O nim (Azadirachta indica) é conhecido na Ásia devido a várias propriedades biológicas conhecidas desde a antigüidade. Os estudos referentes à ação inseticida dessa planta restringem-se a análise de seus mecanismos de ação sobre insetos e também de seus efeitos sobre trabalhadores rurais que fazem uso de produtos a base de nim; não havendo, na literatura pesquisada, trabalhos relativos aos impactos causados sobre o sistema vegetal. As plantas, assim como outros organismos, possuem a capacidade de se defenderem contra ataque de patógenos. Uma das respostas desencadeadas pelo reconhecimento do patógeno pelas células vegetais é a reação de hipersensibilidade (RH), que envolve a morte imediata das células do sítio primário de infecção, oferecendo resistência ao crescimento do patógeno. A RH é caracterizada pela necrose dos tecidos onde primeiro se manifestou a infecção, e este processo de morte celular programada envolve uma série de sinais que ainda não estão completamente elucidados. Neste trabalho, foram estabelecidas as condições do meio de cultura de células de Rubus fruticosus para os estudos com extrato de sementes de nim, avaliado o efeito elicitor deste sobre a cultura. Foram obtidos extratos hidroalcoólicos E1 e E2 e suas respectivas frações lioflizadas, L1 e L2. Estes extratos apresentaram maior teor de açúcares e lipídeos em sua composição e revelaram potencial antioxidante. Detectou-se a presença de AZA-A em L1 e L2, por meio de CLAE, cujos teores foram de 5,03 e 1,1 mg/mL, respectivamente, com tempo de retenção em torno de 9,5 minutos, confirmado por meio de análises via espectrometria de massas. O extrato L2 foi fracionado nas frações L2 inicial e AZA2. O extrato L2, nas concentrações de 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/mL, e destas frações AZA2 e L2 inicial nas proporções do extrato L2 nestas concentrações, elicitaram células de Rubus fruticosus. O extrato L2, nas concentrações de 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/mL, e suas frações AZA2 e L2 inicial nas proporções do extrato L2 nestas concentrações, elicitaram células de Rubus fruticosus. As células de Rubus fruticosus (1,8g) foram incubadas em tampão citrato de sódio contendo o extrato L2 e as frações L2 inicial e AZA2, separadamente, até a concentração de 5 mg/mL, por 1h, em temperatura ambiente. Após este período, os compostos fenólicos, proteínas e açúcares redutores foram determinados no meio extracelular e intracelular por métodos colorimétricos. O efeito destas frações e do extrato L2, na produção de EROs em células intactas de Rubus fruticosus, foi analisado usando a sonda diacetato 2,7-diclorofluoresceína (LEE et al., 1999; MURATA et al., 2001). Os resultados obtidos indicam que AZA isolada não teve efeito sobre respostas de defesa. A fração L2 inicial teve aumento de fenólicos intracelulares, de açúcares redutores extracelulares e diminuição de EROs, com o aumento da concentração do elicitor, indicando potencial antioxidante e mecanismo de defesa. O extrato L2 também demonstrou potencial antioxidante e protetor das células com o aumento da concentração do elicitor, além de possuir ação inseticida. / The neem (Azadirachta indica) is known in Asia due to their several biological properties. The studies on the insecticide action of neem extracts have only been restrict to the insect mechanisms and their effects on rural workers; studies on the impact in the vegetable system are not available. The plants, like the other organisms, have the ability to self-defend against attack of patogens. The hypersensitive response (RH), a type of programmed cell death (PCD) in plants, is triggered by plant cells when they recognize the patogen, and is characterized by necrosis of tissues in the local region surrounding the infection; the signals involved are still not completely elucidated. The present study evaluated the effects of neem extracts in Rubus fruticosus cell. The powdered seeds were submitted to two consecutive extractions with ethanol:water (1:1, v/v) at room temperature for 10 minutes, yielding E1 and E2 fractions. The solvent was evaporated and the aqueous extracts were concentrated and lyophilized, resulting in two samples, L1 and L2. They are used for analyses by high performance liquid chromatograph (HPLC) in C-18 column (4.6 x 250 mm), with acetonitrile-water (4:6 v/v) as mobile phase, flow rate 1 mL/min, monitored at 214 nm. The principal compound of this fraction was azadirachtin (5.03 and 1.1 mg/mL, respectively), the retention time was 9.5 min; it was confirmed using mass spectrophotometry. The L2 extract was partially fractionated by high performance liquid chromatograph (HPLC) in semi preparative C-18 column. The main fractions, analyzed by colorimetric methods, ESI-MS, were L2 initial and AZA2. The Rubus fruticosus cells (18-21 days; 1.8 g) were incubated in sodium citrate buffer containing L2, L2 initial ans AZA2 at concentrations up to 5 mg/mL, for 1h, at room temperature. After this period, the phenolic compounds, proteins and reducing sugar were determined in the extracellular and intracellular medium by colorimetric methods. Also, the effects of these fractions over the production of reactive oxygen species (ROS) in intact cell of Rubus fruticosus, was analyzed using 2,7-dichloro-fluorescein diacetate. AZA2 had no effect on the defense response. The initial L2 fraction increased the phenolic compounds in the intracellular medium and the reducing sugars in the extracellular medium. The same fraction showed an inhibitory effect on ROS and also increased the concentration of the elicitor. These results indicate the antioxidant potential and protector effect of the L2 initial. The L2 extract also demonstrated antioxidant and protective potential of cells with the increase of the elicitor concentration. Therefore, in parallel with its insecticide action, the neem extract contributes to the self-defense ability of the plants.

