L’avènement des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICIs) ciblant l’axe PD-1/PD-L1 a révolutionné le traitement des patients avec un carcinome pulmonaire non à petites cellules (CPNPC). Ce mémoire consolide les conclusions de trois études distinctes visant à analyser et à améliorer l'efficacité des ICIs en monothérapie chez le CPNPC. La première section explore les bénéfices associés au durvalumab suivant une chimioradiothérapie chez les patients présentant un CPNPC localement avancé, confirmant le bénéfice de survie associé aux ICI et élargissant les perspectives émises depuis l'étude PACIFIC, y compris au niveau de la valeur prédictive du PD-L1. Dans l’optique de caractériser de nouveaux biomarqueurs d’efficacité, la deuxième section souligne le rôle crucial du microbiome intestinal dans la modulation de la réponse aux ICIs, spécifiquement au niveau de la dysbiose intestinale liée aux antibiotiques. La méta-analyse proposée confirme l’impact délétère des antibiotiques sur la survie des patients traités avec un ICI, tout particulièrement lorsque l’antibiothérapie précède l’inhibition du PD-1/PD-L1. Dans le domaine des stratégies immunomodulatrices émergentes, la troisième section explore l’impact de la cryoablation chez les patients présentant un CPNPC avec PD-L1≥50% et traités avec le pembrolizumab. Sans relever un signal d’efficacité supérieure, cette étude de phase I/II confirme la faisabilité et l’innocuité de la cryoablation, une technique permettant la libération d’antigènes tumoraux en circulation sans dénaturation thermique. Ultimement, ce mémoire propose un survol des bénéfices de survie, biomarqueurs prédictifs et stratégies immunomodulatrices liés à l’utilisation des ICIs chez les patients avec un CPNPC avec l’espoir d’optimiser les paradigmes thérapeutiques existants. / The advent of immune checkpoint inhibitors (ICIs) targeting the PD-1/PD-L1 axis has revolutionized the therapeutic landscape for patients diagnosed with non-small cell lung cancer (NSCLC). This thesis consolidates the findings of three distinct studies aiming to analyze and enhance the efficacy of ICI monotherapy in NSCLC. The first section delves into the real-world use of durvalumab following chemoradiotherapy in stage III NSCLC, confirming the survival benefit associated with ICI administration in this context and broadening the insights derived from the PACIFIC study, particularly regarding the predictive value of PD-L1. With the aim of characterizing new biomarkers of efficacy, the second section sheds light on the crucial role of the gut microbiome in modulating responses to ICIs, particularly intestinal dysbiosis related to antibiotics. The meta-analysis confirms the detrimental impact of antibiotics on the overall survival of patients with advanced cancer treated with ICI monotherapy, especially when antibiotic therapy precedes PD-1/PD-L1 inhibition. In the realm of emerging immunomodulatory strategies, the third section explores the impact of cryoablation in patients with NSCLC and PD-L1≥50% treated with pembrolizumab. Although the procedure did not translate into a signal of superior efficacy, the proposed phase I/II study confirms the feasibility and safety of cryoablation, a technique allowing the release of circulating tumor antigens without heat-related denaturation. Ultimately, this thesis presents a contemporary overview of survival benefits, predictive biomarkers, and immunomodulatory strategies associated with the use of ICIs in monotherapy in patients with NSCLC, with the hope of optimizing existing therapeutic paradigms.

Filarien persistieren bis zu 15 Jahren in ihren Wirten. Als eine Ursache dieser Persistenz diskutiert man die Fähigkeit der Filarien, die Immunantwort des Wirtes gezielt zu modulieren und eine zelluläre Hyporeaktivität zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob ein sezernierter Cysteinproteasen-Inhibitor (Onchocystatin) der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus immunmodulierende Eigenschaften besitzt und an der Herausbildung eines hyporeaktiven Immunstatus des Wirtes beteiligt ist. Für die Untersuchungen wurde Onchocystatin als full length Molekül (rOv17) und als verkürztes Molekül (trOv17) rekombinant hergestellt. Das verkürzte trOv17 besitzt aufgrund des Fehlens des N-terminalen Bereiches eine verminderte proteaseinhibitorische Aktivität. Die in vitro Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen verdeutlichen, daß rOv17 und auch trOv17 potente Immunmodulatoren sind, die sowohl die antigenspezifische als auch die polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC inhibieren. Die zelluläre Hyporeaktivität ist dabei auf die Modulation von Monozytenfunktionen zurückzuführen. rOv17 und trOv17 modulieren die Antigenpräsentation, die Zytokinproduktion und die Expression kostimulatorischer Signale von humanen Monozyten. So konnte gezeigt werden, daß rOv17 und trOv17 die Aktivität von humanem Cathepsin L und S inhibieren und die Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 vermindern. Die Modulation der Zytokinproduktion durch rOv17 und trOv17 ist durch eine verstärkte TNF-alpha und IL-10 Produktion und durch eine verminderte IL-12 Produktion charakterisiert. Desweiteren konnte in Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak gezeigt werden, daß die verminderte Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 Folge der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion ist. Im Gegensatz dazu bleibt die verminderte IL-12 Produktion und die verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation humaner PBMC auch nach der Neutralisation von IL-10 bestehen. Die Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen zeigen, daß rOv17 und trOv17 ihr immunologisches Umfeld auf vielfältige Art und Weise modulieren. Dabei spielt vermutlich die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease, aber auch ein von der Funktion als Cysteinproteasen-Inhibitor