Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico / Heme (Ferro Protoporfirina IX), uma molécula ubíqua presente em organismos de todos os reinos, é composta de um átomo de ferro ligado a um anel tetrapirrólico. Como grupamento prostético de apoproteínas inativas, o heme desempenha várias funções biológicas determinadas em parte pelo polipeptídeo associado a ele. Doenças de hemólise elevada ou dano celular extensivo podem levar a altos níveis de heme livre , como a anemia falciforme, malária, febres hemorrágicas e sepse. O heme induz estresse oxidativo e tem diversas propriedades próinflamatórias. Uma das principais características da resposta inflamatória é o recrutamento de leucócitos da vasculatura para os tecidos. O heme parece afetar este processo de muitas maneiras: a) induzindo a expressão de moléculas de adesão em células endoteliais in vitro ou in vivo; b) aumentando a permeabilidade vascular; c) aumentando a expressão e secreção de quimiocinas; d) induzindo a migração de leucócitos in vivo e in vitro. O mecanismo pelo qual o heme ativa as células do sistema imune inato causando inflamação não é totalmente compreendido. Nós recentemente observamos que o heme ativa macrófagos através do TLR-4. Considerando que o heme induz a migração de neutrófilos in vitro, nós hipotetizamos que o heme tenha um efeito quimiotático direto sobre este leucócito através da ativação de um receptor acoplado a proteína G. Nós mostramos que o heme induz a migração de neutrófilos in vivo e in vitro e estimula a secreção de citocinas de forma dose-dependente. Sangue, hemoglobina e diversos análogos do heme apresentam uma capacidade semelhante em recrutar neutrófilos in vivo. Por outro lado, a biliverdina e as mesoporfirinas não são eficientes em recrutar neutrófilos e o tratamento com mesoporfirina in vivo inibe o efeito do heme sobre o recrutamento. Finalmente, o efeito quimiotático do heme foi revertido com o uso de toxina pertussis. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o heme induza a quimiotaxia de neutrófilos através da ativação de um receptor acoplado a proteína G. / Heme (Iron Protoporphyrin IX), a ubiquitous molecule present in organisms of all kingdoms, is composed of an atom of iron linked to the four ligand groups of porphyrin. As a prosthetic moiety on inactive apo-heme proteins, heme provides a wide range of biological functions determined in part by the polypeptide associated to it. Diseases of increased hemolysis or extensive cell damage can lead to high levels of free heme, as sickle cell anemia, malaria, hemorrhagic fevers, and sepsis. Heme induces oxidative stress and has several proinflammatory activities. A hallmark of the inflammatory response is the recruitment of leukocytes out of the vasculature to tissues. Heme seems to affect this process in several ways: a) inducing cell adhesion molecule expression on endothelial cells in vitro or in vivo; b) increasing vascular permeability; c) enhancing chemokine expression and secretion; d) inducing migration of leukocytes in vivo and in vitro. The mechanism by which heme activates cells of the innate immune system causing inflammation is not fully characterized. We have recently observed that heme activates macrophages through TLR-4. Considering that heme induces neutrophil migration in vitro, we hypothesize that heme has a direct chemotactic effect on this leukocyte through activation of a G protein coupled receptor. In the present work we show that heme induces neutrophil migration in vivo and in vitro and stimulates the secretion of the inflammatory cytokines, IL-6 and TNF-a, in a dose-dependent fashion. Blood, hemoglobin and diverse heme analogs are also able to induce neutrophil recruitment. In contrast, biliverdin and mesoporphyrins are not efficient to recruit neutrophil and mesoporphyrin treatment in vivo inhibits the heme-induced neutrophil migration. Finally, the chemotactic effect of heme was abolished by pertussis toxin treatment in vitro . Taken together, these results suggest that heme induces neutrophil chemotaxis by activation of a G protein coupled receptor.

