As vias suprabulbares assim como núcleos bulbares são de vital importância na modulação cardiovascular. As informações aferentes que chegam ao NTS ascendem a áreas suprabulbares por neurônios noradrenérgicos (NORérgicos) projetando-se principalmente a neurônios pré-autonômicos do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) em sua maioria ocitocinérgicos (OTérgicos) e vasopressinérgicos (VPérgicos), os quais se projetam a áreas bulbares, fechando um pronto circuito modulatório. É nossa hipótese de trabalho que a hipertensão e/ou o treinamento possam alterar a plasticidade de vias NORérgicas ascendentes as quais, modificando a sinalização aferente, desencadeariam respostas plásticas e funcionais nos neurônios pré-autonômicos do PVN, alterando a modulação cardiovascular nestas situações. Objetivo: estudar o funcionamento da alça suprabulbar de modulação autonômica, avaliando os efeitos sequenciais da hipertensão e do treinamento sobre a sinalização NORérgica ascendente e sobre a plasticidade/atividade de neurônios OTérgicos e VPérgicos do PVN que se projetam a áreas bulbares de controle cardiovascular. Material e Métodos: Protocolo I - Ratos Wistar adultos foram submetidos a T de baixa intensidade (50-60% da capacidade máxima, 5 dias/semana, 1h/dia) ou foram mantidos sendentários (S) por 8 semanas. Após registros da hemodinâmica basal nas semanas 0 (S0=T0), 1 (T1), 2 (T2), 4 (T4) e 8 (T8 e S8) [protocolo Análise Temporal do Treinamento], após 8 semanas de T ou S [para protocolo de lesão seletiva dos neurônios NORérgicos ascendentes pela saporina], e, após 12 semanas de T ou S [para os protocolos SHAM & DAS] os ratos foram eutanasiados para perfusão e fixação do encéfalo. Cortes (30 &um;m) do PVN foram processados para imuno-histoquímica de dupla marcação para OT e dopamina beta-hidroxilase (DBH); imagens foram adquiridas pelo microscópio de fluorescência e confocal e analizadas pelo ImageJ e pelo Imaris, respectivamente. Protocolo II - SHR e WKY (4 semanas de idade no início dos protocolos) foram mantidos sedentários (S) por 8 semanas. Nas semanas experimentais 0, 1, 2, 4 e 8 avaliamos os parâmetros funcionais (valores basais PA e FC) e a imunoistoquímica para VP e DBH; em outro protocolo, realizamos cirurgia Sham ou DAS em animais SHR e Wistar de 41 dias e, após a 13ª semana realizamos estudos funcionais e a análise imunoistoquímica para DBH e VP. Resultados: S determinou no PVN diminuição idade-dependente da OTir em todos os subnúcleos magnocelular (mg), dorsal cap (dc), ventromedial (vm) e posterior (Po), sem alterações significativas de DBHir, e e sem alteração de OTir em aréas bulbares, como DMV, NTS, BVLc e BVLr. T induziu aumento a partir de T2 da síntese de DBH no NTS caudal, intermediário e BVLc, e o T induziu uma diminuição da de DBH no BVLr. No PVNvm e Po houve pronto aumento da OTir em T2 vs S0, e DBHir em T2 vs S0, e aumento de botões sinápticos NORérgicos em neurônios OTérgicos, e bradicardia de repouso entre T4 e T8, sem alterar a pressão arterial. A remoção dos barorreceptores diminuiu a densidade das projeções OTérgica no NTS intermediário, BVLr e no PVN mg, dc, vm e Po, além disso a desnervação sino-aórtica bloqueiou todos os efeitos induzidos pelo treinamento, como o aumento de DBHir no NTS caudal e intermediário, no caudal e rostral VLM e em todo PVN (mg, dc, vm e Po) e impediu o aumento de OTir em ambas as aréas do bulbo quando comparamos DAS -T vs. SHAM-T. No protocolo de saporina, a marcada redução das projeções NORérgicas induziu um significativa queda na síntese de OT em todo o PVN medial e posterior, e o T não foi capaz em aumentar a OTir. Em áreas bulbares, observamos que a DBHx induziu redução na DBHir e de neurônios NORérgicos no NTS caudal e intermediário e BVLc, porém não houve alteração no BVLr em animais S. No grupo DBHx-T houve aumento na síntese proteíca de DBH em todo o bulbo, com exceção do BVLr. Houve uma marcada redução das projeções Otérgicas em todo bulbo, mas não houve alteração da OTir em DBHx, e não foi observado bradicardia de repouso. No protocolo II, WKY e SHR, de 28 dias, possuem PA semelhantes, qual aumentou a partir de S2 apenas em SHR. Animais SHR em fase pré-hipertensiva já possuem FC aumentada, comparado com os WKY, permanecendo com valores superiores até o final do protocolo, em ambas as linhagens houve uma diminuição da FC basal idade depende. Com a técnica de imunoistoquímica de fluorescência, observamos que a VPir é maior em SHR (vs. WKY) durante as 8 semanas de avaliação apenas no PVNmg, no PVNvm e posterior o conteúdo de VP é semelhante entre as duas linhagens em S0 (4 semanas de vida), porém há um aumento significativo e progressivo a partir da S1, apenas em animais SHR. Com os experimentos DAS, observamos a eficácia da cirurgia da remoção dos barorreceptores, devido a ausência da resposta reflexa bradicardica e taquicardia em animais DAS. A DASimpediu o desenvolvimento da hipertensão em animais SHR, assim como houve um bloqueio do aumento de VP em todo PVN medial (mg, vm e dc) e PVN posterior. Conclusão: A observação de que a instalação da bradicardia de repouso (a partir de T4) ocorria após o aumento da densidade de neurônios OTérgicos do PVN que se projetam ao complexo solitário-vagal sugere que alterações induzidas pelo T no controle autonômico do coração são dependentes da maior modulação OTérgica ao complexo solitário-vagal desencadeado pela sinalização NORérgica ascendente. O bloqueio destes efeitos sugere ainda que a sinalização carreada pelos barorreceptores e quimirreceptores periféricos é um fator decisivo em desencadear os efeitos benéficos do T ao sistema cardiovascular. Podemos concluir também que o aumento da PA é acompanhado pelo aumento do conteúdo de VP em áreas que contém neurônios pré-autonômicos, e que os baro e quimiorreceptores desempenham papel chave no desenvolvimento