La presente tesis doctoral se estructura en un total de seis capítulos. En el primer capítulo se presenta la motivación de este trabajo y se expone la estructura de la investigación, las hipótesis y los objetivos más relevantes. Además, se comentan de forma breve las conclusiones que se derivan de cada uno de los capítulos y los antecedentes de investigación que el doctorando ha llevado a cabo hasta la fecha, incluyendo artículos, participación en congresos y seminarios, y el trabajo en proyectos de investigación, entre otros. En el Capítulo II se realiza una aproximación a la teoría de la economía de la innovación, estudiando la aportación de los autores más relevantes, como Joseph A. Schumpeter, Paul Romer, Robert Solow o Robert Lucas, entre otros muchos. En él se establece la que será la base teórica para el conjunto de la tesis, dado que son los fundamentos teóricos de estos autores los que permiten entender la relevancia de la tecnología en el desarrollo económico. Sin comprender por qué la disrupción tecnológica es capaz de provocar un verdadero salto cualitativo y cuantitativo en nuestro tejido productivo, pero también en la propia teoría económica, no podríamos explicar las transformaciones que están teniendo lugar en nuestra sociedad, ni el impacto macroeconómico esperado de la inteligencia artificial (IA) en una mayor fase de desarrollo. En el Capítulo III, tras exponer las medidas y estrategias de las principales potencias económicas en el campo de la IA, realizamos nuestra primera aproximación aplicada. En concreto, llevamos a cabo un análisis sobre el grado de preparación para la adopción de la IA por parte de un conjunto de países, lo que nos conduce a generar un índice multivariable en el que se tiene en cuenta diferentes dimensiones como el capital físico y el entorno, el capital humano y el capital organizativo y social. Ello nos permite conocer qué países están mejor posicionados para liderar la era de la IA. Además, en este primer ejercicio, se ha trabajado sobre un conjunto de factores amplio, muchos de los cuales son usados por primera vez en esta tesis. La metodología Borda Condorcet es empleada para dar robustez a los resultados obtenidos, en los que se comparan las economías europeas más destacadas con países asiáticos y otras potencias occidentales como Estados Unidos (EE.UU.), Canadá o Australia. Los resultados obtenidos con nuestro estudio nos permiten identificar el liderazgo relativo de Asia en lo que respecta a su capacidad de transformación socioeconómica presente y futura en base a la IA. Además, al realizar varias técnicas de análisis comparado, podemos identificar cómo las variables utilizadas condicionan la posición de cada uno de los países analizados, permitiéndonos identificar las principales fortalezas y debilidades de cada uno de ellos. En el Capítulo IV se realiza un análisis sobre si el grado de despliegue de la IA en los países europeos es suficiente como para reflejar el impacto de esta tecnología en su desarrollo económico. Empleando variables similares a las del Capítulo III e incorporando más variables relacionadas con el ecosistema IA, se contrasta si el grado de implantación de la IA tiene un reflejo en factores como el empleo, la productividad, el reparto de la riqueza o el índice de desarrollo humano. Para ello se emplea un modelo de ecuaciones estructurales basado en Partial Least Squares Equation Modeling (PLS-SEM), complementado con un análisis de tétradas –que nos confirma que estamos ante un modelo de constructos formativos– y un test de cúpula gaussiana para controlar los problemas de endogeneidad. La incorporación de este test a nuestro estudio representa una importante novedad en este tipo de trabajos y proporciona información clave para el correcto análisis de la relación entre los constructos. Los resultados de este capítulo ofrecen indicios sólidos sobre el impacto positivo del ecosistema IA europeo en el desarrollo económico del continente. Además, permiten identificar el efecto de cada una de las variables utilizadas sobre los constructos relacionados con el entorno tecnológico y de inteligencia artificial. Por su parte, el test de cúpula gaussiana refleja problemas de endogeneidad entre el entorno tecnológico vinculado a tecnologías más maduras como pueden ser las TIC y el desarrollo económico, no siendo así en el caso del ecosistema IA. Estos resultados enriquecen la argumentación expuesta en el apartado de implicaciones políticas y conclusiones con el que se culmina este capítulo. Una vez descubiertos indicios sólidos sobre el impacto positivo de los ecosistemas IA sobre el desarrollo económico. En el Capítulo V nos planteamos el objetivo de aproximar el estado actual del ecosistema IA de la Comunitat Valenciana. Para ello, en primer lugar analizamos el contexto español puesto que consideramos que constituye un factor determinante para entender la situación de la Comunitat Valenciana. A continuación, llevamos a cabo un ejercicio de inferencia. En concreto, ante la escasez de datos oficiales sobre el estado de la IA a nivel autonómico, procedemos a identificar las organizaciones públicas y privadas que están relacionadas con la IA en esta comunidad. Una vez identificadas, pasamos a extraer información de las mismas mediante la elaboración de una encuesta y la realización de entrevistas telefónicas. Además, esta información se combina con los datos disponibles en CamerData e información disponible en las webs de las propias organizaciones. El propósito de este capítulo es doble: en primer lugar, nos sirve para reconocernos como país y región dentro del entramado geopolítico descrito en los capítulos anteriores, y en segundo lugar para tener información de fuentes directas con la que advertir de los retrasos en el desarrollo y la aplicación de los algoritmos inteligentes en nuestro territorio. Dado el avance que las grandes potencias económicas están llevando a cabo, podemos exponer con datos los riesgos que corremos en materia competitiva y productiva si nos quedamos atrás en el proceso de transformación económica basado en la IA y las tecnologías digitales. En el Capítulos VI se presentan las conclusiones de los apartados anteriores, se exponen las limitaciones encontradas durante la realización de esta tesis doctoral, así como las líneas futuras de investigación que se abren gracias a este trabajo. Finalmente, este capítulo es posteriormente traducido al inglés en el Capítulo VII, a modo de resumen y con una extensión superior a las 5000 palabras, en cumplimiento de los requisitos establecidos por la Escuela Internacional de Doctorado de la Universidad de Alicante para las tesis doctorales con mención internacional.