O trabalho descrito nesta tese mostra de forma detalhada a fabricação e caracterização de diferentes microssensores eletroquímicos os quais têm sido recentemente utilizados como sondas em grupo de técnicas conhecida como Scanning Electrochemical Probe Microscopy (SEPM). Desta forma, a caracterização de superfícies pode ser feita explorando diferentes fenômenos interfaciais relevantes à Ciência. Neste sentido, as interfaces de materiais cristalinos como hidroxiapatita (materiais dentários) e calcita foram o foco de estudo neste trabalho. Assim, diferentes técnicas SEPM foram exploradas no sentido de se obter informações relevantes relacionadas aos processos dentários, como a erosão ácida e hipersensibilidade. Inicialmente, microeletrodos de platina foram desenvolvidos empregando uma metodologia convencional na qual são utilizados microfibras encapsuladas em capilares de vidro. Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) no modo amperométrico foi utilizada para obtenção de informações com relação às alterações de topografia do esmalte dentário causadas pelo contato com substâncias ácidas. Adicionalmente, SECM foi empregada no estudo do transporte de espécies eletroativas em amostras de dentina e investigações relacionadas ao bloqueio dos túbulos empregando-se cremes dentais comerciais foram realizadas. A permeação de peróxido de hidrogênio pela dentina também foi estudada. Os resultados de SECM foram comparados com imagens SEM obtidas nas mesmas condições experimentais. Microeletrodos de membrana ionófora íon-seletiva (Ion Selective Microelectrodes-ISMEs) sensíveis a íons cálcio também foram desenvolvidos e caracterizados, com subsequente aplicação em SECM no modo potenciométrico. A dissolução ácida de esmalte bovino (erosão dentária) foi investigada em diferentes valores de pH (2,5; 4,5; 6,8). Além disso, o transporte de íons cálcio através de membranas porosas sintéticas foi avaliado a uma distância tip/substrato de 300µm. Alterações no fluxo de íons cálcio foram correlacionadas em experimentos realizados na presença e ausência de campos magnéticos gerados por nanopartículas de magnetita incorporadas à membrana porosa. Microcristais de calcita facilmente sintetizados pelo método de precipitação foram utilizados como superfície modelo para investigações interfaciais, cujos resultados podem ser correlacionados aos materiais dentários. Desta forma, nanopipetas de vidro preenchidas com eletrólito suporte foram fabricadas e utilizadas como sonda em Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM). O mapeamento topográfico de alta resolução espacial da superfície de um microcristal de calcita foi obtido utilizando o modo de varredura hopping mode. Adicionalmente, sondas multifuncionais ISME-SICM também foram desenvolvidas e caracterizadas para investigações simultâneas com relação às alterações topográficas e quantificação de íons cálcio sobre a superfície de um microcristal de calcita. A adição de reagentes ácidos no canal SICM promoveu a dissolução da superfície do microcristal, sendo obtidos dados cinéticos de dissolução. Investigações em meio neutro também foram realizadas utilizando a sonda ISME-SICM. Os resultados experimentais obtidos também foram comparados com aqueles oriundos de simulação computacional. / The study reported in this thesis shows in details the fabrication and characterization of different electrochemical microsensors which have been employed as probes in SEPM. Thus, the characterization of surfaces can be performed by exploiting different interfacial phenomena that are relevant to life sciences. In this sense, the interfaces of crystalline materials such as hydroxyapatite (dental materials) and calcite were the focus of this study. Thus, different SEPM techniques were explored in order to obtain relevant information related to dental materials processes such as acid erosion and hypersensitivity. Initially, platinum microelectrodes were developed employing conventional methodology that utilizes microfibers encapsulated in glass capillaries. Amperometric SECM mode was used to obtain information regarding the topography changes of tooth enamel caused by contact with acid chemicals. In addition, SECM was used to study the transport of electroactive species in dentin samples. Investigations related to the treatment of dental hypersensitivity and dental whitening were also evaluated. SECM results were compared with SEM images obtained under the same experimental conditions. Ion-selective microelectrode (ISME) based on the ionophore membrane sensitive to calcium ions were also developed and characterized followed by application in SECM potentiometric mode. The acid dissolution of bovine enamel (dental erosion) was investigated at different pH values (2.5; 4.5; 6.8). In addition, the transport of calcium ions through synthetic porous membranes was evaluated at a tip/substrate distance of 300µm. Changes in calcium ion flux were studied in the presence and absence of magnetic fields generated by magnetite nanoparticles incorporated into the porous membrane. Calcite microcrystals easily synthesized by precipitation method were used as a model of an interfacial surface for investigations which can be correlated to the dental materials. Thus, glass nanopipette filled with supporting electrolyte was fabricated and used as SICM probe. The high resolution topographic mapping of the calcite microcrystal was obtained using hopping mode. Additionally, ISME-SICM multifunction probes were developed and characterized for simultaneous investigations related to the topographical changes and quantification of local calcium ions on the surface of a calcite microcrystal. The addition of acidic reagents in the SICM channel promoted the dissolution of the microcrystal surface and dissolution kinetic data were obtained. Investigations in neutral medium were also studied using the ISME-SICM multifunctional probe. The experimental results were also compared with those obtained by computer simulation.

