Les invasions biologiques sont de plus en plus fréquentes, avec des conséquences importantes sur la biodiversité et la santé humaine. Étudier les mécanismes qui les expliquent permet simultanément (i) d’envisager des stratégies efficaces de contrôle et de prévention et (ii) d’étudier divers processus écologiques et évolutifs sur des échelles de temps contemporaines. Plusieurs hypothèses basées sur le parasitisme et l’immunité des hôtes sont proposées pour expliquer le succès des espèces envahissantes. Ainsi, au cours de l’invasion, les hôtes exotiques (1) perdraient leurs parasites naturels (Enemy Release, ER), (2) transfèreraient leurs parasites exotiques aux hôtes natifs (Spill-Over, SO) et/ou (3) amplifieraient les cycles des parasites natifs au sein des hôtes locaux (Spill-Back, SB). En relation avec ces changements dans les interactions hôtes-parasites, l’hypothèse EICA (Evolution of Increased Competitive Ability) prédit une modulation des ressources de l’hôte envahissant via un investissement moins important dans les réponses immunitaires coûteuses (inflammation) au profit de réponses immunitaires beaucoup moins coûteuses (réponses médiées par les anticorps) et de capacités de reproduction et de dispersion des populations sur le front d’invasion. Le but de ma thèse est de tester ces prédictions dans le cadre de deux invasions actuellement en cours au Sénégal : celles du rat noir Rattus rattus et de la souris domestique Mus musculus domesticus, deux espèces envahissantes majeures tant par leurs impacts (économique, sanitaire, écologique) que par leur distribution quasiment mondiale. Mes travaux se basent sur un dispositif d’échantillonnage en populations naturelles et sur le développement d’approches comparatives le long d’un gradient d’invasion pour chacune des deux espèces exotiques. Les patrons de structure (prévalence, abondance, richesse) de deux communautés de parasites (helminthes gastro-intestinaux, bactéries pathogènes) et les profils immunitaires (réponses médiées par les anticorps naturels, inflammation) des rongeurs commensaux exotiques (M. m. domesticus, R. rattus) et/ou natifs (Mastomys spp.) ont été comparés pour des localités situées dans des régions anciennement envahies (depuis plus de 100 ans), récemment envahies (depuis moins de 30 an : front d’invasion), et non envahies. Mes résultats montrent des variations dans la structure des communautés de parasites et les réponses immunitaires des hôtes natifs et exotiques. Les tendances observées, aussi bien pour les communautés de parasites que pour les composantes immunitaires étudiées le long des deux routes d’invasion, attestent de patrons globalement plus complexes qu’attendu sous les hypothèses de départ, suggérant l’existence de relations complexes entre caractéristiques des communautés d’hôtes et de parasites, investissement immunitaire, conditions environnementales et invasions biologiques. Des approches expérimentales doivent être envisagées afin de déterminer les conséquences et les mécanismes sous-jacents aux différents phénomènes observés. / Biological invasions are increasingly phenomenon worldwide having deleterious impacts on biodiversity and human health. Studying the mechanisms explaining them allows both (i) to define efficient strategies for controlling and preventing invaders and (ii) to study ecological and evolutionary processes at contemporary scales. Some major hypotheses rely on parasitism and host immunity to explain invasion success. Thus, exotic host populations (1) may benefit of an " Enemy Release " (ER) through impoverishment of their original parasite communities, and may affect native hosts by (2) transferring exotic parasites (Spill-Over, SO) and/or (3) by increasing transmission risk of native parasites (Spill-Back, SB). In turn, according to the refined “Evolution of Increased Competitive Ability” (EICA) theory, invasive populations should experience immune trade-offs by favouring less expensive antibody-mediated responses over costly inflammation, to increase their competitive ability (dispersion, reproduction). The aim of my thesis is to test these predictions along the invasion routes of two commensal exotic species in Senegal, the domestic mouse (Mus musculus domesticus) and the black rat (Rattus rattus). These rodent species are considered to be major invasive species worldwide inducing high economic, sanitary and ecological damages. My research is based on comparative analyses along one invasion route for each invasive species. We focused on gastrointestinal helminths and pathogenic bacteria as parasite communities, and inflammation and natural antibody-mediated responses as immune estimates. Comparisons were performed for invasive and/or native (Mastomys spp.) rodents between localities of long-established invasion (100-200 years ago), recent invasion (10-30 years ago; invasion front), and non-invaded localities. My findings showed variations along both invasion routes in parasite community structure and immune patterns, but in a more complex way than expected under the initial predictions. The heterogeneity of changes observed highlights the existence of particular relations between host and parasite traits, host immune investment, environmental conditions and biological invasions. Further experimental works are needed to assess the consequences and mechanisms underlying the changes observed along both invasion routes.