unabhängiger Mechanismus eine Rolle. Der Cysteinproteasen-Inhibitor der Filarie O. volvulus besitzt somit die Eigenschaft, die Immunantwort des Wirtes zu modifizieren, und ist vermutlich eine wesentliche Komponente, die dem Parasiten eine lange Persistenz im Wirt ermöglicht. / Immune responses of individuals infected with filarial nematodes are characterized by a marked cellular hyporesponsiveness. The establishment of this hyporesponsiveness is considered as an important mechanism to avoid host immune responses which could eliminate the parasites. The present study is investigating the immunomodulatory potential of a 17 kD secreted cysteine protease inhibitor (onchocystatin) of the human pathogenic filaria Onchocerca volvulus. In vitro studies using recombinant onchocystatin (rOv17) identified this inhibitor as a potent immunomodulator. rOv17 suppresses the antigen-driven and the polyclonally-stimulated proliferation of human PBMC. This cellular hyporeactivity is due to the modulation of monocytic function by rOv17, comprising the modulation of antigenpresentation, the expression of costimulatory molecules and the production of cytokines. Thus rOv17 strongly inhibits the activity of human cathepsin L and S and reduces the expression of MHC class II molecules as well as the expression of CD40 and CD86 on human monocytes. The modulation of cytokine production by rOv17 is characterized by an initial increase of TNF-alpha which is followed by an increase of IL-10 and a decrease of IL-12. By neutralization studies it was shown that the suppression of MHC class II molecules and of CD86 and CD40 is mediated by the rOv17 induced increase of IL-10. In contrast cellular hyporeactivity and the reduced IL-12 production remain unaffected by neutralization of IL-10. In comparison to rOv17 a truncated onchocystatin (trOv17) with lowered protease inhibitory activity was investigated. Surprisingly even trOv17 is immunomodulatory active suggesting that immunomodulation by onchocystatin is mediated by both an inhibitor-dependent and an inhibitor-independent mechanism. These data demonstrate that onchocystatin is a potent immunomodulator of host immune responses and in consequence is an essential component that enables the parasites a long persistence within their hosts.

Von regenerativen Zellen freigesetzte vesikuläre Strukturen mit einer Lipiddoppelmembran, sogenannte extrazelluläre Vesikel (EVs), stellen einen vielversprechenden Ansatz dar zukünftig Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu behandeln. In diesem Zusammenhang untersuchte die vorliegende Arbeit die Eignung von EVs allogener humaner Herzzellen (CardAP-Zellen) als mögliches Therapeutikum für Erkrankungen des Herzens. Zu diesem Zwecke wurden die EVs durch differentielle Zentrifugation aus dem konditionierten Medium von CardAP-Zellen nach Kultivierung mit oder ohne pro-inflammatorische Zytokine gewonnen. Die so isolierten EV- Präparationen beider Konditionen zeigten vergleichbare Konzentrationen und verfügten sowohl über charakteristische vesikuläre Strukturen als auch transportierte Moleküle, wie die Tetraspanine. Allerdings wiesen stimulierte EVs im Gegensatz zur nichtstimulierten Vergleichsgruppe ein größeres Repertoire an miRNAs und kleinere Durchmesser auf. In verschiedenen in vitro Analysen konnte zudem nachgewiesen werden, dass EVs von CardAP-Zellen i) die Angiogenese fördern, ii) die Apoptose von Herzzellen vermindern, iii) nur schwach immunogen sind und iv) induzierte Immunreaktionen verringern können. Dabei wurden teils deutliche Unterschiede zwischen den induzierten Effekten von EVs aus stimulierten und nichtstimulierten Konditionen dokumentiert, die darauf schließen lassen, dass verschiedene Mechanismen in der Empfängerzelle angeregt werden durch die Interaktion mit den jeweiligen EVs. Insbesondere konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass CD14+ Immunzellen eine essentielle Rolle bei der immunmodulierenden Wirkung der EVs in induzierten Immunreaktionen besitzen. Zusammenfassend stellen EVs von allogenen CardAP-Zellen ein aussichtsreiches therapeutisches Werkzeug für Herz-Erkrankungen dar und zukünftige Studien werden klären, ob eine Anwendung im Menschen möglich ist. / From cells released vesicular structures with a lipid bilayer, the so-called extracellular vesicles (EVs), cannot reproduce but can affect important processes in a recipient cell. EVs of regenerative cells represent a promising therapeutic approach. In this context, the present work investigated whether heart diseases could be treated in the future by using EVs from allogeneic regenerative human cardiac cells (CardAP cells). For this purpose, EVs were isolated by differential centrifugation from the conditioned medium of CardAP cells cultured with or without pro-inflammatory cytokines. These obtained EV preparations from both EV biogenesis conditions exhibited comparable concentrations, characteristic vesicular structures, and characteristic transported molecules, such as the tetraspanins. However, stimulated EVs showed a larger repertoire of miRNAs and smaller diameters in contrast to their unstimulated counterpart. Most importantly, different in vitro analysis demonstrated that the isolated EVs from CardAP cells i) promote angiogenesis, ii) decrease cardiac cell apoptosis, iii) have a low immunogenicity, and iv) can reduce induced immune responses. Interestingly, differences were documented in these beneficial features between stimulated and unstimulated EV preparations, suggesting that different mechanisms in the recipient cell are stimulated by the interaction with the respective EVs. Moreover, CD14+ cells (mainly monocytes) were shown to play an essential role in the detected immunomodulation of EVs. In summary, EVs from CardAP cells appear to be a promising therapeutic tool for cardiac diseases and further studies will clarify open questions such as the efficacy in the organism.