As plantas, assim como outros organismos, possuem a capacidade de se defenderem contra ataque de patógenos. Uma das respostas desencadeadas pelo reconhecimento do patógeno pelas células vegetais é a reação de hipersensibilidade (RH), que envolve a morte imediata das células do sítio primário de infecção, oferecendo resistência ao crescimento do patógeno. Muitas evidências sugerem a participação da mitocôndria neste processo de morte celular programa. O nim (Azadirachta indica) é conhecido devido as suas propriedades medicinais e inseticidas, sendo que os estudos sobre a ação inseticida dessa planta restringem-se a análise de seus mecanismos de ação sobre insetos e também de seus efeitos sobre trabalhadores rurais que fazem uso de produtos a base de nim. Entretanto não há na literatura pesquisada, trabalhos de seus impactos sobre o sistema vegetal. A partir dos resultados previamente obtidos em nosso laboratório e com as análises dos dados da literatura, consideramos de grande importância dar continuidade a esse estudo do efeito do nim como elicitor, avaliando quais mecanismos que levam ao fenômeno de resistência vegetal. O extrato de nim (EB) foi preparado a partir das sementes, sendo caracterizado bioquimicamente pela quantificação de compostos fenólicos, açúcares e proteínas. A atividade antioxidante foi avaliada sendo possível observar que o extrato das sementes de nim possui forte atividade antioxidante de maneira dose-dependente com IC50 de 14,85 mg/mL. Para os ensaios biológicos foi utilizado EB nas concentrações de 0,1 a 5 mg/mL isolado ou em associação com AS a 1 µmol/L ou 1 mmol/L. Para determinação da morte celular foi observado o efeito do EB nas concentrações de 5 e 0,1 mg/mL isolado ou em associação com AS 1 µmol/L nos tempos de 0 a 8 horas. Diante dos resultados foi observado que o EB na concentração de 0,1 mg/mL isolado ou em associação com AS 1 µmol/L foi capaz de causar morte celular em células de Rubus fruticosus de forma mais significativa do que o EB isolado ou em associação com AS na concentração de 5 mg/mL. No tempo de 8 horas, foi observado uma porcentagem de morte celular de 64 % para células elicitadas com EB 0,1 mg/mL isolado e 71 % para células elicitadas com EB 0,1 mg/mL em associação com AS. A diminuição da produção de EROs e da produção de AS endógeno bem como o aumento da produção de compostos fenólicos foi observado em células intactas elicitadas com EB isolado. No entanto quando a células foram elicitadas com EB em associação com AS observamos uma diminuição da produção de compostos fenólicos com o aumento da produção de AS endógeno. Em mitocôndrias isoladas foi avaliado o consumo de oxigênio, o potencial de membrana e a produção de EROs com o EB isolado e sua associação com AS 1 mmol/L. Foi observado que o EB isolado ou em associação com AS foi capaz de diminuir a velocidade de consumo de oxigênio pela cadeia respiratória sendo este efeito mais acentuado quando o nim foi administrado juntamente com AS, onde a porcentagem de inibição da velocidade de consumo de oxigênio pela cadeia respiratória na presença de EB em associação com AS foi de 79 % no estado 3 da respiração e 62 % no estado 4. Sobre o potencial de membrana observamos que o EB isolado ou em associação com AS foi capaz de diminuir o potencial de membrana, porém de forma pouco significativa. Para a produção de EROs observamos que o EB isolado foi capaz de diminuir a produção de EROs em mitocôndrias isoladas em cerca de 55 a 20 % na presença de antimicina A e 39 a 10 % na presença de rotenona, porém quando o EB foi administrado juntamente com AS observamos uma diminuição da produção de EROs somente para o EB nas concentrações de 0,5; 1 e 5 mg/mL. Com os resultados apresentados neste trabalho e os resultados obtidos anteriormente em nosso laboratório é possível sugerir que o extrato das sementes de nim possui um efeito protetor sobre células de Rubus fruticosus. / Plants, like other organisms, have the capacity to defend themselves against attack by pathogens. One of the responses triggered by pathogen recognition by plant cells is the hypersensitive response (HR), which involves the immediate death of cells in the primary site of infection, providing resistance to the pathogen growth. In this regard, it has been well established that mitochondria are involved in cell death. The neem tree (Azadirachta indica) is known due to its medicinal and insecticidal properties; studies on the insecticidal action of this plant had been restricted to the analysis of their action mechanisms on insects and their effects on rural workers who use neem-based products. However, its impact on plant systems has not been addressed. Considering previous results from our laboratory and literature data we assessed the effects of neem as elicitor, particularly the mechanisms leading to the phenomenon of plant resistance. The neem extract (EB) was prepared from the seeds, characterized biochemically by quantification of phenolic compounds, sugars and proteins. The extract showed strong dose-dependent antioxidant activity (IC50 of 14.85 mg/mL). EB concentrations of 0.1-5 mg/mL, alone or in association with 1 mol/L or 1 mmol/L SA (salicylic acid), were used for the biological assays. For cell death assays, EB was employed in concentrations of 0.1 and 5.0 mg/mL, alone or in association with 1 mol/L SA, during 0-8 hours. EB (0.1 mg/mL), alone or in association with 1 mol/L SA, induced Rubus fruticosus cell death more efficiently than EB alone or in association with 5 mg/mL SA. After 8 hours, a 64% of death of cells elicited with 0.1 mg/mL EB and 71% of death of cells elicited with 0.1 mg/mL EB in association with SA, was observed. Decrease in ROS generation and production of endogenous SA, as well as increased production of phenolic compounds, was observed in intact cells elicited with EB alone. However, when cells were elicited with EB in association with SA, a decreased production of phenolic compounds and an increased production of endogenous SA, was observed. In isolated mitochondria, it was measured oxygen consumption, membrane potential and ROS production for EB alone or in association with 1 mmol/L SA. In either conditions, EB decreased oxygen consumption by the respiratory chain, an effect more pronounced in association with SA: ~79 % inhibition for state 3 and ~ 62 % for state 4 respiration. Also, either neem alone or in association with SA decreased mitochondrial membrane potential, as well as ROS generation to an extent of 55-20% in the presence of antimycin A and 39-10% in the presence of rotenone; in association with SA, EB decreased ROS at 5, 1 and 0.5 mg/mL. Together with our previous study, these results suggest that neem seeds extract has a protective effect on Rubus fruticosus cells by scavenging, via phenolic compounds, reactive oxygen species generated by SA, thereby decreasing its action as cell death inducer.

Como os outros organismos, as plantas têm a habilidade de se defenderem através do reconhecimento de patógenos (resposta de hipersensibilidade - RH), causando a morte imediata das células no sítio primário da infecção, desta maneira oferecendo resistência ao seu crescimento. A RH é caracterizada pela necrose dos tecidos neste local, através de muitos sinais ainda não completamente elucidados, como a formação de radicais livres, incluindo o peróxido de hidrogênio (H2O2), e o reforço da parede celular. O objetivo deste estudo foi estabelecer a relação entre esses sinais em cultura de células de amora-preta (Rubus fruticosus). As condições experimentais para a análise da parede celular, das espécies reativas de oxigênio (EROs) e do H2O2 foram padronizadas. O polissacarídeo ácido (ramnoglucuronogalactana, F-I), o ácido salicílico (AS), e o metil jasmonato (MeJA), bem estabelecidos efetores da resposta da defesa, foram usados como elicitores. A produção das EROs e do H2O2 foram ativadas por F-I e pelo AS, seguidos da liberação de fragmentos de dissacarídeos da parede celular, aparentemente devido a sua degradação. Por outro lado, uma produção pequena de EROs e de H2O2 foram observadas na presença de MeJA, assim como um aumento de fragmentos de massa molecular mais elevada, que podem funcionar como sinais para o reforço da parede celular, indução de enzimas e para a produção de outra moléculas de defesa. Quando da elicitação, concomitante, com dois elicitores, AS + MeJA, houve a inibição da produção de EROs causada pelo MeJA e foi mantida a liberação de compostos extracelulares de massa molecular mais elevada. / Like the other organisms, plants have the ability to self-defend through recognition of pathogens (hypersensitive response - HR), causing immediate cell death at the primary infection site, thus offering resistance to their grown. The HR is characterized by necrosis of tissues in this site via many signals still not completely elucidated, like formation of free radicals including H2O2 and reinforcement of cell wall. The aim of this study was to establish the relationship between these signals in blackberry-black cell culture (Rubus fruticosus). The experimental conditions for analysis of cell wall, reactive oxygen species (ROS) and H2O2, were established. Acid polysaccharide (rhamnoglucuronogalactan, F-I), salicylic acid (SA), and methyl jasmonate (MeJA), well established effectors of the defense response, were used as elicitors. ROS and H2O2 production was activated by F-I and SA, followed by release of fragments like disaccharides from the cell wall, apparently due to its degradation. By contrast, a small production of ROS and H2O2 was observed in presence of MeJA, as well as an increase of high molecular weight fragments, that may function as signals for reinforcement of cell wall, enzyme induction and production of others defense molecules. Together, the two elicitors SA and MeJA inhibited the ROS production, caused by MeJA, while sustaining release of the extra cellular compounds of high molecular weight.

