CARVALHO, Raphael Farias de. Efeitos cistométricos da castração hormonal e administração diária de tadalafila em camundongos com hiperatividade detrusora induzida pela deficiência crônica de óxido nítrico. 2015. 49 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-15T13:32:43Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfcarvalho.pdf: 1061042 bytes, checksum: 5eba89dfef511fec69ce8e8878c6f79e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-15T13:50:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfcarvalho.pdf: 1061042 bytes, checksum: 5eba89dfef511fec69ce8e8878c6f79e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-15T13:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfcarvalho.pdf: 1061042 bytes, checksum: 5eba89dfef511fec69ce8e8878c6f79e (MD5) Previous issue date: 2015 / Lower Urinary Tract Symptoms (LUTS) represents one of the most commonly complaints in male. Several voiding disorders can be involved in the pathogenesis of LUTS. Hipogonadism is a common and underdiagnosed disease in the aging male, usually presenting simultaneously with LUTS. The objective of this study was to evaluate the cystometric effects of chronic tadalafil administration in castrated mice with nitric oxide cronic deficiency. The results of tadalafil administration were compared in castrated mice (hypogonadics) and after testosterone replacement (eugonadics). A total of 42 mice were randomized to six groups. Group 1 (L-NAME): L-name (60mg/kg), which is an oxide-nitric sintethase inhibitor, was administrated in drinking water. Group 2 (DTAD): L-name (60mg/kg) + diluent of tadalafil (mannitol and xantane gum). Group 3 (TAD): L-name + daily tadalafil (4mg/kg). Group 4 (ORQ): L-name + orchiectomy. Group 5(ORQ+TAD): L-name + orchiectomy + tadalafil. Group 6 (TEST): L-name + ORQ + TAD + testosterone undecanoate SC single dose (100mg/kg). During cystometry after thirty days, five parameters were measured: number of non-voiding contractions before first micturition (NVC) and micturition frequency (FM). Threshold pressure (TP) and basal pressure (BP) were expressed as mmHg, volume threshold (VT) was expressed as mL. Statistical analysis were held with GraphPad Prism®, using analysis of variance (ANOVA) and Tukey’s tests. Normality distribution was held with Kolmogorov-smirnov test. Level of significance was 5% (P<0.05). Mean and standard desviation (SD) were analysed. TAD (1.28±1.89), ORQ(0.16±0.40), and TEST (1.14±1.21) Groups had lower number of NVC compared to L-name (5.42±4.11) Group; ORQ + TAD(1,5±1,64) and ORQ had similar NVC (F=4,24, p=0,0042). Frequency of micturition: TAD (1.12±0.38) and ORQ (0.60±0.23) Groups had lower FM compared to L-name Group (2.27±0.68); ORQ + TAD (0.75±0.28) and ORQ (0.60±0.23) had similar FM; TEST Group (2,74±0,56) had higher FM compared to ORQ, TAD e ORQ + TAD Groups (F=28,82, p<0,0001). Threshold pressure: TAD (27.57±7.41) and ORQ (27±5.51) Groups had lower TP compared to L-name (41.43±10.86); ORQ + TAD (32.17±7.27) and ORQ (27±5.51) had similar TP; TEST (42.14±6.09) had higher TP compared to ORQ (27±5.51) and TAD (27.57±7.41) Groups (F=5,78, p=0,0006). Basal pressure: TAD (18.71±3.94) and ORQ (13±10.94) Groups had lower BP compared to L-name (31.14±4.56); ORQ(13±10.94) and ORQ+TAD (19.83±3.25) had similar BP; TEST(28±5.83) had higher BP compared to ORQ (F=5,72, p=0,0006). There were no statistical diferences in volume threshold between groups. There were no diferences between DTAD and L-name in any parameter. In conclusion, Tadalafil and castration were equally effective reducing detrusor overactivity and relaxing urethra in mice with nitric oxide chronic deficiency. Co-treatment of testosterone with tadalafil to castrated rats improves frequency of micturition, basal pressure and threshold pressure when compared to castration alone, suggesting an androgen-dependent alternative pathway in smooth muscle contraction e relaxation. / Sintomas do trato urinário inferior (STUI) representam uma das queixas mais comuns em homens. Diferentes distúrbios da micção podem resultar em STUI. Hipogonadismo é uma doença comum e subdiagnosticada no idoso, podendo estar associado a STUI. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da administração crônica da Tadalafila em camundongos hipogonádicos com deficiência crônica de óxido nítrico através de estudo cistométrico in vivo. Para tanto, foi comparado a resposta da Tadalafila em animais castrados (hipogonádicos) e após reposição de testosterona (normogonádicos). Um total de quarenta e dois camundongos foram randomizados em seis grupos. Grupo 1(L-NAME): L-NAME (60mg/kg), que é um inibidor da síntese da óxido-nítrico sintase, foi administrado em água de beber. Grupo 2 (DTAD): L-NAME (60mg/kg) + diluente da Tadalafila (goma xantana e manitol). Grupo 3 (TAD): L-NAME (60mg/kg) + Tadalafila diário (4mg/kg). Grupo 4 (ORQ): L-NAME (60mg/kg) + orquiectomia. Grupo 5 (ORQ + TAD): L-NAME (60mg/kg) + orquiectomia + Tadalafila (4mg/kg). Grupo 6 (TEST): L-NAME (60mg/kg) + orquiectomia + Tadalafila (4mg/kg) + Undecilato de Testosterona SC (100mg/kg) em dose única. Após trinta dias, todos os animais foram submetidos a cistometria. Foram avaliados o número de contrações não-miccionais antes da primeira micção (NVC) e a frequência de micção (FM). Limiar de pressão (LP) e pressão basal (PB) foram medidos em mmHg, limiar de volume (LV) em ml. A avaliação estatística foi realizada com o software GraphPad Prism®, utilizando análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey. A distribuição de normalidade foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Nível