EBAG9 (estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9) hat als unabhängiger prognostischer Marker viel Aufmerksamkeit erregt, da in einigen Tumoren hohe Expressionsraten und Tumorentwicklung korrelieren. In diesen Fällen ist eine hohe EBAG9 Expression häufig mit einer schlechten klinischen Prognose verbunden. EBAG9 ist ein ubiquitär exprimiertes Golgi Protein. Aktuelle Daten demonstrieren, dass es in sekretorischen Zellen an der regulierten Exozytose und an der zytotoxischen Funktion von Lymphozyten beteiligt ist. In epithelialen Zellen führt es zur Generierung von Tumor-assoziierten O-Glykanen, welche ein Erkennungsmerkmal vieler Krebsarten sind. In dieser Arbeit wurde der pathogenetische Zusammenhang zwischen EBAG9 Expression und der Veränderung des zellulären Glykoms untersucht. Um einen tieferen Einblick in die zelluläre Funktion von EBAG9 in epithelialen Zellen zu gewinnen, wurden Zellen mit tumorähnlicher EBAG9 Expression verwendet. Innerhalb dieser Arbeit wurde demonstriert, dass EBAG9 mit anterograden COPI Vesikeln assoziiert und zwischen dem ER-Golgi intermediären Kompartiment und cis-Golgi pendelt. EBAG9 verursacht eine Verzögerung des anterograden Transportes vom ER zum Golgi und verändert die Lokalisation von Komponenten der ER Qualitätskontrolle und des Glycosylierungsapparates. Auf der anderen Seite beschleunigt die verminderte Expression von EBAG9 den Proteintransport durch den Golgi und verstärkt die Aktivität von Mannosidase II. Mechanistisch betrachtet verhindert EBAG9 die Rekrutierung von ArfGAP1 an die Membran. Dies beeinträchtigt das Auflösen der COPI Vesikelhülle und somit die Fusion von Vesikeln am cis-Golgi. Damit agiert EBAG9 in epithelialen Zellen als negativer Regulator des COPI-abhängigen ERGolgi Transportes und stellt damit ein neues phatogenetisches Prinzip dar, bei dem die Beeinflussung des intrazellulären Transportes zu der Entstehung von Tumor-assoziierten Glykanen führt. / The estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9 (EBAG9) has received increased attention as an independent prognostic marker for disease-specific survival since in some human tumor entities high expression levels correlate with tumor progression and poor clinical prognosis. Interestingly, EBAG9 was identified as an ubiquitously expressed Golgi protein. Recent data demonstrate an involvement in regulated exocytosis in secretory cells and the cytotoxic functions of lymphocytes. However, EBAG9 is expressed in essentially all mammalian tissues, and in epithelial cells it has been identified as a modulator of tumorassociated O-linked glycan expression, a hallmark of many carcinomas. This thesis addresses the pathogenetic link between EBAG9 expression and the alteration of the cellular glycome. To gain further insights into the cellular functions of EBAG9 in epithelial cells, tumor-associated EBAG9 overexpression was mimicked in living cells. It was demonstrated that EBAG9 associates with anterograde COPI-coated carriers and shuttles between the ER-Golgi intermediate compartment and cis-Golgi stacks. EBAG9 overexpression imposes a delay in anterograde ER-to-Golgi transport and mislocalizes components of the ER quality-control and glycosylation machinery. Conversely, EBAG9 downregulation accelerates glycoprotein transport through the Golgi and enhances mannosidase activity. Functionally, EBAG9 impairs ArfGAP1 recruitment to membranes and consequently, interferes with the disassembly of the coat lattice at the cis-Golgi prior to fusion. Thus, EBAG9 acts as a negative regulator of a COPI-dependent ER-to-Golgi transport pathway in epithelial cells and represents a novel pathogenetic principle in which interference with intracellular membrane trafficking results in the emergence of a tumor-associated glycome.