Le domaine TIR (Toll/interleukin (IL)-1 receptor) est une composante essentielle du système immunitaire inné, celui-ci est présent dans les récepteurs TLR (Toll-like receptor) et les protéines adaptatrices associées comme MyD88 et TIRAP. La détection de pathogènes déclenche l'interaction entre les domaines TIR permettant ainsi l'initiation et la propagation de la signalisation par les TLRs. Aussi, de nombreux pathogènes produisent des effecteurs contenant un domaine TIR tels que BtpA et BtpB chez Brucella abortus, TirS chez Staphylococcus aureus ou TcpC chez l'uropathogènique Escherichia coli. Tous ces effecteurs bloquent la signalisation des TLRs et sont capables de perturber les voies de signalisation de l'immunité innée pendant l'infection. Cependant les mécanismes moléculaires impliqués restent la plupart du temps non caractérisés et dans certains cas controversés. Dans le but de mieux comprendre le fonctionnement de ce type d'effecteurs bactériens, j'ai caractérisé chez Pseudomonas aeruginosa PA7 un nouvel effecteur contenant un domaine TIR que nous avons renommé PumA pour Pseudomonas UBAP1 Modulator A. En parallele, j'ai aussi participé à des projets de caractérisation de deux autres effecteurs avec un TIR domain : BtpB et TirS. Ainsi, PumA est un facteur essentiel pour la virulence de P. aeruginosa PA7 et son domaine TIR est essentiel pour interaction avec deux protéines adaptatrice, TIRAP et MyD88. Durant l'infection de cellules épithéliales pulmonaires par P. aeruginosa PA7, PumA est responsable du contrôle de la translocation du facteur de transcription NF-κB dans le noyau. De plus, la production de PumA dans une souche de P. aeruginosa non-TIR confère à cette bactérie de nouvelles propriétés d'immuno-modulation. PumA cible aussi UBAP1, une protéine du complexe de tri endosomal requis pour le transport, ESCRT-I (endosomal sorting complex require for transport I) qui a été récemment montré pour moduler l'activation de récepteur de cytokine. Nos résultats montrent que UBAP1 peut s'associer avec TIRAP et MyD88, provoquant le mouvement de MyD88 à la membrane cytoplasmique, suggérant une nouvelle voie cellulaire commune entre UBAP1 et les TLRs, et révélant UBAP1 comme nouvelle cible pour des effecteurs bactériens dans le cadre du contrôle des réponses immunitaires de l'hôte / In higher eukaryotes, the innate immune system provides the first line of defense against invading pathogens. The Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain is an essential component of the innate immune system. This domain is present in Toll-like receptors (TLRs) and associated adaptor proteins such as MyD88 and TIRAP. Pathogen detection requires interaction between the TIR domains, which initiates and triggers propagation of TLR signaling. However, many pathogens produce a TIR domain-containing protein such as BtpA and BtpB in Brucella abortus, TirS in Staphylococcus aureus or TcpC in the uropathogenic strain Escherichia coli. These effectors block TLR signaling and are able to disrupt innate immune response during infection. However, the molecular mechanisms involved remain mostly uncharacterized and in some cases controversial. The objective of this thesis was to study bacterial effectors containing a TIR domain particularly at the molecular level. For this, we focused on Pseudomonas aeruginosa PA7, an atypical multi-drug resistant strain that contains an effector with a TIR domain that we named PumA, for Pseudomonas UBAP1 Modulator A. In addition, during these four years of thesis work I also participated in the characterization of two other effectors with a TIR domain: BtpB in B. abortus and TirS in S. aureus.We found that PumA is essential for virulence of P. aeruginosa PA7 and its TIR domain is the key element for interaction with two adaptor proteins MyD88 and TIRAP. During infection of lung epithelial cells by P. aeruginosa PA7, PumA is responsible for controlling the translocation of NF-?B into the nucleus indicative of activation of this transcription factor. In addition, production of PumA by a TIR-deficient strain of P. aeruginosa confers to this bacterium a new immuno-modulation property. Furthermore, PumA targets ubiquitin-associated protein 1 (UBAP1), a protein of the endosomal sorting complex required for transport I (ESCRT-I) which has recently been shown to modulate cytokine receptor activation. Our results also show that UBAP1 can associated with TIRAP and MyD88, causing movement of MyD88 to the cytoplasmic membrane and suggesting a new cellular pathway between UBAP1 and TLRs. In summary, our data reveal UBAP1 as a novel target for bacterial effectors implicated in control of host immune responses

L’extraction de l’uranium a eu pour conséquence une remobilisation de cet actinide au niveau des écosystèmes avoisinants les mines. L’utilisation de sels métalliques lors de la réhabilitation des sites miniers et la présence naturelle de métaux ont accentué les niveaux de la contamination métallique dans les hydrosystèmes soumis aux rejets miniers uranifères.Des expériences in situ ont été conduites au niveau de deux anciens sites miniers uranifères français. L’encagement de l’épinoche à trois épines a été employé pour connaître les effets sublétaux de ce mélange métallique, ainsi que sur la susceptibilité de ce poisson envers un stress biologique.Cette pollution, caractérisée par de plus importantes concentrations métalliques (notamment en uranium), a entraîné un stress oxydant chez l’épinoche visible sur plusieurs biomarqueurs, ainsi que d’autres effets dépendants du site d’exposition.La contamination polymétallique a occasionné une augmentation de la susceptibilité des épinoches au stress biologique, en empêchant leurs réponses phagocytaire antioxydante à ce stress. Ces travaux ont permis de renforcer l’intérêt de la technique d’encagement lors d’une étude environnementale, et celui des immunomarqueurs au sein d’une approche multi-biomarqueurs. / Uranium extraction has resulted in a remobilisation of this actinide into mine surrounding ecosystems. Uses of metal salts during mining site rehabilitation, and the natural presence of metals have increased the metal contamination in hydrosystems submitted to mine tailings.In situ experiments were conducted in two former French uranium mining sites. Three-spined stickleback caging was used to determine the sublethal effects of this metal mixture on this freshwater fish, as well as its effects on fish susceptibility to a sudden biological stress.This pollution, characterised by higher metal concentrations (especially for uranium), has led to an oxidative stress in sticklebacks visible through several biomarkers, and other effects dependent on the study site. The polymetallic contamination has modified the stickleback responses to the biological stress, by preventing their phagocytic and antioxidant responses. This work has reinforced the interest of the caging technique during environmental studies and that of immunomarkers in a multi-biomarker approach.