de significância utilizado foi de 5% (p<0,05). A média e o desvio-padrão (DP) foram mensurados. Os Grupos TAD (1.28±1.89), ORQ (0.16±0.40) e TEST (1.14±1.21) tiveram menor número de NVC comparados ao Grupo L-NAME (5.42±4.11); o Grupo ORQ + TAD (1.5±1.64) e ORQ (0.16±0.40) foram semelhantes neste parâmetro (F=4.24, p=0,0042). Com relação à frequência miccional, os Grupos TAD (1.12±0.38) e ORQ (0.60±0.23) tiveram menores médias que o Grupo L-NAME (2.27±0.68); os Grupos ORQ + TAD (0.75±0.28) e ORQ (0.60±0.23) tiveram FM semelhantes; o Grupo TEST (2.74±0.56) teve FM superior aos Grupos ORQ, TAD e ORQ + TAD (F=28.82, p<0.0001). Ao avaliar limiar de pressão, os Grupos TAD (27.57±7.41) e ORQ (27±5.51) tiveram médias inferiores ao Grupo L-NAME (41.43±10.86); ORQ + TAD (32.17±7.27) e ORQ (27±5.51) foram semelhantes entre si; o Grupo TEST (42.14±6.09) teve LP superior a ORQ (27±5.51) e TAD (F=5.78, p=0.0006). No que se refere à pressão basal, os Grupos TAD (18.71±3.94) e ORQ (13±10.94) tiveram médias inferiores ao L-NAME (31.14±4.56); ORQ(13±10.94) e ORQ+TAD (19.83±3.25) foram similares entre si; o Grupo TEST(28±5.83) teve média da PB superior ao ORQ (F=5,72, p=0,0006). Não houve diferença estatística entre os grupos com relação ao limiar de volume. Os Grupos DTAD e L-NAME foram semelhantes em todos os parâmetros. Em conclusão, a Tadalafila e a castração foram igualmente efetivos em reduzir a hiperatividade detrusora e relaxar a uretra em camundongos com deficiência crônica de óxido nítrico. A administração de testosterona e Tadalafila de forma combinada para camundongos castrados com deficiência crônica de óxido nítrico aumenta a frequência de micção, pressão basal e limiar de pressão em relação à castração isolada, sugerindo uma via alternativa andrógeno-dependente relacionada com contração e relaxamento do músculo liso.

A trombina é uma serino protease da família das quimotripsinas envolvida na digestão e processos degradativos que possui um importante papel na ativação dos fatores da coagulação e nas vias fibrinolíticas apresentando-se, portanto, como um potencial alvo para o desenvolvimento de novos agentes anticoagulantes. Uma estratégia moderna empregada na busca por tais compostos envolve a elucidação dos aspectos estruturais e dinâmicos associados ao reconhecimento molecular entre enzima e seus moduladores sejam por estratégias ditas experimentais quanto computacionais. Sendo assim, este trabalho apresenta a caracterização de sistemas envolvendo inibidores de trombina, tanto covalentes (PPACK) quanto alostéricos (suramina), através de simulações de dinâmica molecular como meio de estudar a dinâmica e, assim, entender o processo de inativação da trombina para o desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos. Os resultados obtidos possibilitaram a caracterização da dinâmica de interação dos referidos inibidores com a trombina, permitindo-nos identificar: 1) o papel do solvente no reconhecimento enzima-inibidores; 2) a modulação conformacional da enzima-alvo na presença de seus moduladores; e 3) o efeito de forças associadas ao empacotamento cristalino sobre a formação de complexos enzima-inibidor. A partir da validação dos protocolos e resultados obtidos, da interação direta com outras metodologias experimentais e da extrapolação de observações funcionais, espera-se, portanto, que os resultados obtidos venham a contribuir no desenvolvimento de uma linha de pesquisas visando o planejamento, a síntese e a obtenção de novos candidatos a protótipos de agentes antitrombóticos. / Thrombin is a serine protease of the chymotrypsin family, involved in digestion and degradative processes playing an important role in the both coagulation factors activation and fibrinolitic pathways. These aspects turn this enzyme a potencial target to development of new anticoagulants agents. A modern approach employed in the search of such compounds involves the elucidation of structural and dynamics aspects associated to molecular recognition between enzyme and modulators through experimental and computational strategies. In this sense, this work presents the characterization of systems concerning thrombin inhibitors, both covalent (PPACK) and allosteric (suramin), through molecular dynamics simulations in order to elucidate and understand the dynamics of thrombin inactivation aiming the development of new antithrombotic agents. The results obtained enabled the characterization of interaction dynamics with these inhibitors to thrombin, allowing us to identify: 1) the role of solvent in enzyme-inhibitors recognition; 2) the conformational modulation of target-enzyme with modulators presence; and 3) the effect of forces associated to crystal packing in the generation of enzyme-inhibitor complexes. From the protocols validation and results obtained, associated to direct interacation with others experimental methodologies and extrapolation of functional observations, it is expected that the results obtained contribute in the promotion of a research line aiming the development, synthesis and the achievement of new candidates to prototypes of antithrombotic agents.