Parasitische Würmer gehören mit über 3,5 Milliarden Betroffenen zu den weltweit verbreitetesten Infektionskrankheiten. Der Erfolg dieser Parasiten beruht auf ihren ausgefeilten Mechanismen mit denen sie das Immunsystem ihrer Wirte manipulieren. Interessanter Weise gehen Wurminfektionen mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit an Allergien zu erkranken einher. Wie genau die Parasiten das Immunsystem manipulieren ist weitgehend unbekannt. Um diese Mechanismen besser studieren zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht RNA interference (RNAi), anhand des Modellmoleküls Tropomyosin zu etablieren. Wie sich am Beispiel des Strongyliden Heligmosomoides polygyrus bakeri zeigte, ist RNAi als Manipulationsmethode für Nematoden nicht oder nur in geringem Maße geeignet. Dies lässt sich auf das Fehlen von Aufnahme- und Verbreitungsmechanismen für Doppelstrang-RNA zurückführen. Desweiteren wurden die Auswirkungen von rekombinantem Tropomyosin der Filarie Acanthocheilonema viteae (rAv-TMY) auf die Entstehung allergischer Atemwegserkrankungen im Mausmodell untersucht. Eine viermalige Behandlung mit rAv-TMY in einem Zeitraum von vier Wochen führte zu verringerten entzündlichen Reaktionen in den Atemwegen. Die Analyse immunologischer Parameter ergab, dass rAv-TMY signifikant den Einstrom von Entzündungszellen in die Atemwege reduziert, allem voran den Einstrom von Eosinophilen. Dies lässt sich durch die verringerte Ausschüttung an IL-5, Eotaxin und MCP-5 zurückführen. Zudem wurde die Bildung von antigenspezifischen IgE verringert während sich die Produktion blockierender IgG1 Antikörper erhöhte. Diese Arbeit belegt somit die anti-allergischen Eigenschaften von rAv-TMY. Damit stellt rAv-TMY ein interessantes Kandidatenmolekül zur Behandlung allergischer Reaktionen dar. Desweiteren kann der Vergleich von allergenem, nicht allergenem und modulatorischem Tropomyosin wichtige Informationen über die allgemeinen Eigenschaften von Allergenen und ihrer molekularen Struktur geben. / Parasitic worms are among the world''s most prevalent infectious diseases with more than 3.5 billion. The success of these parasites is based on their sophisticated ways to manipulate the immune system of their hosts. Interestingly, worm infections abate the risk to develop allergic disorders. How exactly parasitic worms modulate the immune system is so far largely unknown. In order to be able to investigate parasite induced modulation, this work aimed to establish RNA interference (RNAi), a method of genetic manipulation, using tropomyosin as target gene. As shown for the example of Heligmosomoides polygyrus RNAi is not or only to a small extent useful as method to genetically manipulate nematodes. This can be explained with the lack of uptake and spreading mechanisms for double stranded RNA. Furthermore, this work examined the impact of the recombinant muscle protein tropomyosin of Acanthocheilonema viteae (rAv-TMY) on the course of a rodent model of allergic airway inflammation. A four-time treatment with rAv-TMY over a period of four weeks resulted in decreased inflammatory responses in the airways. The analysis of immunological parameters showed that rAv-TMY significantly reduces the influx of inflammatory cells into the airways, especially eosinophils. The reduced eosinophil influx can be attributed to the decreased expression of IL-5, eotaxin and MCP-5 in the airways. In addition, the formation of antigen-specific IgE was impaired whereas the production of the blocking antibody IgG1 was increased. These results demonstrate the anti-allergic properties of rAv-TMY. For this reason rAv-TMY becomes an interesting model molecule for the treatment of allergic diseases. Furthermore, the comparison of allergenic, non-allergenic and modulatory tropomyosin might put some light on the nature of allergens and their molecular patterns.

Fusionspeptid-, Redox-, Viruscore- und sonstige Proteine. Alle analysierten Single ORF (SO)-VVOV Rekombinanten vermittelten einen signifikanten Schutz vor einer tödlichen Belastung mit Aujeszky-Virus. Zwei der Rekombinanten (SO 93-, SO 94-VVOV) enthalten ORFs, die für ATI/Fusionspeptid-Proteine kodieren. In SO 19- und SO 70-VVOV sind dagegen für Redoxproteine kodierende ORFs integriert. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass SO 94- und SO 19-VVOV in zwei weiteren Modellsystemen immunstimulatorisch aktiv sind. Im Baculo-Virussystem exprimierte Proteine waren nur in Kombination mit Vaccinia Lister-Virus (VV) wirksam. Dabei zeigten jeweils Virus-Protein-Gemische mit dem geringsten Proteinanteil den stärksten immunstimulatorischen Effekt. Proben in denen VV durch bovines Herpes-Virus-1 ersetzt wurde, sind dagegen nicht wirksam. Dies lässt auf eine Beteiligung VV-spezifischer Faktoren schließen. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen führte eine Frameshift-Mutation in ORF 94r von SO 94mut-VVOV nur zur Abschwächung und nicht zum vollständigen Verlust der immunstimulatorischen Wirkung. Beide in Schizosaccharomyces pombe exprimierten Proteine, sp-ORF19 und sp-ORF94r, induzierten keinen signifikanten Schutz im Aujeszky Maus Modell. Mit der Identifikation einzelner immunstimulatorisch aktiver PPVO-Komponenten ist es erstmals gelungen, den paramunisierenden Effekt von Parapox-Viren einzelnen viralen Genen zu zuordnen. Insbesondere stellen SO 94- und SO 19-VVOV viel versprechende Kandidaten für die prophylaktische bzw. therapeutische Anwendung in verschiedenen Indikationen als auch für weitere Untersuchungen des Wirkmechanismus dar.

