a leptin pre-resistant state. BDNF seems to modulate homeostatic and hedonic feeding behavior pathways, however more studies are necessary to a better understanding of the mechanisms.

A obesidade e a resistência à insulina induzidas por dieta têm sido associadas ao aumento da morte de neurônios dopaminérgicos e depleção da dopamina (DA) nigroestriatal em modelo animal da Doença de Parkinson (DP), sugerindo uma maior vulnerabilidade dos neurônios dopaminérgicos em resposta a perturbações metabólicas. No entanto, ainda não há evidências consistentes que demonstrem uma associação linear entre a obesidade e a morte de neurônios dopaminérgicos e os mecanismos subjacentes que podem estar contribuindo para o desenvolvimento da DP. Para avaliar se a obesidade promove neurodegeneração dopaminérgica e/ou alterações nos parâmetros relacionados com a progressão da DP, ratos Wistar machos receberam uma dieta padrão ou uma dieta rica em gordura (HFD) durante vinte e cinco semanas e a substantia nigra, estriado e a área tegmental ventral foram isolados e submetidos a análises bioquímicas. Em conformidade com a ingestão calórica, os ratos HFD apresentaram aumento da massa gorda e peso corporal total associados à intolerância à glicose e resistência à insulina A obesidade induzida por dieta diminuiu os níveis de tirosina hidroxilase (TH) indicando perda de neurônios dopaminérgicos e também promoveu alterações no imunoconteúdo de sinaptofisina relacionadas com a inflamação periférica e central indicadas pelo aumento de TNF-α e IL1β bem como estresse oxidativo/nitrosativo com aumento da nitração de tirosina e oxidação de grupos sulfidril. Nenhuma diferença foi detectada para o imunoconteúdo de α-syn e p-Tau entre os grupos. Além disso, níveis reduzidos de TH foram confirmados na análise de imunofluorescência, bem como morte neuronal e ativação de microglia indicados pela diminuição de NeuN e aumento de Iba1 sem haver alterações para GFAP. Adicionalmente, foram identificadas piora da atividade locomotora, mobilidade e evidências apontando para um comportamento do tipo ansiolítico nas tarefas de campo aberto e claro / escuro. Não houve alterações na coordenação motora e memória. Juntos, estes dados sugerem que a obesidade induzida pela dieta hiperlipídica de fato promove a morte de neurônios dopaminérgicos na via nigroestriatal independentemente de α-syn e fosforilação da Tau. O aumento da morte neuronal pode ser atribuído à inflamação cerebral e estresse oxidativo / nitrosativo induzido pela obesidade, o que possivelmente levou às alterações comportamentais observadas neste estudo. / Diet-induced obesity and insulin resistance has been associated to increased dopaminergic neurodegeneration and nigrostriatal dopamine (DA) depletion in animal model of Parkinson’s Disease (PD), suggesting an enhanced vulnerability of dopaminergic neurons in response to metabolic perturbation. However, there is still no consistent evidence demonstrating a linear association between obesity and dopaminergic neurons death and the underlying mechanisms that can be contributing to the development of PD. In order to evaluate whether obesity promotes dopaminergic neurodegeneration and / or changes in parameters related to PD progression, male Wistar rats were fed with standard chow or high-fat diet (HFD) for twenty five weeks and the brain substantia nigra, striatum and ventral tegmental area were isolated before undergoing biochemical analyzes. In accordance with energy intake, the HFD rats showed increased fat mass and total body weight associated to glucose intolerance and insulin resistance. Diet-induced obesity decreases tyrosine hydroxylase (TH) levels indicating dopaminergic neurons loss and also promoted changes in the synaptophysin immunocontent related to peripheral and brain inflammation with increased TNF-α and IL1β, as well oxidative/nitrosative stress with increased tyrosine nitration and oxidation of sulfhydryl groups No difference was detected for α-syn and p-Tau immunocontent between groups. Moreover, decreased levels of TH were confirmed in the immunofluorescence analysis, as well neuronal death and microglia activation with NeuN and Iba1 without changes for GFAP. In addition, impairment of locomotor activity, mobility and evidences pointing for an anxiolytic-like behavior were identified in the open-field and light/dark tasks. There were no changes in the motor coordination and memory. Together, these data suggest that diet-induced obesity indeed promotes dopaminergic neurodegeneration in the nigrostriatal pathway independent of α-syn and phosphorylation of Tau. The increased neuronal death can be attributed to the brain inflammation and oxidative/nitrosative stress induced by obesity, which would likely lead to behavioral changes observed in this study.