La palourde japonaise, Venerupis philippinarum, a été introduite en France au début des années 70 à des fins aquacoles. Depuis 1987, d’importants épisodes de mortalité, causés par la bactérie pathogène Vibrio tapetis, touchent cette espèce le long des côtes françaises et européennes. Cette vibriose, appelée Maladie de l’Anneau Brun (MAB), est considérée comme une maladie d’eau froide. L’interaction tripartite entre V. philippinarum, V. tapetis et l’environnement a été explorée à travers le rôle du système enzymatique des phénoloxydases (POs) dans le but de mieux comprendre la réponse immunitaire de la palourde japonaise, la virulence de l’agent pathogène mais aussi l’impact de l’environnement et plus particulièrement de la température. Les POs sont des oxydoréductases impliquées dans la synthèse de la mélanine et de ses dérivés mais aussi dans les processus de reconnaissance du non-soi et d’encapsulation chez les invertébrés. Dans un premier temps, l’activité PO du sérum d’hémolymphe a été caractérisée d’un point de vue biochimique comme étant majoritairement de type laccase ; une activité minoritaire de type tyrosinase a également été identifiée. Des infections de palourdes par trois souches de V. tapetis, à différentes températures, ont mis en évidence une modulation de la réponse du système PO en fonction du temps et du compartiment étudiés. De façon générale, l’infection bactérienne s’est traduite par une augmentation de l’activité PO. Toutefois, le niveau basal d’activité PO est variable d’une population à une autre et cette variabilité semble traduire une susceptibilité différente à la MAB. L’augmentation de la température de 15 à 22°C a entraîné une augmentation des capacités immunitaires de la palourde japonaise. La températurea également eu un impact sur la pathogénicité de V. tapetis et ce, de façon différentielle selon les souches. L’inhibition de l’activité PO observée in vitro en présence de produits extracellulaires bactériens souligne la complexité de l’interaction entre V. philippinarum et V. tapetis. Ainsi, le suivi de l’activité PO constitue un biomarqueur pertinent des capacités immunitaires des invertébrés marins dans l’interaction tripartite hôte-pathogène-environnement. / The manila clam, Venerupis philippinarum, was introduced in France in the early 70’s for aquaculture purposes. Since 1987, mass mortality events, caused by the pathogenic bacterium Vibrio tapetis, have occurred in this species along French and European coasts. This vibriose, called Brown Ring Disease (BRD), is considered as a cool water disease. The tripartite interaction between V. philippinarum, V. tapetis and the environment was explored through the role of the enzymatic system of phenoloxidases (POs) in order to better understand the manila clam immune response, the pathogen virulence and also the environment impact and particularly the temperature’s one. POs are oxidoreductase enzymes involved in the synthesis of the melanin and its derivatives and also in the processes of non-self recognition and encapsulation in invertebrates. Firstly, PO activity was biochemically characterized in the hemolymph serum as a laccase-like activity; a minority tyrosinaselike activity was also identified. Clam inoculation with three V. tapetis strains, at various temperatures, highlighted a modulation of the answer of the PO system according to time post-infection and studied compartments. Overall, bacterial infection resulted in an increase in PO activity. However, the PO activity basal level varies between populations and this variability seems to reflect different susceptibility to the BRD. An increase in temperature from 15 to 22°C led to an increase in manila clam immune abilities. The temperature also had an impact on the V. tapetis pathogenicity and this impact was variable according to the strains. PO activity inhibition observed, in vitro, in the presence of bacterial extracellular products underlines the complexity of the interaction between V. philippinarum and V. tapetis. Thus, the monitoring of the PO activity constitutes a relevant biomarker of marine invertebrate immune abilities in the tripartite interaction host-pathogen-environment.