da hipertensão. / Suprabulbar pathways as well as brainstem nuclei are of vital importance in cardiovascular modulation. The afferent information arriving at the NTS ascends to suprabulbar areas by noradrenergic (NORergic) neurons projecting mainly to ocitocinergics (OTergics) and vasopressinergic (VPergicos) pre-autonomic neurons of the Paraventricular Nucleus of Hypothalamus (PVN), which they project to brainstem areas, closing a modulatory circuit. It is our hypothesis that hypertension and / or training may alter the plasticity of ascending NORergic pathways which, by modifying afferent signaling, would trigger plastic and functional responses in pre-autonomic PVN neurons, altering cardiovascular modulation in these situations. Aim: To study the functioning of suprabulbar pathway in autonomic modulation, evaluating the sequential effects of hypertension and training on ascending NORergic signaling and on the plasticity / activity of OTergic and VPergic neurons projecting to cardiovascular control brainstem areas. Methods: Protocol I -Adult Wistar rats were submitted to training (T) of low intensity (50-60% of the maximum capacity, 5 days / week, 1h / day) or were kept in the sententary (S) for 8 weeks. After recording baseline hemodynamics at weeks 0 (S0 and T0), 1 (T1), 2 (T2), 4 (T4) and 8 (T8 and S8) [Time course protocol]; after 8 weeks of T or S [ for protocol of selective lesion of ascending NORergic neurons by saporin]; and after 12 weeks of T or S [for the SHAM & Sino aortic denervation (SAD) protocols] the rats were euthanized for perfusion and fixation of the brain. Slices (30 m) of the PVN were processed for immunohistochemistry double-labelling for OT and dopamine beta-hydroxylase (DBH); images were acquired by fluorescence and confocal microscopy and analyzed by ImageJ and Imaris, respectively. Protocol II - SHR and WKY (4 weeks old at the beginning of protocols) were kept sedentary (S) for 8 weeks. In the experimental weeks 0, 1, 2, 4, 8 we evaluated the functional [parameters baseline arterial pressure (AP) and heart rate (HR)] and immunohistochemistry for VP and DBH; in another protocol, we performed Sham or SAD surgery in SHR and Wistar animals of 41 days. After the 13th week we performed functional studies and immunohistochemical analysis for DBH and VP. Results: Within PVN, there was age-dependent reduction in S group of OT immunoreactivity (ir) all magnocellular (mg), dorsal cap (dc), ventromedial (vm) and posterior (Po) subnuclei, without significant changes in DBHir, and a decrease of OTir in brainstem areas such as DMV, caudal and intermediate NTS, CVLM and RVLM. T induced increase from T2 in the synthesis of DBH in the NTS caudal, intermediate and CVLM, and T induced a decrease in DBH in RVLM. In PVNvm and Po, there was a rapid increase of OTir in T2 vs S0, and DBHir in T2 vs S0, an increase of NORergic synaptic boutons in OTergic neurons and resting bradycardia between T4 and T8, without altering blood pressure. Removal of the baroreceptors decreased the density of the OTergic projections in the NTS intermediate, RVLM and in the PVN mg, dc, vm and Po. Furthermore sino-aortic denervation blocked all training-induced effects, such as increased DBHir in the caudal and intermediate NTS, within caudal and rostral VLM and in the whole PVN (mg, dc, vm and Po) and prevented the increase of OTir in both areas of the brainstem when we compared SAD-T vs. SHAM-T. In the saporin protocol, the marked reduction of the NORergic projections induced a significant decrease in OT synthesis throughout the medial and posterior PVN, and the T was not able to increase the OTir. In the S group on the brainstem areas, we observed that DBHx induced reduction in DBHir and NORergic neurons in the caudal and intermediate NTS and CVLM, but there was no change in RVLM. In the DBHx-T group there was an increase in protein synthesis of DBH in the whole brainstem, with the exception of RVLM. There was a marked reduction of the OTergics projections in every brainstem, but there was no change of OTir in DBHx, and there was no resting bradycardia. In protocol II, WKY and SHR, of 28 days, have similar PA, which increased from S2 only in SHR. SHR animals in the prehypertensive phase already have HR increased, compared with WKY, remaining with higher values until the end of the protocol, in both strain there was a decrease in HR baseline age dependent. With the fluorescence immunohistochemistry technique, we observed that VPir is higher in SHR (vs. WKY) during the 8-week evaluation only in PVNmg, in PVNvm and posterior the VP content is similar between the two strains in S0 (4 weeks of life), but there is a significant and progressive increase from S1, only in SHR animals. With the SAD experiments, we observed the efficacy of baroreceptor removal surgery, due to the absence of bradycardic and tachycardia reflex response in SAD animals. SAD prevented the development of hypertension in SHR animals, as well as a blockade of the increase of VP in all medial PVN (mg, vm and dc) and posterior PVN. Conclusion: The observation that the installation of resting bradycardia (from T4) occurred after increasing the density of PVN OTergic neurons projecting to the solitary-vagal complex suggests that T-induced changes in the autonomic control of the heart are dependent of the greater modulation OTergic to the solitary-vagal complex triggered by ascending NORergic signaling. The blockade of these effects also suggests that the signaling carried by the baroreceptors and peripheral chemoreceptors is a decisive factor in triggering the beneficial effects of T on the cardiovascular system. We can also conclude that increased BP is accompanied by increased VP content in areas containing pre-autonomic neurons, and that baro and chemoreceptors play a key role in the development of hypertension.