O trabalho descrito nesta tese mostra de forma detalhada a fabricação e caracterização de diferentes microssensores eletroquímicos os quais têm sido recentemente utilizados como sondas em grupo de técnicas conhecida como Scanning Electrochemical Probe Microscopy (SEPM). Desta forma, a caracterização de superfícies pode ser feita explorando diferentes fenômenos interfaciais relevantes à Ciência. Neste sentido, as interfaces de materiais cristalinos como hidroxiapatita (materiais dentários) e calcita foram o foco de estudo neste trabalho. Assim, diferentes técnicas SEPM foram exploradas no sentido de se obter informações relevantes relacionadas aos processos dentários, como a erosão ácida e hipersensibilidade. Inicialmente, microeletrodos de platina foram desenvolvidos empregando uma metodologia convencional na qual são utilizados microfibras encapsuladas em capilares de vidro. Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) no modo amperométrico foi utilizada para obtenção de informações com relação às alterações de topografia do esmalte dentário causadas pelo contato com substâncias ácidas. Adicionalmente, SECM foi empregada no estudo do transporte de espécies eletroativas em amostras de dentina e investigações relacionadas ao bloqueio dos túbulos empregando-se cremes dentais comerciais foram realizadas. A permeação de peróxido de hidrogênio pela dentina também foi estudada. Os resultados de SECM foram comparados com imagens SEM obtidas nas mesmas condições experimentais. Microeletrodos de membrana ionófora íon-seletiva (Ion Selective Microelectrodes-ISMEs) sensíveis a íons cálcio também foram desenvolvidos e caracterizados, com subsequente aplicação em SECM no modo potenciométrico. A dissolução ácida de esmalte bovino (erosão dentária) foi investigada em diferentes valores de pH (2,5; 4,5; 6,8). Além disso, o transporte de íons cálcio através de membranas porosas sintéticas foi avaliado a uma distância tip/substrato de 300µm. Alterações no fluxo de íons cálcio foram correlacionadas em experimentos realizados na presença e ausência de campos magnéticos gerados por nanopartículas de magnetita incorporadas à membrana porosa. Microcristais de calcita facilmente sintetizados pelo método de precipitação foram utilizados como superfície modelo para investigações interfaciais, cujos resultados podem ser correlacionados aos materiais dentários. Desta forma, nanopipetas de vidro preenchidas com eletrólito suporte foram fabricadas e utilizadas como sonda em Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM). O mapeamento topográfico de alta resolução espacial da superfície de um microcristal de calcita foi obtido utilizando o modo de varredura hopping mode. Adicionalmente, sondas multifuncionais ISME-SICM também foram desenvolvidas e caracterizadas para investigações simultâneas com relação às alterações topográficas e quantificação de íons cálcio sobre a superfície de um microcristal de calcita. A adição de reagentes ácidos no canal SICM promoveu a dissolução da superfície do microcristal, sendo obtidos dados cinéticos de dissolução. Investigações em meio neutro também foram realizadas utilizando a sonda ISME-SICM. Os resultados experimentais obtidos também foram comparados com aqueles oriundos de simulação computacional. / The study reported in this thesis shows in details the fabrication and characterization of different electrochemical microsensors which have been employed as probes in SEPM. Thus, the characterization of surfaces can be performed by exploiting different interfacial phenomena that are relevant to life sciences. In this sense, the interfaces of crystalline materials such as hydroxyapatite (dental materials) and calcite were the focus of this study. Thus, different SEPM techniques were explored in order to obtain relevant information related to dental materials processes such as acid erosion and hypersensitivity. Initially, platinum microelectrodes were developed employing conventional methodology that utilizes microfibers encapsulated in glass capillaries. Amperometric SECM mode was used to obtain information regarding the topography changes of tooth enamel caused by contact with acid chemicals. In addition, SECM was used to study the transport of electroactive species in dentin samples. Investigations related to the treatment of dental hypersensitivity and dental whitening were also evaluated. SECM results were compared with SEM images obtained under the same experimental conditions. Ion-selective microelectrode (ISME) based on the ionophore membrane sensitive to calcium ions were also developed and characterized followed by application in SECM potentiometric mode. The acid dissolution of bovine enamel (dental erosion) was investigated at different pH values (2.5; 4.5; 6.8). In addition, the transport of calcium ions through synthetic porous membranes was evaluated at a tip/substrate distance of 300µm. Changes in calcium ion flux were studied in the presence and absence of magnetic fields generated by magnetite nanoparticles incorporated into the porous membrane. Calcite microcrystals easily synthesized by precipitation method were used as a model of an interfacial surface for investigations which can be correlated to the dental materials. Thus, glass nanopipette filled with supporting electrolyte was fabricated and used as SICM probe. The high resolution topographic mapping of the calcite microcrystal was obtained using hopping mode. Additionally, ISME-SICM multifunction probes were developed and characterized for simultaneous investigations related to the topographical changes and quantification of local calcium ions on the surface of a calcite microcrystal. The addition of acidic reagents in the SICM channel promoted the dissolution of the microcrystal surface and dissolution kinetic data were obtained. Investigations in neutral medium were also studied using the ISME-SICM multifunctional probe. The experimental results were also compared with those obtained by computer simulation.