Introdução: A Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPAPAH) é um erro inato do metabolismo no qual ocorre aumento dos níveis séricos de fenilalanina (Phe). Estudos recentes, realizados em várias populações, demonstraram que pacientes com HPA-PAH podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de Phe mediante a administração oral de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Identificar em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH aqueles que são responsivos à administração de BH4 por via oral. Métodos: Para um paciente ser incluído no estudo, era necessário ter diagnóstico de HPA-PAH e idade igual ou superior a 7 anos, estar em tratamento dietético e apresentar nível de Phe igual ou superior a 6 mg/dL em todas as medidas realizadas no ano anterior à inclusão no estudo. No dia anterior à sobrecarga de BH4 (Dia 1), os pacientes foram submetidos a três coletas de sangue para mensuração dos níveis de Phe. No Dia 2, os pacientes receberam dose única de 20mg/Kg de BH4. As coletas de sangue foram, então, realizadas nos pontos de hora: 0, 4 e 8h (Dia 2) e 24h (Dias 3) após a ingestão do medicamento. Os níveis de Phe foram determinados através da espectrometria de massa in tandem. Foram utilizados dois critérios para definir a presença de responsividade ao BH4: Critério 1: redução 30% de Phe após 8h da administração do medicamento; Critério 2: redução 30% de Phe após 24h da administração do medicamento. Resultados: Dezoito pacientes foram incluídos no estudo, com mediana de idade de 14 anos, sendo 66,7% do sexo masculino. Onze apresentavam a forma clássica da doença e três a forma atípica. Três (forma clássica: 1, forma atípica: 2) e cinco (forma clássica: 2, forma atípica: 2 e forma não-definida: 1) pacientes foram considerados responsivos ao BH4 conforme critérios 1 e 2, respectivamente. Os níveis de Phe plasmáticos do dia anterior ao teste de sobrecarga não demonstraram variação nos pontos de hora (p=0,523). Entretanto, quando comparamos os níveis de Phe nos pontos de hora do dia pré e pós BH4, encontrou-se variação significativa entre eles (p=0,006). A análise da associação genótipo-fenótipo, para os pacientes com dados disponíveis (n=6) mostrou que a mesma é multifatorial. Conclusão: Nossos achados estão de acordo com a literatura, e indicaram que um número considerável de pacientes brasileiros com HPA-PAH poderá ser beneficiado com a administração oral de BH4. / Introduction: Hyperphenylalaninemia by phenylalanine hydroxylase deficiency (HPAPAH) is an inborn error of metabolism in which increased serum levels of phenylalanine (Phe) occur. Recent studies on several populations showed that patients with HPA-PAH can have their serum levels reduced when receiving oral tetrahydrobiopterin (BH4). Objective: to identify in a sample of Brazilian HPA-PAH the patients who are responsive to the oral administration of BH4. Methods: the following inclusion criteria were used: diagnosis of HPA-PAH, age 7 years, on dietary treatment and Phe levels 6 mg/dL in all tests performed one year prior to the inclusion in this study. On the day before the BH4 challenge (Day 1) 3 blood samples were obtained to measure Phe levels. Blood samples were also obtained at time points 0, 4, 8 hours (Day 2) and 24 h (Day 3) after the intake of the medication. Phe levels were determined by tandem mass spectrometry. Criteria used to define responsiveness to BH4 were: Criterion 1: Phe reduction 30% 8 hours after BH4 administration; Criterion 2: Phe reduction 30% 24 hours after BH4 administration. Results: a total of 18 patients with a mean age of 14 years were included in this study; of those, 66.7% were male. Eleven presented the classical form of the disease and 3, the atypical form. Three patients (classical form: 1, atypical form: 2) and 5 (classical form: 2; atypical form: 2; undefined form: 1) were considered responsive to BH4 according to criteria 1 and 2, respectively. Phe serum levels on the Day 1 did not show any change on the established time point schedule (p=0.523). However, when comparing levels of Phe between Days 1 and 2, significant variation was found (p=0.006). The phenotype – genotype association analysis of patients with available data (n=6) showed that the association is multifactorial. Conclusion: In accordance with the literature, our findings show that many Brazilian patients with HPA-PAH can benefit from the oral administration of BH4.

Introdução: Estudos recentes, utilizando vários protocolos, têm demonstrado que pacientes com Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPA-PAH) podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de fenilalanina (Phe) mediante a administração de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Determinar, em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH, a responsividade à administração de dose única de BH4 por meio de um protocolo incluindo o teste de sobrecarga simples de Phe e o teste combinado de sobrecarga de Phe+BH4. Métodos: Foram incluídos no estudo pacientes com idade ≥ 4 anos, em tratamento dietético e que possuíam mediana de Phe plasmática inferior a 10mg/dL no ano anterior à inclusão. Foram realizados teste de sobrecarga simples de Phe, utilizando 100mg/kg de L-Phe (Teste 1) e teste combinado de Phe+BH4, utilizando 100mg/kg de L-Phe e 20mg/kg de BH4 (Teste 2), com intervalo de uma semana entre ambos. A ingestão do BH4 ocorreu após três horas da ingestão da Phe. Foram realizadas coletas de sangue no ponto basal e após três, 11 e 27h da ingestão de Phe (T0, T1, T2 e T3 dos testes 1 e 2, respectivamente). Para ser considerado responsivo, o paciente deveria apresentar evidência de redução dos níveis de Phe associada à administração do BH4 de acordo com pelo menos um dos seguintes critérios: critério A – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 dos Testes 1 e 2; critério B – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 dos Testes 1 e 2 e critério C – análise da diferença, em percentual, das áreas abaixo da curva de Phe entre os Testes 1 e 2. A classificação de responsividade foi também comparada com quatro critérios adicionais: critério D – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 do Teste 2; critério E – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 do Teste 2; cinco pacientes participaram de estudo anterior do grupo e foram também classificados através do critério F – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 8h da sobrecarga simples com BH4 e do critério G – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 24h da sobrecarga simples com BH4. Para todos os critérios foi utilizado como ponte de corte redução ≥ 30%. Resultados: Dezoito pacientes, com mediana de idade de 12 anos, participaram do estudo. Dez pacientes apresentavam a forma Leve de HPA-PAH e oito a forma Clássica. Seis pacientes foram considerados responsivos de acordo com os critérios adotados (Clássica: 2; Leve: 4). Houve concordância de responsividade entre os critérios A e B em relação ao C (Índice Kappa=0,557; p=0,017). Dos pacientes com genótipo disponível (n=16), seis possuíam dados de responsividade ao BH4 descritos na literatura, que foram concordantes com os encontrados no presente estudo. Conclusão: Dados relativos à responsividade, tipo de HPA-PAH e genotipagem estão de acordo com descrito na literatura. Haja vista a diferença de responsividade dos pacientes ao BH4 conforme o critério de classificação utilizado, salienta-se a importância de uma definição cautelosa de responsividade e que não seja baseada em um único critério. A comparação entre a sobrecarga simples de Phe e combinada de Phe+BH4 parece ser um critério adequado para avaliar responsividade ao BH4 em pacientes com HPA-PAH que apresentam bom controle metabólico quando em tratamento dietético. / Introduction: Recent studies using different protocols showed that patients with hyperphenylalaninemia due to phenylalanine hydroxylase deficiency (HPA-PAH) may have a reduction in phenilalanine (Phe) plasma concentrations after tetrahydrobiopterin (BH4) administration. Objective: To determine responsiveness to the administration of a single dose of BH4, in a sample of Brazilian patients with HPA-PAH using a protocol that includes the simple Phe loading test and the combined Phe+BH4 loading test. Methods: Patients included in the study were ≥ 4 years of age; their median Phe plasma concentration was ≤ 10mg/dL, and all underwent dietary treatment in the 12 months before inclusion in the study. Participants received a simple Phe loading test using 100mg/kg L-Phe (Test 1) and a combined Phe+BH4 loading test using 100mg/kg L-Phe and 20mg/kg /BH4 (Test 2) at a one-week interval. BH4 was ingested three hours after Phe ingestion. Blood samples were collected at baseline and three, 11 and 27h after Phe ingestion (time points T0, T1, T2 and T3 in Tests 1 and 2). To be classified as responsive, there should be evidence that the patient had a reduction in Phe levels associated with BH4 administration according to at least one of the criteria used: criterion A – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Tests 1 and 2; criterion B – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Tests 1 and 2; and criterion C – analysis of percentage differences of the areas under the Phe curve for Tests 1 and 2. Responsiveness classifications were also compared according to four additional criteria: criterion D – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Test 2; criterion E – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Test 2; criterion F – analysis of percentage difference of Phe values 8h after simple BH4 loading used for five patients that participated in a previous study conducted by the same authors; and criterion G – analysis of percentage difference of Phe values 24 h after simple BH4 loading, also used for the patients in the same previous study. The cut-off point for all criteria was a reduction of ≥ 30%. Results: Eighteen patients (median age = 12 years) were included in the study. Ten patients had mild HPA-PAH and eight, classical HPA-PAH. Six patients were responsive according to the criteria used (Classical: 2; Mild: 4). Responsiveness was concordant for criteria A and B when compared with criterion C (kappa=0.557; p=0.017). Of the patients whose genotype was available (n=16), six had data about BH4 responsiveness described in the literature, and these data were in agreement with our findings. Conclusion: Data about responsiveness, HPA-PAH type and genotype were in agreement with those described in the literature. The difference in BH4 responsiveness of patients according to classification criterion emphasizes the importance of a careful definition of responsiveness not based on a single criterion. The comparison of simple Phe loading and combined Phe+BH4 loading seems to be an adequate criterion to evaluate responsiveness to BH4 in patients with HPA-PAH and good metabolic control when following a dietary treatment.

A obesidade e a resistência à insulina induzidas por dieta têm sido associadas ao aumento da morte de neurônios dopaminérgicos e depleção da dopamina (DA) nigroestriatal em modelo animal da Doença de Parkinson (DP), sugerindo uma maior vulnerabilidade dos neurônios dopaminérgicos em resposta a perturbações metabólicas. No entanto, ainda não há evidências consistentes que demonstrem uma associação linear entre a obesidade e a morte de neurônios dopaminérgicos e os mecanismos subjacentes que podem estar contribuindo para o desenvolvimento da DP. Para avaliar se a obesidade promove neurodegeneração dopaminérgica e/ou alterações nos parâmetros relacionados com a progressão da DP, ratos Wistar machos receberam uma dieta padrão ou uma dieta rica em gordura (HFD) durante vinte e cinco semanas e a substantia nigra, estriado e a área tegmental ventral foram isolados e submetidos a análises bioquímicas. Em conformidade com a ingestão calórica, os ratos HFD apresentaram aumento da massa gorda e peso corporal total associados à intolerância à glicose e resistência à insulina A obesidade induzida por dieta diminuiu os níveis de tirosina hidroxilase (TH) indicando perda de neurônios dopaminérgicos e também promoveu alterações no imunoconteúdo de sinaptofisina relacionadas com a inflamação periférica e central indicadas pelo aumento de TNF-α e IL1β bem como estresse oxidativo/nitrosativo com aumento da nitração de tirosina e oxidação de grupos sulfidril. Nenhuma diferença foi detectada para o imunoconteúdo de α-syn e p-Tau entre os grupos. Além disso, níveis reduzidos de TH foram confirmados na análise de imunofluorescência, bem como morte neuronal e ativação de microglia indicados pela diminuição de NeuN e aumento de Iba1 sem haver alterações para GFAP. Adicionalmente, foram identificadas piora da atividade locomotora, mobilidade e evidências apontando para um comportamento do tipo ansiolítico nas tarefas de campo aberto e claro / escuro. Não houve alterações na coordenação motora e memória. Juntos, estes dados sugerem que a obesidade induzida pela dieta hiperlipídica de fato promove a morte de neurônios dopaminérgicos na via nigroestriatal independentemente de α-syn e fosforilação da Tau. O aumento da morte neuronal pode ser atribuído à inflamação cerebral e estresse oxidativo / nitrosativo induzido pela obesidade, o que possivelmente levou às alterações comportamentais observadas neste estudo. / Diet-induced obesity and insulin resistance has been associated to increased dopaminergic neurodegeneration and nigrostriatal dopamine (DA) depletion in animal model of Parkinson’s Disease (PD), suggesting an enhanced vulnerability of dopaminergic neurons in response to metabolic perturbation. However, there is still no consistent evidence demonstrating a linear association between obesity and dopaminergic neurons death and the underlying mechanisms that can be contributing to the development of PD. In order to evaluate whether obesity promotes dopaminergic neurodegeneration and / or changes in parameters related to PD progression, male Wistar rats were fed with standard chow or high-fat diet (HFD) for twenty five weeks and the brain substantia nigra, striatum and ventral tegmental area were isolated before undergoing biochemical analyzes. In accordance with energy intake, the HFD rats showed increased fat mass and total body weight associated to glucose intolerance and insulin resistance. Diet-induced obesity decreases tyrosine hydroxylase (TH) levels indicating dopaminergic neurons loss and also promoted changes in the synaptophysin immunocontent related to peripheral and brain inflammation with increased TNF-α and IL1β, as well oxidative/nitrosative stress with increased tyrosine nitration and oxidation of sulfhydryl groups No difference was detected for α-syn and p-Tau immunocontent between groups. Moreover, decreased levels of TH were confirmed in the immunofluorescence analysis, as well neuronal death and microglia activation with NeuN and Iba1 without changes for GFAP. In addition, impairment of locomotor activity, mobility and evidences pointing for an anxiolytic-like behavior were identified in the open-field and light/dark tasks. There were no changes in the motor coordination and memory. Together, these data suggest that diet-induced obesity indeed promotes dopaminergic neurodegeneration in the nigrostriatal pathway independent of α-syn and phosphorylation of Tau. The increased neuronal death can be attributed to the brain inflammation and oxidative/nitrosative stress induced by obesity, which would likely lead to behavioral changes observed in this study.