No description available.

Type 1 diabetes (T1D) is regarded as an autoimmune disease. Beta cells, which produces insulin in pancreas are attacked by islet cell antibodies (ICA). This leads to gradual destruction of the beta cell, which in turn cause high level of glucose in the blood because the regulator "insulin" has disappeared. In that case the patient needs to be treated lifelong with insulin. It has been shown that the ICA reactivity consisting of reactivities against different autoantigens such as: insulin autoantigen (IAA), glutamic acid autoantigen (GAD), insulinoma antigen-2 autoantigen (IA-2) and most likely also zinc transporter autoantigen (ZnT8). Determination of ICA in serum samples is important for the classification of diabetes, prediction of T1D and the development of autoimmune therapies. Nowadays screening of ICA is performed with ”Medipan ICA screen” which is a commercial enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA). Positives samples are further analysed by ELISA with the indirect immunofluorescence method (IF) to ensure a final positive answer. The purpose of this study was to evaluate and compare a new commercial ELISA kit ”RSR 2screen” with the Medipan ICA screen for use it in routine analysis to evalute if it has the same / higher specificity and sensitivity, and lower price compared with Medipan ICA screen. Serum samples from a control group (n = 199) and a patient’s group diagnosed with T1D (n = 100 were analyzed with both ELISA methods. The results were statistically evaluated to set a threshold value for positivity and to evaluate the method's sensitivity and specificity. The result showed that both ELISA- methods gave the same sensitivity (93%) and specificity (97.5%) and a high concordance (98.7%) was achieved. Analytical price per sample for the RSR 2screen was 4.2% lower than for the Medipan ICA screen. RSR 2screen can be used instead of Medipan ICA screen.

Les toxines formeuses de pore (PFTs) sont des protéines exogènes responsables d’un grand nombre de maladies infectieuses qui perméabilisent les membranes cellulaires de leur hôte. La formation des pores ou l’introduction d’une enzyme dans le cytoplasme peut entrainer l’apparition de symptômes de maladies connues (l’anthrax, le botulisme) et, dans le pire des cas, la mort. Les mécanismes d’infection et de destruction des cellules infectées sont bien caractérisés. Toutefois, l’aspect dynamique des changements de conformation durant le processus de perméabilisation reste à découvrir pour la majorité des toxines formeuses de pore. Le but de cette thèse est d’étudier les mécanismes d’oligomérisation des PFTs, ainsi que la formation des pores à la membrane lipidique grâce à la spectroscopie de fluorescence. Nous avons choisi la toxine Cry1Aa, un bio pesticide produit par le bacille de Thuringe et qui a été rigoureusement caractérisé, en tant que modèle d’étude. La topologie de la Cry1Aa à l’état actif et inactif a pu être résolue grâce à l’utilisation d’une technique de spectroscopie de fluorescence, le FRET ou transfert d’énergie par résonance entre un fluorophore greffé au domaine formeur de pore (D1) et un accepteur non fluorescent (le DPA ou dipicrylamine) localisé dans la membrane et qui bouge selon le potentiel membranaire. Le courant électrique, ainsi que la fluorescence provenant de la bicouche lipidique membranaire horizontale ont été enregistrés simultanément. De cette manière, nous avons pu localiser toutes les boucles reliant les hélices de D1 avant et après la formation des pores. Dans la forme inactive de la toxine, toutes ces boucles se trouvent du côté interne de la bicouche lipidique, mais dans sa forme active l’épingle α3-α4 traverse du côté externe, alors que toutes les autres hélices demeurent du côté interne. Ces résultats suggèrent que α3-α4 forment le pore. Nous avons découvert que la toxine change significativement de conformation une fois qu’elle se trouve dans la bicouche lipidique, et que la Cry1Aa attaque la membrane lipidique de l’extérieur, mais en formant le pore de l’intérieur. Dans le but de caractériser la distribution de toxines à chaque extrémité de la bicouche, nous avons utilisé une technique de double FRET avec deux accepteurs ayant des vitesses de translocation différentes (le DPA et l’oxonol) dans la membrane lipidique. De cette manière, nous avons déterminé que la toxine était présente des deux côtés de la bicouche lipidique durant le processus de perméabilisation. La dynamique d’oligomérisation de la toxine dans une bicouche lipidique sans récepteurs a été étudiée avec une technique permettant le compte des sauts de fluorescence après le photoblanchiment des fluorophore liés aux sous unités composant un oligomère présent dans la bicouche lipidique supportée. Nous avons confirmé de cette manière que la protéine formait ultimement des tétramères, et que cet état résultait de la diffusion des monomères de toxine dans la bicouche et de leur assemblage subséquent. Enfin nous avons voulu étudier le « gating » de la colicine Ia, provenant de la bactérie E.Coli, dans le but d’observer les mouvements que font deux positions supposées traverser la bicouche lipidique selon le voltage imposé aux bornes de la bicouche. Nos résultats préliminaires nous permettent d’observer un mouvement partiel (et non total) de ces positions, tel que le suggèrent les études de conductances du canal. / Pore forming toxins (PFTs) are exogenous often pathogenic proteins that permeabilize the host membrane. Permeabilization or subsequent introduction of an enzyme leads to health disorders and sometimes death. Although the fundamental infection and destruction mechanisms are known, the underlying molecular basis and their link to the structural information remains undetermined for many pore forming toxins. The purpose of this thesis was to study the mechanisms of oligomerization on the membrane and pore formation of PFTs using fluorescence spectroscopy in planar lipid bilayer. We chose Cry1Aa as the most intensively studied member of Bacillus thuringiensis’s toxins. In order to probe the topology both in inactive and active congformation, we used Förster resonance energy transfer (FRET) between a fluorophore site-directedly attached to different positions in the pore forming domain (D1) of Cry1Aa toxin and an acceptor compound dipicrylamine (DPA) in the membrane, which moves in response to the membrane potential. Electrical current and fluorescence emission from planar lipid bilayers in a horizontal configuration were simultaneously recorded. We probed all loops between the seven α helices of D1. All of them were located on the inner leaflet of the bilayer prior to pore formation. In the active form, the α3-α4 hairpin were found to translocate back to the outer leaflet of the bilayer, whereas all other positions remained in the inner leaflet, suggesting that α3-α4 are the pore lining helices. The toxins undergo significant conformational changes once they enter the host membrane, and we found Cry1Aa to attack from the exterior but translocate to the interior. To estimate the distribution of the toxins on either side of the membrane, we used the double-FRET technique. Here, two different acceptors (DPA and oxonol) with different dynamics (time constants) allowed us to determine that approximately equal amounts of the toxin were present on either leaflet during the permeabilization process. We also studied the oligomerization mechanism of Cry1Aa toxins inserted into supported lipid bilayers using a single subunit counting technique based on the step-wise photodestruction (bleaching) of the attached fluorophores. This system allowed determining the number of subunits composing each oligomer. We found that oligomerization is a highly dynamic process which occurs after insertion into the bilayer by lateral diffusion. The final (likely the pore forming) entity of the toxin is tetrameric. Finally, we used the same FRET approach to investigate the gating process of two positions of the pore forming domain of colicin Ia, an antibiotic toxin produced by E. coli. These positions were suspected to translocate reversibly from the outer to the inner leaflet during the gating process. In preliminary results, we found that these positions are moving between the two leaflets of the bilayer during pore formation.