Vários estudos clínicos e experimentais relatam o aumento das concentrações plasmáticas de vasopressina (AVP) na fase inicial da sepse, como tentativa de restabelecer a pressão sanguínea que nesta fase começa a diminuir. Porém em uma fase mais tardia da doença, as concentrações do hormônio estão reduzidas mesmo sob um quadro de hipotensão progressiva, um dos principais estímulos para aumento da secreção deste hormônio. Este padrão de secreção hormonal alterada também parece ocorrer com o outro hormônio neurohipofisário, ocitocina (OT). O objetivo deste trabalho foi analisar a secreção dos hormônios AVP e OT, após estímulos osmótico e hipovolêmico em animais sobreviventes à sepse. A sepse foi induzida pelo método de ligação cecal e punção (CLP) (1 perfuração com agulha 14G) e os animais observados por 10 dias. Os sobreviventes foram submetidos à estímulo osmótico por desidratação (retirada de água para beber da gaiola) por dois dias, ou hipovolêmico por injeção intraperitoneal (i.p) de Polietileno glicol (PEG) (PEG-4000, 200mg/ml de PBS) por 90 minutos. Os animais controles foram hidratados ou receberam injeção intraperitoneal de PBS 0,01M. Após os estímulos, os animais foram decapitados para coleta de sangue e neurohipófise, para as análises de hematócrito, sódio sérico, osmolalidade plasmática, e dosagem hormonal de AVP e OT plasmática e neurohipofisária. Resultados: Os animais sobreviventes à sepse mantiveram a capacidade de responder aos estímulos com relação à secreção de AVP. Porém estes animais apresentaram uma secreção diminuída de OT após desidratação embora nenhuma alteração de secreção aparente ao estímulo volêmico. Conclusão: Animais sobreviventes à sepse apresentam alterações no padrão de resposta hormonal do eixo hipotálamoneurohipofisário ao estímulo osmótico sem aparente alteração quando o estímulo é volêmico, sugerindo que seus osmorreceptores encontram-se alterados / Many clinical and experimental studies reported the increase of plasma vasopressin (AVP) concentration in the early phase of sepsis, as an attempt to restore blood pressure that begins to decrease at this stage. However, in a later stage of the disease, the hormone concentrations are reduced even under a state of progressive hypotension, one of the major stimulus for the increase of secretion of this hormone. This pattern of impaired hormonal secretion during sepsis also seems to happen to the other pituitary hormone, oxytocin (OT). The aim of this study was to evaluate the secretion of the hormones AVP and OT after osmotic and hipovolemic stimuli in sepsis surviving animals. Sepsis was induced by cecal ligation and perforation (CLP) (1 perforation with 14G needle) and the animals observed for 10 days. The survivors were submited to osmotic stimulus by dehydration (privation of drinking water from the Cage) for two days, or hipovolemic by intraperitoneal (i.p) injection of polyethylene glycol (PEG) (PEG-4000, 200mg/ml of PBS) for 90 minutes. The control animals were hydrated or that received intraperitoneal injection of PBS 0,01M. After the stimuli, the animals were decapitated for the collection of blood and neurohypophysis, for the analysis of hematocrit, serum sodium, plasma osmolality and hormonal analysis of AVP and OT in the plasma and neurohypophysis. Results: Sepsis surviving animals maintained the capacity of answering the stimulus with AVP secretion. But these animals presented a lowered secretion of OT after dehydration, while they presented no alterations in secretion after volemic stimulus. Conclusion: Sepsis surviving animals presented alterations in the pattern of hormonal answer for the osmotic stimulus, with lowered secretion of OT, apparently there are no alterations in the pattern of a hormonal secretion after hypovolemia.

Os efeitos dos canabinoides em algumas áreas encefálicas que expressam receptores endocanabinoides, como é o caso dos núcleos hipotalâmicos, não são ainda muito bem definidos. Vários estudos têm demonstrado o papel de alguns núcleos hipotalâmicos na organização das reações induzidas pelo medo inato e pelo pânico. As respostas de defesa induzidas pelo medo instintivo caracterizam-se por serem mais elaboradas e dirigidas para algum abrigo ou rota de fuga. O estado de pânico pode ser provocado experimentalmente em animais de laboratório através da diminuição da atividade do sistema GABAérgico. O objetivo deste trabalho foi estudar os padrões comportamentais de fuga elaborada induzidos pelo bloqueio de receptores GABAérgicos do tipo A, com microinjeções intra-hipotalâmicas de bicuculina (BIC), especificamente na divisão dorso-medial do hipotálamo ventro-medial (VMHDM), assim como estabelecer o envolvimento endocanabinoides e o papel do receptor canabinoide do tipo 1 (CB1) na modulação das respostas defensivas organizadas pelo hipotálamo medial. Os resultados mostraram que a administração prévia de doses intermediárias (5pmol) de anandamida (AEA) atenuaram as respostas defensivas induzidas pela microinjeção intra-VMHDM de bicuculina (40ng), efeito este prevenido pelo pré-tratamento intra-hipotalâmica com antagonista de receptores CB1. Os resultados indicam que a AEA pode modular os efeitos pró-aversivos da bicuculina no VMHDM por meio do recrutamento de receptores CB1. / The effects of cannabinoids in some brain areas that express endocannabinoid receptors, such as some hypothalamic nuclei, are not yet well known. Several studies have demonstrated a role of hypothalamic nuclei in the organisation of behavioural responses induced by innate fear and panic attacks. The defensive responses induced by instinctive fear are more elaborated and oriented toward a burrow or alternative route of escape. Panic-prone states are able to be experimentally induced in laboratory animals decreasing the GABAergic system activity. The aim of this work was to study panic-like elaborated defensive behaviour evoked by GABAA receptor blockade with bicuculline (BIC) in the dorsomedial division of the ventromedial hypothalamus (VMHDM), we also aimed to establish the involvement of endocannabinoids and the role of CB1 cannabinoid receptor in the modulation of elaborated defense behavioural responses organised by medial hypothalamus. The results showed that intra-hypothalamic administration of anandamide (AEA) at the intermediate dose (5pmol) attenuated defensive responses induced by intra-VMHDM microinjection of bicuculline (40ng). This effect, however, was prevented by the pre-treatment of VMHDM with the CB1 receptor antagonist AM251. These results indicate that AEA can modulate the pro-aversive effects of bicuculline into the VMHDM, recruiting CB1 receptors.