Programmed death-1 (PD-1) et ses ligands PD-L1 et PD-L2 appartiennent à la famille B7 : CD28 des molécules de cosignalisation immunitaire. Leur interaction délivre un signal inhibiteur à l’activation lymphocytaire. Ces molécules sont impliquées non seulement dans le contrôle de la tolérance, mais aussi dans un mécanisme d’échappement tumoral et viral au système immunitaire. Les deux ligands de PD-1 : PD-L1 et PD-L2 montrent une expression tissulaire assez large, témoignant de leur rôle étendu aux différents stades de la réponse immunitaire. L’expression de PD-L1 est plus large que celle de PD-L2. PD-L1 est exprimé sur les cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques, PDL2 présente une expression assez restreinte aux CPAs professionnelles. L’expression de PD-L1 et PD-L2 est fortement régulée dans plusieurs cas pathologiques et notamment dans les cancers. La régulation de l’expression de PD-L2 qui fait l’objet de notre étude, représente une cible importante dans le domaine de l’immunothérapie. Notre projet porte sur l’analyse de l’expression, la régulation et la fonction de PD-L2 dans les LT, dans différents contextes physiologiques et pathologiques. Nous avons pu démontrer que PD-L2 qui avait été décrit chez la souris pour son expression restreinte aux CDs et aux macrophages, était de façon surprenante exprimé avec son homologue PD-L1 sur les LT après costimulation CD3+CD28. Nous l’avons confirmé ex vivo par activation par Staphylococcal enterotoxin E. Ce résultat montre que PD-L2 est bien induit sur des LT dans des conditions d’activation physiologique ou pathologique. Nous avons pu démontrer aussi une régulation négative de l’expression transcriptionnelle et protéique de PD-L1 et de PDL2 sous l’effet de la CyclosporineA (CsA). Cet effet est indépendant de l’action de l’IL-2. Nos données d’analyses bioinformatiques nous ont permis d’identifier les sites putatifs de fixation de facteurs de transcription au niveau du promoteur du gène pd-l2, qui peuvent être régulés par la CsA. L’analyse de la fonction de PDL2 sur les LT nous a permis de démontrer que la stimulation de PDL2 par des anticorps monoclonaux fabriqués dans le laboratoire inhibait l’activation T. Nos résultats démontrent pour la première fois une fonction de PDL2 et une signalisation « reverse siglaling » dans les LT potentiels. La caractérisation fonctionnelle et l’étude des voies de signalisation de PD-L2 que nous avons déjà étudié dans notre projet, représentent une piste importante à explorer. Cela permettrait de proposer de nouvelles stratégies permettant de lutter contre les mécanismes d’échappement tumoral. / PD-1 (programmed death-1) is a new CD28 families member, that deliver inhibitory signals that regulate the balance between T cell activation, tolerance, and immunopathology. (1) (ref octa).PD-1, is inducibly expressed on T cells. The PD-1 ligands PD-L1 (B7-H1) and PD-L2 (B7-DC) exhibit distinct patterns of expression: PD-L1 is expressed more broadly than is PD-L2. PD-L1 is expressed on resting and up regulated on hematopoietic, nonhematopoietic cells and cancer cell. However, PD-L2 is expressed only on professional antigen-presenting cells. In addition, it has been demonstrated that PD-L1 and PD-L2 are differentially regulated by Th1 and Th2 cytokines.Suggesting that PD-L2 is regulated differently in the former versus the latter, and this proved to be the case, both in transcription and promotion (2) (ref octa) However, little is known about the regulation of PD-L2 expression and nine is known about the expression of PD-L2 on T cells. In the present study, we observed in the first time, by flow cytometer and real time PCR (RT PCR) that PD-L2 expression is induced on ex vivo on activated CD4+ and CD8+ T cells, on in vitro on activated JURKAT T cell line and this expression is inhibited by the immunosuppressive drogue Cyclosporin A (CsA). In the second time we showed that PD-L2 is up regulated in vivo on Non hodchkin lymphoma, other up regulation of PD-L2 expression is observed on Vb8+ T cells after PBMC treatment with the Staphylococcal enterotoxin E (SEE) super antigen. Finally, we attributed a function to PD-L2 to be a co-inhibitory molecule for CD4+ T cells activation.

Lors d'une infection virale, l'hôte déclenche une réponse rapide, la rémonse immunitaire innée, dont l'interféron (IFN) de type I est la cytokine centrale. Des motifs moléculaires associés aux micro-organismes (MAMP) sont déteectés par de nombreux récepteurs dédiés, dont les récepteurs cytoplasmiques de type RIG-I (RLR) identifiés à partir de 2004. Les RLR, au nombre de trois, RIG-I, MAD5 et LGP2, sont les ARN-hélicases composées de deux ou trois types de domaines : deux domaines CARD, resposables du recrutement de la cascade de signalisation, un domaine C-terminal CTD, site de liaison initial de l'ARN viral, et le domaine central hélicase, site secondaire de liaison àl'ARN et possédant également une activité enzymatiques ATP-dépendante. RIG-I est impliqué dans la