O Histoplasma capsulatum é um fungo dimórfico responsável por infecções pulmonares graves caracterizadas por reação granulomatosa. Sua incidência vem aumentando nos últimos anos devido principalmente às alterações imunológicas relacionadas ao comprometimento da imunidade celular. Anteriormente, nosso grupo de pesquisa demonstrou o envolvimento dos leucotrienos (LTs) nos mecanismos de defesa do hospedeiro durante a histoplasmose. Além disso, demonstrou que antígenos livres de células (CFAgs, do inglês cell-free antigens), derivados de H. capsulatum, quando empregados na imunização de animais, conferem proteção eficiente aos mesmos e controle da infecção, uma vez que ativam a imunidade celular, e aumento da produção de LTs nos pulmões dos animais imunizados. Assim, nosso grupo desenvolveu microesferas (MS) biodegradáveis, constituídas de ésteres derivados dos ácidos láctico e glicólico (PLGA), contendo LTB4. Estas MS foram avidamente fagocitadas por macrófagos in vitro e aumentaram o recrutamento de leucócitos para os pulmões, quando administradas intratraquealmente. Diante do papel dos LTs na histoplasmose e dos potenciais terapêutico e profilático dos CFAgs, o objetivo deste estudo foi avaliar as atividades biológicas in vitro e in vivo de MS contendo LTB4 e/ou CFAgs. Assim, foram desenvolvidas MS (PLGA) contendo LTB4 e/ou CFAgs através do processo de simples ou dupla emulsão seguido pela extração do solvente. Este método permitiu uma eficiente encapsulação tanto do mediador lipídico quanto dos antígenos protéicos e um perfil de liberação sustentada ao longo dos dias avaliados. O potencial zeta e a morfologia das MS não foram alterados com o processo de microencapsulação; da mesma forma, a integridade dos CFAgs não foi interferida. Para estudos in vitro, empregamos macrófagos diferenciados de medula óssea murina (BMDM). O tamanho adequado das MS contribuiu para sua eficiente fagocitose pelos BMDM e as MS contendo LTB4 e/ou CFAgs modularam a produção de TNF-, IL-1, IL-6 e IL-12, quimiocinas (KC, MCP-1 e RANTES), e nitrito, sendo que as MS-CFAgs mostraram-se mais potentes. O estímulo com as diferentes MS induziu discreto aumento na expressão de CD86 na superfície de BMDM. Neste contexto, verificamos o envolvimento do fator de transcrição NF-B durante a ativação de BMDM induzida pelas MS. Apesar da eficiente ativação dos BMDM induzida pelas MS, não foi possível evidenciar uma resposta imune celular em animais imunizados com as MS-LTB4+CFAgs ou MS-CFAgs. Portanto, futuros experimentos deverão ser realizados a fim de investigar o potencial profilático das MS contendo LTB4 e/ou CFAgs na histoplasmose. / Histoplasma capsulatum is a dimorphic pathogenic fungus that causes a pulmonary disease characterized by chronic granulomatous reaction. In the last years, the incidence of histoplasmosis has increased, mainly as a result of the immunological alterations involved with deficiency of the cellular immunity. Previously, our research group demonstrated the involvement of leukotrienes (LTs) on host defense mechanisms during the histoplasmosis. Cell-free antigens (CFAgs) derived from H. capsulatum, when employed for animals´ immunization, can confer efficient protection and control of the infection, since they activate the cellular immunity. Furthermore, the protection of CFAgs-immunized mice was associated with increased LTB4 generation in the lungs. Based on these results, our group developed biodegradable microspheres (MS) based on PLGA containing LTB4. We showed that these MS were phagocytosed by macrophages in vitro and increased the leukocyte recruitment into the lungs, when administrated via intratracheal. Because the role of leukotrienes in the histoplasmosis and therapeutic and profilatic effects of CFAgs, the aim of this study was evaluate the in vitro and in vivo biological activities of MS containing LTB4 and/or CFAgs. Then, MS (PLGA) containing LTB4 and/or CFAgs were developed through simple or double emulsion/extraction process. This method allowed an efficient encapsulation of the lipid mediator and CFAgs, and a sustained release profile during the evaluated days. Zeta potential and morphology of MS were not altered with the microencapsulation process; CFAgs integrity was not interfered. For in vitro studies, we employed bone marrow-derived macrophages (BMDM). The appropriate size of MS contributed for efficient uptake by BMDM. MS containing LTB4 and/or CFAgs modulated the TNF-, IL-1, IL-6 and IL-12, chemokines (KC, MCP-1 and RANTES), and nitrite production by BMDM, since the MS-CFAgs showed potent immunostimulant effect. Moreover, the stimulus with different MS provoked a discreet increase in the CD86 cell expression. Also we verified an involvement of the transcription factor NF-B during the BMDM activation induced by MS. Even though the in vitro biological activities on BMDM, it was not possible to evidence a cellular immune response in immunized mice with the MS-LTB4+CFAgs or MS-CFAgs. Therefore, future experiments should be conducted in order to investigate the profilatic potential of MS containing LTB4 and/or CFAgs in the histoplasmosis.