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-02-19T18:08:21Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-02-25T16:55:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-25T16:55:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5) Previous issue date: 2015 / A busca de peptideos bioativos com potencial capacidade de interacao e modulacao da atividade proteolitica do proteassoma 20S constitui tema de grande interesse em biologia celular. O uso de inibidores de proteassoma ja vem sendo aplicado no tratamento de doencas como o cancer, e varias moleculas encontram-se atualmente em fase de testes clinicos. O presente trabalho teve como objetivos a purificacao do proteassoma 20S e a avaliacao do potencial inibitorio de peptideos sobre a atividade quimotripsina-simile do complexo 20S. Neste intuito duas abordagens distintas foram utilizadas: 1) analise do potencial inibitorio de moleculas analogas ao inibidor de proteassoma PR-11, e 2) obtencao de novos alvos com capacidade de interacao e modulacao da atividade proteassomal por meio de tripsinolise de proteinas sericas. Para purificacao do proteassoma 20S utilizou-se de filtracao molecular e troca ionica, as quais proporcionaram a obtencao de dois perfis distintos do complexo 20S, apos analise por eletroforese unidimensional. A confirmacao das identidades das subunidades do proteassoma e a identificacao de proteinas co-eluidas foram realizadas por espectrometria de massas. Quanto ao potencial inibitorio dos analogos do PR-11, foram selecionados os peptideos F12, G9F12 e I9F12. Esses demonstraram eficacia nas taxas de inibicao da atividade proteolitica do proteassoma 20S com destaque para o F12 o qual foi capaz de inibir em cerca de 70 e 53% a atividade quimotripsina simile, quando utilizado na concentracao de 0,25 e 0,125 ƒÊM respectivamente. Para a identificacao de novos alvos moduladores de atividade do proteassoma, proteinas sericas foram digeridas com tripsina seguido de avaliacao do potencial inibitorio dos peptideos resultantes. Os ensaios de atividade demonstraram cerca de 40 e 10% de inibicao quando os peptideos tripticos totais foram empregados nas concentracoes de 50 ƒÊM e 6,25 ƒÊM, respectivamente. A identificacao dos peptideos tripticos ligantes de proteassoma por espectrometria de massas necessitara de novas abordagens tecnicas para ligacao e recuperacao da fracao peptidica ligada. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram concluir que analogos estruturais do PR-11 representam moleculas inibidoras de alta potencia e ainda que a tecnica de tripsinolise serica utilizada, e capaz de fornecer peptideos alternativos para modulacao da atividade proteassomal. ________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : The search for bioactive peptides endowed with modulatory capability over the activity of 20S proteasomes is a subject of major interest in cell biology. Proteasome inhibitors have been applied in the treatment of diseases such as cancer, and several new molecules are currently under investigation. This study aimed the purification of the 20S murine proteasome and the evaluation of potential inhibitory peptides over its chymotrypsin-like activity. To accomplish these goals two different approaches were used: 1) analysis of the inhibitory activity of three PR-11 derivatives, and 2) generation of new proteasome target molecules through trypsinolysis of serum proteins. 20S proteasome purification was achieved by gel filtration and ion exchange. These chromatographic steps resulted in two distinct and highly homogeneous 20S complexes as judged by one-dimensional gel electrophoresis. Confirmation of the identities for alpha and beta proteasome subunits and co-eluted proteins was made by mass spectrometry. The inhibitory potential of three PR-11 analogs F12, G9F12 and I9F12 was then evaluated. These PR-11 derivatives proved to be efficient 20S proteasome inhibitors highlighting that F12 was able to inhibit approximately 70 and 53% of the chymotrypsin-like activity when used at a concentration of 0.25 and 0.125 μM respectively. For the identification of new target modulators of proteasome activity, serum proteins were digested with trypsin, followed by evaluation of the inhibitory potency of the resulting peptides. Activity assays showed approximately 40 and 10% inhibition when total tryptic peptides were used at concentrations of 50 and 6.25 μM, respectively. The identification of such novel proteasome ligands by mass spectrometry will require the utilization of new approaches for binding and recovering of the bound peptide fraction. The results of this study indicate that structural analogues of PR-11 represent inhibitory molecules endowed with high potency and serum trypsinolysis may offer alternative molecules for modulating proteasome activity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T04:24:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 190411.pdf: 1157171 bytes, checksum: 8d19ed7584db640cb747d47c90fe321f (MD5)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2010. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-13T18:45:48Z No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-06-20T13:38:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T13:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Dietas ricas em leguminosas têm sido associadas à baixa incidência de câncer em populações humanas, sendo essas plantas, ricas em inibidores de proteases. O BTCI (black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor) é um inibidor de protease da família Bowman-Birk, isolado de sementes da leguminosa Vigna unguiculata (feijão-de-corda), que inibe a tripsina e a quimotripsina simultaneamente. Diversos estudos mostraram o efeito de um Inibidor Bowman-Birk (BBI) no controle de vários tipos de câncer. Recentemente, o BTCI foi caracterizado como um agente anticarcinogênico em estudos in vitro utilizando células de câncer de mama. Os resultados encontrados nesse estudo apontam para efeitos citotóxicos e citostáticos, no entanto, o