A ativação dos fagócitos é crítica para a defesa contra vários patógenos, por isso a importância de estudos que desenvolvam alternativas para a ativação dessas células. Nosso estudo visou investigar os efeitos do BAY 41-2272 na ativação de fagócitos. Para este propósito avaliamos a fagocitose, liberação de superóxido e atividade microbicida. Foram usados PBMC, neutrófilos e a linhagem celular THP-1, cultivadas na presença ou ausência de BAY 41-2272 (1mM ou 3mM) por 1h ou 48h a 37°C. A liberação de superóxido foi avaliada pelo ensaio da redução do citocromo c inibido especificamente pela superóxido dismutase; a fagocitose foi analisada através da co-cultura com partículas de Zymosan e contagem das células com partículas englobadas; e a atividade microbicida foi mensurada por meio da co-cultura com E. coli enteropatogênica seguida pela contagem das CFU formadas pelas bactérias recuperadas dos fagócitos. Além disso, fizemos a dosagem de IL-12, IFN-g e TNF-a e a análise da expressão gênica do gene CYBB. Todos os tipos celulares responderam aos tratamentos. Os PBMC, neutrófilos e THP-1 tratados com BAY 41-2272 produziram significativamente mais superóxido (cerca de 50% mais), e apresentaram significativamente maior atividade fagocítica (cerca de 54% mais), microbicida (cerca do dobro) comparados ao grupo controle não tratado, além de produzir TNFa. Ainda, o tratamento com o fármaco aumentou a expressão do gene da gp91phox nas THP-1 e PBMC. BAY 41-2272, especialmente na dose de 3mM, mostrou um grande potencial na ativação dos fagócitos em vários aspectos. Este potencial pode ser explorado na busca por novas terapias destinadas ao controle de infecções, principalmente no caso das imunodeficiências. / Phagocyte activation is critical role for host defense against several pathogens, so that studies developing alternatives for activating these cell are very important. We investigated the effects of BAY 41-2272 on phagocytes activation. For this purpose we evaluated several aspects indicating cellular activation, as phagocytosis, superoxide release and microbicidal activity. We used PBMC, neutrophils and THP-1 cell lineage cultured or not with BAY 41-2272 (1mM and 3mM) for 1h or 48h at 37°C. Superoxide release was tested by superoxide dismutase-inhibitable cytochrome c reduction assay; phagocytosis was evaluated through co-culture with zymosan particles and counting of ingested particles; and microbicidal activity was measured through co-incubation with enteropathogenic E. coli followed by counting of CFU from recovered bacteria from phagocytes. We analyzed the IL-12, IFN-g and TNF-a cytokine production and gp91phox gene expression. All cell types showed a response to treatments. PBMC, PMN and THP-1 treated with BAY 41-2272 produced significantly more superoxide (about 50% more), and presented significantly more phagocytic (about 54% more), microbicidal (about twice) activity than control group and production more TNF-a than control group. The expression of CYBB gene was more expressed on treated cells than control. BAY 41-2272, especially at 3mM, showed a great potential in activation of phagocytes in several aspects. This potential should be investigated at the light of new therapies seeking infection control, mainly in immunodeficiency.

O processo de morte por apoptose pode ser dividido em duas vias: intrínseca e extrínseca. A sinalização via FAS (extrínseca) pode ocorrer independente (células Tipo I) ou dependente da mitocôndria (células Tipo II). É importante considerar que: 1) Resultados prévios mostraram que doses subletais de CHX foram capazes de sensibilizar células Tipo I e Tipo II à apoptose e de converter células Tipo II em Tipo I; 2) Um dos mecanismos envolvidos pode ser o recrutamento de FAS para as \"balsas lipídicas\"; 3) A PGE2 ativa PKA pelo aumento de cAMP via EP2 e EP4, que fosforila ezrina, envolvida nesse processo; 4) A PGE2 pode induzir apoptose em linhagens celulares e sensibilizá-las a esse processo. Assim, formulamos a hipótese de que a PGE2 poderia, assim como a CHX, sensibilizar certas células à apoptose e converter células Tipo II em Tipo I. Esse efeito não foi observado em células DO11.10 nas quais a apoptose foi induzida por CD95L solúvel e em células Tipo I e Tipo II, nas quais a apoptose foi induzida pelo anticorpo agonista anti-FAS. / The death process by apoptosis can be divided into two pathways: intrinsic and extrinsic. The signaling by FAS (extrinsic) may occur in a mitochondrial independent (Type I cells) or dependent (Type II cells) manner. It is important to consider that: 1) Previous results demonstrated that sub-lethal doses of CHX were able to sensitize type I and type II cells to apoptosis and to convert type II cells into type I; 2) One of the mechanisms involved can be FAS recruitment to \"lipid rafts\"; 3) PGE2 activates PKA by increasing cAMP via EP2 and EP4, which phosphorylates of Ezrin, involved in this process; 4) PGE2 can induces apoptosis in cell lines and can to sensitize them to this process. So, we hypothesized that PGE2 could, similarly to CHX, sensitize certain cells to apoptosis and convert type II cells into type I. This effect was not observed in DO11.10 cells in which apoptosis was induced by soluble CD95L and in type I and type II cells, in which apoptosis was induced by agonist anti-FAS antibody.