Traditional medicines prepared from Sutherlandia frutescens are used to manage diseases including HIV and cancer. This study aimed at isolating and identifying biologically active compounds isolated from S. frutescens. Sutherlandia frutescens plants were collected in Petrusburg and Paarl. Powdered plant material was extracted using ethanol or water and their metabolite composition was compared using UPLC-MS. A novel cycloartane, an acetylated variant of this compound as well as a Sutherlandioside B triterpenoid was isolated and characterised using chromatographic and analytical techniques such as NMR and UPLC-MS. Preliminary biological studies were conducted to assess the activity of plant extracts on cell toxicity, herpes virus replication and cytokine expression. The results of this study suggest that aqueous extracts from S. frutescens do not appear to be cytotoxic or show anti-herpetic activity, but may activate the immune system by increasing expression of IL-6, IL-10 and TNFα. Further research should be conducted to confirm and optimise these results. / Life and Consumer Sciences / M. Sc. (Life Science)

Fusionspeptid-, Redox-, Viruscore- und sonstige Proteine. Alle analysierten Single ORF (SO)-VVOV Rekombinanten vermittelten einen signifikanten Schutz vor einer tödlichen Belastung mit Aujeszky-Virus. Zwei der Rekombinanten (SO 93-, SO 94-VVOV) enthalten ORFs, die für ATI/Fusionspeptid-Proteine kodieren. In SO 19- und SO 70-VVOV sind dagegen für Redoxproteine kodierende ORFs integriert. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass SO 94- und SO 19-VVOV in zwei weiteren Modellsystemen immunstimulatorisch aktiv sind. Im Baculo-Virussystem exprimierte Proteine waren nur in Kombination mit Vaccinia Lister-Virus (VV) wirksam. Dabei zeigten jeweils Virus-Protein-Gemische mit dem geringsten Proteinanteil den stärksten immunstimulatorischen Effekt. Proben in denen VV durch bovines Herpes-Virus-1 ersetzt wurde, sind dagegen nicht wirksam. Dies lässt auf eine Beteiligung VV-spezifischer Faktoren schließen. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen führte eine Frameshift-Mutation in ORF 94r von SO 94mut-VVOV nur zur Abschwächung und nicht zum vollständigen Verlust der immunstimulatorischen Wirkung. Beide in Schizosaccharomyces pombe exprimierten Proteine, sp-ORF19 und sp-ORF94r, induzierten keinen signifikanten Schutz im Aujeszky Maus Modell. Mit der Identifikation einzelner immunstimulatorisch aktiver PPVO-Komponenten ist es erstmals gelungen, den paramunisierenden Effekt von Parapox-Viren einzelnen viralen Genen zu zuordnen. Insbesondere stellen SO 94- und SO 19-VVOV viel versprechende Kandidaten für die prophylaktische bzw. therapeutische Anwendung in verschiedenen Indikationen als auch für weitere Untersuchungen des Wirkmechanismus dar.