mecanismo molecular envolvido nesses eventos ainda não foi elucidado. Considerando que o câncer está, de forma geral, relacionado a disfunções no ciclo celular, a via ubiquitina-proteassoma torna-se alvo promissor para o controle de células cancerosas. A investigação dos efeitos do BTCI no proteassoma é uma das principais metas que nortearam o presente trabalho. A caracterização físico-química e molecular da associação BTCI-proteassoma é fundamental para a compreensão da atividade do BTCI, relacionada ao controle do ciclo celular de células de câncer de mama, visando à possível aplicação desse inibidor como agente anticarcinogênico. O BTCI apresentou inibição contra as três atividades proteolíticas do proteassoma 20S: quimotripsina, tripsina e caspase-like. Adicionalmente, peptídeos derivados do BTCI, com apenas um sítio de inibição, apresentaram inibição do proteassoma com menor afinidade, ou ativação de algumas atividades proteolíticas desse complexo macromolecular. O BTCI e o proteassoma 20S formaram complexos estáveis em temperaturas até 55ºC e em pHs neutros e básicos, sendo esse complexo sensível ao NaCl. Estudos in vitro mostraram que o BTCI é colocalizado com o proteassoma em células de câncer de mama MCF-7 no citoplasma e no núcleo e não altera a ubiquitinação de proteínas nessas células. O peptídeo derivado de BTCI, Pep1, que inibe o sítio da quimotripsina, não afeta o conteúdo de proteínas ubiquitinadas nas células MCF-7, o que pode estar relacionado com a inibição de proteínas E3 ligase, envolvidas na ubiquitinação de proteínas celulares. Esses dados indicam que a via ubiquitina-proteassoma está relacionada aos efeitos anticarcinogênicos do inibidor BTCI em células de câncer de mama, MCF-7, o que justifica a ampliação dos estudos nessa linha de pesquisa, visando à aplicação biotecnológica desse inibidor na terapia contra o câncer de mama. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diets rich in leguminous, a rich source of protease inhibitors, have been associated with low incidence of cancer in humans. The BTCI (black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor) is a Bowman-Birk protease inhibitor isolated from Vigna unguiculata (black-eyed pea) seeds, which inhibits trypsin and chymotrypsin simultaneously. Several studies have shown the effect of a Bowman-Birk inhibitor (BBI) in various types of cancer. Recently, BTCI was characterized as an anticancer agent in studies in vitro using breast cancer cells. The results from this study show cytotoxic and cytostatic effects of BTCI, however, the molecular mechanism involved in these events has not yet been elucidated. Considering that cancer is, in general, related to dysfunction in the cell cycle, the ubiquitin-proteasome pathway becomes a promising target for cancer cells control. The investigation of the BTCI effects on proteasome is one of the main purposes of the present study. The physical-chemical and molecular characterization of the BTCI-proteasome association is essential for understanding the activity of BTCI, related to cell cycle control in breast cancer cells, in order to consider its pharmacological application as anticarcinogenic agent. BTCI showed inhibition against all three proteolytic activities of 20S proteasome: chymotrypsin, trypsin and caspase-like. Additionally, peptides derived from BTCI, with only one inhibition site, showed proteasome inhibition with lower affinity or activation of some proteolytic activities of this macromolecular complex. The BTCI and the 20S proteasome formed stable complexes at temperatures up to 55°C and neutral and alkaline pHs, however, this complex is sensitive to NaCl. In vitro studies showed that BTCI colocalizes with the proteasome in breast cancer cells, MCF-7, at cytoplasm and nucleus, and does not alter the ubiquitination of proteins in these cells. The peptide derived from BTCI, Pep1, which inhibits the chymotrypsin site, does not affect the ubiquitinated proteins content in MCF-7 cells, which may be related to inhibition of E3 ligase protein, involved in the ubiquitination of cellular proteins. These data indicate that the ubiquitin-proteasome pathway is related to the anticarcinogenic effects of BTCI in breast cancer cells MCF-7, which justifies the further studies in the same research line, aimed the biotechnological application of this inhibitor in therapy against breast cancer.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-01T13:08:28Z No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-07-26T22:27:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T22:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Os genes de histonas desacetilases (HDAC) são altamente conservados entre diferentes espécies e dirigem importantes processos epigenéticos na manutenção da estrutura e funcionamento do genoma. Entretanto, o papel das HDAC na regulação dos traços de virulência de patógenos permanece pobremente explorado. O fungo patogênico em humanos Cryptococcus neoformans passa por mudanças fenotípicas que promovem persistência e sobrevida dentro do hospedeiro ou em nichos ecológicos. Tais mudanças estão associadas à regulação diferencial da expressão gênica. Neste contexto, inicialmente foi avaliado o efeito de dois inibidores químicos de histona desacetilases (HDACi), o butirato de sódio (NaBut) e a tricostatina A (TSA), sobre as células de C. neoformans. Os resultados demonstraram que ambos inibidores foram capazes de afetar os principais traços de virulência de C. neoformans. Em seguida, foram identificados e deletados 8 genes de HDAC de Classe I e Classe II