A Via Alternativa é a principal via de ativação do sistema complemento (SC), sendo o Fator H (FH) um de seus principais reguladores. No presente estudo, nós investigamos os mecanismos moleculares pelo qual o paciente com a mutação Arg127His no FH possui deficiência do SC. Para isto, utilizamos fibroblastos de paciente e individuo normal estimulados com IFN-<font face=\"Symbol\">g e verificamos que as células do paciente eram capazes de produzir FH, contudo a maior parte das proteínas estava retida no retículo endoplasmático (RE). Em paralelo, transfectamos células Cos-7 com plasmídeos contendo a mutação CG453T<font face=\"Symbol\">&#174; CA453T e observamos que a mutação foi responsável pelo retardo na secreção de FH. Apesar da mutação reduzir a secreção de FH, observamos que a capacidade de FH atuar como co-factor não foi afetada. Assim, avaliamos se o uso de chaperonas químicas poderia induzir a secreção da proteína e observamos que houve aumento na secreção de FH nos fibroblastos. Desta forma, propomos o uso desses fármacos como alternativa de tratamento para melhorar a sobrevida do paciente. / Factor H (FH) is one of the most important regulatory proteins of the alternative pathway of the complement system (CS). In this study, we investigated the consequences of FH Arg127His mutation to the secretion ratio of this protein by skin fibroblasts in vitro. We stimulated the FH synthesis from patient and normal control with IFN<font face=\"Symbol\">g when we observed that the patient cells were able to synthetize FH, however this mutant protein was mainly retained at the endoplasmic reticulum. In parallel, we transfected Cos-7 cells with plasmids containing CG453T<font face=\"Symbol\">&#174; CA453T mutation and observed that the mutation was responsible for the delay in the FH secretion. Although the mutation reduced the FH secretion, we observed that the FH function was not affected. Thus, we evaluated whether the treatment with chemical chaperones could release FH to the culture supernant. We observed that patients fibroblasts treated increased the secretion of FH. In conclusion, we suggest the use of these chemical chaperones as a potential alternative therapeutic to improve the patients survival.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-12-23T12:26:14Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 716349 bytes, checksum: 491af184849bdcb2477fa46e3081a75f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-23T12:26:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 716349 bytes, checksum: 491af184849bdcb2477fa46e3081a75f (MD5) Previous issue date: 2016-07-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os insetos respondem à infecção através da montagem de reações imunes do tipo celular e humoral. Os reguladores primários dessas respostas são células chamadas hemócitos, os quais medeiam importantes respostas celulares, incluindo a fagocitose, encapsulamento, nodulação, e também segregam fatores humorais, tais como opsoninas, fatores de melanização e peptídeos antimicrobianos. Os hemócitos circulam ao longo da hemocele (cavidade corporal do inseto) pelo fluxo rápido da hemolinfa (sangue), além disso, partes desses hemócitos também existem como células sésseis que estão associados aos tecidos. As larvas de Galleria mellonella são uma alternativa viável para os modelos tradicionais dos mamíferos para estudar a eficácia de drogas antimicrobianas e a patogênese de microrganismos in vivo. No entanto, apesar da sua importância como um modelo de infecção, aspectos biológicos sobre as células do sistema imunológico, tais como a densidade e dinâmica dos hemócitos das larvas são mal compreendidos. No presente trabalho, investigamos a resposta imune celular dos hemócitos circulantes das larvas de G. mellonella contra diferentes cepas da bactéria Gram-negativa Actinobacillus pleuropneumoniae: baixa virulência (780), alta virulência (1022), e cepas de referência do sorotipo 8 (R8). Os hemócitos foram classificados com base no seu tamanho, morfologia, coloração e seus papeis na resposta imune, incluindo cinco tipos: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos, esferulócitos, e oenocitóides. Contagem total de hemócitos, contagem diferencial de hemócitos, atividade dos fagolisossomos, resposta autofágica, viabilidade celular, e a ativação da caspase-3 (como indicador de apoptose) foram determinados em hemócitos circulantes provenientes de larvas desafiadas e controle. Demostramos pela primeira vez no modelo de G. mellonella que os plasmatócitos e granulócitos ativam suas respostas autofágicas através da formação dos autofagossomos após o contato com A. pleuropneumoniae. Além disso, nossos dados demonstram que a imunidade celular do presente