O teste alérgico intradérmico (TID) é uma importante ferramenta no diagnóstico dos alérgenos implicados nas reações de hipersensibilidade mediada por IgE. O objetivo deste estudo foi avaliar o TID em eqüinos não alérgicos com extratos alergênicos de Cynodon dactylon, Lolium multiflorum, Paspalum notatum, Culex sp. e Aedes aegipty, e três concentrações de histamina, em dois volumes diferentes, e baseado nos resultados, verificar a acurácia do TID em eqüinos alérgicos. Foram realizados TID em 17 eqüinos não alérgicos com três concentrações de cada extrato (1:2000v/w, 1:4000v/w e 1:8000v/w) e três concentrações de histamina (0,1mg/ml, 0,05mg/ml e 0,025mg/ml), em dois volumes (0,1 e 0,05ml). Baseado nos resultados obtidos, foram realizados TID em seis eqüinos alérgicos utilizando os extratos na concentração de 1:2000v/w, a histamina na concentração de 0,025mg/ml, em um volume de 0,05ml. Nos eqüinos não alérgicos, nenhuma das três concentrações dos extratos testados nos dois volumes mostrou-se irritativa. Concentrações maiores de histamina provocaram halos maiores e levemente mais túrgidos, e quanto maior o volume injetado, maiores as reações Os TID realizados em eqüinos alérgicos mostraram confiabilidade dos resultados por evidenciar hipersensibilidade individual e não provocar reações irritativas. Em conclusão, as diferentes concentrações dos estratos testados em eqüinos não alérgicos não provocaram reações falso positivas (irritantes). O volume de 0,05ml é mais recomendado para realização dos TID pois as aplicações com 0,1ml produziram reações maiores, prejudicando a sensibilidade do teste. A concentração de 0,025mg/ml da solução de histamina provocou a formação de halos menores, permitindo maior acurácia do cut off no TID. Os extratos alergênicos testados em equinos alérgicos não provoraram reações em todos os animais, o que poderia ser considerado uma reação irritativa. Os equinos alérgicos apresentaram reações positivas diferentes, de acordo com a hipersensibilidade individual, demonstrando sensibilização alérgica verdadeira. / The intradermal test (IDT) is an important tool in the diagnosis of allergens involved in IgE-mediated hypersensitivity reactions. The aim of this study was to evaluate the IDT in nonallergic horses with allergenic extracts of Cynodon dactylon, Lolium multiflorum, Paspalum notatum, Culex sp. and Aedes aegypti, and three histamine concentrations, in two different volumes, and based on the results, verify the accuracy of IDT in allergic horses. IDT was performed on 17 nonallergic horses with three concentrations of each extract (1:2000v/w, 1:4000v/h and 18000v/w) and three histamine concentrations (0,1mg/ml, 0,05mg/ml and 0,025mg/ml) in two volumes (0,1 and 0,05ml). Based on the results obtained, IDT was performed in six allergic horses using extracts at the concentration of 1:2000v/w, histamine at a concentration of 0.025mg/ml, in a volume of 0,05ml. In nonallergic horses, none of the three concentrations of the extracts tested in the two volumes were irritant. Larger concentrations of histamine provoked larger and slightly more turgid wheals, and the larger the volume injected, the greater the reactions The IDT performed in allergic horses showed reliability of the results because they demonstrated individual hypersensitivity and did not provoke irritative reactions. In conclusion, the different concentrations of extracts tested in nonallergic horses did not provoke false positive (irritant) reactions. The volume of 0,05ml is more recommended for execution of IDT because the applications with 0,1ml produced larger reactions, impairing the sensitivity of the test. The concentration of 0,025mg/ml of the histamine solution caused the formation of smaller wheals, allowing a better accuracy of the cut off in the IDT. The allergenic extracts tested in allergic horses did not provoke reactions in all the animals, what could be considered an irritative reaction. Allergic horses presented different positive reactions, according to individual hypersensitivity, demonstrating true allergic sensitization.

Objetivo: Avaliar o teste de contato atópico (TCA) em pacientes com alergia ao leite de vaca (APLV) IgE mediada - grupo 1 e naqueles com doenças eosinofílicas do trato digestório (DETD) - grupo 2, comparando os extratos de leite de vaca (LV) a 20% com o leite in natura, o tempo ideal de oclusão do teste e o valor preditivo positivo do TCA na identificação do leite como desencadeante no grupo 2, avaliada pela melhora clinica e endoscópica após dieta de restrição. Métodos: Estudo de corte transversal, com avaliação de 45 pacientes e 9 controles. O grupo 1 (n=15) com APLV IgE mediada foram diagnosticados pelo teste de provocação e prick teste positivo para LV e o grupo 2 (n=30) pela biópsia mostrando esofagite eosinofílica (15 eosinófilos/cga) ou enterocolite eosinofílica (>20 eosinófilos/cga), prick teste positivo para LV (n=15) e sintomas desencadeados pelo leite. O grupo 3 (n=9) incluiu pacientes com exclusão do diagnóstico de APLV. Utilizou-se câmaras de 12mm e LV in natura e LV a 20% como extratos ( IPI ASAC, Espanha). Os tempos de leitura foram de 24, 48 e 72 horas e considerou-se como TCA positivo, a presença de hiperemia com infiltração e formação de pápulas ou vesículas. Para avaliação do valor preditivo positivo do TCA, considerou-se pacientes com DETD com sintomas associados ao leite, sem melhora com tratamento adequado, IgE específica ao LV e melhora clínica e histológica com a instituição da dieta de restrição. Resultados: Considerando ambos os extratos, houve semelhança quanto à frequência de positividade do TCA nos três tempos de leitura em ambas situações clínicas. Com relação à concordância entre os tempos de leitura do TCA com ambos extratos, observou-se diferença estatisticamente significante entre o tempo de 24 hs com aqueles de 48 e 72hs (p=0,031 em ambas comparações), o mesmo não ocorrendo entre o tempo de 48 e 72hs tanto na APLV como nas DETD. Isoladamente, o LV a 20% mostrou comportamento semelhante em ambas as doenças, com diferença entre o tempo de 24 e aqueles de 48 (p=0,031 / 0,000) e 72hs (p=0,031/ 0,002) respectivamente na APLV e DETD. O extrato de leite in natura nos pacientes com APLV não mostrou diferença estatisticamente significante entre os tempos avaliados, enquanto nos pacientes com DETD observou-se diferença entre 24 hs e os tempos de 48hs (p=0,003) e 72hs (p=0,003). A restrição dietética do leite naqueles pacientes com DETD