em C. neoformans. A maioria dos processos previamente associados à virulência em C. neoformans foi afetada pelo tratamento com HDACi eou pela deleção de genes: a capacidade de crescimento a 37 – 39 ºC, a formação da cápsula polissacarídica, a produção de melanina, as atividades de fosfolipase e de proteases, a formação de hifas de acasalamento e a integridade da parede celular. Os mutantes de HDAC também mostraram defeitos na sobrevivência intracelular quando co-cultivados com macrófagos murinos, assim como virulência comprometida nos modelos de infecção de Galleria mellonella e camundongos. A histona desacetilase Clr3 foi apontada como um importante regulador da virulência em C. neoformans. A linhagem de C. neoformans clr3mutante mostrou-se hipovirulenta em ambos os modelos de criptococose animal. Outrossim, a análise de RNA-seq indicou que a proteína Clr3 regula a expressão de vários genes importantes para a adaptação e sobrevivência de C. neoformans ao ambiente hospedeiro. Os resultados indicam que a remodelação da cromatina, por meio das conservadas HDAC, é um importante mecanismo envolvido na virulência de C. neoformans. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Histone Deacetylase (HDAC) genes are highly conserved among different species, directing one of the most important epigenetic processes regulating gene expression – chromatin remodeling. However, the role of HDACs in the regulation of virulence traits in pathogens remains poorly explored. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans undergoes phenotypic changes to promote persistence and survival inside the host or in specific ecological niches. Very likely, these changes are associated with epigenetic regulation. In this context, we initially evaluated the effect of two chemical inhibitors of histone deacetylases (HDACi): Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA). The results showed that both were able to impair the expression of the main virulence traits of C. neoformans. Based on these data, we identified and deleted eight genes encoding predicted class I/II HDACs in C. neoformans. In this way, we predicted that we would be able to assign specific function to each HDAC, especially in regards to virulence trait expression. Phenotypes of specific HDAC mutant strains indicate that individual proteins control non-identical but overlapping cellular processes associated with virulence. In the other hand, for some genes we also have observed an opposite regulation. Most processes previously related to virulence in C. neoformans were affected here, such as thermotolerance (growth at 37-39 oC); capsule, melanin and protease formation; and cell wall integrity. Additionally, defects in mating and hyphal development were observed for the clr3HDAC mutant strain. HDAC mutants also displayed defects in intracellular survival when co-cultured with activated macrophages, a finding highly correlated with altered virulence in vivo. Also, we tested the virulence in Galleria mellonella and mice. Overall our results support that the Clr3 histone deacetylase is a newly identified regulator of fungal virulence. The corresponding mutant was hypovirulent in both animal models of cryptococcosis. Furthermore transcriptional profiling shows that the Clr3 protein regulates the expression of many genes that are important for the adaptation of C. neoformans for survival inside the host. Our work displays that chromatin remodeling by the conserved histone deacetylases is an important mechanism behind the virulence of C. neoformans.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-01-29T18:42:10Z No. of bitstreams: 1 2014_GiselledeAndradeRamos_Parcial.pdf: 223168 bytes, checksum: 9fd475647c175ccdaad31dee250ad14f (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-02-03T12:15:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_GiselledeAndradeRamos_Parcial.pdf: 223168 bytes, checksum: 9fd475647c175ccdaad31dee250ad14f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-03T12:15:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_GiselledeAndradeRamos_Parcial.pdf: 223168 bytes, checksum: 9fd475647c175ccdaad31dee250ad14f (MD5) / A Doença de Alzheimer (DA) acomete a área cortical do cérebro, tendo a demência como manifestação clínica clássica, e outros sintomas tais como: perda de memória e cognição, alteração do comportamento, e outros, sendo considerada como doença progressiva que se instala de maneira lenta e irreversivel. No âmbito de uma linha de pesquisa que visa ao desenvolvimento de novos inibidores da enzima acetilcolinesterase (AChE), descrevemos neste estudo a síntese e caracterização de intermediários e produtos finais planejados a partir do cardol (1), bem como a avaliação de seus perfis inibitórios frente à AChE. Foram sintetizados dois intermediários chave, LDT490 (41, 76%) e LDT490Ms (42, 80%), e vinte compostos em rendimentos globais que variaram entre 4,59% a 9,73%. Os derivados foram avaliados frente à AChE de E. electricus com percentual de inibição (%I) que variou de 10% a 92% e IC50 entre 7,2 a 75,3 μM, determinados para os compostos com %I ≥ 50%. Dentre a classe dos bioisostéricos cíclicos o %I variou de 62% a 92%, sendo LDT491 (43) o melhor composto (IC50 7,2 μM). Os derivados da série de piperazínico e arilpiperazínicos, somente o LDT495 (46) apresentou %I ≥ 50% (64%) a 100 μM, sendo os outros derivados não apresentando %I significativo a 30 μM. O derivado pirrolidínico LDT506 (53) apresentou IC50 de 9,1 μM, similar ao derivado piperidínico substituído LDT516 (57, IC50 10,2 μM). Os derivados benzilamínicos