détection de plusieurs virus dont ceux de l'ordre des mononegavirales (virus de la rage, de la rougeole, Ebola). Ce récepteur reconnait des ARN viraux possédant une région double brin adjacente à une extrémité 5'-triphosphate. Les nombreuses études menées n'ont cepnedant pas encore permis de dégager un mécanisme complet et cohérent de l'activation de RIG-I. Notre objectif était donc d'apporter des réponses molécualires quant au mécanismes d'activation de RIG-I. Dans un premier temps, l'élucidation de la structure de la protéine entière RIG-I de canard, par l'équipe de Stephen Cusack, leur a permis d'identifier une conformation auto-réprimée de la protéine. En l'absence d'ARN le domaine CARD2 interagit avec le sous domaine Hel2i du domaine hélicase. Nous avons apporté une preuve fonctionelle de cette observation. Les mutations F540 A/D, du résidu situé dans le sous domaine Hel2i, inhibent l'interaction CARD2-Hel2i et produisent des mutant constituvement actifs. A l'opposé, les mutations correspondantes dans le domaine CARD2 rendent RIG-I inactif. L'interaction CARD2-Hel2i semble donc impliquer une double auto-répression via (i) le masquage du site de liaison à l'ARN du sous-domaine Hel2i, et (ii) le masquage de résidus du domaine CARD2 impliqués dans le recrutement d'intermédiaires requis pour la transduction du signal. Par ailleurs, l'étude de mutants impliqués dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP nous a permis de proposer un nouveau rôle régulateur pour cette activité enzymatique. Dans un deuxième temsp, l'étude de la nécessité de l'oligomérisation de RIG-I pour l'activation de la réponse IFN a été menée. Eva Kowalinski, en thèse dans l'équipe de Stephen Cusack, n'observe la formation de dimères de RIG-I, in vitro, qu'en présence d'un ARN synthétique possédant deux extrémités 5'-triphosphate. Nous avons complété cette observation avec des analyse montrant que des ARN synthéttiques leader incapables d'induire la dimérisation de RIG-I in viro, activent néanmoins ce récepteur in cellula. Par ailleurs, nim'utilisation de la technique de co-immunoprécipitation, ni celle du test de complémentation basé sur la luciférase Gaussia, avec ou sans activiation par un ARN ou une infection virale, n'ont permis d'observer d'oligomérisation de RIG-I. L'auto-association de RIG-I ne semble donc pas être indispensable pour son activation. / Vertebrate are permanently threatened by infections that they manage to counteract using a dedicated system. The innate immunity allows a rapid response against viral infection, mainly through the type I interferon (IFN) production. Dedicated receptors detect microbe-associated molecular patterns (MAMPs), and among them the RIG-likereceptors (RLRs), RIG-I, MDA5 and LGP2, can sense viral RNA into the cytoplasm. RLRs are compossed of two or three different domains : two N-terminal CARDs domains are resposible for signal transduction, a C-terminal domains is the first RNA binding site, and a central helicase domainis the second RNA binding site and possesses an ATP-dependent activity. RIG-I is important for sensing of several mononegavirales, such as rabies, measle and Ebola viruses, and recongnized 5'-triphosphorylated double stranded RNA. Despite intensive studies, a full and comprehensive model of the mechanismof RIG-I activation is still lacking. Our aim was to clarify the first molecular steps of RIG-I activation. First, Stephen Cusack's team elucidated the structure of the full lenght duck RIG-I protein and identified the principle of RIG-I auto-repressed conformation. In absence of ligand RNA, CARD2 domain interacts with Hel2i subdomain of helicase domain. We confirmed this conformation with functional evidence. Mutaions F540A/D, in Hel2i subdomain, inhibits CARD2:Hel2i interaction and renders RIG-I constitutively active. In contrast, the corresponding mutations in the Hel2i contacting site of CARD2 domain produce inactive mutants. Thus CARDS;Hel2i interactio induces an auto-repressed state through a deual masking of both Hel2i RNA binding site and CARD2 residus necessary for signal transduction. Moreover, study of mutants involved in ATP binding and hydrolysis reealed a portential unsuspected regulatory role for the ATP-dependent enzymatic activity of RIG-I. Second, we studied the necessity of RIG-I oligomerization for RIG-I activation. Eva Kowalinski, PhD student in Stephen Cusack's team, observed RIG-I dimers in vitro, only in presence of synthetic RNA with two 5'triphosphorylated ends. We complete this observation with functional assays showing that synthetic leader RNA incapable to induce RIG-I oligomerization in vitro, did activate RIG-I in cellula. Moreover, we did not observe RIG-I oligomerization using either co-immunoprecipitation or Gaussia Luciferase-based-protein complementation assay, after activation with cognate RNA or viral infection. Altogether our results indicate that the self-oligomerization og RIG-I is either dispensable or very transient for signal transduction.