e TCA positivo foi associada à melhora clínica em 80% dos pacientes e associação com melhora histológica em 65% destes. Conclusões: O TCA utilizando tanto LV in natura como extrato LV a 20%, com leitura após 48 ou 72hs da sua aplicação mostrou-se útil na identificação de pacientes com DETD desencadeada pelo LV. A instituição de dieta restrita neste alimento contribuiu para a melhora dos sintomas e para a redução do número de eosinófilos na biópsia de controle / Objective: To evaluate the atopic patch test (APT) in IgE mediated cow\'s milk allergic patients (CMA) - Group 1 and those with gastrointestinal eosinophilic diseases (GED) - Group 2, comparing extracts of cow\'s milk (CM) 20% protein concentration and fresh milk, the optimal time reading and the positive predictive value of APT in the identification of milk as a trigger food in the group 2, as assessed by clinical and endoscopic improvement after dietary restriction. Methods: Cross-sectional study with evaluation of 45 patients and 9 controls. The group 1 (n = 15) with IgE-mediated CMA was diagnosed by provocation test and positive skin prick test for CM in all patients and group 2 (n = 30) by biopsy showing eosinophilic esophagitis ( 15 eosinophils / hpf) or eosinophilic enterocolitis (> 20 eosinophils / hpf ), prick test positive for CM (n = 15) and symptoms triggered by milk. Group 3 (n = 9) included patients which CMA was excluded. It was used 12mm a plastic chamber of inert material, and as extracts the fresh milk and CM at 20% (IPI ASAC, Spain). The reading times were 24, 48 and 72 hours and was considered as APT positive, the presence of hyperemia with infiltration and papules or vesicles. To evaluate the positive predictive value of the APT, it was considered GED patients with symptoms associated to milk, no response to treatment, specific IgE to CM and clinical and histological improvement after the restricted diet institution. Results: Considering both extract, there was similarity in the frequency of positive APT evaluating all the reading times in both clinical situations. Regarding the agreement between the reading times with both extracts, there was a statistically significant difference between the time of 24 hours with those of 48 and 72 hours (p = 0.031 for both comparisons). This fact was not observed between the time of 48 and 72 hours in both diseases. The CM 20% extract showed a similar pattern in both diseases, with difference between the reading time of 24 with the 48 hours (p = 0.031/0.000) and 72 hours (p = 0.031/ 0.002) respectively in both diseases. The fresh milk extract in CMA patients showed no statistically significant difference between the reading times evaluated, while in GED patients it was observed difference between 24 hours with the time of 48 hours (p = 0.003) and 72 hours (p = 0.003). The milk restricted diet for GED patients with positive APT was associated to clinical improvement in 80% of patients and in both clinical and histological response in 65% of them. Conclusions: The APT using both fresh CM and CM 20% extract with reading time of 48 or 72 hours showed useful in identifying GED patients triggered by CM. The establishment of milk restricted diet contributed to the improvement of symptoms and to reduce the number of eosinophils in the control biopsy

Nos últimos anos, inúmeros avanços têm sido alcançados no que diz respeito aos mecanismos moleculares que participam na indução e manutenção da dor crônica, incluindo ativação glial. Já foi demonstrado que alguns receptores de reconhecimento padrão (PRRs), como os receptores do tipo Toll (TLRs) participam desse processo e, que em modelos de inflamação/infecção do Sistema Nervoso Central, os TLRs e os receptores do tipo NOD (NLRs) cooperam na ativação das células da glia, o que nos levou a hipotetizar que os receptores NOD1 e NOD2 também possam desempenhar um papel importante no processo de dor crônica. O NOD2 é responsável pela detecção intracelular do muramil dipeptídeo (MDP) enquanto que NOD1 reconhece o ácido diaminopimélico (iE-DAP), ambos padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) encontrados no peptideoglicano de bactérias. Após o reconhecimento, NLRs recrutam diretamente RIPK2 (proteína 2 de interação com o receptor RICK), uma serina-treonina quinase importante na ativação do fator nuclear kB (NF-kB). Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a participação de NOD1 e NOD2, via RIPK2, no desenvolvimento da hipersensibilidade mecânica neuropática focando principalmente nos mecanismos espinais envolvidos. Dessa maneira, foi observado que os animais NOD1-/-, NOD2-/- e RIPK2-/- apresentaram redução significativa da hipersensibilidade nociceptiva mecânica quando comparado aos animais selvagens após indução de neuropatia periférica pelo modelo experimental de lesão limitada do nervo isquiático (SNI, Spared Nerve Injury). Ao contrário, a hipersensibilidade inflamatória induzida pelo adjuvante completo de Freud (CFA) não foi reduzida nesses animais. A redução da dor neuropática em NOD1-/-, NOD2-/- e RIPK2-/- foi associada a uma diminuição da expressão de IBA-1, GFAP, IL-1, TNF- e P2X4 na medula espinal quando comparado ao grupo WT. In vitro, foi observado que culturas primárias de micróglia não induziram liberação de IL-1, TNF-, IL-6 em resposta ao MDP (10g/mL) e iE-DAP (100ng/mL). No entanto, quando o MDP foi administrado juntamente com uma baixa concentração de lipopolissacarídeo (LPS) (0,1ng/mL), apresentou uma forte produção destas citocinas. Além disso, também foi demonstrado que células periféricas que infiltram na medula espinal podem expressar NOD1 e NOD2 e portanto serem capazes de induzir hipersensibilidade mecânica e ativação microglial após a indução de neuropatia. Dessa maneira, os resultados sugerem que NOD1 e NOD2, via RIPK2, contribuem para a gênese da dor neuropática, possivelmente mediando a liberação de citocinas pró-nociceptivas e a ativação de células gliais. Além disso, os resultados apontam ação potencial de NOD2 com TLR4 no intuito de estimular a ativação glial. Estes mecanismos representam uma nova abordagem para elucidar os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da dor crônica e um possível alvo para o desenvolvimento de drogas para o tratamento da dor neuropática. / In the last years, many advances have been made related to the molecular mechanisms involved in the induction and maintenance of chronic pain, including glial activation. It has been shown that some