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma alteração neuromuscular hereditária e progressiva que afeta humanos do sexo masculino. O modelo canino Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) é considerado modelo experimental para estudos de novas propostas terapêuticas e melhor entendimento da fisiopatogênica da DMD. O processo progressivo da distrofia está relacionado com alterações nas populações celulares que compõe o sistema imune dos pacientes, pois devido a ausência da proteína distrofina na membrana sarcoplasmática, o músculo fica mais susceptível à lesões, ocorrendo liberação de citocinas, que recrutam e estimulam células do sistema imune, principalmente macrófagos e linfócitos T. A longo prazo, essa resposta inflamatória contínua e persistente, leva a uma série de reações que culminam com danos cada vez maiores, a ponto de ocorrer um esgotamento de células satélites e fibrose do tecido muscular. Uma das propriedades mais estudadas das células tronco mesenquimais (MSCs) é sua capacidade imunomoduladora, fazendo com que essas células se tornem promissoras na utilização da terapia celular. Neste contexto, esta ferramenta imunomoduladora pode atuar como uma estratégia interessante na manipulação do sistema imune. O estudo proposto foi elaborado com a finalidade de trazer subsídios para viabilização de experimentos de terapia celular na distrofia muscular, por meio do conhecimento sobre a imunomodulação durante o tratamento in vitro, contribuindo para uma possível aplicação terapêutica em humanos. Para tanto, foram estudados dois grupos de cães, um grupo controle (GR; n=5) e um grupo de cães afetados (GRMD; n=9), compostos por machos e fêmeas. O estudo consistiu na avalição da proliferação de linfócitos na presença de MSC em diferentes concentrações, bem como da proliferaçao de linfócitos específicos como o Tauxiliar (CD4+FoxP3-) e Tregulatórios (CD4+FoxP3+) com as MSCs. Adicionalmente, realizamos a dosagem de nitrito com o intuito de quantificar a produção de óxido nítrico (NO) através do cocultivo de macrófagos com as MSCs. Neste estudo foi possível observar que as MSCs estimularam a proliferação significativa de linfócitos T regulatórios. Adicionalmente, essa porcentagem de divisão aumentou em cocultivos que utilizaram maiores concentrações de MSC. Maior concentração de nitrito também foi encontrada no cocultivos de MSC e macrófagos estimulado com LPS. Estas informações geram incrementos no entendimento de como as MSCs podem agir no organismo distrófico e como poderemos explorar essa fonte para promover um retardamento no processo inflamatório e consequentemente melhorar a qualidade de vida do paciente. / The Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive hereditary neuromuscular disorder that affects human males. The canine model Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) is considered experimental model for studies of new therapies and better understanding of the DMD. The process of progressive dystrophy is related to changes in cell populations that comprise the immune system of patients, because due to the absence of the protein dystrophin in the sarcoplasmic membrane, the muscle is more susceptible to injury, occurring release of cytokines that recruit and stimulate cell immune, mainly macrophages and T lymphocytes in the long term, this continuous and persistent inflammatory response, the system takes a series of reactions that culminate with increasing damage to the point of exhaustion of satellite cells of muscle tissue and fibrosis occur. One of the most studied properties of mesenchymal stem cells (MSCs) is their immunomodulatory capacity, making these cells become promising in the use of cell therapy. In this context, this immunomodulatory can act as an interesting strategy in manipulating the immune system. The proposed study was designed in order to provide support for the feasibility of cell therapy trials in muscular dystrophy, through the knowledge of immunomodulation during treatment in vitro, contributing to a possible therapeutic application in humans. In this purpose, two groups were studied, a group of affected dog (GRMD, n=9) and a control group (GR, n=5 GR). The study consisted of rating of lymphocyte proliferation in the presence of MSCs in different concentrations as well as the proliferation of specific lymphocytes as Thelper (CD4+FoxP3-) and Tregulatory (CD4+FoxP3+) to MSCs. In addition, the dosage of nitrite performed in order to quantify the production of nitric oxide (NO) by coculture with macrophages MSCs. In this study we observed that MSCs stimulated significant proliferation of regulatory T lymphocytes. Additionally, this percentage split increased cocultivos that used higher concentrations of MSC. Highest concentration of nitrite was also found in cocultivos of MSC and macrophages stimulated with LPS. This information generates increments in understanding how MSCs may act in the body dystrophic and how we exploit this source to promote a delay in the inflammatory process and consequently improve the quality of life of patients