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires des moisissures qui peuvent naturellement contaminer de nombreuses denrées alimentaires, notamment les céréales. Dans les travaux de thèse, nous nous sommes intéressés à deux mycotoxines majeures produites par des champignons du genre Fusarium, le Déoxynivalénol (DON) et la Fumonisine (FB). Les objectifs de la thèse ont été de déterminer les effets individuels et combinés d’une contamination en DON et FB chez le porc, une espèce cible et sensible aux mycotoxines. Les effets sur les fonctions immunitaires lors d’un challenge antigénique ainsi que sur les fonctions intestinales ont été évalués. Par ailleurs, dans le cadre d’un partenariat avec un industriel, nous avons évalué in vivo les effets de méthodes de détoxification par biotransformation et ciblant spécifiquement ces deux toxines. Chez le porc, l’ingestion d’aliments contaminés avec de faibles doses de mycotoxines (DON, 3 mg/kg ; FB, 6 mg/kg) a provoqué des lésions tissulaires (foie, reins et poumons) et a fortement altéré la mise en place d’une réponse immunitaire spécifique de l’antigène (expression des cytokines, prolifération des lymphocytes et anticorps spécifiques). Les animaux ont été significativement plus affectés après la consommation du régime co-contaminé, et l’interaction a pu être considérée comme additive. De plus, les paramètres intestinaux examinés ont révélé des changements dans la morphologie, dans le profil de sécrétion des cytokines et dans l’adhésion cellulaire. L’interaction des deux toxines a pu ici être caractérisée comme moins qu’additive. Les approches de détoxification biologique proposées par l’industriel étaient basées sur la transformation par voie enzymatique du DON et des FB, à partir d’un microorganisme entier et d’une enzyme respectivement. La stratégie d’élimination des FB a suscité un intérêt plus important étant donné que cette méthode est non commercialisée et en cours de développement. Ainsi, la toxicité du produit d’hydrolyse de la FB1 (mycotoxine principale de la famille des FB) obtenu initialement par traitement enzymatique, a été comparée in vivo à celle de la molécule mère la FB1. Les résultats ont montré que l’hydrolyse de la FB1 réduisait fortement la toxicité hépatique et intestinale chez les porcelets. L’expérimentation animale avec le DON et la FB, seuls ou en combinaison a ensuite été reproduite afin de déterminer l’efficacité d’hydrolyse de ce procédé chez le porc après incorporation de l’enzyme dans les aliments contaminés. Dans ces aliments, le microorganisme entier ciblant le DON avait également été inclus. La nette diminution du marqueur d’exposition des FB et la neutralisation partielle ou totale des effets ont suggéré que le procédé avait fortement réduit la biodisponibilité des FB dans le tractus gastro-intestinal. Cette observation a aussi été en partie confirmée pour l’approche de dégradation du DON. La biotransformation par voie enzymatique des mycotoxines représente ainsi une stratégie biotechnologique prometteuse dans la lutte contre ces contaminants. / Mycotoxins are secondary metabolites of fungi that are natural contaminants of several commodities, in particular cereals. In the present work, we focused on two major mycotoxins produced by the Fusarium genus, Deoxynivalenol (DON) and Fumonisin (FB). The main objectives of the thesis were to determine the toxic effects of individual and combined DON and FB contamination in pig, a target species highly sensitive to mycotoxins. The effects on the immune functions following an antigenic challenge and also on the intestinal functions were evaluated. Besides, within the framework of an industrial partnership, we evaluated in vivo the effects of detoxifying methods by biotransformation and targeting specifically these two toxins. In pigs, ingestion of contaminated feeds with low doses of mycotoxins (DON, 3 mg/kg ; FB, 6 mg/kg) triggered tissular lesions (liver, kidneys and lungs) and strongly impaired the establishment of the antigenic immune response (cytokines expression, lymphocytes proliferation and specific antibodies). Animals consuming the cocontaminated diet were more affected and the interaction could be considered as additive. In addition, changes in morphology, in profile of cytokines secretion and in cell adhesion were observed at intestinal level. The interaction here could be characterized as less than additive. The biological detoxification approaches proposed by the industrial were based on the transformation by enzymatic way of DON and FB, from intact microorganism and enzyme respectively. We paid a particular attention to the strategy of FB removal as this method is not marketed and still in development. Therefore, the toxicity of the hydrolysis product of FB1 (major mycotoxin in the FB group) initially obtained by enzymatic way, was compared in vivo to the toxicity of the parent compound FB1. Results showed that the hydrolysis of FB1 strongly reduced the toxicity in piglets at intestinal and hepatic levels. The animal experiment with DON and FB, alone or in combination was then repeated in order to determine in pigs the hydrolysis efficiency of this process when enzyme was incorporated in contaminated feeds. In these feeds, the intact microorganism toward DON was also included. The marked decrease of the biomarker of exposure to FB and the partial or total counteraction of the effects suggested that the process had greatly reduced the FB bioavailability in the gastrointestinal tract. This observation was also in part confirmed for the method degrading DON. The biotransformation method of mycotoxins by enzymatic way represents therefore a promising biotechnological strategy in the control of these contaminants.