pattern recognition receptors (PRRs) such as Toll-like receptors (TLRs) are involved in this process, and that in inflammation/infection models of the CNS, the TLRs and Nod-like receptors (NLRs) cooperate in activation of glial cells, which led us to hypothesize that NOD1 and NOD2 receptors may also play an important role in chronic pain process. NOD2 are responsible by intracellular detection of muramyl dipeptide (MDP) and NOD1 detects meso-diaminopimelic acid (iE-DAP), pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) found in the peptidoglycan from bacteria. Upon recognition, NLRs recruit directly RIPK2, an adaptor protein, important in NLRs-mediated NFB activation. In the present study, we aimed to evaluate the participation of NOD1 and NOD2, via RIPK2, in the development of neuropathic mechanical hypersensitivity focusing mainly on spinal mechanisms involved. The results demonstrate that NOD1-/-, NOD2-/-, RIPK2-/- showed a significant reduction in mechanical hypersensitivity when compared to WT mice, after submitted to an experimental model of neuropathic pain Spared Nerve Injury (SNI). Interestingly, CFA-induced chronic inflammatory hypersensitivity was not decreased in these mice. The reduction in neuropathic pain in NOD1-/-, NOD2-/- and RIPK2-/- mice was associated with a decrease in the expression of IBA-1, GFAP, IL-1, TNF- and P2X4 in spinal cord when compared with WT. In vitro, it was observed that primary cultures of microglia did not produce IL-1, TNF-, IL-6 in response to MDP (3g/mL) or iE-DAP (100ng/mL). However, MDP, together with an ineffective concentration of LPS (0.1ng/mL), produced a robust production of these cytokines. Moreover, it was also demonstrated that peripheral cells infiltrating the spinal cord could express NOD1 and NOD2 and thus, be able to induce mechanical hypersensitivity and microglial activation after induction of peripheral neuropathy. The results suggest that NOD1 and NOD2, via RIPK2, contribute to the genesis of neuropathic pain, possibly by mediating the release of pronociceptive cytokines and increased glial cells activation. Moreover, the results indicate potential action of NOD2 with TLR4 in attempt to stimulate glial cells activation. These mechanisms represent a novel approach for elucidating the pathophysiology of chronic pain, and a target for the development of drugs for the treatment of neuropathic pain.

INTRODUÇÃO: A Hipersensibilidade do seio carotídeo (HSC) é a exacerbação do reflexo normal e foi definida como ocorrência de pausa ventricular 3 segundos ou redução da pressão arterial sistólica (PAS) 50 mmHg em resposta à massagem do seio carotídeo (MSC). Fenômeno relacionado à idade, raramente diagnosticado em pacientes com menos de 50 anos, tem recebido especial atenção como causa de síncope e quedas inexplicadas nos idosos, nas últimas décadas, com relatos de taxas de prevalências superiores a 45%. Entretanto, ainda não estão claras as implicações diagnósticas da HSC na síncope, com resultados controversos na literatura. OBJETIVOS: Determinar a prevalência da HSC em pacientes com sintomas de síncope e pré-síncope e comparar com indivíduos assintomáticos. Correlacionar a resposta à MSC com a rigidez aórtica e os parâmetros anatômicos e funcionais carotídeos. MÉTODOS: Foram avaliados em estudo prospectivo 99 pcts sintomáticos, com síncope ou pré-síncope a esclarecer (idade média de 69 anos, 41,4% homens), e 66 pcts assintomáticos para controle (idade média de 73 anos, 34,8% homens). Excluíram-se pacientes com cardiopatia estrutural ou com contraindicações para MSC. A MSC foi realizada no ponto com maior impulsão carotídea por 5 segundos, com o registro contínuo e não invasivo da pressão arterial (PA) e eletrocardiograma, com o paciente em postura ortostática a 70º. Foram consideradas respostas anormais: cardioinibitória (CI): assistolia 3 segundos e vasodepressora (VD): redução da PAS 50 mmHg. O índice da rigidez arterial foi obtido por meio de medida da velocidade de onda de pulso carotídeo-femoral (VOP). As características anatômicas e funcionais da carótida foram determinadas por medidas de diâmetro, espessura íntima-média carotídea (EIMC) e índice de distensibilidade. RESULTADOS: Não foram constatadas diferenças nas respostas obtidas na MSC entre os grupos, com 67,7% e 60,6% de respostas fisiológicas; 24,2% e 25,8% de respostas CI; 8,1% e 13,6% de respostas VD em grupo sintomáticos e assintomáticos, respectivamente (p=0,466). Não foram observadas correlações entre a resposta à MSC, tanto com a VOP como com a EMIC, a distensibilidade e o diâmetro carotídeo. CONCLUSÕES: 1- A prevalência de HSC e resposta hemodinâmica à MSC em pacientes com sintomas de síncope e pré-síncope foram semelhantes a pacientes assintomáticos provenientes da mesma instituição, com características clínicas semelhantes. 2- Não foi observada correlação significativa entre a rigidez arterial, medida por meio da VOP, EIMC, distensibilidade e diâmetro carotídeo e a resposta à MSC / The carotid sinus hypersensitivity (CSH) is the exaggeration of the normal reflex and was defined by occurrence of asystole 3 seconds or fall in systolic BP 50 mmHg in response to carotid sinus massage (CSM). Phenomenon related to age, rarely diagnosed in patients younger than 50 years, has gained importance as a cause of syncope and unexplained falls in the elderly in recent decades with reported prevalence rates above 45%. However, the correlation between CSH and syncope etiology is still controversial. OBJECTIVE: To determine the prevalence of CSH in patients with syncope and near syncope of unknown origin and compare with asymptomatic individuals; to evaluate the correlation between CSM responses and arterial stiffness. METHODS: We studied prospectively 99 symptomatic pts with syncope or near syncope (mean age 69 years, 41.4% men) and 66 asymptomatic controls (mean age 73 years, 34.8% men). Patients with significant structural heart disease or with contraindications to CSM were excluded. The CSM was performed at the point with maximal carotid pulsation, for 5 seconds with continuous and noninvasive blood pressure and electrocardiogram recording at 70° in upright posture. Were considered abnormal responses: cardioinhibitory (CI): asystole 3 seconds and vasodepressor (VD): decrease in systolic BP 50 mmHg. The aortic stiffness was determined by aortic pulse wave velocity (PWV). The anatomical and functional characteristics of the carotid were determined by measurements of diameter, intima-media thickness (IMT) and distensibility index. RESULTS: There were no differences in the responses obtained in the CSM between the groups, being 67.7 % and 60.6% physiological responses, 24.2% and 25.8% CI responses and 8.1% and 13.6% VD responses in symptomatic and asymptomatic groups, respectively (p=0.466). There were no correlations between response to the CSM with VOP, IMT, carotid diameter and distensibility. CONCLUSIONS: The prevalence of CSH in patients with symptoms of syncope and near syncope was similar to asymptomatic patients from the same institution with similar clinical characteristics. There was no significant correlation between arterial stiffness, measured by PWV, IMT, carotid diameter and distensibility with the response to CSM