Der neuronale Zelluntergang bei einer Vielzahl von Krankheiten des ZNS, wie z.B. Morbus Alzheimer (AD) und Temporallappenepilepsie (TLE), wird mit oxidativem Stress sowie Fehlfunktionen von Kaliumkanälen in Verbindung gebracht. In dieser Studie soll die selektive neuronale Sensitivität auf oxidativen Stress durch die Messung der oxidativen Modulation von Kaliumströmen untersucht werden. Dabei werden sternförmige Neuronen der zweiten Schicht des entorhinalen Kortex (EC) (bei AD bereits früh geschädigt) mit pyramidalen Neuronen der dritten Schicht des EC (früh geschädigt bei TLE) sowie hippocampalen pyramidalen Neuronen der CA1 Region (bei AD und TLE erst spät geschädigt) miteinander verglichen. Mittels patch-clamp Ganzzellmessung zeigt diese Studie die differentielle Hemmung spannungsabhängiger transienter (IA) und „delayed-rectifier“ K+-Ströme (IK(V)) durch Arachidonsäure (AA) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Die intrazelluläre Applikation von AA (1 pM) reduzierte IA in Neuronen des entorhinalen Kortex signifikant stärker verglichen mit Neuronen des CA1. ETYA imitiert diesen Effekt, dies schliesst die Metabolite der AA als Mediatoren des Effekts auf Kaliumkanäle aus. Weder AA noch ETYA reduzierten IK(V). Im Gegensatz dazu reduzierte H2O2 IA in Neuronen des CA1 effektiver als in Neuronen der Schichten II und III des entorhinalen Kortex. Die Reduktion des IA, vermittelt durch AA, wurde durch Radikalfänger (Glutathion, Ascorbinsäure, Vitamin E Analogon Trolox) blockiert. Dabei verstärkten manche dieser Antioxidantien den Effekt der AA, dies legt eine komplexere Modulation dieser Ströme in Schnitten verglichen mit Kulturen nahe. Dies sollte bei der Entwicklung antioxidativer Therapien von AD und TLE berücksichtigt werden. Bei der heterologer Expression von Kv1.4 und Kv4.2 in HEK-293 Zellen wurden funktionelle Kanäle gebildet und A-Typ Ströme ausgelöst. Diese Ströme wurden nach der Applikation von 1 pM AA stark reduziert. ROS scheinen neben ihrer zellschädigenden Wirkung physiologische Prozesse zu regulieren, indem sie eine Reihe von Signalwegen beeinflussen. Da spannungsabhängige Kaliumkanäle vielen wichtigen zellulären Funktionen zugrundeliegen, könnte die Modulation dieser Kanäle durch ROS einen Mechanismus für die Feinabstimmung zellulärer Prozesse darstellen. / Oxidative stress and dysfunction of potassium channels are believed to play a role in neuronal death in a number of CNS diseases (e.g. Alzheimer’s disease, epilepsy). The present study addresses selective neuronal vulnerability to oxidative stress by studying oxidative modulation of potassium channels in entorhinal cortex (EC) layer II stellate neurons (cell loss early in AD) and layer III pyramidal neurons (early damage in TLE), in comparison to hippocampal CA1 pyramidal neurons (late damage in TLE and AD). Using whole-cell patch-clamp, differential inhibition of transient IA and delayed rectifier K+-currents IK(V) by arachidonic acid (AA) and H2O2 was demonstrated. Intracellular AA (1 pM) reduced IA in EC neurons significantly stronger than in CA1 neurons. AA affected the voltage dependence of steady-state inactivation as well. ETYA mimicked the effect of AA, excluding its metabolites as mediators of IA modulation. Neither AA nor ETYA reduced IK(V). In contrast, a non-lipid oxidizing agent, H2O2 reduced IA more effectively and robustly attenuated IK(V) in CA1, compared to EC neurons. AA-mediated reduction of IA was blocked by free radical scavengers (glutathione, ascorbic acid, Trolox). Antioxidants did not simply inhibit AA and H2O2 effects. In particular, they even enhanced AA effects, suggesting more complex modulation of these currents in slices, compared to culture. Moreover, intracellular antioxidants, themselves, influenced maximal conductance and voltage-conductance characteristics of IA and IK(V). This should be considered in design of anti-oxidative therapies in AD and TLE. Heterologous expression of Kv1.4 and of Kv4.2 cDNA in HEK-293 cells formed functional channels and elicited A-type currents, which shared similar biophysical characteristics with native IA from the hippocampus. These currents were strongly decreased upon administration of 1pM AA, demonstrating that at least one of multiple sites for AA action is situated on the pore-forming alfa-subunit of the A-channel. In conclusion, beside contribution to cell damage, ROS may regulate physiological processes by acting on different signalling pathways. Since voltage-gated K+-channels underlie many important cellular functions modulation of these channels by ROS would represent a mechanism for fine tuning of cellular processes.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2017-07-13T00:34:13Z No. of bitstreams: 1 Disserta??o final 2016 Jo?o Daniel Guimar?es Oliveira.pdf: 655013 bytes, checksum: d0a2de9f4bcda190e3f62f17cf4803e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-13T00:34:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??o final 2016 Jo?o Daniel Guimar?es Oliveira.pdf: 655013 bytes, checksum: d0a2de9f4bcda190e3f62f17cf4803e7 (MD5) Previous issue date: 2015-12-16 / This study performs a reading of Pornopop?ia (2009), the romance wrote by Reinaldo Moraes, borned in S?o Paulo. In my analysis, I try to identify the manifestations of street smarts and cynicism present in Zeca figure, the protagonist. In the erotic and irresponsible adventure of romance, this guy of metropolis finds himself at the mercy of consumerism and moral vacuum. The individualism and the hero's hedonism, mostly geared toward to the enjoyment, are the result of the logic of a society where the consumer is not a subject but its object. Zeca integrates a particular line of characters that possibly originated in Spain with so-called picaresque novels. Such a line had in Manuel Antonio de Almeida a pioneer in Brazil, with the book Mem?rias de um sargento de mil?cias, in which the author, though inheriting characteristics of the Spanish rogue, absorbs the folk style of local historical figures like Peter Malasartes, creating, so in Leonardo (protagonist of Mem?rias), the prototype of the Brazilian trickster. While in the first chapter i select some individuals who, given their representation throughout history, would be formative parts for the creation of Zeca, in the second i choose for bringing literary