Introdução: A exposição crônica a diferentes tipos de dieta altera o metabolismo hipotalâmico e mesolímbico, podendo causar alterações no comportamento alimentar do indivíduo. O BDNF, fator de crescimento neuronal, pode atuar na modulação do comportamento alimentar tanto em vias hedônicas quanto homeostáticas. O objetivo do estudo foi investigar como o BDNF atua na modulação do comportamento alimentar em vias homeostáticas e hedônicas em ratas fêmeas com diferentes perfis metabólicos. Materiais e métodos: Ratas Wistar fêmeas adultas randomizadas por peso foram divididas em: dieta controle (C) contendo 22% de proteína e 4% de lipídios; dieta hipoproteica (LP) 8% de proteína ou dieta hiperlipídica (HF) 45% de lipídios, ad libitum, por 5 semanas, sendo o consumo medido a cada 72 horas e o peso semanalmente. O trabalho foi dividido em duas partes. Na primeira parte, após as 5 semanas de dieta os animais ficaram em jejum por 4 horas e foram expostos ao alimento doce (Froot Loops®), previamente pesado, por 1 hora, a fim de verificar o consumo de alimento palatável em ratas com diferentes perfis metabólicos. Imediatamente após coletou-se sangue e cérebro, assim como, o peso da gordura abdominal foi mensurado. Na segunda parte do estudo, após as 5 semanas de dieta, os animais ficaram durante 7 dias no BioDAQ®, um sistema computadorizado de análise do comportamento alimentar, para avaliar o consumo da dieta habitual em ratas com diferentes perfis metabólicos. O consumo foi mensurado através de mordidas (diferença de 0,1 g na balança) e refeições (conjunto de porções por um tempo igual ou menor a 15 min, porções são mordidas ininterruptas). No dia 10 foi realizado o teste de preferência alimentar no qual o animal poderia escolher entre a dieta habitual (dieta que eles receberam por 5 semanas) ou a dieta hipersacarídica (HP) (contendo 34% lipídios, 30,2% carboidratos, 14% proteínas, 20% sacarose), com duração de 20 horas. Após 1 semana, foi coletado sangue, cérebro e mensurada a gordura abdominal. Foi realizado western blotting para tirosina hidroxilase (TH) e fosfo- tirosina hidroxilase (pTH) no núcleo accumbens, STAT3 e fosfo-STAT3 (pSTAT3) no hipotálamo. Adicionalmente, foi mensurado BDNF no soro, no núcleo do trato solitário (NTS), área tegmentar ventral (VTA) e glicemia no soro. Resultados: Nas 5 semanas de tratamento, em relação ao ganho de peso dos animais não houve diferenças significativas entre os grupos, não houve interação, apenas apresentaram efeito do tempo (p< 0,001). A gordura abdominal foi maior nas ratas HF (p= 0,002) e LP (p= 0,023) em relação aos controles. Os animais que receberam dieta HF comeram menos gramas de Froot Loops® do que os animais controle (p= 0,003). Durante a habituação ao BioDAQ® não houve diferença significativa no consumo de dieta entre os grupos. Na análise do comportamento alimentar no BioDAQ®, comparando os grupos controle versus hiperlídica (C x HF), animais HF tiveram o tamanho da refeição (g) (p=0,049), número de porções (p= p< 0,001), tamanho da refeição ciclo escuro (p= 0,002), número de porções ciclo escuro (p < 0,001) menor do que os controles e tamanho da porção ciclo escuro (p=0,006) maior do que os controles. Na análise do comportamento alimentar, comparando os grupos controle versus hipoproteica (C x LP) foram encontradas diferenças significativas nos seguintes parâmetros: média do tamanho da porção (g) (p= 0,004), média do tamanho da porção no ciclo claro (g) (p= 0,042), média do tamanho da refeição no ciclo escuro (g) (p= 0,035), média do tamanho da porção no ciclo escuro (g) (p= 0,006). Em todos os parâmetros os animais LP tiveram uma média maior do que os animais controle. No teste de preferência alimentar, os animais HF apresentaram uma média inferior aos animais controle nos seguintes parâmetros: consumo de dieta hipersacarídica (Kcal) (p= 0,034), número de refeições de dieta hipersacarídica (p= 0,016), número de porções de dieta hipersacarídica (p= 0,001). Os animais HF apresentaram médias superiores aos animais C em relação ao tamanho da porção de dieta hipersacarídica (g) (p= 0,023), PMI (intervalo entre refeições) total de dieta hipersacarídica (p= 0,022), saciedade total de dieta hipersacarídica (p= 0,008). Durante o teste de preferência alimentar comparando-se controle versus hipoproteica (C x LP), os animais (LP) apresentaram o consumo de dieta hipersacarídica (kcal) (p= 0,030) e o número de porções de dieta hipersacarídica (p= 0,003) menor que os animais controles. Os animais LP apresentaram saciedade total de dieta hipersacarídica (p= 0,046) maior do que os controles. Não houve diferenças significativas nos níveis de glicemia no soro entre os grupos. Os animais HF apresentaram as médias de pSTAT3 maior do que os controles (p= 0,013) e fosfo-tirosina hidroxilase menor do que os controles (p= 0,05). Os animais LP apresentaram STAT3 menor do que os animais controle (p= 0,035) e tiveram resultados de BDNF próximos da significância (p=0,053), tendo apresentado uma média inferior aos animais controle. Conclusões: A exposição aos diferentes tipos de dieta muda os padrões de alimentação bem como a estrutura corpórea. Tanto animais expostos a dieta HF quanto a LP apresentam alterações compatíveis com um estado de pré-resistência à leptina. O BDNF parece modular as vias homeostáticas e hedônicas do comportamento alimentar, no entanto mais estudos são necessários para entendermos melhor esses mecanismos. / Introduction: The chronic exposure to different types of diet modifies the hypothalamic and mesolimbic metabolism, what can lead to changes in the individual feeding behavior. BDNF, a neuronal growing factor, can act modulating feeding behavior in hedonic as well as in homeostatic pathways. The aim of this study was to investigate how BDNF acts modulating feeding behavior regarding hedonic and homeostatic pathways in female rats with different metabolic profiles. Materials and methods: Female adult Wistar rats randomized by weight were divided in: control diet (C) with 22% of protein and 4% of lipids; low-protein diet (LP) with 8% of protein or high fat diet (HF) with 45% of lipids, ad libitum, for 5 weeks, with the diet consumption verified every 72 hours and the weight verified weekly. The study was divided in two parts. In the first