Mesenchymale Stromazellen (MSC) unterstützen die endogene Geweberegeneration und sind kaum immunogen. Die Mechanismen der Immunmodulation sind kaum bekannt. Diese Arbeit untersucht, ob MSC in die Interaktion von Dendritischen Zellen (DC), Natürlichen Killer (NK) und T Zellen eingreifen, indem sie die DC-Reifung beeinflussen. Das Netzwerk ist wichtig für die Differenzierung naïver T Zellen zu Typ 1 T Helferzellen (Th1). Abhängig vom DC-Subtyp und dem Zeitpunkt des Aufeinandertreffens, beeinflussten Knochenmark-MSC (BM-MSC) die in vitro DC-Reifung verschieden. Sie inhibierten die Differenzierung, aber nicht die Reifung humaner von Monozyten-abgeleiteter DC (moDC). BM MSC hatten keinen klaren Einfluss auf die Reifung plasmazytoider DC (pDC), während sie in aktivierten CD1c+ myeloiden DC (mDC) einen tolerogenen Phänotyp induzierten, charakterisiert durch eine geringere CCR7-abhängige Migration und ein tolerogenes Zytokinprofil. Daraus resultierend, wiesen BM-MSC-geprägte mDC aufgrund der veränderten IL 12/IL 10 Sekretion eine geringere Fähigkeit zur Stimulation der IFNγ Produktion in NK Zellen auf und induzierten weniger Th1 Differenzierung naïver T Zellen. Placenta-derived mesenchymal-like adherent stromal cells (PLX PAD) erzielten ähnliche Ergebnisse. Es konnte keine Alloimmunogenität in Patienten mit kritischer Ischämie der Extremitäten (CLI), die im Rahmen einer Phase I klinischen Studie allogene PLX PAD erhalten hatten, nachgewiesen werden. Keiner der Patienten entwickelte eine signifikante Gedächtnis T Zellantwort spezifisch für das Zellprodukt, was durch unsere in vitro Beobachtungen erklärbar sein könnte. Es ist schwierig MSC im Gewebe nachzuweisen, da Markerkombinationen notwendig sind. CD73+CD90+CD105+CD45-CD34-CD14-CD19- MSC konnten mithilfe einer neuen Multiplex-Immunhistologie-Technik (Chipzytometrie) in humanen Plazentaschnitten detektiert werden. Für die Zukunft könnte damit die Interaktion injizierter MSC mit Immunzellen in Biopsien untersucht werden. / Mesenchymal stromal cells (MSC) support endogenous tissue regeneration and seem to be low immunogenic, allowing application across MHC barriers. But little is known about the mechanisms for their immunomodulation. Hence, the main goal of this study was to understand if MSC interfere with the crosstalk between dendritic cells (DC), natural killer (NK) and T cells by influencing DC maturation. This network is important for efficient priming of naïve T cells into type 1 helper T cells (Th1). Bone marrow-derived MSC (BM-MSC) had diverse effects on DC maturation in vitro, depending on the DC subset and the time of interaction. BM MSC inhibited differentiation but not maturation of monocyte-derived DC (moDC). They did not have a clear effect on maturation of plasmacytoid DC (pDC), whereas they induced a tolerogenic phenotype in activated CD1c+ myeloid DC (mDC), characterized by an impaired CCR7-dependent migration and a tolerogenic cytokine profile. Consequently, BM-MSC-licensed mDC displayed a reduced ability to induce IFNγ production in NK cells due to their altered IL 12/IL 10 secretion. BM MSC-licensed mDC also induced less efficiently Th1 lineage commitment of naïve T cells. Similar results were observed with placenta-derived mesenchymal-like adherent stromal cells (PLX PAD). Samples from critical limb ischemia (CLI) patients treated with MHC-unmatched PLX-PAD within a phase I clinical trial were analysed for alloimmunogenicity. None of the patients developed a significant memory T cell response specific to the allogeneic cells, which might be explainable by our in vitro observations. MSC are difficult to detect in tissues because a set of lineage markers is needed. Here, CD73+CD90+CD105+CD45-CD34-CD14-CD19- MSC could be identified in human placenta cryosections using a novel multiplex-immunohistology technique (chipcytometry), offering the possibility to investigate the crosstalk between injected MSC and attracted immune cells in patient biopsies in the future.

Multiple Sklerose (MS) ist eine heterogene Krankheit des Zentralnervensystems, deren pathologische Mechanismen noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Die gegenwärtige Hypothese ist, daß pro-inflammatorische T-Zellen entscheidend an der Pathogenese der MS beteiligt sind. Man geht davon aus, daß eine Fehlregulation der T-Zell-Kontrolle, möglicherweise bedingt durch ein Ungleichgewicht an Apoptose-regulierenden Molekülen, dabei eine Rolle spielt. Tatsächlich zielen therapeutische Strategien darauf ab, T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Produktion von Zytokinen zu verringern, oder T-Zell-Eliminierung zu fördern. Diese Arbeit sollte zum einen die Bedeutung regulatorischer Faktoren klären, die für das überleben der T-Zellen von MS-Patienten verantwortlich sind. Zum anderen sollten die antiproliferative oder Apoptose-fördende Wirkung potentiell therapeutisch wirksamer Moleküle untersucht werden. Eine eingeschränkte Regulation der autoreaktiven T-Zellen durch Apoptose in der Peripherie und im ZNS trägt möglicherweise zur Pathophysiologie der MS bei. Als Schlüsselfaktoren der Regulation von Apoptose wurden Mitglieder der Bcl-2-Familie in MS-Patienten und Probanden untersucht. Diese Faktoren wurden in Relation zu der Suszeptibilität der T-Zellen gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (sog. Activation-induced cell death oder AICD) überprüft. Um die in-vivo-Elimination der Antigen-reaktiven T-Zellen nachzuahmen, wurde