examples listed as examples of the types listed in the previous chapter, as well as notabilizam themselves while Reinaldo Moraes' precursors. In the third chapter I dwell on the text and develop my reading from three directions: the Zeca relations with pleasure, with morality and with the void. Therefore, reflect, in this dissertation, on the possible belonging of this character, given its sharp bend to the marginal and peripheral zone. / O presente trabalho realiza uma leitura da Pornopop?ia (2009), romance do escritor paulista Reinaldo Moraes. Em minha an?lise, busco identificar as manifesta??es da malandragem e do cinismo presentes na figura de Zeca, o protagonista. Na aventura er?tica e irrespons?vel do romance, esse indiv?duo da urbe se v? ? merc? do consumismo e do vazio moral. O individualismo e o hedonismo do her?i, majoritariamente voltados para o gozo, s?o frutos da l?gica de uma sociedade para a qual o consumidor n?o ? o sujeito, mas seu objeto. Zeca integra uma linha particular de personagens que possivelmente originou-se na Espanha com os chamados romances picarescos. Tal linha teve em Manuel Antonio de Almeida seu pioneirismo aqui no Brasil, com a obra Mem?rias de um sargento de mil?cias, na qual o autor, embora herdando caracter?sticas do p?caro espanhol, absorve o estilo folcl?rico de figuras hist?ricas locais como Pedro Malasartes, criando, assim, em Leonardo (protagonista das Mem?rias), o prot?tipo do malandro brasileiro. Enquanto no primeiro cap?tulo elenco alguns sujeitos que, dada a sua representatividade ao longo da hist?ria, seriam pe?as formativas para a cria??o de Zeca, no segundo opto por trazer exemplos liter?rios que figuram como exemplos dos tipos listados no cap?tulo anterior, bem como notabilizam-se enquanto precursores de Reinaldo Moraes. No terceiro cap?tulo me debru?o sobre o texto e desenvolvo minha leitura a partir de tr?s dire??es: as rela??es de Zeca com o prazer, com a moral e com o vazio. Assim sendo, reflito, nesta disserta??o, acerca do poss?vel pertencimento desta personagem, tendo em vista sua n?tida curvatura para a zona marginal e perif?rica.

Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune caractérisée par la destruction des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas. Au cours de ce processus auto-immun, des auto-anticorps sont produits contre plusieurs antigènes des cellules bêta, par exemple l'insuline, l'acide glutamique décarboxylase (GAD65), la protéine tyrosine phosphatase (IA-2) et le transporteur de zinc (ZnT8). Au moins un auto-anticorps contre l'un de ces antigènes est présent dans> 95% des personnes atteintes de diabète de type 1 lors de la détection de l'hyperglycémie. Ces auto-anticorps peuvent servir de marqueurs précoces de diabète de type 1, car ils peuvent être présents des années avant l'apparition de la maladie, ce qui permet un diagnostic précoce avant les manifestations cliniques. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé, en partenariat avec une équipe de recherche clinique, une série de tests diagnostiques originaux, basée sur la détection précoce des différents auto-anticorps d’îlots de Langerhans à partir d'échantillons de sérum humain. Ces tests de diagnostic comprennent des tests bridging ELISA pour la détection d'auto-anticorps contre l'insuline, IA-2 et GAD65, qui sont rapides, facile à utiliser et n’utilisent pas de radioactivité. De plus, un test immunochromatographique sur bandelette pour la détection des auto-anticorps contre IA-2 a été développé. Le principal avantage des tests bandelettes est sa convivialité : les résultats peuvent être obtenus en 45 min en utilisant de très petits volumes de sérums et sans l'utilisation d’appareils spécialisés. Tous ces tests développés en interne ont été validés avec des échantillons de sérum de patients atteints de diabète de type 1 et de témoins sains et leurs performances ont été comparées avec celles de tests disponibles sur le marché. En outre, nous avons développé un test multiplex pour la détection simultanée de plusieurs auto-anticorps associés au diabète de type 1, ce qui permet de gagner du temps et d’augmenter la valeur diagnostic et prédictive du test par rapport à la détection d’un seul autoanticorps. Ce test multiplex a été validé pour la détection de deux autoanticorps (IA-2A et GADA) et comparé à nos tests ELISA de IA-2A et GADA. / Type 1 diabetes is an autoimmune disease characterized by the destruction of pancreatic beta cells within the islets of Langerhans. In the course of this autoimmune process, autoantibodies are generated against several beta-cell antigens, e.g. insulin, glutamic acid decarboxylase (GAD65), tyrosine phosphatase-like protein (IA-2) and zinc transporter 8 (ZnT8). At least one autoantibody against one of these antigens is present in >95% of individuals with type 1 diabetes upon hyperglycemia detection. These autoantibodies can serve as early markers of type 1 diabetes, since they can be present years before disease onset, allowing for an early diagnosis before clinical manifestations. In the course of this thesis we have developed, in partnership with a clinical research team, a series of original diagnostic tests, based on the early detection of the different anti-Langerhans islet autoantibodies from human serum samples. These diagnostic tests include bridging ELISAs for the detection of autoantibodies to insulin, IA-2 and GAD65, which are rapid, non-radioactive and easy-to-use. Moreover, a lateral flow immunoassay (dipstick) for detection of autoantibodies to IA-2 was developed. The key advantage of lateral flow immunoassay is its user-friendly format: results can be obtained within 45 min using very small volumes of sera and without the use of any specialized apparatus. All these in-house assays were validated with diabetic and healthy human serum samples and the assay performances were compared to commercially available tests on the market. In addition, we have developed a multiplex assay for simultaneous detection of multiple diabetes-associated autoantibodies, which is time-effective and increases the diagnostic and predictive values of the assay, comparing to single autoantibody detection. This multiplex assay was validated for detection of two autoantibodies i.e. IA-2A and GADA and compared to in-house IA-2A and GADA bridging ELISAs.