part, after 5 weeks receiving diet, animals were submitted to 4 hours of fasting and then were exposed to sweet food (Froot Loops®), previously weighted, for 1 hour to verify the palatable food consumption in rats with different metabolic profiles. Immediately after, blood and brain were collected and the abdominal fat weight was verified. In the second part of the study, after 5 weeks receiving diet, the animals were submitted to the BioDAQÒ, a computer system of feeding behavior analyses, to evaluate the habitual diet consumption in rats with different metabolic profiles for 7 days. The consumption was measured through bites (0.1g of difference in the scale) and meals (a group of portions for a period of time less or equal than 15min, portions are uninterrupted bites). On day 10 the food preference test was done and the animals could choose between the habitual diet (the one they have received for 5 weeks) and the high sucrose palatable diet (HP) (with 34% of lipids, 30.2% of carbohydrates, 14% of protein, 20% of sucrose) for a period of 20 hours. After one week, blood and brain were collected and abdominal fat was measured. Western blotting was used to verify the content of tyrosine hydroxylase (TH) and phospho-tyrosine hydroxylase (pTH) in the nucleus accumbens, STAT3 and phospho-STAT3 (pSTAT3) in the hypothalamus. Additionally, BDNF was measured in the serum, in the solitary tract nucleus (NTS) and in the ventral tegmental area (VTA) and glycemia was also verified. Results: Considering the 5 weeks of treatment regarding animals weight gain there was no significant difference between groups and no interaction, only an effect of time (p<0.001). Abdominal fat was higher in HF (p=0.002) and LP (p=0.023) rats comparing to controls. Animals that received HF diet ate less grams of Froot Loopsâ than controls (p=0.003). During the habituation to the BioDAQÒ no significant difference was seen in the consumption of the diet between the groups. When analyzing feeding behavior in the BioDAQÒ, comparing control against high fat groups (C x HF), HF animals had a decrease in the size of the meal (g) (p=0.049), number of portion (p<0.001), meal size in the dark phase (p=0.002), number of portions in the dark phase (p<0.001) compared to controls while the size of the portion in the dark phase (p=0.006) was bigger than controls. Analyzing feeding behavior comparing control against low-protein groups (C x LP) a significant difference was observed in the following parameters: average of the size of the portion (g) (p=0.004), average of the size of the portion in the light phase (g) (p=0.042), average of the size of the meal in the dark phase (g) (p=0.035), average of the size of the portion in the dark phase (g) (p=0.006). LP animals showed a higher average than controls in all parameters. In the food preference test, HF animals showed a lower average than controls in the following parameters: consumption of high sucrose palatable diet (Kcal) (p=0.034), number of meals of high sucrose palatable diet (p=0.016), number of portions of high sucrose palatable diet (p=0.001). HF animals showed higher averages than controls regarding the size of the portion of the high sucrose palatable diet (g) (p=0.023), total PMI (post interval meal) of high sucrose palatable diet (p=0.022) and total satiety of high sucrose palatable diet (p=0.008). In the food preference test comparing controls against low-protein groups (C x LP), LP animals showed a lower consumption of high sucrose palatable diet (Kcal) (p=0.030) and a lower number of portions of high sucrose palatable diet (p=0.003) than control animals. LP animals showed total satiety of high sucrose palatable diet (p=0.046) bigger than controls. There was no significant difference in the glycemia levels between groups. HF animals had pSTAT3 averages higher than controls (p=0.013) and phospho-tyrosine hydroxylase lower than controls (p=0.05). LP animals showed STAT3 lower than control animals (p=0.035) and had BDNF results close to the significance (p=0.053), showing a lower average than control animals. Conclusion: The exposure to different types of diets changes the feeding patterns as well as the body structure. Animals exposed to HF diet as well as those exposed to LP diet showed changes related to a leptin pre-resistant state. BDNF seems to modulate homeostatic and hedonic feeding behavior pathways, however more studies are necessary to a better understanding of the mechanisms.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum. Ela é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) que é responsável por converter a fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), que acaba elevando os níveis de Phe e seus metabólitos no sangue e tecidos. Se não tratada, a PKU pode desenvolver problemas neurológicos como convulsões, distúrbios motores e retardo mental. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos da Phe em alguns parâmetros do metabolismo, estresse oxidativo e viabilidade celular em cultura de astrócitos de ratos Wistar. Os astrócitos foram cultivados sob quatro condições: controle (com 0,4 mM de Phe no meio de cultura) e outros três grupos com concentrações finais de Phe de 0,5, 1,0 e 1,5 mM. Após 72 horas, os astrócitos foram coletados para análises bioquímicas. Nós observamos que os teste de brometo de tetrazolium (MTT) e lactato desidrogenase mostraram alterações na viabilidade celular em todas as doses testadas. Também foram notadas alterações em parâmetros de estresse oxidativo, indicando que a Phe pode induzir a produção de radicais livres, mas não encontramos diferenças significaticas nos parâmetros do metabolismo como a creatina-cinase, piruvato-cinase e adenilato-cinase. Estes resultados sugerem que a fenilalanina nas concentrações encontradas na PKU pode induzir estresse oxidativo e consequente morte celular em cultura de astrócitos. Considerando a importâncias dessas células para a manutenção da homeostase cerebral, é possível que estas alterações estejam relacionadas com os problemas neurológicos encontrados em pacientes com PKU. / Phenylketonuria (PKU) is the most common inborn error of amino acid metabolism. It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene that expresses phenylalanine hydroxylase enzyme (Pah) that