modelo de infecção muda dependendo do grau de virulência das cepas bacterianas. / Insects respond to infection by mounting cellular and humoral immune reactions. The primary regulators of these immune responses are cells called hemocytes, which mediate important cellular immune responses including phagocytosis, encapsulation, nodulation and also secrete immune factors such as opsonins, melanization factors and antimicrobial peptides. Hemocytes circulate through the hemocoel (body cavity) by the swift flow of hemolymph (blood), and part of these hemocytes population are sessile and are attached to tissues. Larvae of Galleria mellonella is a widely used factitious host as a viable alternative to traditional mammalian models to study the efficacy of antimicrobial drugs and the microbial pathogenesis in vivo. However, despite their importance as an infection model, biological aspects about the immune cells, such as density and hemocyte dynamic of larvae are poorly understood. In the present study, we investigated the cellular immune response of hemocytes from G. mellonella larvae against three strains of the gram-negative bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae: low virulent (780), high virulent (1022), and the serotype 8 reference strain (R8). Five types of larval hemocytes, prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, oenocytoids, and spherulocytes, were distinguished according to size, morphology, detection by molecular probes, dye-staining properties, and their role in the immune response. Total hemocyte count, differential hemocyte count, lysosome activity, autophagic response, cell viability, and caspase-3 activation were determined in circulating hemocytes of naïve and infected larvae. Granulocytes and plasmatocytes were the major hemocyte types involved in the cellular defense against A. pleuropneumoniae; these hemocytes activated phagolysosome activities associated with an autophagic response against the bacteria. Moreover, our results showed that apoptosis in circulating hemocytes after exposure to virulent bacterial strains was related to an excessive autophagic cell death response induced by stress and subsequent caspase-3 activation.

A Asma vem apresentando taxas de prevalência crescentes em todo o mundo. Os objetivos deste trabalho são avaliar a presença de elementos celulares e humorais indicativos em sangue e colostro de mães asmáticas e saudáveis e no sangue de cordão umbilical de seus recém-nascidos (RN). Observamos menor produção de IgG pelas mães asmáticas. Células dendríticas de mães asmáticas possuem maior expressão de CD80 e CD86. Mães asmáticas possuem mais células de memória central. Linfócitos T CD4+ de mães asmáticas produzem níveis maiores IFN-g. Células CD3+ e CD4+ de mães asmáticas produziram mais IL-13. Mães saudáveis produziram maiores quantidades de IL-10. Concluímos que mães asmáticas possuem menores níveis de IgG e IgM, o que parece aumentar dos níveis de IgE, mães asmáticas possuem mais células de memória central, linfócitos T CD4+ produzem maiores quantidades de citocinas como IL-13 e IFN-g, células dendríticas de mães asmáticas possuem maior expressão das moléculas co-estimulatórias, assim como seus RNs possuem maior expressão de CD80. Células de mães asmáticas produzem níveis menores de IL-10, o colostro de mães atópicas não possui diferenças entre os parâmetros aqui estudados. O aleitamento materno deve ser indicado para mães asmáticas e seus filhos. / Asthma has been presenting higher prevalence rates worldwide. The objective of this work is to evaluate the presence of cellular elements and humoral indicative in blood and colostrums of healthy and asthmatic mothers and in cord umbilical blood of their newborn (NB). Lower production of IgG from asthmatic mothers was observed. Dendritic cells of asthmatic mothers have higher CD80 and CD86 expression. Asthmatic mothers have more central memory cells. TCD4+ lymphocyte of asthmatic mothers produce higher levels of IFN-g. CD3+ and CD4+ cells of asthmatic mothers produce higher quantity of IL-13. Healthy mothers produce higher quantity of IL-10. We conclude that asthmatic mothers have lower levels of IgG and IgM, and this seems to raise the IgE levels, asthmatic mothers have more central memory cells, CD4+ T lymphocyte and produce higher quantities of cytokines such as Il-13 and IFN-g. Dendritic cells of asthmatic mothers have higher expression of costimulatory molecules, as well as their NBs have higher expression CD80. Cells of asthmatic mothers produce lower levels of IL-10, the colostrums of atopic mothers does not have differences in the parameters here studied. The maternal breastfeeding must be indicated for asthmatic mothers and their of spring.

A Bordetella pertussis é a bactéria causadora da coqueluche, doença infectocontagiosa que tem reemergido em diversos países apesar das altas coberturas vacinais. Como os indivíduos mais afetados são crianças menores de seis meses de idade, a vacinação de gestantes com uma dose de vacina adsorvida contra tétano, difteria e coqueluche (B. pertussis acelular - dTpa) foi proposta. O objetivo é promover a transferência de altos títulos de anticorpos maternos ao feto e recémnascido, resultando na sua proteção até que o seu esquema vacinal esteja concluído. Esta estratégia é empregada em diversos países e no final de 2014 foi introduzida no Brasil. Entretanto, pouco se sabe sobre sua eficácia, efetividade e interação com a posterior vacinação da criança, que é realizada com a formulação de células inteiras (DTP), enquanto outros países substituíram-na pela formulação acelular (DTPa). Sabe-se que a vacinação materna induz anticorpos que ajudam a proteger recém-nascidos da infecção, mas podem, também, neutralizar a vacinação da criança, diminuindo a eficiência vacinal, além de promover a transferência de antígenos para o feto, induzindo desvio do perfil de resposta. Esses aspectos são particularmente importantes e devem ser investigados quando novos programas de vacinação materna são implantados. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta celular contra B. pertussis em parturientes e neonatos no dia do parto, e em lactentes após vacinação completa contra a coqueluche com DTP no primeiro ano de vida, comparando-se o grupo proveniente de mães que foram vacinadas durante a gestação com as que não receberam a dose de reforço. As células mononucleares do sangue periférico e de cordão umbilical dos participantes foram isoladas e estimuladas com antígeno bacteriano ou antígeno policlonal em cultura. Após o tempo estipulado, verificou-se o perfil de expressão gênica por qPCR nas células e a concentração de citocinas de interesse em sobrenadante, por meio de citometria de fluxo. Os dados obtidos mostram que a vacina na gestação induz resposta celular favorável à proteção contra infecção em gestantes, com produção de citocinas de perfil Th1 após estímulo antigênico, enquanto que nos neonatos poucas citocinas estavam acima dos limites de detecção. Quando se comparou a resposta de lactentes nascidos de mães vacinadas ou não durante a gestação, não foi encontrada diferença significativa nos níveis de citocinas produzidos, sugerindo que os anticorpos maternos presentes durante o desenvolvimento fetal e os primeiros meses de vida das crianças não interferiu no processo de reconhecimento e geração de resposta específica. Apesar do número amostral limitado, este trabalho mostra um panorama da interação da vacinação materna com a resposta celular à vacinação da criança no seu primeiro ano de vida, mostrando que a princípio a dose de reforço com dTpa durante a gestação é capaz de gerar resposta celular protetora nas gestantes, prevenindo-as de transmitir a doença a seus filhos, e a resposta humoral produzida não interfere na geração de resposta celular de seus filhos após o seu próprio esquema de imunização. / Bordetella pertussis is the bacterial agent of whooping cough, an infectious and contagious re-emerging disease despite high vaccine coverage. As the most affected are children younger than six months of age, a dose of tetanus/diphtheria/pertussis vaccine (acellular pertussis - Tdap) in pregnancy was proposed. It is aimed to promote the transfer of high maternal antibodies\' titres to the foetus and newborns, resulting in their protection until their own vaccination scheme is completed. This strategy is present in several countries, and it was implemented in Brazil by the end of 2014. However, little is known about its efficacy, effectiveness and interaction with the subsequent child\'s vaccination, which comprehends the whole-cell formulation (DTP), while other countries replaced it for the acellular version (DTaP). Maternal vaccination induces antibodies that would protect newborns from infection, but they can also neutralize the effect of the child vaccination, reducing the vaccine efficiency. Besides, it can promote the transfer of antigens to the foetus, which can induce deviation in the response pattern. These aspects are particularly important and should be investigated when new maternal vaccination programs are implemented. Therefore, the aim of this project was to evaluate the cellular response against B. pertussis in women at labour and their neonates, as in young children after complete pertussis vaccination by the first year of life, comparing groups from vaccinated and non-vaccinated women during pregnancy. Peripheral blood and cord blood mononuclear cells were isolated and stimulated with bacterial or polyclonal antigen in culture. After the stipulated time the gene expression profile and cytokine concentration were evaluated by qPCR and flow cytometry. Data from the present study show that pregnancy vaccination inducing favourable cellular response for protection against infection in pregnant women, with Th1 cytokines\' production upon antigenic stimulus, while in newborns few cytokines were detected above the detection limit. When comparing children\'s response, born either from vaccinated or unvaccinated mothers, cytokine levels were not significantly different, suggesting that maternal antibodies present during foetal development and first months of life do not interfere with recognition and cellular response generation to vaccination. Despite limited sample size, this work shows a broader view of interaction between maternal and child vaccination, showing that the Tdap boost dose during pregnancy may be able to generate protective response in women, preventing them to transmit the disease to children, and the induced humoral response may not interfere in generating cellular response in children after their own vaccination.

A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção sistêmica que tem como agente etiológico o P. brasiliensis e afeta os pulmões, áreas mucocutâneas e o sistema mononuclear-fagocitário. Trabalhos anteriores usando camundongos BALB/c atímicos e eutímicos demonstraram que os animais deficientes de células T são mais suscetíveis à infecção pelo P. brasiliensis e indicaram que a imunidade celular e natural são fundamentais para promover a resistência e o controle da doença. Com base nestes dados, nosso trabalho teve por objetivo demonstrar a importância de alguns mediadores da resposta imune natural durante a PCM murina. Utilizamos como abordagem experimental a depleção de IFN-&#947;, IL-12, leucócitos PMN e células NK em camundongos BALB/c atímicos e eutímicos infectados por via intratraqueal com leveduras de P. brasiliensis. Nossos resultados indicaram que a depleção de leucócitos PMN não alterou a gravidade da doença, entretanto essas células parecem exercer importante papel na modulação da síntese de citocinas em animais atímicos. A IL-12, por sua vez, demonstrou ter ação relevante na resposta ao P. brasiliensis em animais deficientes de células T, pois a sua neutralização levou ao aumento do número de leveduras viáveis recuperadas nos órgãos de disseminação (fígado e baço). Os animais eutímicos que foram tratados com AcM anti IL-12 apresentaram exacerbação da doença pulmonar e esplênica mas em ambas as linhagens não encontramos quaisquer alterações nas reações de HTT e no tempo de sobrevida. Os nossos experimentos confirmaram o papel fundamental do IFN-&#947; no controle doença tanto nos animais eutímicos que apresentaram redução das reações de HTT e exacerbação da doença, como também nos deficientes de células T que demonstraram, além do aumento da gravidade da doença, a redução do tempo de sobrevida. Analisamos também a participação da célula NK por serem consideradas fontes expressivas da síntese de IFN-&#947;. Observamos a exacerbação da doença pulmonar e a disseminação do fungo para o fígado e baço nos animais atímicos. A depleção dessas células em animais eutímicos induziu somente o agravamento da infecção pulmonar, sem maior comprometimento de outros órgãos. A reação de HTT e a taxa de mortalidade não sofreram alterações em ambas as linhagens. As células NK demonstraram atuar como moduladoras da síntese de imunoglobulinas em animais atímicos e de citocinas em eutímicos e também participaram da quimiotaxia de leucócitos PMN nos períodos iniciais da PCM. Em conclusão, usando um modelo experimental homogêneo (cepa infectante e linhagens de hospedeiros definidos) pudemos, pela primeira vez, demonstrar que o IFN-&#947; é o mais importante mediador da imunidade natural na imunoproteção ao P. brasiliensis. Verificamos também a contribuição relativa da IL-12 e dos leucócitos PMN na proteção da PCM pulmonar. Além disso, também pela primeira vez, foi caracterizada in vivo a importância das células NK no controle da infecção pelo P. brasiliensis. / The Paracoccidioidomicose (PCM) is a systemic infection caused by P. brasiliensis and affects the lungs, mucocutaneous areas and the mononuclear-phagocitary system. Previous works using athymics and euthymics BALB/c mice demonstrated that T cells deficient animals are more susceptible to the infection and indicated that the cellular and natural immunity is essential to promote the resistance and the control of disease. Based in these data, the objective of our work was demonstrated the importance of some natural mediators during murine PCM immune response. As experimental protocols we used the systemic depletion of IFN-&#947;, IL-12, PMN leukocytes and NK cells in athymics and euthymics BALB/c mice infected by intratracheal route with P. brasiliensis yeasts. Our results indicated that PMN leukocytes depletion did not alter the severity of infection; however these cells showed to exert important function in the cytokines synthesis modulation in athymics mice. In turn, the IL-12 demonstrated relevance action in T cells deficient mice response to P. brasiliensis infection, its neutralization induces an increased of viable yeasts numbers recovered in the dissemination organ (liver and spleen). The euthymics animals treated with anti IL-12 MAb presented an exacerbation of pulmonary and spleenic disease but in both species did not finds any alteration in the HTT reaction or survival times. Our experiments confirm the fundamental action of IFN-&#947; in disease control in both strains that showed decreased in the HTT reaction, disease exacerbation. These depletion in T cells deficient mice it also induced a decreased in survival times. We also analyzed the NK cells participation because are considered important sources of IFN-&#947; synthesis. We observed in athymics mice an exacerbation of pulmonary disease and fungal dissemination to liver and spleen. This depletion, in euthymics, mice induces only the pulmonary infection aggravation, other organs were not affected. The HTT reaction and mortality alterations were not observed in both strains. We demonstrated that NK cells acting as immunoglobulins synthesis modulators in athymics mice and the cytokines in euthymics mice and also participated of PMN leukocytes attractive in early PCM. In conclusion, using an experimental homogeneous model (infectant agent and strains hosts defined) we demonstrated for the first time that the IFN-&#947; is the most important mediator of the natural immunity in the immunoprotection to the P. brasiliensis. We also verificated the relative contribution of IL-12 and PMN leukocytes in the PCM pulmonary protection. Moreover, we also characterized, for the first time in vivo, the NK cells importance to the control of P. brasiliensis infection.

A cromoblastomicose é uma micose crônica que causa lesões granulomatosas e supurativas que atingem a pele e o tecido subcutâneo. Micose cosmopolita e freqüentemente observada no Brasil. As lesões aumentam progressivamente e posteriormente podem desenvolver um processo crônico e que geralmente não respondem a uma terapia convencional. Entretanto o mecanismo de defesa da resposta imune adaptativa, principalmente das células T na cromoblastomicose ainda não está definido. Em nosso estudo avaliamos a produção de citocinas e a resposta linfoproliferativa de diferentes amostras de sangue de pacientes com cromoblastomicose e indivíduos saudáveis in vitro após estimulação com antígenos do fungo. Além disso, nos acompanhamos esses pacientes sob terapia antifúngica em diferentes períodos de tratamento. Este estudo mostrou que a forma grave da cromoblastomicose é caracterizada pelo aumento na produção de IL-10 e deficiência na proliferação das células T após estimulação com antígenos do fungo. Ao contrario, pacientes com a forma leve da doença foram capazes de secretar predominantemente IFN-&#947;, que é uma citocina importante para defesa do hospedeiro. Em adição eles secretaram menores quantidades de IL-10 e suas células T proliferaram eficientemente in vitro após estimulação do fungo. Os pacientes avaliados após 6 meses de terapia antifúngica as células T proliferaram e secretaram altos níveis de IFN-&#947; eficientemente após estimulação. Ao contrário, pacientes com 12 meses de tratamento ocorreu um aumento na produção de IL-10 uma diminuição nos níveis de linfoproliferação. Interessantemente, os monócitos obtidos desses pacientes durante a doença foram capazes expressar moléculas co-estimulatorias (CD80 e CD86) e também aumento nos níveis de HLA-DR após estimulação com LPS. Além disso, monócitos desses pacientes secretam altos níveis de IL-12 e TNF-&#945;, sugerindo que a suscetibilidade desses pacientes não apresentam uma deficiência na apresentação de antígeno por monócitos. Em suma, em nossos resultados mostraram que alta secreção de IFN-&#947; e eficiente proliferação de células T de pacientes com cromoblastomicose está diretamente relacionada com a forma leve da doença, enquanto que a produção de IL-10 e diminuição na proliferação de células T caracterizam a forma grave da doença. / Chromoblastomycosis is a chronic granulomatous and suppurative disease that causes lesions mainly in skin and subcutaneous tissues. Although found worldwide, this mycosis is frequently observed in tropical countries such as Brazil. The skin lesions increase slowly and progressively in a chronic process that usually relapse even after canonical treatment. However, the mechanism of the host adaptive immune response, specially the role of T cells, in chromoblastomycosis is still unclear. In studies here, we evaluated the cytokine production and T cell response of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from different patients and healthy controls upon in vitro stimulation with fungal antigens. Moreover, we performed a follow-up study in patients undergoing long-term antifungal treatment. We collected PBMC samples from patients with an active form (either severe or mild skin lesions) of chromoblastomycosis and PBMC samples from healthy individuais. In PBMC from patients with a severe form of the disease we found a predominant production of IL-10 over IFN-gamma and a deficiency in T cell proliferation upon fungal antigen stimulation. In contrast, PBMC from patients in a mild form of the disease were able to secrete predominantly IFN-gamma, a cytokine important for host defense. In addition, they secreted low amounts of IL-10 and their T cells efficiently proliferated under in vitro stimulation with the fungal antigens. Surprisingly, the patients undergoing 6 months antifungal therapy PBMC from patients secreted higher amounts of IFN-gamma and their T cells proliferated efficiently upon stimulation. On the contrary, PBMC from patients after 12m of treatment showed an increase in IL-10 secretion followed by an inefficient T cell proliferation. Interestingly, monocytes obtained from patients during chronic phase of the disease were able to up-regulate their co-stimulatory molecules (CD80 and CD86) as well as their HLA-DR upon in vitro fungal stimulation. Moreover, monocytes from these patients secreted high amounts of pro-inflammatory cytokines IL-12 and TNF-alfa, suggesting that susceptibility of patients must be due to a immune deficiency other than a monocyte deactivation. Altogether, our data clearly show that a higher secretion of IFN-gamma and an efficient T cell proliferation of PBMC from infected individuals can distinguish the mild from the severe form of the chromoblastomycosis

Mesmo com o constante avanço no estudo da sibilância e asma, existem inúmeras controvérsias sobre a participação da exposição à endotoxina, background genético e ativação celular. Investigamos a participação da exposição à endotoxina ambiental e o papel do LPS no desenvolvimento dos fenótipos de sibilância e asma. Para tanto selecionamos crianças sibilantes e não sibilantes, e crianças asmáticas e não asmáticas, sendo seu sangue coletado e as PBMC cultivadas com LPS. O sobrenadante foi colhido para análise de citocinas por ELISA, e analisamos os polimorfismos nos genes de CD14 e TLR4 por PCR-RFLP. Não encontramos relação entre a exposição à endotoxina ambiental e o quadro de sibilância. Observamos que PBMC estimuladas ou não com LPS de crianças sibilantes e asmáticas produzem baixos níveis de IL-12 e IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 quando comparado com crianças não sibilantes e não asmáticas. Os polimorfismos de TLR4 e CD14 não tiveram associação com sibilância ou asma. Nossos dados sugerem que não somente a polarização Th2 é importante para desenvolver essas patogenias, mas também uma diminuição na resposta Th1. / Although the great advance in the study of asthma and wheezing, there are numerous controversies about the involvement of endotoxin exposure, genetic background and cellular activation. We investigated the involvement of environmental endotoxin exposure and the role of LPS in the development of phenotypes wheezing and asthma. For experiments we selected wheezing and non-wheezing, and asthmatic and non-asthmatic children, and their blood collected and the PBMC cultured with LPS. The supernatant was collected for analysis cytokines by ELISA, and analyzed CD14 and TLR4 polymorphisms by PCR-RFLP. There was no relationship between environmental endotoxin exposure and the framework of wheezing. We observed that LPS-stimulated PBMC of wheezing and asthmatic children produce lower levels of IL-12 and IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 when compared with non-wheezing and non-asthmatic children. The polymorphisms TLR4 and CD14 were not associated with wheezing or asthma. Our data suggest that not only Th2 polarization is important to develop these diseases, but also a decrease in Th1 response.