Les toxines formeuses de pore (PFTs) sont des protéines exogènes responsables d’un grand nombre de maladies infectieuses qui perméabilisent les membranes cellulaires de leur hôte. La formation des pores ou l’introduction d’une enzyme dans le cytoplasme peut entrainer l’apparition de symptômes de maladies connues (l’anthrax, le botulisme) et, dans le pire des cas, la mort. Les mécanismes d’infection et de destruction des cellules infectées sont bien caractérisés. Toutefois, l’aspect dynamique des changements de conformation durant le processus de perméabilisation reste à découvrir pour la majorité des toxines formeuses de pore. Le but de cette thèse est d’étudier les mécanismes d’oligomérisation des PFTs, ainsi que la formation des pores à la membrane lipidique grâce à la spectroscopie de fluorescence. Nous avons choisi la toxine Cry1Aa, un bio pesticide produit par le bacille de Thuringe et qui a été rigoureusement caractérisé, en tant que modèle d’étude. La topologie de la Cry1Aa à l’état actif et inactif a pu être résolue grâce à l’utilisation d’une technique de spectroscopie de fluorescence, le FRET ou transfert d’énergie par résonance entre un fluorophore greffé au domaine formeur de pore (D1) et un accepteur non fluorescent (le DPA ou dipicrylamine) localisé dans la membrane et qui bouge selon le potentiel membranaire. Le courant électrique, ainsi que la fluorescence provenant de la bicouche lipidique membranaire horizontale ont été enregistrés simultanément. De cette manière, nous avons pu localiser toutes les boucles reliant les hélices de D1 avant et après la formation des pores. Dans la forme inactive de la toxine, toutes ces boucles se trouvent du côté interne de la bicouche lipidique, mais dans sa forme active l’épingle α3-α4 traverse du côté externe, alors que toutes les autres hélices demeurent du côté interne. Ces résultats suggèrent que α3-α4 forment le pore. Nous avons découvert que la toxine change significativement de conformation une fois qu’elle se trouve dans la bicouche lipidique, et que la Cry1Aa attaque la membrane lipidique de l’extérieur, mais en formant le pore de l’intérieur. Dans le but de caractériser la distribution de toxines à chaque extrémité de la bicouche, nous avons utilisé une technique de double FRET avec deux accepteurs ayant des vitesses de translocation différentes (le DPA et l’oxonol) dans la membrane lipidique. De cette manière, nous avons déterminé que la toxine était présente des deux côtés de la bicouche lipidique durant le processus de perméabilisation. La dynamique d’oligomérisation de la toxine dans une bicouche lipidique sans récepteurs a été étudiée avec une technique permettant le compte des sauts de fluorescence après le photoblanchiment des fluorophore liés aux sous unités composant un oligomère présent dans la bicouche lipidique supportée. Nous avons confirmé de cette manière que la protéine formait ultimement des tétramères, et que cet état résultait de la diffusion des monomères de toxine dans la bicouche et de leur assemblage subséquent. Enfin nous avons voulu étudier le « gating » de la colicine Ia, provenant de la bactérie E.Coli, dans le but d’observer les mouvements que font deux positions supposées traverser la bicouche lipidique selon le voltage imposé aux bornes de la bicouche. Nos résultats préliminaires nous permettent d’observer un mouvement partiel (et non total) de ces positions, tel que le suggèrent les études de conductances du canal. / Pore forming toxins (PFTs) are exogenous often pathogenic proteins that permeabilize the host membrane. Permeabilization or subsequent introduction of an enzyme leads to health disorders and sometimes death. Although the fundamental infection and destruction mechanisms are known, the underlying molecular basis and their link to the structural information remains undetermined for many pore forming toxins. The purpose of this thesis was to study the mechanisms of oligomerization on the membrane and pore formation of PFTs using fluorescence spectroscopy in planar lipid bilayer. We chose Cry1Aa as the most intensively studied member of Bacillus thuringiensis’s toxins. In order to probe the topology both in inactive and active congformation, we used Förster resonance energy transfer (FRET) between a fluorophore site-directedly attached to different positions in the pore forming domain (D1) of Cry1Aa toxin and an acceptor compound dipicrylamine (DPA) in the membrane, which moves in response to the membrane potential. Electrical current and fluorescence emission from planar lipid bilayers in a horizontal configuration were simultaneously recorded. We probed all loops between the seven α helices of D1. All of them were located on the inner leaflet of the bilayer prior to pore formation. In the active form, the α3-α4 hairpin were found to translocate back to the outer leaflet of the bilayer, whereas all other positions remained in the inner leaflet, suggesting that α3-α4 are the pore lining helices. The toxins undergo significant conformational changes once they enter the host membrane, and we found Cry1Aa to attack from the exterior but translocate to the interior. To estimate the distribution of the toxins on either side of the membrane, we used the double-FRET technique. Here, two different acceptors (DPA and oxonol) with different dynamics (time constants) allowed us to determine that approximately equal amounts of the toxin were present on either leaflet during the permeabilization process. We also studied the oligomerization mechanism of Cry1Aa toxins inserted into supported lipid bilayers using a single subunit counting technique based on the step-wise photodestruction (bleaching) of the attached fluorophores. This system allowed determining the number of subunits composing each oligomer. We found that oligomerization is a highly dynamic process which occurs after insertion into the bilayer by lateral diffusion. The final (likely the pore forming) entity of the toxin is tetrameric. Finally, we used the same FRET approach to investigate the gating process of two positions of the pore forming domain of colicin Ia, an antibiotic toxin produced by E. coli. These positions were suspected to translocate reversibly from the outer to the inner leaflet during the gating process. In preliminary results, we found that these positions are moving between the two leaflets of the bilayer during pore formation.

Στα δίκτυα επικοινωνιών, η δρομολόγηση περιλαμβάνει τον προσδιορισμό μιας πορείας μεταξύ των κόμβων της πηγής και του προορισμού για κάθε αίτημα σύνδεσης. Στρέφουμε την προσοχή μας στην κατηγορία των διαφανών (transparent) οπτικών δικτύων όπου, σε απάντηση σε ένα δεδομένο αίτημα κλήσης, εγκαθιδρύεται μια circuit-switched σύνδεση μεταξύ του κόμβου που έχει την απαίτηση κλήσης (πηγή) και του κόμβου που λαμβάνει αυτή την κλήση (προορισμός) σε ένα ενιαίο μήκος κύματος, υπό τον όρο ότι ένα ελεύθερο μήκος κύματος είναι διαθέσιμο σε όλους τους ενδιάμεσου συνδέσμους. Σε ένα διαφανές οπτικό δίκτυο που δρομολογείται βάσει του μήκους κύματος (wavelength routed), η πληροφορία μιας σύνδεσης μεταδίδεται πάνω από αμιγώς οπτικά μονοπάτια (lightpaths) στα οποία το μεταδιδόμενο σήμα παραμένει στο οπτικό πεδίο καθ’ όλη τη διάρκεια της διαδρομής που ορίζεται ανάμεσα στην πηγή και τον προορισμό. Οι παραδοσιακές προσεγγίσεις δρομολόγησης βρίσκουν μια πορεία που είτε ελαχιστοποιεί μια ορισμένη παράμετρο κόστους - όπως το μήκος της σύνδεσης ή των πόρων του δικτύων που χρησιμοποιούνται - ή μεγιστοποιούν την κυκλοφορία που εξυπηρετείται και καλούνται αλγόριθμοι Δρομολόγησης και Ανάθεσης Μήκους Κύματος (Routing and Wavelength Assignment - RWA). Το RWA πρόβλημα εξετάζεται συνήθως κάτω από δύο εναλλακτικές τοποθετήσεις. Η Στατική ή Offline εγκαθίδρυση lightpath που εξετάζει την περίπτωση όπου το σύνολο των συνδέσεων είναι γνωστό εκ των προτέρων και εξυπηρετείται από κοινού. Η Δυναμική ή Online εγκαθίδρυση lightpath εξετάζει την περίπτωση όπου τα αιτήματα σύνδεσης φθάνουν τυχαία χρονικές περιπτώσεις και εξυπηρετούνται ένα προς ένα. Σε αυτήν την μελέτη θα εστιάσουμε στο Online RWA πρόβλημα. Οι περισσότεροι από τους RWA αλγορίθμους υποθέτουν λειτουργία σε ιδανικό φυσικό επίπεδο μετάδοσης όπου μόλις προσδιοριστεί μια διαθέσιμη πορεία και ένα μήκος κύματος, η σύνδεση είναι εφικτή. Όμως στα διαφανή οπτικά δίκτυα, η ποιότητα του σήματος υποβαθμίζεται λόγω εξασθενίσεων (impairments) στο φυσικό επίπεδο που κάνει αδύνατη τη δρομολόγηση (physical-layer blocking). Ως εκ τούτου, απαιτούνται αλγόριθμοι δρομολόγησης που να λαμβάνουν υπ’ όψιν τους περιορισμούς εξασθένισης (impairment aware RWA) προκειμένου να εξασφαλιστεί το γεγονός ότι οι συνδέσεις είναι εφικτές αλλά και με ικανοποιητική ποιότητα μετάδοσης (Quality of Transmission - QoT). Για να γίνει αυτό, είναι απαραίτητο να συνυπολογιστούν τόσο η κατάσταση του δικτύου όσο και η φυσική απόδοση της σύνδεσης. Σε ένα οπτικό δίκτυο που δρομολογείται βάσει του μήκους κύματος το οποίο εκτείνεται σε μεγάλη γεωγραφική περιοχή, ένα οπτικό σήμα μπορεί να μεταβεί σε διάφορους ενδιάμεσους κόμβους και μεγάλα τμήματα ινών. Οι προοδευτικά αυξανόμενες απώλειες του σήματος σε όλους τους ενδιάμεσους κόμβους και τα μεγάλα τμήματα ινών απαιτούν τη χρήση οπτικών ενισχυτών σε στρατηγικές θέσεις στο δίκτυο, ενδεχομένως σε κάθε κόμβο και μέσα στις ίνες, αλλά και Optical Cross Connect Switches (OXC). Δυστυχώς, οι ενισχυτές και οι OXC μπορεί να εισάγουν σημαντικές εξασθενίσεις στη μετάδοση, όπως η παραγωγή crosstalk, ενισχυμένου αυθόρμητου θορύβου (Amplified Spontaneous Emission - ASE), κορεσμού και εξάρτησης από το μήκος κύματος του κέρδους των ενισχυτών, που κάνει το κέρδος μια ποσότητα μη ντετερμινιστική και εξαρτώμενη από την κυκλοφορία της πληροφορίας. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας είναι να προσδιοριστεί αυτή η σχέση εξάρτησης μεταξύ του κέρδους των ενισχυτών και του μήκους κύματος που χρησιμοποιείται για την εξυπηρέτηση της απαίτησης από τον κόμβο πηγής στον κόμβο προορισμού. Πιο συγκεκριμένα, το κέρδος, με το οποίο ενισχύεται το σήμα κατά τη μετάδοσή του, εξαρτάται από το την ισχύ εισόδου του ενισχυτή, δηλαδή το πλήθος των μηκών κύματος που μπορεί να ενισχύσει ο εκάστοτε ενισχυτής. Επομένως, θέλουμε οι αλλαγές στα κέρδη των ενισχυτών ανάλογα με τo πλήθος των μηκών κύματος που χρησιμοποιούνται σε κάθε κόμβο να συνυπολογίζονται κατά τη διάρκεια εύρεσης των μονοπατιών και της δρομολόγησης των αιτήσεων. Για την επίτευξη αυτού δημιουργήθηκε μια επέκταση ενός ήδη υπάρχοντος αλγορίθμου δρομολόγησης και ανάθεσης μήκους κύματος πολλαπλών κριτηρίων (Multicost Impairment Aware Routing and Wavelength Assignment – IA-RWA) που λαμβάνει υπ’ όψιν του εκτός από τις εξασθενίσεις από το φυσικό επίπεδο κατά τη μετάδοση και τις αλλαγές στα κέρδη των ενισχυτών. Ο προτεινόμενος αλγόριθμος ονομάζεται αλγόριθμος δρομολόγησης και ανάθεσης μήκους κύματος πολλαπλών κριτηρίων με περιορισμούς ισχύος (Multicost Impairment Aware Routing and Wavelength Assignment with Power Constraints – IA-RWA with Power Constraints). Για την εξυπηρέτηση μιας σύνδεσης, βρίσκει μια πορεία και ένα ελεύθερο μήκος κύματος, που να μην επηρεάζει αρνητικά το κέρδος των ενισχυτών της πορείας αυτής, ώστε να έχει αποδεκτή ποιότητα μετάδοσης, βάσει του τρέχοντος βαθμού χρήσης (utilization) του δικτύου, που αλλάζει όσο νέες συνδέσεις εγκαθιδρύονται ή απελευθερώνονται. Ο IA-RWA with Power Constraints αλγόριθμος ακολουθεί τις ίδιες δυο φάσεις ανάπτυξης για την ανάθεση και δρομολόγηση με τον