converts phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr), that leads to high levels of Pheand its metabolites in blood and tissues. If left untreated, PKU can develop neurological problems as seizures, motor disturbances and severe mental retardation. The aim of this study is to investigate the effects of Phe on oxidative stress, some metabolic parameters and cell viability in astrocytes culture of Wistar rats.Astrocytes were cultures under four conditions: control (0.4 mMPhe in the medium), and other three groups with final Phe concentration of 0.5, 1.0 and 1.5 mM. After 72 hours, astrocytes were collected for biochemical measurements. We observed that tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays indicated that Phedecreased cell viability at all tested doses. Alterations on oxidative stress parameters indicated that Phecould induce free radicals production, but we didn’t find significative differences on metabolic parameters as creatine, pyruvate and adenylate kinases. Those results suggest that phenylalanine at concentrations found in PKU can induce oxidative stress and consequently cell death in astrocytes cultures. Considering the importance of astrocytes in brain homeostasis, it is possible that these changes may be related to neurological problems seen in PKU patients.

O objetivo desta tese foi analisar os efeitos do exercício físico sobre o comportamento motor, a expressão de tirosina hidroxilase na subtsância nigra, a sensibilidade mecânica e nociceptiva, a morfologia do nervo sural e a expressão de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no corno dorsal da medula espinal de ratos adultos machos e diabéticos induzidos por estreptozotocina. Para isso foram realizados três experimentos. No primeiro, foi realizado protocolo de oito semanas de treinamento em esteira em animais não diabéticos e diabéticos. Foi analisado o comportamento motor, pelo uso do teste do rotarod e campo aberto e a expressão de TH na substância nigra e área tegmental ventral desses animais. Os animais diabéticos sedentários apresentaram déficits motores e diminuição na reatividade à tirosina hidroxilase (TH) na substância nigra e área tegmental ventral. As alterações motoras e reatividade à TH na substância nigra foram prevenidas nos animais diabéticos treinados. No segundo experimento os animais diabéticos sedentários apresentaram diminuição no limiar sensorial mecânico, avaliado pelos filamentos de von Frey, bem como diminuição da área e diâmetro das fibras mielinizadas, aumento da densidade de fibras e área ocupada pelo tecido conjuntivo, diminuição da espessura da bainha de mielina e aumento da relação g no nervo sural. Essas alterações não foram vistas nos animais diabéticos treinados. Ainda, o nervo sural dos animais diabéticos apresentou maior porcentagem de fibras mielinizadas pequenas e menor porcentagem de fibras mielinizadas de pequeno diâmetro quando comparado aos animais controles e diabéticos treinados. No terceiro experimento demonstramos que os animais diabéticos induzidos por estreptozotocina apresentaram diminuição da sensibilidade nociceptiva, avaliada pelo teste do tail flick, assim como diminuição da expressão do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no corno dorsal da medula espinal. Por outro lado, os animais diabéticos treinados não mostraram alterações na sensibilidade mecânica e na expressão do mesmo peptídeo. Estes dados demonstram que o exercício físico em esteira em ratos diabéticos é capaz de prevenir alterações no comportamento motor e sensorial, assim como as alterações morfológicas no nervo sural, na expressão de tirosina hidroxilase na substância nigra e do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no corno dorsal da medula espinal. / The aim of this thesis was to study the effects of treadmill training on the motor and sensitive behavior, the tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the substantia nigra, the mechanical and nociceptive sensitivity, the sural nerve morphology and the calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the dorsal horn of the spinal cord from diabetic rats induced by streptozotocin. For this, we made three experiments. In the first, an eight weeks treadmill training protocol was made in diabetic and non diabetic animals. Was analyzed the motor behavior using rotarod and open field tests and the immunoreactivity to tyrosine hydroxylase (TH) in the substantia nigra and ventral tegmental area of these animals. Sedentary diabetic animals showed motor deficits and a decrease in the TH immunoreactivity in the substantia nigra and in the ventral tegmental area. Treadmill training in diabetic animals prevented the motor deficits and the decrease in the tyrosine hydroxylase reactivity. In the second experiment, sedentary diabetic animals showed a reduction in the mechanical sensitivity threshold, analyzed using von Frey filaments. Also, diabetic animals showed a decreased in the area and in diameter of the myelinated fibers, an increased in the fibers density and in the area occupied by connective tissue, a decreased myelin sheat thickness and an increased g ratio in the sural nerve. These alterations were not seen in trained diabetic animals. In addition, the sural nerve of the sedentary diabetic animals had a higher percentage of small myelinated fibers and a lower percentage of large diameter myelinated fibres than the control and trained diabetic animals. Moreover, in the third experiment we showed that the diabetic animals induced by streptozotocin had a decrease in the nociceptive sensitivity, analyzed using the tail flick test. These animals showed a decrease in the calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the dorsal horn of the spinal cord. Furthermore, these decreased in the nociceptive sensitivity and in the peptide immunoreactivity were not seen in the trained diabetic rats These data showed that treadmill training in diabetic rats is able to prevent alterations in the motor and sensitive behavior. Also, exercise is able to prevent the morphological alterations in the sural nerve, the decrease in the TH immunoreactivity in the substantia nigra and the decrease in the calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the dorsal horn of the spinal cord.