ein in-vitro-Modell des AICD mit repetitiver T-Zell-Stimulation verwendet. Tatsächlich zeigten polyklonale T-Zellen von MS-Patienten eine verringerte Suszeptibilität für AICD, nachgewiesen sowohl durch verminderte Caspaseaktivtät (p=0.013) als auch durch DNA-Fragmentierung (p=0.0071). Weiter wurden höhere Spiegel des Proteins Bcl-XL in den Immunzellen von MS-Patienten mit Immunoblotting gemessen (p=0.014). Eine inverse Korrelation zwischen der Expression an Bcl-XL und der Empfindlichkeit der T-Zellen gegenüber AICD steht in Übereinstimmung mit vorhergehenden Daten bezüglich der Bedeutung dieses Proteins für die Apoptose-Resistenz von T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, daß dieses Molekül die Ausprägung der experimentell-autoimmun Enzephalomyelitis, des Tiermodells der MS, verstärkt. Zusammen mit den erhöhten Bcl-XL-Werten bei MS-Patienten, ergeben sich nun Perspektiven für einen therapeutischen Ansatz. Abgesehen von dem Konzept die apoptotische Eliminierung von T-Zellen zu unterstützen, streben gegenwärtige therapeutische Strategien an, die Aktivierung und weitere Proliferation der schädlichen T-Zellen zu hemmen. Basierend auf klinischer Erfahrung mit eher unselektiven Therapien, ist es ein therapeutisches Ziel, neue immunomodulatorische Substanzen mit besserer Selektivität zu finden, um das Nutzen/Risiko-Verhältnis zu maximieren. Aus diesem Grund wurden zwei unterschiedliche Substanzen untersucht die beide den Zellzyklus beeinflussen. Als erster Kandidat wurde der kürzlich entdeckte Todesligand TRAIL (engl.: TNF-related apoptosis inducing ligand) aus der TNF/NGF-Familie untersucht, da diesem bereits T-Zell-regulatorische Funktionen zugeschrieben worden waren, humane Antigen-spezifische T-Zellen jedoch resistent gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose sind. Der zweite Kandidat mit potenziell therapeutischer Wirkung bei MS ist Atorvastatin, ein HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, der bereits als Lipidsenker bei Patienten eingesetzt wird. Um die Hypothese zu überprüfen, daß diese Substanzen T-Zell-Rezeptor-Signale beeinflussen können, wurden humane Antigen-spezifische T-Zell-Linien von MS-Patienten und gesunden Probanden eingesetzt. Diese wurden hinsichtlich T-Helfer-Phänotyp und Peptid-Spezifität charakterisiert. Eine Behandlung mit TRAIL führte zur Hemmung der Proliferation in unterschiedlichem Ausmaß (6.2% - 63.8%). Atorvastatin hemmte in Abhängigkeit von der Dosis ebenso die Proliferation Antigen-spezifischer T-Zellen. Beide Substanzen wirkten antiproliferativ unabhängig von der Antigenpräsentation, aufgrund ihrer Fähigkeit, die Proliferation in Abwesenheit von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen zu vermindern. Diese Eigenschaft weißt auf einen direkten Einfluß auf die T-Zell-Funktion hin. Die TRAIL-induzierte Hypoproliferation war assoziiert mit einer Herunterregulation der Zyklin-abhängigen Kinase CDK4 (engl.: cyclin dependent kinase 4), einem Schlüsselenzym für die nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation einsetzende Transition von der G1- zur S-Phase des Zellzyklus. Inkubation mit Atorvastatin induzierte ebenso eine Verminderung von CDK4, begleitet von einer Erhöhung von p27Kip1. Die Atorvastatin-vermittelte Proliferations- und Zellzyklus-Blockade konnte durch Mevalonat rückgängig gemacht werden. Mevalonat ist ein Zwischenprodukt des HMG-CoA-Reduktaseweges. Atorvastatin scheint demnach einen direkten Einfluß auf diese Enzymkaskade zu haben, der wichtig für die Isoprenylierung von GTPase-Proteinen der Rho-Familie ist. T-Zell-Rezeptor-Stimulation führt zur Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern und nachfolgend zur Öffnung transmembranöser Kalzium-Kanäle (sog. calcium release-activated calcium oder CRAC-Kanäle), die eine für die T-Zellaktivierung notwendige und anhaltende Erhöhung der intrazellulären Kalzium-Konzentration hervorruft. Nach Behandlung mit TRAIL wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition des Einstroms extrazellulärer Kalzium-Ionen durch die CRAC-Kanäle beobachtet. Dies wurde mit löslichem TRAIL-Rezeptor-Fusionsprotein, einem TRAIL-Antagonisten, rückgängig gemacht. Die Blockade von Kalzium-abhängigen Aktivierungssignalen stellt damit möglicherweise einen primären immunregulatorischen Mechanismus für diese Todesliganden dar. Jedoch wurde keine Auswirkung von Atorvastatin auf die T-Zellaktivierung beobachtet, da der Einstrom von extrazellulärem Kalzium nicht beeinflußt wurde. Während Studien zum TRAIL-vermittelten Einfluß auf die T-Zell-Aktivierung und dem Zellzyklus erst in der präklinischen Phase sind, werden Statine, die ebenfalls den Zellzyklus beeinflussen, bereits in der Therapie anderer Erkrankungen angewand. Darüber hinaus werden derzeit bereits klinische Studien mit Statinen zur MS-Therapie durchgeführt. Weitere Untersuchungen zu den detaillierten Mechanismen antiproliferativer Substanzen mit potenziellem therapeutischen Effekt in der MS ermöglichen die Entwicklung von selektiveren immunomodulatorischen Therapien mit höherem therapeutischen Nutzen für MS-Patienten. / Multiple sclerosis (MS) is a heterogeneous disease of the central nervous system whose pathological mechanisms are far from completely understood. The current hypothesis is that pro-inflammatory T cells are orchestrating the pathogenesis of this condition. It is considered that a dysregulation in T cell control to be involved, with an imbalance