IA-RWA αλγόριθμο. Στην πρώτη φάση, ο αλγόριθμος βρίσκει το σύνολο των επιτρεπτών για την απαιτούμενη QoT πορειών από τη δεδομένη πηγή σε όλους τους κόμβους του δικτύου, συμπεριλαμβανομένου και του προορισμού. Στη δεύτερη φάση, εφαρμόζεται μια συνάρτηση βελτιστοποίησης στο διάνυσμα δαπανών (cost vector) των πορειών, που είναι αυτό που θα πρέπει να κρατά πληροφορίες σχετικές με τις αλλαγές στα κέρδη των ενισχυτών, προκειμένου να βρεθεί η βέλτιστη λύση. Η προσθήκη που επιτυγχάνει το σκοπό μας είναι ο υπολογισμός του κέρδους των ενισχυτών σε όλους τους συνδέσμου του δικτύου πριν την πρώτη φάση του αλγορίθμου αλλά στο τέλος της δεύτερης, όπου εκεί γίνεται ουσιαστικά ένας έλεγχος για τον τρόπο με τον οποίο επηρεάζει η εγκαθίδρυση της νέας αίτησης τις ήδη υπάρχουσες. Με απώτερο στόχο στην περίπτωση της μείωσης του QoT τη φραγή (blocking) ή την επαναδρομολόγηση (rerouting) της αίτησης. Στα Κεφάλαια που θα ακολουθήσουν θα γίνει μια εκτενής παρουσίαση όλων των στοιχείων που συνθέτουν το Online RWA πρόβλημα. Στο Κεφάλαιο 1 θα αναπτυχθεί η τεχνική της Πολυπλεξίας με Διαίρεση Μήκους Κύματος (Wavelength Division Multiplexing - WDM), στο Κεφάλαιο 2 θα περιγραφούν οι φυσικές εξασθενίσεις που συνυπολογίζονται κατά τη διαδικασία της δρομολόγηση και ανάθεσης μήκους κύματος. Στο Κεφάλαιο 3 παρουσιάζονται οι οπτικοί ενισχυτές και ο τρόπος λειτουργίας τους. Στο Κεφάλαιο 4 αναλύουμε τους παράγοντες που βοηθούν στον υπολογισμό της ποιότητας μετάδοσης της πληροφορίας. Τέλος, στα Κεφάλαια 5 και 6 γίνεται η ανάλυση του RWA προβλήματος, του αλγορίθμου που αναπτύχθηκε αλλά και ανάπτυξη των πειραματικών αποτελεσμάτων. / In communication networks, routing involves the identification of a path between the source and destination nodes for each connection request. We focus our attention on the class of transparent optical networks wherein, in response to a given call request, a circuit-switched connection is established between the calling (source) and the called (destination) nodes on a single wavelength, provided a free wavelength is available over the desired lightpath. In a transparent wavelength-routed optical network, the information of connection is transmitted above purely optical paths (lightpaths) in which any transmitted signal remains in the optical domain over the entire route assigned to it between its source and destination nodes. Traditional routing approaches find a path that either minimizes a certain cost parameter - such as the length of the connection or the network resources used – or maximize the traffic served and are called Routing and Wavelength Assignment (RWA) algorithms. The RWA problem is usually considered under two alternative settings. Static or Offline lightpath establishment addresses the case where the set of connections is known in advance and are jointly served. Dynamic or Online lightpath establishment considers the case where connection requests arrive at random time instances and are served on a one-by-one basis. In this study we will focus on the online RWA problem. Most of the RWA algorithms assume an ideal physical layer transmission that once an available path and wavelength have been identified, the connection is feasible. However, in all-optical transparent network, the quality of the signal degrades due to physical layer impairments which make routing unfeasible (physical-layer blocking). Hence, impairment-constraint-based routing is needed in order to ensure that the connections are feasible with acceptable Quality of Transmission (QoT). To do this, it is necessary to consider not only the network-level conditions but also the equally important physical performance of the connection. In a wavelength-routed optical network spanning a large geographical area, an optical signal may traverse a number of intermediate nodes and long fibre segments. The progressive losses incurred by the signal in all intermediate nodes and long fibre segments necessitate the use of optical amplifiers at strategic locations in the network, possibly at each node and within the fibre segments, and optical cross connect switch (XCS). Unfortunately, the XCS and the amplifiers may introduce significant transmission impairments, such as crosstalk generation, generation of amplified spontaneous emission (ASE) noise, saturation and wavelength dependence of amplifiers gain, making the gain a traffic-dependent nondeterministic quantity. Aim of particular work is to determine this relation of dependence between the amplifiers’ gain and the wavelength that is used to serve the request from the source node to the destination node. More concretely, this gain, with which is amplifies the transmission signal, depends on the input power of the amplifiers. Consequently, we want the changes of the amplifiers’ gain, which depend on the number of wavelengths that are used in each node, to be taken into account when requests are routed. For the achievement of this, we created an extension of the Multicost Impairment-Aware Routing and Wavelength Assignment algorithm (IA-RWA) that