O presente estudo visou avaliar os efeitos da administração do resíduo aquoso final (RAF) da Ipomoea carnea e da suainsonina, sobre o sistema imune de ratos jovens em idade pré-pubere (21 dias) e adultos (70 dias). Para isso, o RAF foi administrado nas doses de 1,0; 3,0 e 7,0 g/kg e a suainsonina na dose de 5,0 mg/kg, por gavage, durante 14 dias para avaliação histopatológica de diferentes órgãos, peso relativo de baço e timo, celularidade de medula óssea, fenotipagem de linfócitos T e B presentes no sangue, timo e baço, e atividade proliferativa de linfócitos T de animais tratados apenas com suainsonina. Além disto, foi realizada toxicocinética da suainsonina de animais jovens e adultos. Dentre os resultados obtidos com o tratamento com RAF, foi verificado que todos os animais apresentaram lesões, tais como: congestão hepática e esplênica e vacuolização renal. Em ratos adultos observou-se ainda diminuição do ganho de peso e do consumo de ração, além de involução tímica e diminuição da celularidade da medula óssea. Já nos jovens, as principais alterações observadas foram quanto à alteração fenotípica das populações de linfócitos T CD8+ no timo, sangue e baço e de linfócitos B no sangue e baço. Entretanto, estas alterações não podem ser atribuídas exclusivamente ao RAF de I. carnea, pois os animais do grupo pear-feeding (grupo sob restrição alimentar para mimetizar a diminuição da ingesta de alimentos daqueles ratos tratados com a maior dose do RAF) apresentaram resultados semelhantes àqueles tratados com a planta. Em relação aos resultados obtidos em ratos jovens tratados com suainsonina, verificou-se menor porcentagem de linfócitos B no baço e no sangue e maior expansão clonal de linfócitos T CD4+ de ratos imunizados in vivo e desafiados ex vivo com anatoxina tetânica. Por fim, o estudo toxicocinético revelou que este alcalóide possui biodisponibilidade de apenas 9 horas tanto nos animais jovens quanto nos adultos. Assim, é possível concluir que a suainsonina, principal princípio ativo da I. carnea, tem atividade imunomodulatória, mas esta atividade difere do efeito imunomodulador causado pelo RAF provavelmente devido a presença de outros alcalóides também encontrados na planta / This study aimed to evaluate the effects of administration of the final aqueous residue (RAF) of Ipomoea carnea and swainsonine on the immune system of young (21 days) and adult rats (70 days). For this, the RAF was administered at doses of 1.0, 3.0 and 7.0 g/kg and swainsonine at dose of 5.0 mg/kg by gavage for 14 days for histopathological evaluation of different organs, relative weight of spleen and thymus, bone marrow cellularity, phenotyping of T and B lymphocytes in the blood, thymus and spleen, and proliferative activity of T lymphocytes from animals treated with swainsonine. Moreover, we performed toxicokinetics of swainsonine in young and adult rats. Among the results obtained with treatment with the RAF, it was observed that all animals had lesions such as hepatic and splenic congestion and kidney vacuolization. In adult rats there was also reduction in weight gain and feed intake, thymic involution and decreased bone marrow cellularity. Already in the young rats, the main changes observed were in the populations of T CD8+ lymphocytes in the thymus, spleen and blood and B lymphocytes in the blood and spleen. However, these changes cannot be attributed solely to the RAF of I. carnea, because the animals of the pear-feeding group (group under food restriction to mimic the decrease in food intake of those rats treated with the higher dose of the RAF) had similar results to those treated with the plant. Regarding the results obtained in young rats treated with swainsonine, there was a lower percentage of B lymphocytes in the spleen and blood and increased clonal expansion of T CD4+ lymphocytes from rats immunized in vivo and challenged ex vivo with tetanus toxoid. Finally, the toxicokinetic study has revealed that bioavailability of this alkaloid is only 9 hours in the both animals young and adult. Thus, we conclude that swainsonine, the main active principle of I. carnea, has immunomodulatory activity, but this activity differs from the immunomodulatory effect caused by the RAF probably due to the presence of other alkaloids also found in the plant

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-08-24T16:53:19Z No. of bitstreams: 1 ThiareBraga.pdf: 2583243 bytes, checksum: c6622c8e436020170dbf4d6da63bb75e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-24T16:53:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ThiareBraga.pdf: 2583243 bytes, checksum: c6622c8e436020170dbf4d6da63bb75e (MD5) Previous issue date: 2017-05-08 / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Propolis produced by bees Apis mellifera is a resinous balsamic material used to protect the hive against fungi, bacteria, viruses and insects. Among the antimicrobial activities of propolis already proven, the antifungal action observed in strains of Candida albicans, commensal fungus of the oro-gastrointestinal tract and skin, associated with opportunistic infections, local or systemic, especially in immunosuppressed patients, are highlighted. The objective of this study was to evaluate the effect of treatment with standardized extract of propolis on systemic infection caused by C. albicans in immunosuppressed mice. Initially the C57Bl/ 6 mice were immunosuppressed with dexamethasone (3mg / kg) for one week and, on the eighth day, were infected