Dans un contexte d'usage raisonné des antibiotiques lié au développement des résistances bactériennes, il est pertinent de chercher à optimiser les profils d'exposition plasmatique qui conduiraient à la meilleure efficacité de l'antibiotique sur les bactéries pathogènes. La charge bactérienne n'est pas stationnaire tout au long du développement d'une infection, mais elle augmente spontanément ou diminue avec un traitement antibactérien efficace. L'objectif de cette thèse était d'évaluer l'influence de la variation de la charge bactérienne sur l'efficacité des antibiotiques et du système immunitaire.Au cours d'un premier travail, nous avons montré que dans les conditions de réalisation de tests de sensibilité in vitro (détermination de CMI), une dégradation de certains antibiotiques se produisait, d'amplitude variable selon les molécules testées. Cette dégradation peut être responsable d'une augmentation des valeurs de CMI et de CMB. Les variations observées étaient cependant inférieures à une dilution au demi dans une gamme de concentrations. Cette dégradation ne devrait pas avoir d'impact significatif sur les résultats des tests de sensibilité aux antibiotiques concernés, excepté dans des cas particuliers comme des pathogènes à croissance très lente. Dans un deuxième travail, nous avons étudié in vitro chez E. coli et S. aureus l'effet de la taille de l'inoculum bactérien sur l'activité bactéricide de 2 céphalosporines, la céphalexine et le cefprozil. Nous avons observé une diminution de l'activité bactéricide des 2 céphalosporines avec l'augmentation de la taille de l'inoculum chez E. coli et S. aureus. Nous avons également montré une efficacité et une puissance moins importante des 2 céphalosporines sur S. aureus par rapport à E coli.Dans un troisième temps, nous avons développé un système incluant les trois composantes suivantes : une bactérie - S. aureus -, des cellules du système immunitaire - des macrophages murins issus de la moelle osseuse - et un antibiotique -la céphalexine-. Dans ce système, nous avons fait varier la taille de l'inoculum bactérien de départ ainsi les concentrations en antibiotique. Une augmentation de la phagocytose bactérienne et de la mortalité des macrophages ont été observées avec l'augmentation de la charge bactérienne. L'activité bactéricide des macrophages était saturable et en présence d'une charge bactérienne trop importante, une partie des macrophages sont devenus un réservoir de S. aureus phagocytés. En présence de la céphalexine, qui a une distribution exclusivement extracellulaire, les quantités de bactéries extracellulaires, " candidates " à la phagocytose, ont diminué. Ainsi, en présence de céphalexine et pour les charges bactériennes initiales les plus faibles, les capacités de survie et de bactéricidie des macrophages ont été préservées. Cette action n'a cependant plus été visible en présence de gros inocula bactériens pour lesquels l'action limitée de la céphalexine n'a pas permis de prévenir la saturation des macrophages et ses conséquences. Le modèle à trois composantes que nous avons développé constitue une première étape dans le développement de modèles in vitro qui associent des éléments de l'immunité innée aux modèles pharmacologiques classiques bactéries/antibiotiques, avec l'objectif d'optimiser l'évaluation préclinique de molécules antibactériennes. / As one of the current pre-eminent public health concerns is to reasonably use antibiotics in order to limit antibacterial resistance development, it appears relevant to determine the plasmatic exposition profile that would lead to the best efficiency of the antibiotic on pathogenic bacteria. The bacterial load is not stationary during an infection but it increases or decreases with an effective antibiotic treatment. The aim of this thesis was to evaluate the influence of variation of the bacterial load on antibiotic and immune system activity.First, we showed that during antibacterial sensibility tests, such as standard MIC determination, some antibiotics underwent abiotic degradation during incubation, with a magnitude depending on the drug tested. This degradation can increase MIC and MBC values. However, the observed discrepancy (less than one twofold dilution) suggests that this would only be clinically significant in special cases such as slow-growing bacteria.Then, we studied, with E. coli and S. aureus, the in vitro effect of the bacterial inoculum size on bactericidal activity of 2 cephalosporins, cephalexin and cefprozil. We observed a decrease of bactericidal activity of both cephalosporins with an increase of the initial inocula of E. coli and S. aureus. A decreased efficacy and potency of the 2 cephalosporins against S. aureus compared to E. coli was also found. Finally, we developed an in vitro 3-components model including a bacterium -S. aureus-, cells of the immune system -murine bone-marrow-derived macrophages- and an antibiotic -cephalexin-. Within this system, we tested several initial bacterial inoculum sizes and different antibiotic concentrations. Increased bacterial phagocytosis and macrophage mortality were observed with increasing bacterial inocula. Bactericidal activity of macrophages was saturable and faced to a large bacterial inoculum, some macrophages became a reservoir for living S. aureus. With cephalexin, which is an extracellular antibiotic, extracellular bacteria diminished over time implying a diminution of the bacteria to be phagocytosed by macrophages. Thus, macrophages bactericidal and survival abilities were preserved with cephalexin and small bacterial inocula. This effect of the antibiotic was no longer visible with highest bacterial inocula for which limited action of cephalexin did not allow to prevent macrophages bursting. The tripartite model we developed is a first step toward innovative in vitro models combining elements of innate immunity with classical bacteria/antibiotics pharmacological models, with the objective of optimising preclinical evaluation of antibacterial drugs.