takes under consideration, apart from the impairments on the physical layer during transmission, the changes of the amplifiers’ gain. The proposed algorithm is called Multicost Impairment Aware Routing and Wavelength Assignment with Power Constraints (IA-RWA with Power Constraints). To serve a connection, the algorithm finds a path and a free wavelength, which does not degrade the amplifier gain of the chosen path, so as to have acceptable quality of transmission (QoT) performance according to the current utilization of the network, which changes as new connections are established or released. The IA-RWA with Power Constraints algorithm follows the same two phases for the routing and wavelength assignment with the IA-RWA algorithm. In the first phase, the algorithm finds the total number of paths with the required QoT, from the given source to all nodes of the network, included the destination. In the second phase, is applied an optimization function in the cost vector of the paths so as to find the most optimal solution. The addition that achieves our aim is the calculation of amplifiers’ gain in all nodes of the network before the first phase of algorithm but also and at the end of the second phase, where substantially checks the way that the establishment of new request influences the already existing. With final objective the blocking of the new connection in the case where the QoT is reduced or the rerouting of the request. In the following Chapters there will be an extensive presentation of all elements that compose Online RWA problem. In Chapter 1 will be developed the technique of Wavelength Division Multiplexing (WDM), in Chapter 2 will be described the physical impairments that are taken under consideration in routing and wavelength assignment procedure. In Chapter 3 are presented the optical amplifiers and their operation. In Chapter 4 we analyze the factors that are used in order to calculate the quality of transmission of a signal. Finally, in Chapter 5 and 6 we analyze the RWA problem, the algorithm that was developed but also the presentation of the experimental results.

This paper presents the production, implementation and analysis of the Circles of Conversations as a teaching strategy in the perspective of the development of critical thinking capacities, capable of allowing reflection and dialogue in a shared way. For that, three Circles of Conversations were carried out with five groups of 7th year of Elementary School having as its generating theme the "Life of Darwin". It is a qualitative research of the research-action type. The record was made in audiovisual recording, transcribed and discussed from the content analysis method. Some ideas stood out, being possible to construct categories based on the capacities of Critical Thinking and the questions made in the Circles of Conversations from the FA²IA typology. The discussions carried out presented possibilities and limits from the elaboration to the implementation of this strategy, mainly with regard to waiting time and the number of questions. Inserting the Circles of Conversations in school contexts refers to the reflection on different teaching strategies that allow the participation and construction of knowledge in a critical and purposeful way. Moreover, if planned and implemented from the capabilities of Critical Thinking, it leads to reflection in a democratic and dialogical character in the process of teaching and learning, in which all subjects can participate in the collective construction of a particular knowledge. / Este trabalho apresenta a produção, implementação e análise da Roda de Conversa como estratégia de ensino na perspectiva do desenvolvimento de capacidades de Pensamento Crítico, capaz de possibilitar a reflexão e o diálogo de forma compartilhada. Para tal, foram realizadas três Rodas de conversa com cinco turmas de 7º ano do Ensino Fundamental tendo como tema gerador o “A vida de Darwin”. Trata-se de uma pesquisa qualitativa do tipo pesquisa-ação. O registro foi feito em gravação audiovisual, transcrito e discutido a partir do método de análise de conteúdo. Algumas ideias se destacaram, sendo possível a construção de categorias baseadas nas capacidades de Pensamento Crítico e nos questionamentos realizados nas Rodas de Conversa a partir da tipologia FA²IA. As discussões realizadas apresentaram possibilidades e limites desde a elaboração até a implementação desta estratégia, principalmente no que diz respeito ao tempo de espera e a quantidade de questionamentos. Inserir a Roda de Conversa nos contextos escolares remete à reflexão sobre diferentes estratégias de ensino que possibilitem a participação e a construção do conhecimento de forma crítica e propositiva. Além disso, se planejada e implementada a partir de capacidades de Pensamento Crítico, conduz à reflexão num caráter democrático e dialógico no processo de ensino e aprendizagem, em que todos os sujeitos podem participar da construção coletiva de um determinado saber. / São Cristóvão, SE