Introdução: Estudos recentes, utilizando vários protocolos, têm demonstrado que pacientes com Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPA-PAH) podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de fenilalanina (Phe) mediante a administração de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Determinar, em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH, a responsividade à administração de dose única de BH4 por meio de um protocolo incluindo o teste de sobrecarga simples de Phe e o teste combinado de sobrecarga de Phe+BH4. Métodos: Foram incluídos no estudo pacientes com idade ≥ 4 anos, em tratamento dietético e que possuíam mediana de Phe plasmática inferior a 10mg/dL no ano anterior à inclusão. Foram realizados teste de sobrecarga simples de Phe, utilizando 100mg/kg de L-Phe (Teste 1) e teste combinado de Phe+BH4, utilizando 100mg/kg de L-Phe e 20mg/kg de BH4 (Teste 2), com intervalo de uma semana entre ambos. A ingestão do BH4 ocorreu após três horas da ingestão da Phe. Foram realizadas coletas de sangue no ponto basal e após três, 11 e 27h da ingestão de Phe (T0, T1, T2 e T3 dos testes 1 e 2, respectivamente). Para ser considerado responsivo, o paciente deveria apresentar evidência de redução dos níveis de Phe associada à administração do BH4 de acordo com pelo menos um dos seguintes critérios: critério A – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 dos Testes 1 e 2; critério B – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 dos Testes 1 e 2 e critério C – análise da diferença, em percentual, das áreas abaixo da curva de Phe entre os Testes 1 e 2. A classificação de responsividade foi também comparada com quatro critérios adicionais: critério D – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 do Teste 2; critério E – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 do Teste 2; cinco pacientes participaram de estudo anterior do grupo e foram também classificados através do critério F – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 8h da sobrecarga simples com BH4 e do critério G – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 24h da sobrecarga simples com BH4. Para todos os critérios foi utilizado como ponte de corte redução ≥ 30%. Resultados: Dezoito pacientes, com mediana de idade de 12 anos, participaram do estudo. Dez pacientes apresentavam a forma Leve de HPA-PAH e oito a forma Clássica. Seis pacientes foram considerados responsivos de acordo com os critérios adotados (Clássica: 2; Leve: 4). Houve concordância de responsividade entre os critérios A e B em relação ao C (Índice Kappa=0,557; p=0,017). Dos pacientes com genótipo disponível (n=16), seis possuíam dados de responsividade ao BH4 descritos na literatura, que foram concordantes com os encontrados no presente estudo. Conclusão: Dados relativos à responsividade, tipo de HPA-PAH e genotipagem estão de acordo com descrito na literatura. Haja vista a diferença de responsividade dos pacientes ao BH4 conforme o critério de classificação utilizado, salienta-se a importância de uma definição cautelosa de responsividade e que não seja baseada em um único critério. A comparação entre a sobrecarga simples de Phe e combinada de Phe+BH4 parece ser um critério adequado para avaliar responsividade ao BH4 em pacientes com HPA-PAH que apresentam bom controle metabólico quando em tratamento dietético. / Introduction: Recent studies using different protocols showed that patients with hyperphenylalaninemia due to phenylalanine hydroxylase deficiency (HPA-PAH) may have a reduction in phenilalanine (Phe) plasma concentrations after tetrahydrobiopterin (BH4) administration. Objective: To determine responsiveness to the administration of a single dose of BH4, in a sample of Brazilian patients with HPA-PAH using a protocol that includes the simple Phe loading test and the combined Phe+BH4 loading test. Methods: Patients included in the study were ≥ 4 years of age; their median Phe plasma concentration was ≤ 10mg/dL, and all underwent dietary treatment in the 12 months before inclusion in the study. Participants received a simple Phe loading test using 100mg/kg L-Phe (Test 1) and a combined Phe+BH4 loading test using 100mg/kg L-Phe and 20mg/kg /BH4 (Test 2) at a one-week interval. BH4 was ingested three hours after Phe ingestion. Blood samples were collected at baseline and three, 11 and 27h after Phe ingestion (time points T0, T1, T2 and T3 in Tests 1 and 2). To be classified as responsive, there should be evidence that the patient had a reduction in Phe levels associated with BH4 administration according to at least one of the criteria used: criterion A – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Tests 1 and 2; criterion B – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Tests 1 and 2; and criterion C – analysis of percentage differences of the areas under the Phe curve for Tests 1 and 2. Responsiveness classifications were also compared according to four additional criteria: criterion D – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Test 2; criterion E – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Test 2; criterion F – analysis of percentage difference of Phe values 8h after simple BH4 loading used for five patients that participated in a previous study conducted by the same authors; and criterion G – analysis of percentage difference of Phe values 24 h after simple BH4 loading, also used for the patients in the same previous study. The cut-off point for all criteria was a reduction of ≥ 30%. Results: Eighteen patients (median age = 12 years) were included in the study. Ten patients had mild HPA-PAH and eight, classical HPA-PAH. Six patients were responsive according to the criteria used (Classical: 2; Mild: 4). Responsiveness was concordant for criteria A and B when compared with criterion C (kappa=0.557; p=0.017). Of the patients whose genotype was available (n=16), six had data about BH4 responsiveness described in the literature, and these data were in agreement with our findings. Conclusion: Data about responsiveness, HPA-PAH type and genotype were in agreement with those described in the literature. The difference in BH4 responsiveness of patients according to classification criterion emphasizes the importance of a careful definition of responsiveness not based on a single criterion. The comparison of simple Phe loading and combined Phe+BH4 loading seems to be an adequate criterion to evaluate responsiveness to BH4 in patients with HPA-PAH and good metabolic control when following a dietary treatment.