intraperitoneally with C. albicans blastopores (2x106). After 24 hours of infection, the daily treatment of the animals with propolis at the doses of 10 and 100 mg/kg was initiated for 15 days intraperitoneally. Immunosuppression with dexamethasone was maintained for all the analysis. At the end of the 15 days, all the animals treated with propolis at the dose of 100 mg/kg were kept alive, while all the animals from the other groups had already died. From then on, it was possible to investigate possible immunological mechanisms to explain this effect. For this, the same protocol of immunosuppression and infection described above was repeated, however, the treatment was performed in a single application of propolis at a dose of 100 mg/kg, 24 hours after infection and the tests were performed 24 hours after this treatment. Treatment with propolis reduced the colony forming units in the peritoneum and spleen. In addition, propolis reversed dexamethasone-induced immunosuppression, increasing the number of circulating leukocytes, mainly neutrophils, proliferation of splenocytes, recruitment of leukocytes to the site of infection and increase of CD4+ T lymphocytes. Regarding the inflammatory mediators, it was observed that the treatment with propolis induced the increase of the ex vivo production of nitric oxide by peritoneal cells and the reduction of plasmatic inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α). Finally, in an in vitro experiment, peritoneal macrophages were treated with dexamethasone (4 μg/mL), for 48 hours, and then treated with propolis (100 μg/mL) for 12 hours. Then, cells were incubated with C. albicans for 1 hour. In this assay, it was observed that propolis increased phagocytosis, without, however, altering Dectin-1 and Mannose receptor expression. In conclusion, the standardized extract of propolis increased life expectancy and reduced C. albicans dissemination in immunosuppressed mice. Such effects are probably due to its ability to reverse dexamethasone-induced immunosuppression, recruit and activate effector immune cells to the site of infection, and reduce serum inflammatory cytokines, thereby reducing the progression of the deleterious aspects of systemic candidemia. / A própolis produzida pelas abelhas Apis melífera é um material balsâmico resinoso, utilizado para a proteção da colmeia contra fungos, bactérias, vírus e insetos. Dentre as atividades antimicrobianas da própolis já comprovadas, destaca-se: a ação antifúngica observada em cepas de Candida albicans, fungo comensal do trato oro-gastrointestinal e da pele, associado a infecções oportunistas, locais ou sistêmicas, em especial, em pacientes imunossuprimidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com Extrato Padronizado de Própolis (EPP-AF®) na infecção sistêmica ocasionada por C. albicans em camundongos imunossuprimidos. Inicialmente, os camundongos C57Bl/6 foram imunossuprimidos com dexametasona (3mg/kg) durante uma semana e, no oitavo dia foram infectados, por via intraperitoneal, com blastóporos de C. albicans (2x106). Após 24 horas da infecção, foi iniciado o tratamento diário dos animais com própolis nas doses de 10 e 100mg/Kg, durante 15 dias, por via intraperitoneal. A imunossupressão com dexametasona foi mantida ao longo de toda a análise. Ao final dos 15 dias, observou-se que todos os animais tratados com própolis na dose de 100mg/Kg, mantinham-se vivos, enquanto todos os animais dos demais grupos já haviam morrido. A partir daí, passou-se a investigar possíveis mecanismos imunológicos que explicassem esse efeito. Para isto, foi repetido o mesmo protocolo de imunossupressão e infecção descritos acima, entretanto, o tratamento foi realizado em uma única aplicação de própolis na dose de 100mg/Kg, 24 horas após a infecção e os ensaios foram realizados 24 horas após esse tratamento. O tratamento com própolis reduziu as unidades formadoras de colônia no peritônio e no baço. Além disso, a própolis reverteu a imunossupressão induzida pela dexametasona, aumentando o número de leucócitos circulantes, principalmente, neutrófilos, a proliferação de esplenócitos, o recrutamento de leucócitos ao sítio da infecção e aumento de linfócitos T CD4+. Em relação aos mediadores inflamatórios, foi observado que o tratamento com própolis induziu o aumento da produção ex vivo de óxido nítrico por células peritoneais e a diminuição das citocinas inflamatórias (IL-6 e TNF-α) plasmáticas. Finalmente, em experimento in vitro, macrófagos peritoneais foram tratados com dexametasona (4µg/mL), por 48 horas, e, em seguida, tratados com própolis (100µg/mL), durante 12 horas. Ao final, as células foram incubadas com C. albicans por 1 hora. Neste ensaio, foi observado que a própolis aumentou a fagocitose, sem, no entanto, alterar a expressão proteica de Dectina-1 e Receptor de manose. Em conclusão, o extrato padronizado de própolis aumentou a expectativa de vida e reduziu a disseminação de C. albicans em camundongos imunosuprimidos. Tais efeitos, provavelmente devem-se a sua capacidade de reverter a imunossupressão induzida pela dexametasona, recrutando e ativando células imunes inatas para o sítio da infecção, além de reduzir as citocinas inflamatórias séricas, diminuindo, assim, a progressão dos aspectos deletérios da candidemia sistêmica.