Este estudo experimental avaliou o efeito neuronal e comportamental da administração de dois esteroides anabolizantes androgênicos (EAA), Deposteron® (Cipionato de Testosterona) e Winstrol Depot® (Stanozolol), utilizados indiscriminadamente em academias em doses supra-fisiológicas. Através de extrapolação alométrica, doses foram administradas por via intraperitoneal (IP), 0,8mg/kg/dia de Deposteron® e 1,8mg/kg/dia de Winstrol Depot®, em camundongos machos e fêmeas da linhagem Swiss, estes foram comparados com animais controle tratados com solução salina (0,04mL). Os animais foram submetidos à natação durante o período do experimento, simulando uma possível atividade física. Através da análise de estimativa da densidade dos perfis de corpos celulares de neurônios, este estudo mostrou-se estatisticamente significativo, quanto à redução do número de corpos celulares neuronais, no hipotálamo lateral de machos e fêmeas, e na amígdala central de fêmeas, após administração de EAA, indicativo de que esses dois EAA podem gerar danos neuronais, prejudicando funções desempenhadas por estas estruturas cerebrais. As análises de comportamento agressivo foram realizadas pelo paradigma residente-intruso e não se mostraram estatisticamente significativas, entretanto todos os animais residentes tratados mostraram comportamento agressivo, além de uma postura submissa e neutra dos animais intrusos, em contrapartida, a uma postura dominante dos animais residentes. Contudo, este estudo apresenta grande relevância científica, devido à falta de estudos morfológicos quantitativos acerca dos EAA, mostrando que a uso abusivo de EAA levam a perda neuronal, e consequente perda de atividade, entretanto, mais estudos se fazem necessários, devido às controvérsias quanto à relação entre o uso de EAA e comportamento agressivo. / This experimental study evaluated the behavioral and neuronal effect of two Anabolic-Androgenic Steroids (AAS) administration, testosterone cypionate (Deposteron®) and stanozolol (Winstrol Depot®), which are indistinguishably used by gym customers in hyperphysiologic doses. Usingallometric extrapolation, intraperitoneal (IP) daily doses of 0.8mg/kgDeposteron® and 1.8mg/kg Winstrol Depot® were administered to male and female Swiss mice, in comparison to a control group treated with daily 0.04ml saline solution. All animals were submitted to swimming exercise during experiment time in order to simulate physical activity. By means of estimated profile analyses of neuron cell bodies density, results showed statistically significant decrease of neuron cell bodies number in lateral hypothalamus area of both male and female animalsaswell as in central amygdaloid area of female ones after AAS administration. The outcomes indicated that these two AAS can generate neuronal damage and impaired functions in these brain structures. Aggressive behavioral tests analyses were performed by resident-intruder paradigm and proved to be no statistically significant. Nevertheless, all resident-treated animals displayed an aggressive behavior; in contrast to a dominant attitude of resident animals, intruder ones presented themselves with a compliant and neutral attitude. For all that, we believe this study to be scientificallyimportant due to the scarcity of quantitative morphologic researches concerning AAS and it alsoshows that AAS abuse lead to neuronal loss and consequent activity impairment. In our opinion, further studies are necessary because of controversies about AAS use and aggressive behavior relationship.

Neste trabalho elaboramos um paradigma para estudar os comportamentos de defesa ao contexto de uma derrota social e as estruturas neurais envolvidas nas respostas de defesa do animal derrotado utilizando imunohistoquímica para proteína Fos. Utilizou-se um aparato que consistia de uma caixa moradia ligada a outra caixa por um corredor. Houve uma habituação de 10 dias a esse aparato, com a outra caixa contendo apenas maravalha limpa. No 11º dia o animal foi exposto a um macho agressivo colocado na outra caixa, e derrotado por ele. Vinte e quatro horas após a derrota social, os animais derrotados foram expostos ao ambiente em que ocorreu a derrota. Eles apresentaram comportamentos de defesa tanto durante a derrota social quanto durante a exposição ao contexto. No contexto, os derrotados apresentaram comportamentos de avaliação de risco e os controles exploraram livremente o aparato. Notamos um aumento na expressão de proteína Fos no MEApd na amígdala, no LSr no septo lateral, no circuito sexualmente responsivo do hipotálamo medial, na LHAjd no hipotálamo, e no PMD. / We investigated the neural systems involved in the contextual defense to a social defeat. We established a protocol to observe contextual defensive responses in animals previously defeated by an aggressive conspecific: animals were kept ten days living in a apparatus composed by two cages (room and resident cages). On the 11th day animals were exposed to an aggressive conspecific and defeated by it. On the following day, animals were exposed to the apparatus. These defeated animals presented defensive responses, characterized by risk assessment behaviors. Increased Fos expression was found in MEApd, LSr, elements of the social responsive medial hypothalamic circuit, the juxtadorsal part of the lateral hypothalamic area and the dorsal premammillary nucleus (PDMdm). The data allowed us to outline a putative circuit involved in the expression of contextual defense to social defeat, and indicates that both innate and contextual defense to social threat apparently share the same neural circuits.