O objetivo desta tese foi analisar os efeitos do exercício físico sobre o comportamento motor, a expressão de tirosina hidroxilase na subtsância nigra, a sensibilidade mecânica e nociceptiva, a morfologia do nervo sural e a expressão de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no corno dorsal da medula espinal de ratos adultos machos e diabéticos induzidos por estreptozotocina. Para isso foram realizados três experimentos. No primeiro, foi realizado protocolo de oito semanas de treinamento em esteira em animais não diabéticos e diabéticos. Foi analisado o comportamento motor, pelo uso do teste do rotarod e campo aberto e a expressão de TH na substância nigra e área tegmental ventral desses animais. Os animais diabéticos sedentários apresentaram déficits motores e diminuição na reatividade à tirosina hidroxilase (TH) na substância nigra e área tegmental ventral. As alterações motoras e reatividade à TH na substância nigra foram prevenidas nos animais diabéticos treinados. No segundo experimento os animais diabéticos sedentários apresentaram diminuição no limiar sensorial mecânico, avaliado pelos filamentos de von Frey, bem como diminuição da área e diâmetro das fibras mielinizadas, aumento da densidade de fibras e área ocupada pelo tecido conjuntivo, diminuição da espessura da bainha de mielina e aumento da relação g no nervo sural. Essas alterações não foram vistas nos animais diabéticos treinados. Ainda, o nervo sural dos animais diabéticos apresentou maior porcentagem de fibras mielinizadas pequenas e menor porcentagem de fibras mielinizadas de pequeno diâmetro quando comparado aos animais controles e diabéticos treinados. No terceiro experimento demonstramos que os animais diabéticos induzidos por estreptozotocina apresentaram diminuição da sensibilidade nociceptiva, avaliada pelo teste do tail flick, assim como diminuição da expressão do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no corno dorsal da medula espinal. Por outro lado, os animais diabéticos treinados não mostraram alterações na sensibilidade mecânica e na expressão do mesmo peptídeo. Estes dados demonstram que o exercício físico em esteira em ratos diabéticos é capaz de prevenir alterações no comportamento motor e sensorial, assim como as alterações morfológicas no nervo sural, na expressão de tirosina hidroxilase na substância nigra e do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no corno dorsal da medula espinal. / The aim of this thesis was to study the effects of treadmill training on the motor and sensitive behavior, the tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the substantia nigra, the mechanical and nociceptive sensitivity, the sural nerve morphology and the calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the dorsal horn of the spinal cord from diabetic rats induced by streptozotocin. For this, we made three experiments. In the first, an eight weeks treadmill training protocol was made in diabetic and non diabetic animals. Was analyzed the motor behavior using rotarod and open field tests and the immunoreactivity to tyrosine hydroxylase (TH) in the substantia nigra and ventral tegmental area of these animals. Sedentary diabetic animals showed motor deficits and a decrease in the TH immunoreactivity in the substantia nigra and in the ventral tegmental area. Treadmill training in diabetic animals prevented the motor deficits and the decrease in the tyrosine hydroxylase reactivity. In the second experiment, sedentary diabetic animals showed a reduction in the mechanical sensitivity threshold, analyzed using von Frey filaments. Also, diabetic animals showed a decreased in the area and in diameter of the myelinated fibers, an increased in the fibers density and in the area occupied by connective tissue, a decreased myelin sheat thickness and an increased g ratio in the sural nerve. These alterations were not seen in trained diabetic animals. In addition, the sural nerve of the sedentary diabetic animals had a higher percentage of small myelinated fibers and a lower percentage of large diameter myelinated fibres than the control and trained diabetic animals. Moreover, in the third experiment we showed that the diabetic animals induced by streptozotocin had a decrease in the nociceptive sensitivity, analyzed using the tail flick test. These animals showed a decrease in the calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the dorsal horn of the spinal cord. Furthermore, these decreased in the nociceptive sensitivity and in the peptide immunoreactivity were not seen in the trained diabetic rats These data showed that treadmill training in diabetic rats is able to prevent alterations in the motor and sensitive behavior. Also, exercise is able to prevent the morphological alterations in the sural nerve, the decrease in the TH immunoreactivity in the substantia nigra and the decrease in the calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the dorsal horn of the spinal cord.