Introdução: Desde a década de 1970, quando se observou que a transfusão pré-transplante renal diminuía a rejeição ao enxerto, o efeito transfusion-related immunomodulation (TRIM) vem sendo estudado, não havendo, ainda, um entendimento completo de seu mecanismo. Recentemente, a descrição das células T reguladoras (TREG) trouxe novas possibilidades de compreensão desse fenômeno, com grande implicação terapêutica. Objetivos: Avaliar a proporção de células TREG antes e após a transfusão de concentrado de hemácias em uma amostra de pacientes clínicos não imunossuprimidos e correlacionar os resultados com o volume transfundido e o tempo de estocagem do sangue. Métodos: Pacientes com diversas patologias clínicas e com indicação de transfusão de concentrado de hemácias foram recrutados consecutivamente. Após assinatura do consentimento informado, o número de células TREG pré e pós-transfusão foi avaliado, bem como sua correlação com o número de unidades transfundidas e o tempo de estocagem. Resultados: Observou-se um aumento estatisticamente significativo na proporção de células TREG (CD4+, CD25+, FOXP3+) 72 horas após a transfusão (p=0,003). Tal aumento mostrou correlação com o número de unidades transfundidas, mas não com o tempo de estocagem (p=0,017 e 0,49, respectivamente). Conclusão: O aumento do numero de células TREG parece estar presente após transfusão de hemácias não leucodepletadas mesmo em uma amostra heterogênea, o que reforça sua importância clínica. A influência do número de unidades mas não do tempo de estocagem corrobora estudos anteriores. O mecanismo molecular do efeito TRIM, bem como seu impacto clínico em um cenário real, ainda precisam ser melhor avaliados. / Background: Transfusion-related immunomodulation (TRIM) has been the subject of research since the 1970s, when transfusion before kidney transplantation was found to decrease the rates of allograft rejection, but the mechanisms underlying this effect have yet to be fully elucidated. The recent description of regulatory T cells (TREG) has paved the way for a new understanding of this phenomenon, with major therapeutic implications. Objectives: To assess the levels of TREG cells before and after transfusion of packed red blood cells in a clinical sample of non-immunosuppressed patients and to correlate findings with the volume of blood transfused and length of storage. Methods: Patients with a variety of clinical conditions and with an indication for transfusion of packed red blood cells were recruited consecutively. After providing informed consent, pre- and post-transfusion TREG levels were measured, and their correlation with number of units transfused and length of storage was assessed. Results: There was a significant increase in the levels of TREG cells (CD4+/CD25+/FOXP3+) within 72 hours of transfusion (p=0.003). This increase correlated with the number of units transfused, but not with length of storage (p=0.017 and 0.49, respectively). Conclusion: An increase in TREG cell levels appears to follow transfusion of non-leukoreduced packed red blood cells even in a heterogeneous sample, which highlights the clinical relevance of this phenomenon. The influence of number of transfused units, but not of length of storage, on the results corroborates the findings of previous non-clinical studies. Further research is warranted to better investigate the molecular mechanism of the TRIM effect, as well as its clinical impact in real-world settings.

A esclerose múltipla é uma doença inflamatória crônica desencadeada por células T autorreativas contra antígenos proteicos da mielina. A encefalomielite experimental autoimune é o modelo murino mais utilizado para o estudo da EM. As tubas uterinas e o útero de camundongos fêmeas são órgãos ricos em células mesenquimais que são pouco utilizadas em estudos. Dessa forma, no presente projeto, caracterizamos a obtenção dessa população e avaliamos sua capacidade imunossupressora utilizando o modelo de EAE. Observamos que o tratamento é capaz de modular o perfil de linfócitos T CD4+ durante sua ativação nos linfonodos, induzindo o direcionamento para a subpopulação Tr1 e atenuando as Th1 e Th17. Assim, houve uma diminuição do número de células infiltrantes no SNC associado a uma menor ativação de células da microglia. Em conjunto, demostraramos que as meMSC utilizadas como tratamento são capazes de atrasar o desenvolvimento da EAE e, portanto, evidenciando o caráter imunomodulador das MSCs derivadas do endométrio, chamando a atenção para seu potencial terapêutico. / Multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease triggered by autoreactive T cells against myelin protein. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis is the most commonly used murine model for the study of MS. The uterine tubes and uterus of female mice are organs rich in mesenchymal cells which are rarely used. Thus, in the present work, we characterized the extraction of this population and evaluated its immunosuppressive capacity using the EAE model. We observed that the meMSC treatment is capable of modulating the CD4 T lymphocyte profile during its activation in the lymph nodes, inducing the expansion of the Tr1 subpopulation and attenuating Th1 and Th17. Consequently, there was a decrease in the number of infiltrating cells in the CNS associated with a reduction of microglial activation. Taken together, our results demonstrated that the meMSCs used as treatment are capable of delaying the development of EAE, therefore, evidencing its immunomodulatory features drawing attention to its therapeutic potential.