A área incerto-hipotalâmica (IHy) é uma região diencefálica que atua em funções reprodutivas através da presença do hormônio concentrador de melanina (MCH). Nosso objetivo é estudar as conexões da IHy de fêmeas com áreas relacionadas ao controle neuroendócrino reprodutivo, usando traçador anterógrado dextrana amina biotinilada (BDA) e retrógrado Fluorogold (FG). Nesse sentido, destacamos que a IHy, em fêmeas, conecta-se reciprocamente com diversos núcleos hipotalâmicos da região periventricular e pré-óptica, além das áreas hipotalâmica anterior, posterior e lateral. Nosso resultados também sugerem um dimorfismo sexual das projeções da IHy, já que a área pré-óptica medial, o núcleo anteroventral periventrciular e o núcleo arqueado são mais densamente inervadas pelas IHy em fêmeas do que em machos. / The incerto-hypothalamic area (IHy) is a diencephalic region poorly studied which is characterized by two non-colocalized neurochemical groups composed by the A13 dopaminergic group intermingled with predominantly GABAergic cells co-expressing melanin-concentrating hormone (MCH) and/or cocaine and amphetamine regulated transcript (CART). Functional studies suggest that IHy is involved in the neuroendocrine control of female reproduction in specific metabolic states mediated by MCH. In this way, our aim is to study the IHy connections in female rats related to neuroendocrine control of female reproduction using neuronal anterograde Biotin Dextran Amine (BDA) and retrograde Flurogold (FG) tracers. As a result, we found that IHy projections are the lateral septal nucleus, bed nucleus of stria terminalis, paraventricular thalamic nucleus, reuniens thalamic nucleus, medial preoptic area, medial and lateral preoptic nucleus, median preoptic nucleus, periventricular hypothalamic nucleus, anteroventral periventricular nucleus, anterior, posterior and lateral hypothalamic area and precommissural nucleus. The main afferents to the IHy, in females, are the lateral septal nucleus, median preoptic nucleus and paraventricular thalamic nucleus. These results suggest sexually dimorphic projections from the IHy, since IHy more densely innervates neuroendocrine regions in female than in male rats.

A avicultura brasileira tem alcançado altos índices de desempenho na produção de carne e ovos, como resultado da atualização constante de tecnologias no setor. A biotecnologia vem contribuindo nesse sentido, atuando especialmente em programas de seleção de animais com maior potencial de desenvolvimento e crescimento. Como toda a fisiologia animal é controlada direta e/ou indiretamente pela hipófise e hipotálamo, este trabalho propôs identificar e analisar genes expressos nestas estruturas de galinhas de duas linhagens divergentes quanto ao potencial de crescimento e avaliar a expressão dos genes correspondentes a transcritos cuja identidade não pôde ser revelada (sem similar nos bacos de dados), uma vez que estes podem representar possíveis genes novos. Para isto, foram construídas e analisadas bibliotecas a partir da hipófise e hipotálamo de aves de 21 dias de idade de uma linha macho de corte (TT) e uma linhagem de postura (CC), provenientes da Embrapa Suínos e Aves. Um total de 4.286 ESTs válidas foi obtido (no mínimo150 pb com qualidade PHRED acima de 20), correspondendo a 2.133 ESTs da biblioteca da linhagem TT e 2.153 ESTs da biblioteca da linhagem CC. O exercício de montagem, via programa Cap3, revelou 3.074 seqüências únicas, sendo 1.643 da biblioteca da linhagem TT e 1.649 da CC. Estas seqüências únicas foram automaticamente classificadas, de acordo com as categorias do GeneOntology, sendo que as seqüências de ambas as bibliotecas apresentaram uma distribuição similar entre os termos. Após montagem das ESTs e análise do padrão de expressão digital das seqüências constituintes, dos 389 contigs obtidos, 194 foram compostos por seqüências diferencialmente expressas entre as bibliotecas. Foram detectados 28 contigs contendo SNPs linhagem específicos, sendo 52 SNPs TT específicos e 25 CC específicos. Um total de 146 ESTs não pôde ter sua identidade revelada, porém destas, 133 puderam ser localizadas no genoma da galinha e apresentaram pelo menos uma fase de leitura aberta (ORF). Após análise de expressão gênica, os genes correspondentes a 78 destas ESTs sem identidade apresentaram-se diferencialmente expressos entre pelo menos dois dos tecidos de aves de uma linhagem comercial de corte de 21 dias de idade estudados: hipófise, hipotálamo, cérebro, fígado e músculo. Os resultados apresentados são promissores e merecem ser investigados em estudos futuros com o objetivo de identificar marcadores moleculares para programas de seleção e melhoramento animal. / The brazilian aviculture has reached a high development level in both meat and egg production as a result of constant technological atualization in the sector. Biotechnology can contribute in this way acting in selection programs of animals that show higher growth and development potential. The global animal physiology is direct or indirectly controlled by pituitary and hypothalamus. The aim of this work was to identify and analyse genes expressed in these structures of two divergent line chickens according to growth potential and evaluate the gene expression of corresponding transcripts classified as "no hit", once these ESTs could represent new genes. In this way, two pituitary and hypothalamus libraries of 21 days broiler (TT) and a layer (CC) chickens supplied by Embrapa Swine and Poultry National Research Center were constructed and analysed. A total of 4,286 valid ESTs was obtained (showing at least 150 bp with PHRED quality above 20) corresponding to 2,133 ESTs of TT line library and 2,153 ESTs of CC line library. The clustering process by Cap3 resulted in 3,074 unique sequences corresponding to 1,643 TT library sequences and 1,649 of CC sequences. These unique sequences were automatically annotated according GeneOntology categories and both library sequences showed a similar distribution between the terms. After ESTs clustering and northern digital analysis, 389 contigs were obtained – 194 of them showed differentially expressed sequences between the libraries. A total of 28 contigs showed line specific SNPs, corresponding to 52 TT specific SNPs and 25 CC specific SNPs. 146 ESTs were classified as "no hit" but 133 of these sequences were localized in chicken genome and showed open reading frame (ORF). After gene expression analysis, the genes of 78 "no hit" ESTs showed different expression level between the five tissues of commercial broilers with 21 days old: pituitary, hypothalamus, brain, liver and muscle. These results are promising and must be more investigated in future studies to identify molecular markers for use in animal selection and improvement programs.