Objetivo: Avaliar o teste de contato atópico (TCA) em pacientes com alergia ao leite de vaca (APLV) IgE mediada - grupo 1 e naqueles com doenças eosinofílicas do trato digestório (DETD) - grupo 2, comparando os extratos de leite de vaca (LV) a 20% com o leite in natura, o tempo ideal de oclusão do teste e o valor preditivo positivo do TCA na identificação do leite como desencadeante no grupo 2, avaliada pela melhora clinica e endoscópica após dieta de restrição. Métodos: Estudo de corte transversal, com avaliação de 45 pacientes e 9 controles. O grupo 1 (n=15) com APLV IgE mediada foram diagnosticados pelo teste de provocação e prick teste positivo para LV e o grupo 2 (n=30) pela biópsia mostrando esofagite eosinofílica (15 eosinófilos/cga) ou enterocolite eosinofílica (>20 eosinófilos/cga), prick teste positivo para LV (n=15) e sintomas desencadeados pelo leite. O grupo 3 (n=9) incluiu pacientes com exclusão do diagnóstico de APLV. Utilizou-se câmaras de 12mm e LV in natura e LV a 20% como extratos ( IPI ASAC, Espanha). Os tempos de leitura foram de 24, 48 e 72 horas e considerou-se como TCA positivo, a presença de hiperemia com infiltração e formação de pápulas ou vesículas. Para avaliação do valor preditivo positivo do TCA, considerou-se pacientes com DETD com sintomas associados ao leite, sem melhora com tratamento adequado, IgE específica ao LV e melhora clínica e histológica com a instituição da dieta de restrição. Resultados: Considerando ambos os extratos, houve semelhança quanto à frequência de positividade do TCA nos três tempos de leitura em ambas situações clínicas. Com relação à concordância entre os tempos de leitura do TCA com ambos extratos, observou-se diferença estatisticamente significante entre o tempo de 24 hs com aqueles de 48 e 72hs (p=0,031 em ambas comparações), o mesmo não ocorrendo entre o tempo de 48 e 72hs tanto na APLV como nas DETD. Isoladamente, o LV a 20% mostrou comportamento semelhante em ambas as doenças, com diferença entre o tempo de 24 e aqueles de 48 (p=0,031 / 0,000) e 72hs (p=0,031/ 0,002) respectivamente na APLV e DETD. O extrato de leite in natura nos pacientes com APLV não mostrou diferença estatisticamente significante entre os tempos avaliados, enquanto nos pacientes com DETD observou-se diferença entre 24 hs e os tempos de 48hs (p=0,003) e 72hs (p=0,003). A restrição dietética do leite naqueles pacientes com DETD e TCA positivo foi associada à melhora clínica em 80% dos pacientes e associação com melhora histológica em 65% destes. Conclusões: O TCA utilizando tanto LV in natura como extrato LV a 20%, com leitura após 48 ou 72hs da sua aplicação mostrou-se útil na identificação de pacientes com DETD desencadeada pelo LV. A instituição de dieta restrita neste alimento contribuiu para a melhora dos sintomas e para a redução do número de eosinófilos na biópsia de controle / Objective: To evaluate the atopic patch test (APT) in IgE mediated cow\'s milk allergic patients (CMA) - Group 1 and those with gastrointestinal eosinophilic diseases (GED) - Group 2, comparing extracts of cow\'s milk (CM) 20% protein concentration and fresh milk, the optimal time reading and the positive predictive value of APT in the identification of milk as a trigger food in the group 2, as assessed by clinical and endoscopic improvement after dietary restriction. Methods: Cross-sectional study with evaluation of 45 patients and 9 controls. The group 1 (n = 15) with IgE-mediated CMA was diagnosed by provocation test and positive skin prick test for CM in all patients and group 2 (n = 30) by biopsy showing eosinophilic esophagitis ( 15 eosinophils / hpf) or eosinophilic enterocolitis (> 20 eosinophils / hpf ), prick test positive for CM (n = 15) and symptoms triggered by milk. Group 3 (n = 9) included patients which CMA was excluded. It was used 12mm a plastic chamber of inert material, and as extracts the fresh milk and CM at 20% (IPI ASAC, Spain). The reading times were 24, 48 and 72 hours and was considered as APT positive, the presence of hyperemia with infiltration and papules or vesicles. To evaluate the positive predictive value of the APT, it was considered GED patients with symptoms associated to milk, no response to treatment, specific IgE to CM and clinical and histological improvement after the restricted diet institution. Results: Considering both extract, there was similarity in the frequency of positive APT evaluating all the reading times in both clinical situations. Regarding the agreement between the reading times with both extracts, there was a statistically significant difference between the time of 24 hours with those of 48 and 72 hours (p = 0.031 for both comparisons). This fact was not observed between the time of 48 and 72 hours in both diseases. The CM 20% extract showed a similar pattern in both diseases, with difference between the reading time of 24 with the 48 hours (p = 0.031/0.000) and 72 hours (p = 0.031/ 0.002) respectively in both diseases. The fresh milk extract in CMA patients showed no statistically significant difference between the reading times evaluated, while in GED patients it was observed difference between 24 hours with the time of 48 hours (p = 0.003) and 72 hours (p = 0.003). The milk restricted diet for GED patients with positive APT was associated to clinical improvement in 80% of patients and in both clinical and histological response in 65% of them. Conclusions: The APT using both fresh CM and CM 20% extract with reading time of 48 or 72 hours showed useful in identifying GED patients triggered by CM. The establishment of milk restricted diet contributed to the improvement of symptoms and to reduce the number of eosinophils in the control biopsy