O presente estudo visou avaliar os efeitos da administração do resíduo aquoso final (RAF) da Ipomoea carnea e da suainsonina, sobre o sistema imune de ratos jovens em idade pré-pubere (21 dias) e adultos (70 dias). Para isso, o RAF foi administrado nas doses de 1,0; 3,0 e 7,0 g/kg e a suainsonina na dose de 5,0 mg/kg, por gavage, durante 14 dias para avaliação histopatológica de diferentes órgãos, peso relativo de baço e timo, celularidade de medula óssea, fenotipagem de linfócitos T e B presentes no sangue, timo e baço, e atividade proliferativa de linfócitos T de animais tratados apenas com suainsonina. Além disto, foi realizada toxicocinética da suainsonina de animais jovens e adultos. Dentre os resultados obtidos com o tratamento com RAF, foi verificado que todos os animais apresentaram lesões, tais como: congestão hepática e esplênica e vacuolização renal. Em ratos adultos observou-se ainda diminuição do ganho de peso e do consumo de ração, além de involução tímica e diminuição da celularidade da medula óssea. Já nos jovens, as principais alterações observadas foram quanto à alteração fenotípica das populações de linfócitos T CD8+ no timo, sangue e baço e de linfócitos B no sangue e baço. Entretanto, estas alterações não podem ser atribuídas exclusivamente ao RAF de I. carnea, pois os animais do grupo pear-feeding (grupo sob restrição alimentar para mimetizar a diminuição da ingesta de alimentos daqueles ratos tratados com a maior dose do RAF) apresentaram resultados semelhantes àqueles tratados com a planta. Em relação aos resultados obtidos em ratos jovens tratados com suainsonina, verificou-se menor porcentagem de linfócitos B no baço e no sangue e maior expansão clonal de linfócitos T CD4+ de ratos imunizados in vivo e desafiados ex vivo com anatoxina tetânica. Por fim, o estudo toxicocinético revelou que este alcalóide possui biodisponibilidade de apenas 9 horas tanto nos animais jovens quanto nos adultos. Assim, é possível concluir que a suainsonina, principal princípio ativo da I. carnea, tem atividade imunomodulatória, mas esta atividade difere do efeito imunomodulador causado pelo RAF provavelmente devido a presença de outros alcalóides também encontrados na planta / This study aimed to evaluate the effects of administration of the final aqueous residue (RAF) of Ipomoea carnea and swainsonine on the immune system of young (21 days) and adult rats (70 days). For this, the RAF was administered at doses of 1.0, 3.0 and 7.0 g/kg and swainsonine at dose of 5.0 mg/kg by gavage for 14 days for histopathological evaluation of different organs, relative weight of spleen and thymus, bone marrow cellularity, phenotyping of T and B lymphocytes in the blood, thymus and spleen, and proliferative activity of T lymphocytes from animals treated with swainsonine. Moreover, we performed toxicokinetics of swainsonine in young and adult rats. Among the results obtained with treatment with the RAF, it was observed that all animals had lesions such as hepatic and splenic congestion and kidney vacuolization. In adult rats there was also reduction in weight gain and feed intake, thymic involution and decreased bone marrow cellularity. Already in the young rats, the main changes observed were in the populations of T CD8+ lymphocytes in the thymus, spleen and blood and B lymphocytes in the blood and spleen. However, these changes cannot be attributed solely to the RAF of I. carnea, because the animals of the pear-feeding group (group under food restriction to mimic the decrease in food intake of those rats treated with the higher dose of the RAF) had similar results to those treated with the plant. Regarding the results obtained in young rats treated with swainsonine, there was a lower percentage of B lymphocytes in the spleen and blood and increased clonal expansion of T CD4+ lymphocytes from rats immunized in vivo and challenged ex vivo with tetanus toxoid. Finally, the toxicokinetic study has revealed that bioavailability of this alkaloid is only 9 hours in the both animals young and adult. Thus, we conclude that swainsonine, the main active principle of I. carnea, has immunomodulatory activity, but this activity differs from the immunomodulatory effect caused by the RAF probably due to the presence of other alkaloids also found in the plant

As Doenças inflamatórias intestinais (DII) são multifatoriais e sua etiologia envolve susceptibilidade genética, fatores ambientais, disbiose e ativação exacerbada do sistema imunológico no intestino. Essas doenças também tem sido relacionadas a baixos níveis de dehidroepiandrosterona (DHEA), um hormônio precursor de diversos esteroides e relacionado à modulação das respostas imunes. Porém, os mecanismos precisos que relacionam as ações deste hormônio com a proteção ou susceptibilidade à doença de Crohn ou colite ulcerativa ainda não são totalmente conhecidos. Sendo assim, este projeto buscou entender o papel imunomodulador do DHEA exógeno in vitro e in vivo durante a inflamação intestinal experimental induzida por dextran sulfato de sódio (DSS) em camundongos C57BL/6. Inicialmente, in vitro, DHEA inibiu a proliferação de células do baço de forma dose dependente nas concentrações de 5?M, 50?M ou 100?M, com diminuição da produção de IFN-?. Este hormônio não foi tóxico para células de linhagem mieloide, embora tenha causado necrose em leucócitos nas doses mais elevada (50 ?M e 100?M), o que pode ter influenciado a diminuição das citocinas in vitro. Nos ensaios in vivo, os camundongos tratados com DHEA (40 mg/Kg) foram avaliados na fase de indução da doença (dia 6) e durante o reparo tecidual, quando os animais expostos ao DSS e ao DHEA por 9 dias foram mantidos na ausência destas drogas até o dia 15. Houve diminuição do escore pós-morte, melhora no peso e nos sinais clínicos da inflamação intestinal, com redução de monócitos no sangue periférico com 6 dias e aumento de neutrófilos circulantes na fase de reparo tecidual (15 dias). Ainda, a suplementação com DHEA levou à redução da celularidade da lâmina própria (LP) e ao restabelecimento do comprimento normal do intestino. O uso deste hormônio também diminuiu a expressão do RNAm de IL-6 e TGF-?, enquanto aumentou a expressão de IL-13 no colón dos animais durante a fase de indução da doença, o que provavelmente ajudou na atenuação da inflamação intestinal. Além disso, houve acúmulo de linfócitos CD4+ e CD8+ no baço e diminuição apenas de linfócitos CD4+ nos linfonodos mesentéricos (LNM), indicando retenção das células CD4+ no baço após uso do DHEA. O tratamento foi também capaz de aumentar a frequência de células CD4 produtoras de IL-4 e diminuir CD4+IFN-?+ no baço, além de reduzir a frequência de CD4+IL-17+ nos LNM, sugerindo efeito do DHEA no balanço das respostas Th1/Th2/Th17 relacionadas à colite. Em adição, as células de baço dos animais tratados com DHEA e expostos ao DSS se tornaram hiporresponsivas, como visto pela diminuição da proliferação após re-estímulos in vitro. Finalmente, DHEA foi capaz de atuar no metabolismo dos camundongos tratados, levando à diminuição de colesterol total e da fração LDL no soro durante a fase de indução da doença, sem gerar quaisquer disfunções hepáticas. Com isso, podemos concluir que o DHEA atua por meio do balanço das respostas imunes exacerbadas, minimizando os danos locais e sistêmicos causados pela inflamação intestinal induzida por DSS. / Inflammatory bowel diseases (IBD) are multifactorial diseases whose etiology involves genetic susceptibility, environmental factors, dysbiosis and exacerbated activation of the immune system in the gut. These diseases have also been associated to lower levels of dehydroepiandrosterone (DHEA), a precursor of various steroid hormones, related to modulation of immune responses. However, the precise mechanisms that link the actions of this hormone with protection or susceptibility to Crohn\'s disease or ulcerative colitis are still not fully understood. Thus, this project aimed to understand the immunomodulatory role of exogenous DHEA in vitro and in vivo in experimental intestinal inflammation induced by dextran sodium sulfate (DSS) in C57BL/6 mice. Initially, in vitro, DHEA inhibited the proliferation of spleen cells in a dose dependent way on the concentrations of 5?M, 50?M and 100?M, with decreased production of IFN-?. This hormone was not toxic to myeloid lineage cells, although it caused necrosis of leukocytes at the highest doses (50?M and 100?M), which may have influenced the decrease of the cytokines in vitro. Mice treated with DHEA (40 mg / kg) were evaluated at the induction phase of the disease (day 6) and during tissue repair, when animals exposed to DSS and DHEA for 9 days were maintained in the absence these drugs until the day 15. There was decrease of postmortem score, improved weight and clinical signs of intestinal inflammation, besides reduced peripheral blood monocytes on day 6, together with an increase in circulating neutrophils in tissue repair phase (15 days). Supplementation with DHEA also led to a reduction in cellularity of the lamina propria (LP) and to the restoration of normal length of the gut. The use of this hormone also decreased the expression of of IL-6 and TGF-? mRNA, while IL-13 was augmented in the colon of mice during the induction phase of the disease, a fact probably related to attenuation of intestinal inflammation. Furthermore, there was accumulation of CD4+ and CD8+ cells in the spleen along with decreased CD4+ leukocytes in mesenteric lymph nodes (MLN), indicating retention of CD4+ cells in the spleen after use of DHEA. The treatment was also able to increase the frequency of CD4+ cells producing IL-4 and decrease CD4+IFN-?+ in spleen, with reduced frequency of CD4+IL-17+ in the MLN, suggesting a role for DHEA on the balance of Th1/Th2/Th17 responses related colitis. In addition, splenocytes of mice treated with DHEA and exposed to DSS became hiporresponsives as seen by decreased proliferation after re-stimulation in vitro. Finally, DHEA was able to act on the metabolism of treated mice, leading to decreased total cholesterol and LDL cholesterol in serum during the induction phase of the disease, without generating any liver dysfunction. Thus, we concluded that DHEA acts by balancing the exacerbated immune responses, minimizing local and systemic damages caused by intestinal inflammation induced by DSS.

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are being explored for treatment of inflammatory, ischemic, autoimmune, and degenerative diseases. More and more of these diseases require MSCs to be delivered locally to the diseased site rather than systemically injected into patients. However, little is understood about whether cell cryopreservation or prelicensing will affect the efficacy of the locally injected product or how the local injection environment affects MSC expression of trophic factors and interactions with patient immune cells. Several groups have disagreed on whether cryopreservation hinders MSC potency and therefore it is important to understand the effects of cryopreservation on MSC function and in what contexts cryopreservation can be used. Therefore, a better understanding of MSC phenotype after local injection is needed so that cryopreservation and prelicensing can be optimized to modulate cell potency for more efficacious MSC products. Currently, it has been shown that in vivo there are rapid drastic shifts in gene expression by MSCs which have been locally injected. One of the most prominent gene changes is in the enzyme COX-2 which leads to the production of bioactive lipids called prostaglandins, namely PGE2. PGE2 has several functions depending on the context in which other cells encounter it. In order to model the gene changes that occur in vivo, in vitro cell aggregates termed spheroids have been utilized to study the effects of local injection of MSCs. MSC spheroids have shown more potency than their 2D counterparts in shifting macrophage polarization and rescue of cells from ischemic damage. This thesis examines how process variables like cryopreservation and prelicensing affect the efficacy of the MSC product in the context of local injection. Additionally, it shows how spheroid formation alters therapeutic factor expression and activity and how drug treatment and biomaterials can be utilized to modify potency of these cells. In Chapter 2, we demonstrate that cryopreservation in the context of an ischemia/reperfusion injury in the eye does not significantly decrease MSCs effectiveness in salvaging neuronal cells. However, IFN-γ, a commonly used prelicensing cytokine to increase MSC potency, led to a decrease in the effectiveness of MSCs in this model. Chapters 3 and 4 define the changes that occur to several of MSCs’ trophic factors including immunomodulatory and growth factors and how these alterations affect MSC interactions with macrophages and T cells. Because validation and tracking of locally injected products can be cost-prohibitive for many research groups, Chapter 5 lays out a low-cost method to track fluorescently labeled cells in local injections to skin to aid in minimization of variability in results obtained from animal wound healing models. These findings demonstrate that initial preparation of MSC therapeutics is critical to their efficacy in local injection. Therefore, careful testing of potency for large-scale MSC production pipelines should be evaluated to ensure the efficacy of the resulting product. Additionally, spheroids exhibit differences in the mechanisms of action due to alterations in their secretome which can be partly overcome with co-administration of steroids such as budesonide. Therefore, steroid co-administration with MSCs being considered for local application should be further explored for use in local delivery of MSCs for the treatment of inflammatory conditions. Finally, this research demonstrates the need to further understand the mechanisms by which spheroids alter their gene and trophic factor production to better tailor MSC therapies for disease specific localized injection.

We report herein that IL-10-treated dendritic cells (DC) can be used effectively to reverse established severe asthma-like disease in a mouse model. Our lab had shown previously that allergen-presenting splenic CD8¦Á+ DCs could ¡Ö50% reduce airway hyper responsiveness (AHR), eosinophilia, and Th2 responses in asthma-phenotype mice, but only marginally reduce IgE/IgG1 levels. We now show that bone marrow-derived DCs that have been differentiated in the presence of IL-10 (DCIL-10) are effective in reversing the asthma phenotype. Co-culture of DCIL-10 with T memory (TM) cells from asthma-phenotype mice was associated with lack of Th2 responses, and this was partially reversed by IL-2. Immunostimulatory DC activated these Th2 cells. <i>In vivo</i>, delivery of allergen-pulsed DCIL-10, either into the airway or intraperitoneally abrogated AHR from weeks 3-10 post-treatment, and ameliorated lung eosinophilia and Th2 (IL-4, -5, -9, & -13, IgE) responses, as well as circulating allergen-specific IgE responses for at least 32 weeks following treatment. Repeated OVADCIL-10 treatments kept AHR normalized for 8 weeks as well as Th2 responses significantly low. In vivo, delivery of anti-IL-10R, but not anti-TGF-¦Â from day 12-21 after treatment had moderate effects on DCIL-10-driven tolerance, but 1-methyl tryptophan (inhibitor of indoleamine-2,3-dioxygenase) treatment had significant effects on Th2 responses. The mechanisms mediating tolerance in vivo are likely complex, but we speculate that infectious tolerance sustains this regulatory activity during the 32-week period in which we have observed tolerance to be in place.