Investigou-se o efeito da leptina exógena e do maior consumo de energia, sobre o padrão da expressão de genes no hipotálamo de novilhas zebuínas; de modo a elucidar o mecanismo de sinalização da leptina no hipotálamo e os genes responsáveis pela obtenção da puberdade. Trinta e seis novilhas não púberes, e com idade entre 18 e 20 meses, foram divididas em três grupos experimentais: baixa energia (BAIXA), alta energia (ALTA), baixa energia com administração de leptina recombinante ovina (BAIXA+LEP), totalizando 56 dias de tratamento. Vinte e quatro novilhas foram abatidas ao apresentar sinais de puberdade, sendo eles: concentração de progesterona no soro superior a 1 ng/mL por duas amostras seguidas e presença de corpo lúteo detectável por ultra-sonografia. O hipotálamo foi colhido e armazenado a -80ºC. As amostras foram submetidas à extração do RNA total, tratadas com DNAse I e submetidas à síntese de cDNA. A quantificação relativa de quatro genes candidatos reconhecidamente envolvidos com a sinalização hipotalâmica da leptina em bovinos: NPY, NPY-Y1, NPY-Y4 e SOCS-3, foi feita através de PCR quantitativo (tempo real). Não houve efeito da administração de leptina sobre a expressão do NPY (P=0,70), ou de seus receptores: NPY-Y1 (P=0,27) e NPY-Y4 (P=0,92) no início da puberdade. A expressão de SOCS-3 foi reduzida (P=0,05) no hipotálamo de novilhas tratadas com leptina, o que sugere menor ação inibitória sobre a leptina. Em novilhas alimentadas com dieta de alta energia, a expressão do NPY-Y1 foi reduzida (P=0,04), o que indica que o hipotálamo estaria menos sensível à ação do NPY, permitindo a entrada precoce em puberdade. Nos demais genes estudados, NPY (P=0,75), NPY-Y4 (P=0,92) e SOCS-3 (P=0,24), a dieta não alterou significativamente suas expressões hipotalâmicas. Estudo mais abrangente do efeito da nutrição e da administração de leptina foi realizado através de hibridização em microarranjos de DNA, objetivando a identificação de possíveis genes candidatos, expressos no hipotálamo, que influenciam na obtenção da puberdade em novilhas Nelore tratadas com leptina ou submetidas à dieta de alta energia. Foram encontrados 78 genes cuja expressão foi alterada pela densidade energética da dieta (P=0,05) no hipotálamo das novilhas Nelore, destes foram selecionados os que apresentaram razões de expressão da ordem de 1,4 ou mais, totalizando 20 genes. Entre esses se destaca o gene da &beta;-arrestina 1 (ARRB1), que foi 1,40 vezes mais expresso (P=0,04) em novilhas submetidas à dieta de alta energia, pois atua na mediação da dessensibilização dos receptores acoplados à proteína-G-(GPCRs)1, como os receptores de NPY. Foram encontrados 134 genes diferencialmente expressos (P=0,05) devido a aplicação de leptina. Dentre os 80 genes que apresentaram razões superiores a 1,4, 18 genes tiveram a expressão reduzida, e 62 tiveram a expressão aumentada pela aplicação de leptina. Destes, alguns estão envolvidos na regulação da sinalização da leptina. O gene SRC foi menos expresso (1,64 vezes; P=0,04) em novilhas tratadas com leptina, o que sugere menor ação inibitória pela SHP-2. A proteína SOCS-2 foi 1,43 vezes (P=0,01) mais expressa no hipotálamo de novilhas tratadas com leptina. Sabe-se que, ao contrário de SOCS-1 e SOCS-3, CIS e SOCS-2 não se ligam, ou inibem, as janus kinases. O STAT-3 foi 2,14 vezes (P=0,03) mais expresso em novilhas tratadas com leptina, e sua ativação possibilita a ligação hipotalâmica da leptina com seu receptor (Ob-Rb). As IGFPB-1 e -2 foram mais expressas no hipotálamo de novilhas tratadas com leptina que em novilhas não tratadas, sendo IGFPB-1 1,78 vezes (P=0,04) mais expressa e IGFPB-2 1,89 vezes (P=0,05). As IGFPBs podem desempenhar função de potencialização da ação do IGF-1, ou exercer ação inibitória. Conclui-se que tanto o consumo de energia quanto a aplicação com leptina influenciaram o padrão de expressão gênica no hipotálamo de novilhas Nelore. A modulação da quantidade do receptor do NPY, NPY-Y1, no hipotálamo pode ser uma via importante pela qual a nutrição afeta o início da puberdade em novilhas. E ainda que estudos mais aprofundados de expressão dos genes encontrados nas hibridizações por microarranjo poderão revelar interações mais concisas entre os genes, a nutrição e a leptina na obtenção da puberdade. / It was investigated the effect of exogenous leptin and the high energy intake on gene expression pattern in the hypothalamus of zebuine heifers; in a way to elucidate the mechanism of leptin signaling in hypothalamus and the responsible genes for puberty. Thirty six heifers not in puberty at 18 and 20 months of age were divided in three experimental groups: low energy diet (LOW), high energy diet (HIGH), low energy diet with administration of recombinant ovine leptin (LOW+LEP), totalizing 56 days of treatment. Twenty four heifers were slaughtered when presented the signals of puberty: progesterone serum concentration above 1 ng/mL for two followed weeks and the presence of detectable corpus luteum by ultrasonography. The hypothalamus was collected and stored at -80ºC. Samples were submitted to total RNA extraction, treated with DNAse I and submitted to cDNA synthesis. The relative quantification of four candidate genes admittedly involved with hypothalamic leptin signaling in bovine: NPY, NPY-Y1, NPY-Y4 and SOCS-3, was evaluated through quantitative PCR (real time). There was no effect of leptin administration on NPY expression (P=0.70), or on its receptors: NPY-Y1 (P=0.27) and NPY-Y4 (P=0.92) in the onset of puberty. The expression of SOCS-3 was reduced (P=0.05) in the hypothalamus of heifers treated with leptin, what suggests lower inhibitory action over leptin. In heifers fed high energy diets, the expression of NPY-Y1 was reduced (P=0.04), which indicates that the hypothalamus would be less sensitive to the action of NPY, allowing the precocious onset of puberty. In other studied genes, NPY (P=0.75), NPY-Y4 (P=0.92) and SOCS-3 (P=0.24), the diet did not significantly altered their hypothalamic expressions. A more comprehensive study regarding the effect of nutrition and leptin administration was performed through the hybridization in DNA microarrangements, aiming the identification of possible candidate genes, expressed in hypothalamus that influence in the onset of puberty in Nelore heifers treated with leptin or submitted to high energy diets. It was found 78 genes whose expression was altered by the energy density of the diet (P<0.05) in the hypothalamus of Nelore heifers. From them, it was selected those genes which presented rates of expression in the order of 1.4 or more, totalizing 20 genes. From them, the highlight gene was &beta;-arrestin 1 (ARRB1) which