IC50 entre 13,8 a 75,3 μM, tendo o LDT519 (58) como o melhor da série. Os resultados sugeriram que ALH/DLH são tolerados na posição 2 em aminas heterocíclicas e que aminas cíclicas possuem bom perfil de inibição, destacando-se LDT491 (43). A avaliação farmacológica de novos compostos faz-se necessária para melhor racionalização dos resultados e estabelecimento de relações estrutura-atividade. Adicionalmente, estudos de modelagem molecular e a avaliação frente a AChE, BuChE bem como da atividade antiagregante βA induzida pela própria AChE, constituem perspectivas do trabalho na validação do planejamento estrutural de inibidores desta classe. / Alzheimer's disease (AD) affects cortical area of the brain, showing dementia as classical manifestation, and other symptoms such as loss of memory and cognition, behavior changes, and others, being considered as progressive disease that develops slowly and irreversibly. Within a line of research that aims to develop novel inhibitors of the enzyme acetylcholinesterase (AChE), in this study we describe the synthesis and characterization of intermediates and final products planned from cardol (1), as well the evaluation of their inhibitory profiles against AChE. Thus, we synthesized two key intermediates, LDT490 (41, 76%) and LDT490Ms (42, 80%) and twenty compounds in overall yields ranging from 4,59% to 9,73%. The derivatives were evaluated front AChE of E. electricus with a percentage of inhibition (%I) ranging from 10% to 92% and IC50 values between 7,2 to 75,3 μM, determined for the compound of %I ≥ 50%. Among the class of the cyclic bioisosters the %I ranged from 62% to 92%, the best being LDT491 (43, IC50 7,2 μM). For the series of piperazyne and arylpiperazine derivatives, only the LDT495 (46) showed %I ≥ 50% (64%) at 100 μM concentration, on the other hand, the derivatives in this series could not inhibit more than 50% at 30 μM. The pyrrolidine derivative LDT506 (53) showed IC50 of 9,1 μM, as the piperidine substituted derivative LDT516 (57, IC50 10,2 μM). The benzylamines derivatives showed %I between 47% to 64% and IC50 between 13,8 to 75,3 μM, and the LDT519 (58) as the best of the series. The results suggested that hidrogen bond aceptors and hidrogen bond donors are tolerated at position 2 in heterocyclic amines and cyclic amines have good inhibition profile, highlighting LDT491 (43). The pharmacological evaluation of new compounds is needed to better rationalization of results and establishment of structure-activity relationships. In addition, molecular modeling studies and evaluation against AChE, BuChE and anti-aggregation activity of βA-induced AChE itself, are the prospects in the validation of the structural design of inhibitors of this class in this work.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T00:09:15Z No. of bitstreams: 1 2010_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4857021 bytes, checksum: b8294fbbbf239d1baa69a033cad26483 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T00:11:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4857021 bytes, checksum: b8294fbbbf239d1baa69a033cad26483 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-17T00:11:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4857021 bytes, checksum: b8294fbbbf239d1baa69a033cad26483 (MD5) / O inibidor BTCI (Black-eyed pea Trypsin and Chymotrypsin Inhibitor) foi isolado de Vigna unguiculata, purificado e cristalizado em complexos binário com -tripsina e ternário com -tripsina e -quimotripsina em pH 4,5 e 7,5. Os dados cristalográficos foram coletados no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). A estrutura cristalográfica foi resolvida em 1,55 Å para o complexo binário com tripsina e 1,70 Å (pH 7,5) e 1,63 Å (pH 4,5) para o ternário pelo método de substituição molecular utilizando a estrutura do inibidor de Phaseolus angularis (PDB 1tab) como modelo. O modelo final do complexo binário obtido após o refinamento foi depositado no PDB com o código 2G81, apresentando qualidade estrutural conforme indicado pelos valores de Rfactor de 0,154 e Rfree de 0,169 e os parâmetros estereoquímicos dentro da faixa de modelos de alta resolução estrutural. Similarmente o modelo do complexo ternário apresentou qualidade estrutural em pH 7,5 e 4,5 conforme indicado pelos valores baixos de Rfactor = 0,171 e 0,168; Rfree = 0,218 e 0,192 respectivamente. As estruturas tridimensionais desses complexos não apresentam diferenças significativas na estrutura tridimensional na cadeia principal. No entanto, modificações na estrutura tridimensional durante a formação dos complexos, principalmente nas cadeias laterais das enzimas, ocorrem. A estrutura cristalográfica do complexo binário com tripsina mostra que as mais importantes alterações conformacionais ocorrem na região da interface, indicadas pela alteração na acessibilidade dos resíduos de triptofil nessa região de contato. As interações observadas na região da tripsina são as mesmas em complexo binário e ternário. Em contraste, as análises de fluorescência dinâmica mostraram que a interação da quimotripsina com o BTCI não causa alteração na acessibilidade ao solvente dos triptofanos, e a interação da tripsina com o BTCI resulta no enterramento parcial de um grupo triptofil. Neste trabalho, o processo de desdobramento dos complexos binários e ternário do BTCI foi realizado para analisar a estabilidade dessas moléculas. Estes ensaios foram acompanhados por dicroísmo circular utilizando temperatura como agente desnaturante. A associação do BTCI estabilizou a estrutura tridimensional das enzimas, indicado pelos