in apoptosis-regulating molecules possibly playing a role. In fact, therapeutic strategies aim to reduce T cell activation, proliferation and cytokine production or to promote T cell elimination. The focus of this thesis was to identify the role of regulatory molecules for T cell survival in the immune pathogenesis of MS, and to investigate antiproliferative or apoptosis-promoting effects on T cells by potential therapeutic molecules. A limitation in the apoptotic regulation of autoreactive T cells in the periphery and in the CNS may contribute to the pathophysiology of MS. As key regulators of apoptosis, members of the Bcl-2 family were investigated in both MS patients and controls. These factors were examined in relation to the susceptibility of T cells, from both groups, towards activation-induced cell death (AICD). To mimic the in vivo elimination of antigen-reactive T cells, an in vitro model of AICD involving repetitive T cell receptor mediated stimulation was utilized. In fact, polyclonal T cells from MS patients showed a decreased susceptibility to undergo AICD as shown by both caspase activity (p=0.013) and DNA fragmentation (p=0.0071) assays. Furthermore, Bcl-XL protein levels, as measured by immunoblotting, were increased in the peripheral immune cells of MS patients (p=0.014). An inverse correlation observed between Bcl-XL levels and susceptibility of T cells to undergo AICD is in line with previous data on the significance of this anti-apoptotic protein in T cell resistance. Since this molecule has already been shown to aggravate the outcome of experimental autoimmune encephalitis, the animal model for MS, the observation of elevated Bcl-XL levels in patients offers perspectives towards therapeutic manipulation in MS. Apart from promoting apoptotic elimination, current therapeutic strategies aim at inhibiting activation and further proliferation of potentially harmful T cells. Based on clinical experience with rather non-selective therapies that promote T cell elimination, a therapeutic goal is to identify newer immunomodulatory substances with better selectivity in order to maximize the therapy's benefit to risk ratio. Thus, two different substances, both interfering with cell cycle regulation, were investigated. The first candidate was the recently discovered member of the TNF/NGF family of death ligands, TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) since it has been reported to have immunoregulatory functions and since human antigen-specific T cells were shown to be resistant towards apoptosis induction by this ligand. The second candidate drug with potential in MS therapy is atorvastatin, a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme (HMG-CoA) reductase inhibitor and lipid-lowering drug, already indicated for anomalies in lipid metabolism. In order to prove the hypothesis that these substances interfere with T cell receptor signaling, human antigen-specific T cell lines from both MS patients and controls, characterized with regards to T helper differentiation and peptide specificity, were employed. Exogenous treatment of TRAIL resulted in an inhibition in proliferation, albeit to varying degrees (6.2% - 63.8% inhibition). Atorvastatin also inhibited proliferation of antigen-specific T cell lines in a dose-dependent manner. Both compounds induced hypoproliferation independently of antigen presentation, as shown by their ability to block T cell proliferation in response to direct T cell receptor engagement, thus indicating a direct influence on T cell function. The growth inhibition by TRAIL was associated with a downregulation of the cell cycle regulator CDK4, indicative of an inhibition of cell cycle progression at the G1/S transition. Incubating T cells with atorvastatin also induced a downregulation of CDK4 expression, which was accompanied by an upregulation of p27Kip1 expression. The atorvastatin-mediated inhibition in proliferation and cell cycle progression could be reversed by mevalonate, an intermediate product of the HMG-CoA reductase pathway, suggesting a direct involvement of atorvastatin in this pathway, necessary for the isoprenylation of small GTPase proteins of the Rho family. Utilizing a thapsigargin model of calcium influx to activate the same calcium-release activated calcium (CRAC) channels as T cell receptor-stimulation by antigen, an inhibition in calcium influx could be observed on pre-incubating T cells with TRAIL. Co-incubating with human recombinant TRAIL receptor 2 fusion protein, a competitive antagonist for TRAIL, reversed this inhibition. A direct influence on calcium influx is indicative of an influence of TRAIL on the activation status of human T cells. Therefore, TRAIL directly inhibits activation of these cells via blockade of calcium influx. However, no impact of atorvastatin on early T cell activation was observed, since calcium influx was unaffected. While TRAIL-mediated interference with T cell activation and further cell cycle progression is still in the pre-clinical phase, statins, which have also been shown here to interfere with the T cell cycle, are already employed in the clinic for other ailments. In fact, clinical trials are currently being undertaken with this group of drugs for MS. Further studies on detailed mechanisms of antiproliferative substances effective in MS will allow the development of highly selective immunomodulatory agents with increased beneficial profile as MS therapy.