was 1.40 more expressed (P=0.04) in heifers fed high energy diet due to its action in the mediation of receptors desensibilization coupled to protein-G-(GPCRs)1, as the receptors of NPY. It was found 134 genes differently expressed (P<0.05) due to leptin administration. From the 80 genes that presented rates of expression higher than 1.4, 18 genes had their expression reduced and 62 had their expression increased by leptin administration. Some of these 62 genes are involved in the regulation of leptin signaling. The gene SRC was the less expressed (1.64 times; P=0.04) in heifers treated with leptin what suggests lower inhibitory action by SHP-2. The protein SOCS-2 was 1.43 times (P=0.01) more expressed in the hypothalamus of heifers treated with leptin. It is known that on the contrary of SOCS-1 and SOCS-3, CIS and SOCS-2 do not bind or inhibit, as janus kinases. The STAT-3 was 2.14 times (P=0.03) more expressed in heifers treated with leptin and its activation enables the hypothalamic binding of leptin and its receptor (Ob-Rb). The IGFPB-1 and -2 were more expressed in the hypothalamus of heifers treated with leptin than the animals not treated, being the IGFPB-1 1.78 times (P=0.04) more expressed and the IGFPB-2 1.89 times (P=0.05). The IGFPBs could play a function of IGF-1 action enhancer or exert an inhibitory action. It is concluded that both energy intake and leptin administration influenced gene expression pattern in the hypothalamus of Nelore heifers. The modulation of the receptor quantity of NPY, NPY-Y1 in hypothalamus could be an important route in which nutrition affects the onset of puberty in heifers. Moreover, more detailed studies regarding gene expression in hybridization by microarrangement could reveal more concise interactions between genes, nutrition and leptin in the onset of puberty.

O período neonatal é considerado uma janela de vulnerabilidade a alterações fisiológicas e comportamentais no decorrer da ontogenia. Modificações ambientais nessa fase podem predispor o indivíduo a transtornos, como o déficit de atenção com hiperatividade (TDAH), abusos de substâncias psicoativas e transtornos alimentares. Modelos animais que mimetizem intervenções nessa fase são relevantes cientificamente. A manipulação neonatal (MN) é um desses modelos, em que breves separações entre a mãe e a ninhada são realizadas durante as primeiras duas semanas de vida (1º-10º dia de vida) por 10 minutos diários. No decurso do período neonatal, o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) trabalha de maneira distinta da fase embrionária, levando ao assim denominado período hiporresponsivo ao estresse, com menores liberações de corticosterona e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Estudos apontam que a MN induz uma modulação a longo prazo sobre o eixo HPA, diminuindo a reatividade a eventos estressores e modificando alguns comportamentos na vida adulta. O objetivo central da presente tese foi avaliar comportamentos executivos e possíveis alterações neuroquímicas no córtex pré-frontal medial vento-medial de ratos manipulados no período neonatal. Os resultados mostraram-se sexo-específicos, pois animais machos manipulados no período neonatal mostraram-se mais impulsivos na vida adulta, apresentando também alterações na atenção e na flexibilidade cognitiva. Além disso, a responssividade ao fármaco metilfenidato (Ritalina®) nesse grupo foi encontrada diminuída. Com referência ao controle inibitório comportamental, mediante a tarefa de tolerância ao atraso da recompensa, a impulsividade foi observada apenas em animais machos e manipulados no período neonatal, e esta alteração não foi revertida pelo fármaco metilfenidato. Contudo ao analisar os níveis das aminas biogênicas, dopamina e serotonina e seus metabólitos 3,4-ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA) e 5-ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) e noradrenalina, não se verificou modificação em relação aos grupos experimentais, entretanto, fêmeas tiveram concentrações maiores de DOPAC que os machos. Em relação à atenção e à flexibilidade cognitiva em machos, verificou-se no teste de deslocamento da atenção (TDA) um pior desempenho dos animais manipulados nas associações simples e na mudança intradimensional; entretanto, com melhora na extradimensional. A respeito das análises neuroquímicas no CPFvm, observou-se diminuição da atividade da enzima Na+/K+-ATPase e do imunoconteúdo da proteína sinaptofisina. Não houve alterações, contudo, nos imunoconteúdos de tirosina hidroxilase (TH) e sua forma fosforilada (THf), e nos níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF). Ao observar a flexibilidade cognitiva e a atenção, os resultados indicaram pior desempenho na tarefa do deslocamento da atenção apenas em fêmeas do grupo MN, na discriminação de reversão. Juntamente com esses parâmetros, a atividade da enzima Na+/K+-ATPase foi encontrada diminuída em CPFvm no grupo MN. Tendo em vista os resultados desta tese, percebe-se que a manipulação neonatal em ratos altera alguns comportamentos cognitivos de forma distinta entre os sexos: provoca a diminuição do controle inibitório e resposta ao metilfenidato em machos; e modifica a atenção e flexibilidade cognitiva em ambos os sexos, com maior volume de alterações em machos. Coube a esta tese considerar que, breves separações entre a mãe e os filhotes no período neonatal provocam diferentes consequências cognitivo-comportamentais na vida adulta da prole, e isto é dependente do sexo. Com isso, pôde-se concluir que, a fase neonatal é um momento vulnerável a influências ambientais, e estas produzem múltiplos desfechos comportamentais ao longo da vida. / The neonatal period is considered a vulnerability window to physiological and behavioral alterations during ontogeny. Enviromental modifications in this period may predispose the individual to disorders as attention defficit hyperactivity disorder (ADHD), psicoative substance abuse, and eating disorder. Animal models which mimic interventions in this phase are scientifically relevant. Neonatal handling (NH) is one of these models: brief separations between the mother and the litters are made during the first two weeks of life (1st-10th day of life) for 10 minutes daily. During the neonatal period, the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis works differently from the embrionary phase, resulting in a stress hiporresponsive period, with a less release of corticosterone and adrenocorticotropic hormone (ACTH). Studies show that NH induces a long-term modulation on HPA axis, decreasing its reactivity to stressors in adult life. The main objective of this thesis was to evaluate executive behaviors and possible neurochemical alterations in the medial ventro-medial prefrontal cortex of rats handled in the neonatal period. The results were sex-specific, because neonatal handled male animals showed more impulsive behavior in adult life, also presenting modifications in attention and cognitive fexibility. Furthermore, the responsiveness to methilphenidate (Ritalina®) in this group was decreased. In relation to behavioral inhibitory control by tolerance to delay of reward task, the impulsivity was observed only in male handled animals, and it was not reversed by methilphenidate. However, when biogenic amines (dopamine and serotonin and their metabolites 3,4-dihidroxidphenilacetic acid (DOPAC), homovanilic acid (HVA), 5-hidroxy-indol-acetic acid (5-HIAA), and noradrenaline) were measured, their levels were not modified, though females showed increased concentrations of DOPAC compared to males. In relation to attention and cognitive flexibility in males, we verified a reduced performance of the neonatal handled group in the attentional set shifting task, both in simple associations and intradimensional shifts, despite an improvement in extradimensional shift. The neurochemical analysis in PFCvm showed a decrease in the activity of Na+/K+-ATPase, and in the immunocontent of synaptophysin. There were no alterations in the immunocontent of tyrosine hydroxylase (TH) or its phospholitated form (pTH), and no difference was observed in the levels of brain derived neurotrophic factor (BDNF). When studying cognitive flexibility and attention in attentional set shifting task in females, the results indicated a decreased performance in reverse discrimination in the NH group. Additionally, the activity of Na+/K+-ATPase enzyme was found decreased in PFCvm in NH group. Thus, the results of this thesis show that neonatal handling in rats alter, in a distinct form, cognitive behaviors between sexes: Provoke a decrease of inhibitory behavior and together the response to methilphenidate in males; and addictionally modifies attention and cognitive flexibility in both sexes, with more alterations in males. Therefore, this thesis considered that briefly separations between dam and pups in the neonatal period provoke differents behavioral cognitive consequences in adult life of litters, and this subject depend on sex. Thus, we can conclude that neonatal period is a vulnerable moment to enviromental influences, and these features produce multiple behavior outcomes along life.

O hipotálamo é uma região cerebral fundamental na detecção e na integração de sinais nutricionais e hormonais da periferia, proporcionando mudanças fisiológicas adequadas para a manutenção da homeostase energética, além de estar envolvido em outras funções essenciais aos organismos, tais como a regulação do balanço energético, da temperatura corporal, do ritmo circadiano e da reprodução. O hipotálamo também é uma estrutura crucial durante o envelhecimento, em virtude do papel dominante que desempenha no organismo e, considerando-se o aumento da expectativa de vida da população mundial, entender as alterações ocorridas nesta região cerebral pode ajudar a elucidar mecanismos patofisiológicos de doenças neurometabólicas, bem como levar a uma melhora na qualidade de vida dos indivíduos. Os astrócitos hipotalâmicos desempenham várias funções que podem afetar diretamente a homeostase energética, pois estas células estão envolvidas na detecção e no transporte de nutrientes, e expressam receptores para hormônios metabólicos e neuropeptídios, podendo modular a atividade dos neurônios responsáveis pelo controle do apetite e saciedade. Além disso, este tipo celular participa da resposta inflamatória na região hipotalâmica, podendo levar à resistência à leptina e à intolerância à glicose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar as características morfofuncionais de culturas primárias de astrócitos hipotalâmicos de ratos Wistar recém-nascidos, adultos e envelhecidos (1-2 dias, 90 dias e 180 dias, respectivamente). Foram observadas alterações idade-dependentes na regulação da homeostase glutamatérgica, biossíntese da glutationa, perfil de aminoácidos, metabolismo da glicose, suporte trófico, resposta inflamatória e sensibilidade à leptina. Além disso, verificou-se que importantes vias de sinalização, tais como Nrf-2/HO-1, p38 MAPK, NFκB, COX-2, iNOS e PI3K/Akt, apresentaram alterações com o passar da idade. Portanto, este estudo evidencia que a capacidade homeostática dos astrócitos hipotalâmicos se mostra alterada ao longo do processo de envelhecimento e que, consequentemente, estas células podem estar envolvidas no desenvolvimento de distúrbios metabólicos, tornando-se alvos terapêuticos em potencial. / The hypothalamus is a fundamental brain region in the detection and integration of nutritional and hormonal signals from the periphery, providing adequate physiological changes to maintain energy homeostasis, besides being involved in other essential functions to the organisms, such as: energy balance, temperature, circadian rythm and reproduction. Additionally, the hypothalamus is crucial in the aging process, due its neurometabolic role, and considering the extending human life span, understanding the changes in this brain region might contribute to elucidate the patho(phisio)logical mechanisms of neurometabolic diseases, as well as might improve the healthy of individuals. Hypothalamic astrocytes perform various functions that may directly affect energy homeostasis, since these cells are involved in the detection and transport of nutrients, and express receptors for metabolic hormones and neuropeptides, thus modulating the activity of neurons responsible for controlling appetite and satiety. In addition, these cells participate in the inflammatory response in the hypothalamic region, and may lead to leptin resistance and glucose intolerance. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphofunctional properties of primary cultures of hypothalamic astrocytes from newborn, adult and aged Wistar rats (1-2 days, 90 days and 180 days, respectively). Age-dependent changes in the regulation of glutamatergic homeostasis, glutathione biosynthesis, amino acid profile, glucose metabolism, trophic support, inflammatory response and leptin sensitivity were observed. Furthermore, important signaling pathways, such as Nrf-2/HO-1, p38 MAPK, NFκB, COX-2, iNOS and PI3K/Akt, changed with age. Therefore, this study showed that the homeostatic capacity of hypothalamic astrocytes is altered throughout the aging process and that, consequently, these cells may be involved in metabolic disorders, becoming potential therapeutic targets.