maiores valores da temperatura de transição durante o desdobramento e da energia livre (?G) após formação dos complexos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The inhibitor BTCI (Black-eyed Pea Trypsin and Chymotrypsin Inhibitor) was purified from Vigna unguiculata seeds and crystallized in binary complex with -trypsin and in ternary complex with - chymotrypsin and -trypsin at pH 4.5 and 7.5. The crystallographic data were collected at the National Synchrotron Light Laboratory (LNLS). The crystallographic structures were solved to a maximum resolution of 1.55 Å for the binary complex and 1.70 (pH 7.5) and 1.63 (pH 4.5) for the ternary complexes, by molecular replacement using the structure of the inhibitor from Phaseolus angularis (PDB code 1TAB) as a search model. The final model of the binary complex obtained after several refinement cycles was deposited in the protein data bank (PDB code 2G81). This model is of good quality as indicated by the low values of Rfactor = 0.154 and Rfree = 0.169 and stereochemical parameters within the range of high-resolution structural models. Similarly the ternary complex model showed structural quality at pH 7.5 (Rfactor = 0.171 and Rfree = 0.218) and pH 4.5 (Rfactor = 0.168 and Rfree = 0.192), respectively. The threedimensional structures of these ternary complexes show no significant differences in their main chains. However, conformational changes were observed after complex formation, especially in the side chains of enzymes. The interactions of BTCI with trypsin are the same in binary and ternary complex. Most of the conformational changes of the binary complex with trypsin occur in the interface as indicated by the accessibility of triptofil residues in this contact region. In contrast, fluorescence analysis showed that the interaction of chymotrypsin with BTCI causes no change in solvent accessibility of tryptophans. In this work, the unfolding processes of binary and ternary complexes were performed by circular dichroism using temperature as denaturing agent to analyze the stability of these molecules. The association of BTCI stabilized the three-dimensional structure of the enzymes, indicated by the highest temperature transition and the unfolding free energy (?G) upon formation of complexes.

A trombina é uma serino protease da família das quimotripsinas envolvida na digestão e processos degradativos que possui um importante papel na ativação dos fatores da coagulação e nas vias fibrinolíticas apresentando-se, portanto, como um potencial alvo para o desenvolvimento de novos agentes anticoagulantes. Uma estratégia moderna empregada na busca por tais compostos envolve a elucidação dos aspectos estruturais e dinâmicos associados ao reconhecimento molecular entre enzima e seus moduladores sejam por estratégias ditas experimentais quanto computacionais. Sendo assim, este trabalho apresenta a caracterização de sistemas envolvendo inibidores de trombina, tanto covalentes (PPACK) quanto alostéricos (suramina), através de simulações de dinâmica molecular como meio de estudar a dinâmica e, assim, entender o processo de inativação da trombina para o desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos. Os resultados obtidos possibilitaram a caracterização da dinâmica de interação dos referidos inibidores com a trombina, permitindo-nos identificar: 1) o papel do solvente no reconhecimento enzima-inibidores; 2) a modulação conformacional da enzima-alvo na presença de seus moduladores; e 3) o efeito de forças associadas ao empacotamento cristalino sobre a formação de complexos enzima-inibidor. A partir da validação dos protocolos e resultados obtidos, da interação direta com outras metodologias experimentais e da extrapolação de observações funcionais, espera-se, portanto, que os resultados obtidos venham a contribuir no desenvolvimento de uma linha de pesquisas visando o planejamento, a síntese e a obtenção de novos candidatos a protótipos de agentes antitrombóticos. / Thrombin is a serine protease of the chymotrypsin family, involved in digestion and degradative processes playing an important role in the both coagulation factors activation and fibrinolitic pathways. These aspects turn this enzyme a potencial target to development of new anticoagulants agents. A modern approach employed in the search of such compounds involves the elucidation of structural and dynamics aspects associated to molecular recognition between enzyme and modulators through experimental and computational strategies. In this sense, this work presents the characterization of systems concerning thrombin inhibitors, both covalent (PPACK) and allosteric (suramin), through molecular dynamics simulations in order to elucidate and understand the dynamics of thrombin inactivation aiming the development of new antithrombotic agents. The results obtained enabled the characterization of interaction dynamics with these inhibitors to thrombin, allowing us to identify: 1) the role of solvent in enzyme-inhibitors recognition; 2) the conformational modulation of target-enzyme with modulators presence; and 3) the effect of forces associated to crystal packing in the generation of enzyme-inhibitor complexes. From the protocols validation and results obtained, associated to direct interacation with others experimental methodologies and extrapolation of functional observations, it is expected that the results obtained contribute in the promotion of a research line aiming the development, synthesis and the achievement of new candidates to prototypes of antithrombotic agents.