Le récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR) b/d est un facteur de transcription impliqué dans l’activation de la voie d’oxydation des lipides qui possède également une fonction anti-inflammatoire. Étudié chez les macrophages, son rôle reste très peu connu dans d’autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T. Nous avons généré un nouveau modèle murin où PPARb/d est surexprimé spécifiquement dans les lymphocytes T (souris Tg T-PPARb), afin d’étudier l’effet de sa surexpression sur le développement ainsi que la fonction des lymphocytes T grâce à deux types de challenges : métabolique et immunitaire. Nos résultats ont permis de mettre en évidence un rôle de PPARb/d dans le développement des lymphocytes T ab (blocage de leur développement) mais pas des lymphocytes T gd. On observe alors une diminution de 70% du nombre de lymphocytes T ab dans les organes lymphoïdes conduisant à une diminution du ratio de Lymphocytes T ab/gd. Les lymphocytes T ab qui arrivent tout de même à se développer ne surexpriment pas PPARb/d. Au cours d’un challenge métabolique (régime hyperlipidique), nous avons observé que les souris Tg T-PPARb sont partiellement protégées contre l’obésité. Elles présentent également une amélioration de leur phénotype métabolique (sensibilité à l’insuline et au glucose, stéatose hépatique) et inflammatoire (diminution de l’inflammation des dépôts de tissus adipeux). Au cours d’un challenge immunitaire (injection de LPS), nous observons une diminution du nombre de macrophages pro-inflammatoires M1 dans la cavité péritonéale des souris Tg T-PPARb dès 1h post-injection. Chez les souris contrôles, ce phénomène est visible à partir de 3h postinjection de LPS. Il semble ainsi que la réponse immunitaire des souris Tg T-PPARb soit plus précoce que celle des souris contrôles en réponse à un challenge immunitaire. En conclusion, la surexpression de PPARb spécifiquement dans les lymphocytes T semble provoquer une altération des populations de lymphocytes T ainsi qu’une potentielle modification de leur fonction qui pourraient expliquer que les souris Tg T-PPARb réagissent mieux que les souris contrôles lorsqu’elles sont soumises à différents types de challenges (immunitaire ou métabolique). / The Peroxisome Proliferator Activated Receptor (PPAR) b/d is a transcription factor involved in the activation of the lipid oxidation pathway that also has an anti-inflammatory function. While well-studied in macrophages, its role in other immune cells like in T cells remains largely unknown. We have generated a new mouse model in which PPARb/d is specifically overexpressed in T cells (Tg T-PPARb mice) and studied the effect of its overexpression on the development and the function of T cells through two types of challenge: metabolic and immune. Our results show a role of PPARb/d in the development of ab T cells (blocking their development) but not gd T cells. There is then a 70% decrease in the number of ab T cells in lymphoid organs leading to a decrease in the ab/gd T cell ratio. ab T cells that are still able to develop do not overexpress PPARb/d. During a metabolic challenge (high fat diet), we observed that Tg T-PPARb mice are partially protected against high fat diet inducedobesity. They also show an improvement in their metabolic (insulin and glucose sensitivity, hepatic steatosis) and inflammatory phenotype (decrease in inflammation in adipose tissue depots). During an immune challenge (LPS injection), we observed a decrease in pro-inflammatory M1 macrophage number in the peritoneal cavity of Tg TPPARb mice at 1h post-injection. In control mice, this phenomenon is seen at 3h post-injection of LPS. Thus, it appears that the immune response in Tg T-PPARb mice is faster than the one in control mice in response to an immune challenge. In conclusion, PPARb/d overexpression specifically in T cells appears to cause an alteration in T cell population as well as a potential change in their function which could explain that Tg T-PPARb mice respond better than control mice when they are subjected to different types of challenges (immune or metabolic).

Chez les espèces aviaires, le stockage des spermatozoïdes s’étend sur plusieurs semaines principalement au niveau du réservoir de la jonction utéro-vaginale, contenant les tubules de stockage des spermatozoïdes (SST). Les mécanismes impliqués dans ce processus restent indéterminés. L’effet de l’insémination artificielle (IA) a été évalué sur le protéome du fluide utérin (FU), des protéines cibles et des glycanes dans les SST, provenant de poules possédant une longue (F+) ou courte (F-) durée de stockage. La longue durée de stockage est associée à une abondance relative dans le FU après IA des protéines exosomales (ANXA4, ANXA5), des protéoglycanes (TSKU), des protéines liant les protéoglycanes (HAPLN3, FN1, VTN), des transporteurs de lipides (VTG1, VTG2, APOA1, APOA4, APOH), et des protéines matricielles de la coquille (OCX32). Au contraire, la faible capacité de stockage est associée à la régulation après IA des protéines immunitaires (PIGR, immunoglobulines) ou pro-inflammatoire (LTA4H), des protéases (XPNPEP1), des chaperones (HSPA8), des mucines (MUC5AC, MUC5B), et de l’ovalbumine (OVALY). Au niveau des SST, les protéines matricielles de la coquille (OC-116, OCX36, OC-17) ont été identifiées dans l’épithélium et la lumière. La longue durée de stockage est associée à la sécrétion luminale de résidus Glc/GlcNAc, à la mobilisation apicale de protéines exosomales (ANXA4), et la non-activation des voies métaboliques impliquant les protéines PIGR, HSPA8, et ANXA5 dans les SST. En conclusion, la composition protéique du FU et des SST requièrent des régulations spécifiques après IA certainement pour garantir le stockage des spermatozoïdes. / In avian species, the sperm storage mainly takes place in uterovaginal sperm storage tubules (SST) during several weeks. Mechanisms implied in this process are not fully understood. The effect of artificial insemination (AI) has been evaluated on the uterine fluid (UF) proteomic composition, and on SST candidate proteins, from hens exhibiting long (F+) or short (F-) sperm storage duration. Long sperm storage duration was associated with the relative abundance in UF after AI of proteoglycans (TSKU), proteoglycan binding proteins (HAPLN3, FN1, VTN), lipid transporters (VTG1, VTG2, APOA1, APOA4, APOH), and eggshell matrix proteins (OCX32). In contrast, poor sperm storage ability was associated with the regulation of immune factors (PIGR, immunoglobulins), pro-inflammatory factors (LTA4H), proteases (XPNPEP1), chaperone (HSPA8), mucins (MUC5AC, MUC5B), and ovalbumin related protein Y (OVALY). At the level of SST, eggshell matrix proteins (OC-116, OCX36, OC-17) were identified in SST cells and lumen. Long sperm storage duration was associated in SST with the luminal secretion of Glc/GlcNAc residues, ANXA4 apical mobilization, and non-activation of metabolic pathway implying PIGR, HSPA8, and ANXA5. In conclusion, the proteomic composition of UF and SST require specific regulation after insemination, most probably to guarantee the success of sperm storage process.