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_GlauciaCoelhode_D.pdf: 13820355 bytes, checksum: f4848f2050224a7f6808a8923338dac1 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os inibidores de proteinases desempenham as mais variadas funções biológicas. Em plantas, eles podem estar envolvidos no mecanismo de defesa vegetal contra predadores e doenças. Devido à habilidade dessas moléculas protéicas bloquearem enzimas, os inibidores também podem ser usados como ferramentas no estudo de processos bioquímicos relacionados a patologias, tais como a inflamação, hemorragia e até mesmo o câncer. Neste trabalho, a caracterização físico-química e o estudo dos papéis biológicos de dois inibidores isolados e purificados de sementes de Dimorphandra mollis, DMTI (Mace do et ai., 2000) e DMTI-II (Mello et aI., 2001) foram realizadas com o objetivo de melhor conhecer essas moléculas. DMTI (20 kDa) e DMTI-II (23kDa) são inibidores de tripsina pertencentes à família de Kunitz. A estabilidade da atividade inibitória de DMTI e DMTI-II foi analisada e comparada. DMTI e DMTI-II perde, respectivamente, cerca de 20% e 40% da atividade quando incubados a 60 °e por 20 minutos. Entretanto, a atividade de ambos não foi afetada por diferentes condições de pH, concentrações crescentes dos agentes redutores DTT e uréia. No entanto, a atividade DMTI-II sofreu um descréscimo de 50% quando incubado com cloreto de guanidina. A diferença da estabilidade dos inibidores levou a investigação da estrutura protéica de ambos; DMTI e DMTI-II foram submetidos a análises de dicroísmo circular e calorimetria. A ação inseticida de DMTI-II e DMTI sobre os lepidópteros Anagasta kuehniella e Corcyra cephalonica, foram analisadas através de ensaios in vitro e in vivo. Tanto DMTI-II quanto DMTI, quando incorporados ao nível de 2% na dieta artificial dos insetos, não se mostraram agentes inseticidas potenciais contra essas duas espécies. Estes resultados não descartam a utilização dos inibi dores de D. mollis na biotecnologia vegetal contra outras espécies de insetos, apenas ajudam a esclarecer as características como agentes inseticidas biológicos. Quando estudado o envolvimento de DMTI-II e DMTI na resposta inflamatória utilizando o edema de pata em ratos como modelo experimental, os resultados mostraram que doses crescentes de DMTI-II geram uma curva dose-dependente sendo que a resposta máxima ocorre 30 minutos após a sua injeção subplantar, o que sugeriu a ação do inibidor na liberação de histamina e serotonina, que são responsáveis pelo aumento da penneabilidade vascular. A elucidação do mecanismo de ação de DMTI-Il foi estudada através da utilização de drogas antiinflamatórias, como a mepiramina e ciproheptadina; sendo esta última a que melhor inibiu a ação de DMTI-Il na indução do edema. Concomitantemente, a sua ação na liberação de bradicinina também pode estar ocorrendo, pois o pré-tratamento com o antagonista de receptores B 2, HOE 140, reduziu cerca de 79% do edema induzido por DMTI-II / Abstract: Proteinase inhibitors have a wide range of biological functions. In plants, they¿re part of the defense mechanism against predators and diseases. As they can block enzymes, inhibitors are useful tools in the study of biochemical processes related to pathologies, such as inflammation, hemorrhage and even cancer. This paper aims at assessing the physical-chemical features and the biological functions of two inhibitors isolated and purified trom Dimorphandra mollis seeds, DMTI (Macedo et al., 2000) and DMTI-II (Mello et aI., 2001). DMTI (20 kDa) and DMTI-TI (23 kDa) are trypsin inhibitors ITom the Kunitz family. The stability of the inhibitory activity of DMTI and that ofDMTI-II were analyzed and compared to each other. DMTI and DMTI-II lost 20% and 40%, respectively, oftheir activities when incubated at 60°C for 20 minutes. However, neither inhibitory activity was sensitive to pH above the 2.0-10.0 range, reducing DTT agents and urea. On the other hand, DMTI-II activity was reduced by 50% when incubated with guanidine hydrochloride. The difference of stability between the inhibitors led to further investigation of their protein structure; DMTI and DMTI-II structures were analyzed by circular dichroism (CD) and differential scanning calorimetry (DSC). The effectiveness of DMTI-II and DMTI as insecticide in Lepidoptera insects, Anagasta kuehniella and Corcyra cephalonica, was analyzed in vitro and in vivo assays. Neither DMTI-II nor DMTI, when incorporated into artificial diet at 2%, were active as insecticide agents against these two species. Nevertheless, these results do not discard the use of inhibitors trom D. mollis in plant biotechnology against other species of insects; they just help us to understand how they work as biological agents. When studying DMTI and DMTI-II participation in inflammatory response in the rat paw edema experimental model, the results showed that increased doses of DMTI-II induced a dose dependent curve, and maximum response occurred 30 min after sub-plantar injection, which indicated that the inhibitor is active in the release of histamine and serotonin, which are responsible for the increase of vascular permeability. The elucidation of DMTI-II action mechanism was studied by using anti-inflammatory drugs, such as mepyramine and cyproheptadine, the latter the most effective against DMTI-II effects in edema induction. At the same time, it may also be active in bradykinin release as the pretreatment with B2 receptor antagonist HOE 140 reduced the DMTI-II induced edema by near1y 79% / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular