Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The nematode Strongyloides stercoralis responsible for strongyloidiasis diagnosed by detection of larvae in feces. However, the elimination of low larvae hampers the detection of disease particularly in cases of immunosuppression. Immunodiagnostic tests have been developed, but the difficulty of obtaining larvae of S. stercoralis for the production of homologous antigenic extract, thereby Strongyloides venezuelensis and their different evolutionary forms for the production of antigen extracts. The aim of this study was to evaluate the detection of antibodies anti S. venezuelensis against alkaline extracts of L3 larvae, parthenogenetic females or eggs in experimental strongyloidiasis associated with immunosuppression. Male rats were divided into two groups: non-immunosuppressed and immunosuppressed experimentally infected and serum from all animals were obtained at 0, 5th, 8th, 13th and 21th days post infection (d.p.i.). The test enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to compare the reactive potential of alkaline extracts of L3 larvae, parthenogenetic females and eggs of S. venezuelensis in rats non-immunosuppressed and immunosuppressed. Immunoblotting was also evaluated for detection of IgG anti S. venezuelensis in both groups front to alkaline of the three developmental forms of the parasite extracts. In all comparative ELISA extracts were skilled in detecting IgG S. venezuelensis. The extract of larvae showed reactivity from the 5th dpi ceasing at 21th d.p.i in the non-immunosuppressed group while the group immunosuppressed this reactivity remained at 21th d.p.i. immunoblotting showed the reactivity profile with immunoreactive fractions in immunosuppressed group from the 5th d.p.i. while the non-immunosuppressed group reactivity from 8th d.p.i. The alkali extracts of parthenogenetic females and eggs showed a similar profile of reactivity in both ELISA and immunoblotting. Immunoreactive protein fractions of 26 and 17 kDa present in the alkaline extract of larvae presented as important markers of infection in immunosuppressed animals. It is concluded that all alkali extracts have diagnostic potential in experimental strongyloidiasis especially the larval extract in cases of immunosuppression, and immunoblotting an important complementary diagnostic tool. / O nematódeo Strongyloides stercoralis é responsável pela estrongiloidíase cujo diagnóstico é realizado pela detecção de larvas nas fezes. Porém a baixa eliminação de larvas dificulta a detecção da doença em especial em casos de imunossupressão. Testes imunodiagnósticos têm sido desenvolvidos, porém há dificuldade de se obter larvas de S. stercoralis para a produção de extrato antigênico homólogo assim o parasito Strongyloides venezuelensis e suas diferentes formas evolutivas são utilizados para produção de extratos antigênicos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a detecção de anticorpos anti S. venezuelensis a partir de extratos alcalinos de larvas L3, fêmeas partenogenéticas ou ovos na estrongiloidíase experimental associada à imunossupressão. Ratos machos foram divididos em dois grupos: não-imunossuprimidos e imunossuprimidos experimentalmente infectados e o soro de todos os animais foram obtidos no 0, 5º, 8º, 13º e 21º dias pós-infecção (d.p.i.). O teste enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) foi realizado para comparar o potencial reativo dos extratos alcalinos de larva L3, fêmeas partenogenéticas e ovos de S. venezuelensis em ratos não-imunossuprimidos e imunossuprimido. Immunoblotting foi avaliado quanto sua detecção de IgG anti S. venezuelensis em ambos os grupos frente aos extratos alcalinos das três formas evolutivas do parasito. No ELISA comparativo todos extratos foram efetivos na detecção de anti-IgG de S. venezuelensis. O extrato de larvas apresentou reatividade a partir do 5º d.p.i cessando no 21º d.p.i. no grupo não-imunossuprimido enquanto o grupo imunossuprimido essa reatividade permaneceu no 21º d.p.i.. O immunoblotting apresentou perfil de reatividade com frações imunorreativas no grupo imunossuprimido a partir do 5º d.p.i. enquanto o grupo não-imunossuprimido a reatividade a partir do 8º d.p.i. Os extratos alcalinos de fêmeas partenogenéticas e de ovos apresentaram similar perfil de reatividade tanto no ELISA comparativo quanto no immunoblotting. Frações proteicas imunorreativas de 26 e 17 kDa presentes no extrato alcalino de larvas apresentaram como importantes marcadores de infecção em animais imunossuprimidos. Conclui-se que todos os extratos alcalinos possuem potencial diagnóstico na estrongiloidíase experimental com destaque para o extrato de larvas em casos de imunossupressão, sendo o immunoblotting uma importante ferramenta diagnóstica complementar. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-06-14T13:30:19Z No. of bitstreams: 1 Marcela de Lima Moreira-Duração da imunidade vacinal na Leishmaniose visceral canina- perfil fenotípico e funcional da atividade fagocítica anti Leishmania chagasi- 2013.pdf: 1972625 bytes, checksum: 20bef25e1a3fb4e90b4e04090bdb1adf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-14T13:30:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcela de Lima Moreira-Duração da imunidade vacinal na Leishmaniose visceral canina- perfil fenotípico e funcional da atividade fagocítica anti Leishmania chagasi- 2013.pdf: 1972625 bytes, checksum: 20bef25e1a3fb4e90b4e04090bdb1adf (MD5) Previous issue date: 2013 / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença que nas Américas, possui a Leishmania chagasi como agente etiológico, sendo transmitida através da picada de flebotomíneos e tem como principais hospedeiros membros da família Canidae. Por esta razão a eutanásia de cães soropositivos é recomendada no Brasil como estratégia de controle da doença, sendo a eficácia desta medida muitas vezes contestada. Desta forma, o uso de uma vacina efetiva na proteção contra leishmaniose visceral canina (LVC) poderá ser a melhor ferramenta de controle, capaz de reduzir o número de animais infectados e consequentemente a oferta de parasitos aos vetores, reduzindo assim o número de casos de LV. A primeira vacina contra a LVC licenciada e disponível comercialmente no Brasil é a Leishmune ®, uma vacina de segunda geração constituída da fração fucose manose ligante (FML) de Leishmania donovani, acrescida de saponina como adjuvante. Sua formulação demonstrou segurança e alta imunogenicidade para cães, mas poucos estudos a respeito da duração da imunidade foram realizados até o momento.Neste contexto, o principal objetivo deste trabalho foi investigar, nos intervalos de um, seis e doze meses após a intervenção vacinal com a Leishmune®, alterações de alguns eventos imunológicos relacionados a imunoproteção como: atividade fagocítica, produção de óxido nítrico e os aspectos fenotípicos e funcionais em células do sangue periférico dos animais. Nossos dados demonstraram que Leishmune® foi capaz de induzir aumento da atividade fagocítica em monócitos, e que este aumento apresentou correlação com a produção de óxido nítrico, atingindo pico de atividade funcional seis meses após a vacinação. Em neutrófilos, foi observado também aumento da capacidade fagocítica. A busca de fatores que possivelmente poderiam estar auxiliando o aumento da atividade fagocítica induzido pela vacinação, mostrou que os animais vacinados apresentavam aumento dos níveis de IgG anti-promastigotas de Leishmania chagasium e seis meses após a vacinação, acompanhado do aumento de expressão de receptor de FC(CD32) por monócitos. Além disso, aumentos na expressão de TLR2 e TLR4 foram correlacionados positivamente com atividade fagocítica e TLR5 e TLR9 estiveram correlacionados ao aumento de produção de óxido nítrico em monócitos. Aumento de expressão de moléculas ativadora (MHC II) e coativadora (CD80) também foram observados em monócitos um mês após a vacinação. A vacinação induziu,ainda, inibição da produção de IL-4 um e seis meses após a vacinação e aumento duradouro da produção de IL-8 por monócitos, acompanhados do aumento da produção de IFN-um e seis meses após a vacinação e da produção de IL-17a um mês após a vacinação por linfócitos T totais. Os resultados observados, leva-nos a acreditar que a vacinação com Leishmune® é capaz de induzir alterações na resposta imune mediada pela interação de imunidades inata e adaptativa, com impacto em propriedades funcionais de monócitos, consistentes com mecanismos potencialmente leishmanicidas que podem participar na imunidade protetora contra LVC. Além disso, os resultados indicam a necessidade de revacinação dos animais antes de doze meses após a primeira dose da vacina, conforme recomendado pelo fabricante. / Viceral Leishmaniasis (LV), a severe disease caused by Leishmania chagasi, is transmitted by the bite of phlebotimine sandflies and it hasthe main reservoir hosts wild canine and domestic dogs. For this reason, the elimination of seropositive dogs is recommended in Brazil as the current strategy for managing the disease control. Although the dog culling had a positive impact in maintenance of a low ratio of increase of LV, the canine incidence and seroprevalence do not negativate, maintaining a residual reservoir of parasites in the field. Comparatively, the use of a canine protective vaccine would represent the better control tool, reducing the parasites offer to sand fly vectors and consequently the LV cases number. The Leishmune®, a second-generation vaccine, have been recently licensed in Brazil and become commercially available. Its formulation proved to be safe protective and highly immunogenic for dogs, butthere are a few studies aboutduration of protective immunity responses. Accordingly, the main goal of the current work was to investigate if the time-frameof one year, proposed for protective immunity following vaccination with Leishmune®, is accompainied by supportive imunological events,such as cytokine profile change, nitric oxide syntesis, and phagocytosis in peripheral blood immunity cell. Our data identified that Leishmune® was able to induce an incremented phagocytic capacity in monocytes closely associated with the NO production by these phagocytes, reaching a peak of functionalactivity at six months after vaccination. In neutrophils, the higher long lasting phagocytic capacity triggered was not accompanied by enhanced NOproduction by them. Among the immunological events correlated with phagocytic capacity increase, high levels of anti-Leishmania chagasi promastigotes IgG were detected by flow cytometry (PPFP), one and six months following vaccination, besides increase of Fcreceptor (CD32) expression by monocytes. Moreover, increase expression of TLR2 and TLR4 were positively correlated with phagocytic capacity and TLR5 and TLR9 were positively correlated with NO production in monocytes. In addition, we observed increase expression of activation (MHC) and costimulatory (CD80) molecules by monocytes one month following vaccination.The vaccination induced too a long lasting blockage to IL-4 and an increase in the IL-8 production by monocytes along with higher IFN- production by T-cells upon L. chagasi challenge in vitro. The evidences presented suggested that Leishmune® is able to induce a long lasting change in the immune response mediated by the interface of adaptive/innate immunity with impact on the monocyte functional properties, consistent with supportive immunological events with potential anti-Leishmaniaeffector mechanisms that could participate in protective immunity against CVL.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-22T12:52:26Z No. of bitstreams: 1 TESE COMPLETA Guilherme P P Zolini.pdf: 5332439 bytes, checksum: 59494ecd480af09a4c7fc97891dfd358 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-22T12:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE COMPLETA Guilherme P P Zolini.pdf: 5332439 bytes, checksum: 59494ecd480af09a4c7fc97891dfd358 (MD5) / FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz (PAPES IV / PAPES V) CPqRR – Centro de Pesquisa René Rachou CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais INCTV – Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas / Este trabalho foi realizado no laboratório de Imunopatologia do Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) e no Laboratório de Vírus (Labvirus) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os herpesvirus possuem genoma DNA e são envelopados. Aproximadamente 70% dos adultos já tiveram contato com Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1). O HSV-1 causa úlceras ou até mesmo lesões mais graves como encefalite, e após a infecção, o vírus comumente fica latente e pode ser ou não reativado. Células do sistema immune inato, através dos “Receptores do Tipo Toll” (TLRs), reconhecem “padrões moleculares associados a patógenos” (PAMPs) orquestrando a resposta imune contra o vírus. Quando ativados, TLRs iniciam uma cascata de sinalização que culmina na ativação de genes relacionados à defesa imune inata (óxido nítrico-NO, citocinas e quimiocinas). Outros estudos do grupo mostraram que animais nocautes (KO) para TLR9 ou TLR2/9 apresentam alta mortalidade na infecção por HSV-1, ao contrário dos C57BL/6 selvagens (WT) e TLR2KO, que são capazes de controlar o vírus. Objetivamos pesquisar a interrelação na expressão dos TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 em animais TLR2 KO, TLR9 KO e TLR2/9 KO infectados por HSV-1 e principais citocinas, células e mecanismos imune celulares contra infecção por HSV-1. No presente trabalho camundongos WT, TLR2KO, TLR9KO e TLR2/9KO foram infectados via intranasal com 106 u.f.p. de HSV-1, e seus controles receberam PBS. A eutanásia dos animais foi realizada no 5º dia após infecção (dpi), que previamente já foi demonstrado ser o pico da infecção neste modelo, e então gânglios trigêmeos (TG) e cérebros foram coletados. A expressão de TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 foi avaliada por PCR em Tempo Real. Camundongos WT infectados apresentaram diferença significativa na expressão destes TLRs comparados com seus respectivos controles no TG, mas não no cérebro. Nos KOs, houve aumento da expressão dos TLRs tanto nos TGs (mas com níveis mais moderados comparado aos WT) quanto nos cérebros. Também foi avaliada a expressão de gp91phox, p22phox e iNOS. A expressão de iNOS em C57BL/6 WT infectados foi maior que nos outros grupos, mas o mesmo não ocorreu para gp91phox, p22phox. Adicionalmente, foi mensurada a produção de NO por macrófagos intraperitoneais, através da reação de Griess, que demonstrou maior produção por macrófagos WT, comparados aos grupos TLR KOs. Ensaios de histopatologia e imunofluorescência demonstraram maior celularidade nos TGs infectados, além de confirmar a presença de CD8, macrófagos, e aumento da produção de iNOS nos C57BL/6 WT infectados, o que não ocorreu com os camundongos TLRs KO. Em ensaio de sobrevivência com C57BL/6 WT, CCL3 KO, CD8 KO, RAG KO e iNOS KO a importância das células T e do iNOS foi confirmada, uma vez que CD8 KO, RAG KO e iNOS KO tiveram 0% de sobrevida. Camundongos C57BL/6 WT, RAG KO, CCL3 KO e iNOS KO tiveram seus TGs analisados por PCR em tempo real para verificar a expressão do gene viral VP-16 e MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes e TNF-_ no 5º dpi. Estes dados indicaram a relevância de iNOS e das célúlas T na resposta inata contra o HSV-1, uma vez que os RAG KO foram irresponsivos à expressão das citocinas, enquanto os iNOS KO apresentaram uma resposta exacerbada das mesmas. Ensaio de citometria indicou que IFN_ produzido pelas células T CD8, nos TGs, e produzido pelas células T CD4 e Natural Killer (NK), nos linfonodos regionais, são um possível mecanismo de controle contra a infecção de HSV-1 dos animais WT infectados. Hipotetizamos que a expressão coordenada de TLRs reflete na orquestração eficiente do sistema imune inato, através da produção equilibrada de quimiocinas e citocinas e da atividade imune celular adequada, com produção de NO por macrófagos e ação de células T CD8, T CD4 e NK controlando a infecção por HSV-1. / This work was carried out in the Immunopathology laboratory of the Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) and Virus laboratory (Labvirus) of the Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Herpes viruses have DNA genome and are enveloped. Approximately 70% of adult people have had contact with the Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1). After infection, HSV-1 cause cold sores, or more serious injuries such as encephalitis, and after infection, the virus usually become latent and may be reactivated or not. Cells of innate immune system recognize the “pathogen associated molecular patterns” (PAMPs) through “Toll Like Receptors” (TLRs), orchestrating the immune response against the virus. When activated, TLRs start a signalization cascade that culminates in the activation of genes related to the innate immune defense (NO, cytokines and chemokines). Previous research from our group demonstrated that knockout (KO) mice to TLR9 and TLR2/9 showed high mortality after HSV-1 infection, unlike C57BL/6 wild type (WT) and TLR2KO, which were able to control the virus. Research aimed in interrelation of the expression of TLRs 1, 2, 3, 6, 7 and 9 in TLR2 KO, TLR9 KO and TLR2 / 9 KO mice infected with HSV-1 and the main cytokines, cells and cellular immune mechanisms against infection by HSV-1. In this work, TLR2KO, TLR9KO, TLR2/9KO and C57BL/6 WT mice were intranasally infected with 106 p.f.u. of HSV-1, and their respective controls received PBS. Mice euthanasia was at the 5th day post infection (dpi), previously showed to be the viral multiplication peak in our model, and then trigeminal ganglia (TG) and brain were collected. The expression of TLRs 1, 2, 3, 6, 7 and 9 were measured by Real Time PCR. Infected WT mice showed significant increase in the expression of these TLRs compared to respective controls in TG, but not in brain.KOs mice had increased expression of TLRs in TG (but in more moderated levels compared to WT) and in the brains. The expression of gp91phox, p22phox and iNOS were also measured. iNOS expression in infected C57BL/6 WT was higher than in other groups, that not occurs to gp91phox, p22phox. In addition, NO production by intraperitoneal macrophages was measured through Griess reaction, that demonstrated a more pronounced production by WT macrophages, compared to TLR KOs groups. Histopathology and immunofluorescence assays demonstrated higher cellularity in infected TG, and besides confirmed the CD8 and macrophages presence and increase of iNOS production in infected C57BL/6 WT, what did not occurred with TLR KO mice. In survival assay with C57BL/6 WT, CCL3 KO, CD8 KO, RAG KO and iNOS KO, we showed the importance of the T cells and iNOS, because CD8 KO, RAG KO and iNOS KO had 0% of survival. C57BL/6 WT, RAG KO, CCL3 KO and iNOS KO mice had their TG analyzed by Real Time PCR, to verify the expression of viral gene VP-16 and MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes and TNF-_ in 5th dpi. These data show us that iNOS and T cells are important in innate responses against HSV-1, once RAG KO were irresponsive to cytokines expression, while iNOS KO showed an excessive response to cytokines expression. The cytometry assay indicated that IFN_ produced by T CD8 cells, in the TG, and by T CD4 and Natural Killer cells (NK), in region lymph nodes, are a possible mechanism to control HSV-1 infection of WT infected mice. We hypothesize that coordinated expression of TLRs leads to an efficient orchestration of the innate immunity system, through cytokines and chemokines stable production and proper cellular immune activity, with NO production by macrophages and T CD8, T CD4 e NK cells action controlling HSV-1 infection.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:19:49Z No. of bitstreams: 1 Tese_FláviaAlessandradeSouzaQuadros.pdf: 5626326 bytes, checksum: 3a2001d8c2c44f5356efeaf135dc284a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:19:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_FláviaAlessandradeSouzaQuadros.pdf: 5626326 bytes, checksum: 3a2001d8c2c44f5356efeaf135dc284a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:20:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_FláviaAlessandradeSouzaQuadros.pdf: 5626326 bytes, checksum: 3a2001d8c2c44f5356efeaf135dc284a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:20:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_FláviaAlessandradeSouzaQuadros.pdf: 5626326 bytes, checksum: 3a2001d8c2c44f5356efeaf135dc284a (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A Duffy binding protein do Plasmodium vivax (PvDBP) é uma proteína essencial para o processo de invasão do Plasmodium vivax em eritrócitos humanos Duffy/DARC positivos, sendo consequentemente uma forte candidata à vacina antimalárica. Apesar disso, estudos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa mostraram que a maioria dos indivíduos expostos à malária na Amazônia brasileira não desenvolvem anticorpos anti-PvDBP. Isto pode estar relacionado tanto a características do parasito quanto do hospedeiro vertebrado. Entre as características do parasito estão a baixa imunogenicidade da PvDBP ao sistema imune e o alto polimorfismo na região do ligante (região II). Entretanto, estas características do parasito não explicam o fato de que a maioria dos indivíduos expostos a diferentes variantes do parasito, por um longo período de tempo, não desenvolvem anticorpos bloqueadores da interação ligante-receptor. Diante disso, faz-se necessário avaliar características do hospedeiro vertebrado que poderiam influenciar nessa baixa resposta de anticorpos. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência de polimorfismos do receptor DARC e do HLA classe II (antígeno leucocitário humano) na resposta imune anti-PvDBP. O estudo foi do tipo coorte aberta de base populacional realizado em área de assentamento agrícola da Amazônia brasileira onde os indivíduos foram acompanhados por cerca de 12 meses. A abordagem metodológica envolveu: (i) genotipar o receptor Duffy/DARC (Real time PCR) e o HLA de classe II (locis HLA-DRB1, HLA-DQB1 e HLA-DQA1, por PCR-SSO) na população estudada (n=620); (ii) realizar ensaios sorológicos, convencionais (ELISA) e funcionais (bloqueio da interação DBPII-DARC) no plasma dos indivíduos estudados. Os resultados mostram que, na área estudada, o genótipo de DARC mais frequente foi FY*A/FY*B, o que foi consistente com o que tem sido descrito para as populações residentes na Amazônia brasileira. Em relação à resposta de anticorpos, nenhuma associação significativa foi encontrada entre os genótipos de DARC e as respostas de anticorpos IgG no ELISA (região II ou regiões II-IV da PVDBP). Contudo, a resposta de anticorpos que inibem a interação ligante (DBPII) - receptor (DARC) foi significativamente mais frequente em indivíduos heterozigotos carreadores de um alelo DARC positivo (genótipos FY*A/FY*BES e FY*B/FY*BES). Em geral, a distribuição de frequência dos alelos de HLA classe II na população estudada corrobora com as frequências já descritas em estudos anteriores realizados no Brasil e na América Latina. De interesse, o estudo permitiu identificar 11 alelos de HLA classe II associados positivamente com a resposta de anticorpos anti-PvDBP detectados no ELISA, com destaque para os alelos DQA1*01:03 e HLA-DRB1*02:02. Por outro lado, o estudo permitiu identificar 4 alelos associados negativamente com a resposta de anticorpos. Além disso, quatro alelos - HLADQA1* 02:01, HLA-DRB1*07:01, HLA-DQB1*02:02 e HLA-DQA1*02:01 - parecem influenciar positivamente na resposta de anticorpos inibitórios da interação DBPII-DARC, enquanto que o alelo HLA-DRB1*16:02 influenciou negativamente nesta resposta. Estes achados são de grande importância, pois, em áreas hiperendêmicas de malária, a resposta de anticorpos inibitórios tem sido associada com proteção clínica. Em conjunto, os resultados do presente estudo permitiram demonstrar, pela primeira vez, que polimorfismos do receptor DARC e do HLA classe II podem influenciar na resposta imune protetora contra a PvDBP. / The Duffy binding protein of Plasmodium vivax (PvDBP) is a critical adhesion ligand that participates in merozoite invasion of human Duffy/DARC positive erythrocytes, being considered, therefore, a target for vaccine-mediated immunity. Although anti-PvDBP immune responses have been well characterized, few studies have investigated the influence of host variability on the development of this immune response. In the present study, we examined whether host genetic polymorphisms might affect humoral immunity against PvDBP. More specifically, we investigated polymorphisms on the DARC receptor and in the human leucocyte antigen (HLA) class II. For that, we carried out a 12-months follow-up study in an agricultural settlement of the Brazilian Amazon region (n=620 volunteers). The methodological approach included (i) to genotype the DARC receptor (Real-time PCR), and the HLA class II (loci HLA-DRB1, HLA-DQB1 and HLADQA1 by PCR-SSO); (ii) to analyze the plasma levels of PvDBP antibodies through conventional serology (ELISA-detected IgG antibodies) and inhibitory binding assays (PvDBP binding inhibitory antibodies, BIAbs). The results showed no association between DARC polymorphisms and ELISA–detected antibodies. However, the follow-up study demonstrated that BIAbs targeting PvDBP towards to be more frequent in heterozygous carrying a DARC-silent allele (genotypes FY*A/FY*BES and FY*B/FY*BES), suggesting a gene-dosage effect. Regarding the HLA class II polymorphisms, we identified 11 alleles positively associated with the response of PvDBP ELISA-detected antibodies. In addition, the study revealed four alleles negatively associated with the antibody response (HLA-DRB1*10:01, HLA-DRB*14:02, DRB1*14:02 e DQA1*05:01 citar os 4 aqui). Of relevance, four alleles (HLA-DQA1*02:01, HLA-DRB1*07:01, HLADQB1* 02:02 and HLA-DQA1*02:01) were positively associated with the PvDBP BIAb, whereas a single allele (HLA-DRB1*16:02) was negatively associated with this protective response. Together, the results of the present study demonstrate, for the first time, that polymorphisms on the DARC receptor and in the HLA class II may influence the protective immune response against PvDBP.

Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 414.pdf: 7133398 bytes, checksum: f3c34dbc03132f760978a32309a5b7ce (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é uma doença causada por um flavivírus, representado por quatro sorotipos distintos (DENV1-4). Entre as proteínas virais, ENV e NS1 contribuem fortemente com o processo de resposta imune desencadeado pelo vírus. Os principais sistemas de diagnóstico utilizam a detecção de anticorpos através da técnica Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA, a qual, embora útil, apresenta inúmeras limitações (custo, tempo de processamento, entre outros). Neste trabalho, nós desenvolvemos ensaios multiplex de microarranjos líquidos para ENV e NS1. Sequências de aminoácidos codificantes das proteínas, provenientes de cepas isoladas da América Latina foram selecionadas em bancos de dados públicos, alinhadas para a geração das respectivas sequências consenso e construção dos antígenos recombinantes. As sequências obtidas foram otimizadas para expressão bacteriana, submetidas à síntese comercial e clonadas em vetores de expressão procarióticos. Os antígenos foram expressos e validados através de ensaios de microarranjos líquidos, com obtenção de promissores resultados, especialmente para as proteínas ENV (domínios I/II) sorotipo 1 e 2, com potencial aplicação comercial. Este trabalho desenvolveu ainda metodologia para renaturação de NS1 com excelente rendimento. Os resultados das proteínas produzidas neste trabalho foram de forma geral superiores aos obtidos por antígenos comercialmente disponíveis para a proteína ENV de dengue vírus, utilizando a mesma metodologia. As proteínas NS1 foram ainda utilizadas para imunização de coelhos e produção de anticorpos policlonais, que se mostraram bem sucedidos para aplicações em ensaios de imunofluorescência, western blot, citometria de fluxo e como anticorpo de detecção para ensaios quantitativos para a proteína NS1 por ELISA de captura. Os resultados obtidos neste projeto foram considerados extremamente promissores, com potencial aproveitamento no desenvolvimento de testes diagnósticos comerciais com alta precisão, rápidos e com baixo custo

Respiratory syncytial virus is well recognized as the most important pathogen accounting for acute respiratory disease in infants and young children, mainly bronchiolitis and pneumonia. Two major antigenic subgroups, A and B, have been identified; however, there is a disagreement between the severity of the disease caused by them. This study investigated a possible association between RSV subgroups and severity of the cases. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction was used to characterize 128 RSV nasopharyngeal specimens from children less than five years old experiencing acute respiratory disease. It was possible to subgroup 64.1% samples in RSV A (64) and RSV B (18). Severity was measured by clinical evaluation associated with demographic factors. For RSV A-infected patients, 53.1% were hospitalized, whereas for RSV B it was 27.8%. Around 35.0% of the patients presented risk factors for severity. The hospitalization happened for 47.6% of RSV A patients and for 18.2% of RSV B, for children without risk factors. It was observed a trend for RSV B infection to be milder than RSV A. Even though RSV A infected patients were more likely to require hospitalization than those infected by RSV B, including cases without underlying condition and prematurity, the disease severity could not to be attributed to the RSV subgroups. / O vírus respiratório sincicial (VRS) é referido como o principal agente viral de doença respiratória aguda (DRA) em recém nascidos e lactentes, causando principalmente bronquiolite e pneumonia. Dois subgrupos antigênicos, A e B, são conhecidos, entretanto há divergências a respeito da gravidade da doença causada por esses subgrupos. Para tentar caracterizar 128 amostras de VRS obtidas de crianças menores de cinco anos de idade com DRA, foi utilizada a transcrição reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR). Desta maneira, foram subgrupadas 64,1% (82/128) das amostras, sendo 64 VRS A e 18 VRS B. No período de estudo o VRS A predominou sobre o B e em quatro anos observou-se a cocirculação alternada de ambos, sendo o VRS B mais detectado em dois deles. O critério de gravidade foi definido com base nas informações clínicas e nos dados demográficos obtidos das crianças infectadas. Dentre os pacientes com infecção pelo VRS A, a taxa de hospitalização foi de 53,1% (34/64) e para o VRS B de 27,8% (5/18) (p=0,067; OR=2,947; RR=1,250; IC 95%=0,940-9,235; mediana de idade: 2,1 e 3 meses, respectivamente). Das crianças infectadas pelo VRS A, 59,4% (38/64) eram <6 meses de idade, enquanto que para o VRS B esse percentual foi de 55,6% (10/18). Todavia, dentre os infectados pelo VRS B nenhum era <1 mês. Aproximadamente 35,0% (29/82) das crianças apresentaram doença de base e prematuridade. Quando se excluiu esses fatores de risco e procedeu à uma análise, observou-se uma taxa de hospitalização de 47,6% (20/42) e 18,2% (2/11), respectivamente para os casos de VRS A e B (p=0,097, OR=4,091; RR=1,281; IC 95%=0,788-21,249). Concluindo, não foi observada diferença estatística para gravidade clínica entre os subgrupos do VRS, mas apenas uma tendência de doença mais branda pelo VRS B. Embora pacientes infectados pelo VRS A tenham sido mais hospitalizados do que os infectados pelo VRS B, inclusive os casos sem doença de base e prematuridade, a gravidade da doença não pôde ser atribuída aos subgrupos do VRS. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A malária é um grave problema de saúde pública. Os medicamentos de escolha para tratar a doença são as terapias baseadas em combinações de artemisininas. Porém, uma crescente resistência à estas drogas tem sido reportada. A presente investigação teve como objetivo avaliar o papel do extrato etanólico bruto de Trichoderma stromaticum (Ext-Ts) em camundongos C57BL/6 infectados com Plasmodium berghei ANKA, um conhecido modelo experimental de malária cerebral experimental. Foram monitoradas as manifestações clinicas, histológicas, imunológicas e bioquímicas características da infecção. Observou-se que o tratamento com Ext-Ts foi capaz de prevenir as alterações neurológicas associadas à malária cerebral experimental, diminuir os níveis de parasitemia e aumentar significativamente a sobrevivência de animais infectados. Além disso, foi observado que em camundongos tratados com Ext-Ts houve diminuição dos níveis de colesterol total, triglicerídeos e TGP no soro, menor deposição de hemozoína no fígado, atenuação da intensidade do edema pulmonar, proteção da integridade da barreira hematoencefálica, assim como menor citoaderência e achados histopatológicos nos tecidos avaliados, quando comparado com camundongos infectados não tratados. Esta proteção foi associada com uma diminuição na expressão de IFN-γ e ICAM-1 no cérebro dos animais tratados em relação a animais não tratados. Estes resultados sugerem que o Ext-Ts é uma potencial fonte de compostos antimaláricos e/ou imunomoduladores que poderiam melhorar o tratamento atual no contexto do aumento da resistência aos derivados da artemisinina. / Malaria is a severe health problem. The first-line treatment against the disease are the artemisinin-based combination therapies. However, increased resistance to these drugs has been reported. The aim of this study was to evaluate the role of crude etanolic extracts of Trichoderma stromaticum (Ext-Ts) in C57BL/6 mice infected with Plasmodium berghei ANKA, a well-known model of experimental cerebral malaria. Clinical, histological, immunological and biochemical features of the infection were monitored. It was found that Ext-Ts treatment was able to prevent neurological alterations associated with experimental cerebral malaria, decreased parasitemia levels and significantly improved survival of infected animals. Furthermore, it was observed that in Ext-Ts-treated mice a reduction of total serum cholesterol, triglycerides and TGP, lower hemozoin deposition into the liver, attenuation of pulmonary edema intensity, integrity of the blood-brain barrier as well as fewer cytoadherence and histopathological findings in assessed tissues in comparison with untreated infected mice. This protection was associated with decreased IFN-γ and ICAM-1 mRNA expression in brain of treated animals compared with untreated animals. These results suggest that Ext-Ts is a potential source of antimalarial and immunomodulatory compounds that could improve the current treatment in the context of resistance to artemisinin derivatives. / Dissertação (Mestrado)

Nosocomial infections caused by antibiotic resistant bacteria represents a substantial problem due to increasing in mortality, morbidity and health-care costs, especially in intensive care units. This study evaluated the frequencies of epidemiologically important antibiotic resistance phenotypes, recovered from ventilator-associated pneumonia (VAP) in critically ill patients and urinary tract infection (UTI) and bloodstream infections (BSI) in critical and non-critical patients. An one year study was performed in the adult intensive care unit (AICU) of the Clinical Hospital (CH) of Federal University of Uberlândia, where clinical specimens were obtained for diagnosis of VAP and UTI; moreover, the laboratory of the CH provided data that was used to define all the cases of BSI and UTI in non-critical units; additionally, a monthly inquiry of the antimicrobials consumption was carried through in AICU at the period of the study. Coagulase-negative staphylococci predominated as etiological agent of BSI in critically ill (24.6%) and non-critical (30.6%) patients, with frequency of 60,0% of oxacilin-resistant coagulase-negative staphylococci; Klebsielleae (23.4%) and E. coli (29.6%) were the major cause of UTI in critical and non-critical patients, respectively, with resistance above 20.0% to third generation cephalosporins and P. aeruginosa (42.0%) was the main etiological agent of VAP, with rates of resistance to imipenem and fluoroquinolons above 70,0%. The prevalence study of antibiotic consumption in the AICU pointed to cephalosporins (49.6%), followed by vancomycin (37.4%) and carbapenems (26.6%) as the most prescribed antibiotics in the unit. The comparison of our findings with other national and international studies demonstrated a highest frequency of antibiotic resistant phenotype in our hospital, in critical and non-critical units, especially among the Gram-negative bacterias, however, it was not observed a significant variation between the frequency of resistance phenotypes recovered from critical and non-critical units, what strongly suggests that these phenotypes had already spread in the hospital, except P. aeruginosa whose resistance to antibiotic was more expressive when recovered from critical patients than non-critical ones. / Infecções hospitalares causadas por bactérias resistentes a antibióticos representam um problema expressivo quanto à morbidade, mortalidade e custos hospitalares, especialmente em unidades de terapia intensiva. Esse trabalho avaliou as freqüências de fenótipos de resistência a antimicrobianos dos patógenos epidemiologicamente importantes, isolados de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) em pacientes críticos e de infecções de trato urinário (ITU) e de corrente sangüínea (ICS) em pacientes críticos e não críticos. Foi feita uma vigilância epidemiológica ativa na Unidade de Terapia Intensiva de adultos (UTIA) do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia (HC-UFU), no período de um ano, coletando-se dados e espécimes clínicos para diagnóstico de PAV e ITU; além da coleta de dados no laboratório do HC para definir as ICS em pacientes críticos e não críticos e as ITU em unidades não críticas; adicionalmente, foram realizados no período do estudo, inquéritos mensais da prescrição de antimicrobianos na UTIA. Houve um predomínio do Staphylococcus spp coagulase negativo como agente etiológico das ICS em pacientes críticos (24,6%) e não críticos (30,6%) com 60,0% dos isolados resistentes a oxacilina; da tribo Klebsielleae (23,4%) e da E. coli (29,6%) como causa de ITU em pacientes críticos e não críticos, respectivamente, com resistência acima de 20,0% às cefalosporinas de terceira geração e da P. aeruginosa (42,0%) em isolados de PAV, com resistência acima de 70,0% para imipenem e fluoroquinolonas. A pesquisa do consumo de antibióticos na UTIA apontou as cefalosporinas (49,6%), seguidas por vancomicina (37,4%) e carbapenêmicos (26,6%) como os antimicrobianos mais prescritos na unidade. Comparando nossos achados com outros estudos epidemiológicos em unidades críticas e não críticas nacionais e internacionais, observou-se um elevado isolamento de fenótipos de resistência em nosso hospital, principalmente entre os Gramnegativos, entretanto, não foram observadas variações importantes entre o percentual de fenótipos de resistência aos antimicrobianos isolados nas unidades críticas e não críticas, o que sugere que estes fenótipos se encontram disseminados no hospital, exceto a P. aeruginosa cuja freqüência de resistência foi mais expressiva nos isolados obtidos de pacientes críticos do que aqueles de unidades não críticas. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Parasitic infections are among the commonest health problems that affect birds. The identification of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in wild birds is relevant, since these animals can act as disseminators of these parasites to humans through environmental contamination. The aim of this research was to determine the occurrence and to perform the molecular characterization of Cryptosporidium and Giardia species/genotypes in feces from free-living and captive wild birds treated in the Laboratory of Wild Animals Research from the Federal University of Uberlândia (LAPAS) and kept in the Zoo of the Municipal Park of Sabiá, in Uberlândia, Minas Gerais, Brazil. The DNA extracted directly from feces was submitted to nested-PCR and semi-nested PCR analysis for amplification of fragments of the SSU rRNA and gdh genes of Cryptosporidium spp. and Giardia spp., respectively. Results showed that out of 256 samples collected, 10 (3.9%) were positive for Cryptosporidium spp., and 8 (3.1%) for Giardia spp.. Out of 172 samples of captive birds, six (3.49%) were positive for Cryptosporidium spp., and four (2.32%) for Giardia spp.. Out of 84 samples of free-living birds, four (4.76%) for Cryptosporidium spp. and four (4.76%) for Giardia spp. were positive. The occurrence of parasites in waterfowl (n=39) was two (5.13%) for Cryptosporidium spp., and four (10.26%) for Giardia spp.; in non-aquatic birds (n=217), it was eight (3.7%) and four (1.84%), respectively. There was no significant difference in the occurrence of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. among captive and free-living birds (p = 0.62 and 0.29, respectively). Although no statistical analysis was performed for the positivity of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. between waterfowl and non aquatic birds, the meeting of these parasites in waterfowl may have implications for the transmission of these protozoa to humans and other animals. RFLP and sequencing analysis have identified C. meleagridis in two birds of the Anatidae family, in two Aratinga leucophthalma (White-eyed parakeet), and in two Athene cunicularia (Burrowing Owl). They have also found C. baileyi in three Amazona aestiva (Blue-fronted Parrot) and in one Amazona amazonica (Orange-winged Parrot). Only three positive samples for Giardia spp. - classified as Giardia duodenalis assemblage B - were sequenced, two of them found in Rupornis magnirostris (Roadside Hawk), and one in Theristicus caudatus (Buff-necked Ibis). The essay concluded that Cryptosporidium spp. and Giardia spp. are present in wild birds in the microregion of Uberlândia, MG. The existence of zoonotic C. meleagridis and G. duodenalis assemblage B in the animals of this study may have a negative impact on public health. / Infecções parasitárias estão entre os problemas sanitários comuns que acometem aves em todo mundo. A identificação de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em aves silvestres é relevante, visto que esses animais podem agir como veiculadoras dos parasitos para o ser humano, por meio da contaminação ambiental. O objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência e caracterizar geneticamente as espécies/genótipos de Cryptosporidium e Giardia em aves silvestres de cativeiro e vida livre atendidas no Laboratório de Pesquisa em Animais Silvestres da Universidade Federal de Uberlândia (LAPAS-UFU) e procedentes do zoológico do Parque Municipal do Sabiá, Uberlândia, Minas Gerais, Brasil. O DNA, extraído diretamente das fezes coletadas, foi submetido a reações de nested-PCR e semi-nested PCR para amplificação de fragmentos dos genes SSU rRNA e gdh de Cryptosporidium spp. e Giardia spp., respectivamente.Das 256 amostras coletadas, 10 (3,9%) foram positivas para Cryptosporidium spp. e 8 (3,1%) para Giardia spp. Das 172 amostras de aves de cativeiro, seis (3,49%) foram positivas para Cryptosporidium spp.. e quatro (2,32%) para Giardia spp.; das 84 amostras de aves de vida livre, quatro (4,76%) para Cryptosporidium spp. e quatro (4,76%) para Giardia spp. foram positivas. A ocorrência dos parasitos em aves aquáticas (n=39) foi dois (5,13%) para Cryptosporidium spp. e quatro (10,26%) para Giardia spp.; em aves não aquáticas (n=217), oito (3,7%) e quatro (1,84%), respectivamente. Não foi encontrada diferença significante na ocorrência de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. entre os grupos de aves de cativeiro e vida livre (p=0,62 e 0,29, respectivamente). Apesar de não ter sido realizada análise estatística para a positividade de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. entre aves aquáticas e não aquáticas, ressalta-se que o encontro desses parasitos nas aves aquáticas pode ter implicações na transmissão desses protozoários para o homem e outros animais. Análises de RFLP e sequenciamento identificaram C. meleagridis em duas aves da família Anatidae, duas Aratinga leucophthalma (Maritaca) e duas Athene cunicularia (Corujas-buraqueira) e C. baileyi em três Amazona aestiva (papagaio-verdadeiro) e uma Amazona amazonica (papagaio-do-mangue). As amostras sequenciadas para Giardia spp., provenientes de dois Rupornis magnirostris (Gavião-carijó) e uma Theristicus caudatus (Curicaca), foram classificadas como Giardia duodenalis assemblage B. Cryptosporidium spp. e Giardia spp. estão presentes em aves silvestres de cativeiro e vida livre na microrregião de Uberlândia, MG. A presença de C. meleagridis e G. duodenalis assemblage B, considerados zoonóticos, em animais desse estudo, pode gerar impacto negativo na saúde pública. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Toxoplasmosis is a zoonosis caused by the intracellular parasite Toxoplasma gondii, which infects different hosts including up to a third of the world s human population and may cause severe damage to the fetus in congenital infection. Maternal breastfeeding is the most natural and safe way to feed a newborn, with the ability to provide good development of the infant s immune system. All immunoglobulin isotypes are present in human breast milk, mainly in the colostrum, with systemic or local source. There are several pieces of evidence showing that breastfeeding protects the infant against a wide range of diseases, but few efforts have been directed to identifying the protecting action of human milk against parasitic infections, including T. gondii. Due to the importance of breastfeeding and to the high prevalence of toxoplasmosis, this study was conducted in order to detect and evaluate the presence of specific T. gondii IgG, IgM and IgA antibodies in paired serum and colostrum samples. The study was carried out on 289 puerperal women from Clinical Hospital of Universidade Federal de Uberlândia (mean age 24.8 years, range 14 43 years). Their serum and colostrum samples were analyzed by ELISA and immunoblotting assays against soluble antigens from T. gondii. ELISA tests showed reactivity for anti-T. gondii IgG, IgM and IgA, respectively, in 136 (47.0%), 20 (6.9%), 8 (2.8%) serum samples and in 133 (46.0%), 23 (7.9%), 8 (2.8%) colostrum samples. Also, it was observed significant correlation rates between anti-T. gondii antibodies levels in serum and colostrum samples. Immunoblotting assays showed that it was possible to detect IgG, IgM and IgA antibodies specific to different antigens of T. gondii in serum as well as colostrum. IgG present in serum and colostrum recognized more antigenic fractions compared to the IgM and IgA, and seric IgG always detected more antigenic fractions than IgG in colostrum from the same patient. In contrast, specific IgA antibodies present in colostrum recognized a higher number of antigens than IgA present in serum from the same patient. Furthermore we have shown that 60 kDa antigenic fraction may be a good marker to diagnose acute toxoplasmosis infection, because it was recognizes frequently by low avidity IgG antibodies in both samples; and 39 kDa antigenic fraction may be a marker to diagnose congenital toxoplasmosis. Our results showed a significant association between T. gondii-specific antibodies present in serum and in milk samples from the patients, demonstrating that it is possible to diagnose toxoplasmosis using human milk, a noninvasive way to obtain biological samples. / Toxoplasmose é uma zoonose causada pelo parasita intracelular obrigatório Toxoplasma gondii, que infecta diversas espécies, incluindo mais de um terço da população humana mundial e pode causar danos severos ao feto na infecção congênita. A amamentação é a forma natural e segura de alimentar o recém-nascido, com capacidade de proporcionar o desenvolvimento adequado do sistema imunológico do neonato. Todas as classes de imunoglobulinas estão presentes no leite humano, principalmente no colostro, as quais podem ser de fonte sistêmica e local. Diversos estudos documentaram que a amamentação protege a criança contra várias doenças, mas poucos esforços tem sido direcionados para identificar a ação protetora do leite humano contra doenças parasitárias, inclusive T. gondii. Devido à importância da amamentação e à alta prevalência de toxoplasmose, o objetivo desse estudo foi detectar e avaliar a presença de anticorpos IgG, IgM e IgA anti-T. gondii presentes em amostras pareadas de soro e colostro humano. Foram inclusas neste estudo 289 puérperas do Hospital de Clínicas da UFU (média de idade: 24,8 anos, intervalo: 14-43 anos). As amostras foram analisadas pelos imunoensaios ELISA e Immunoblotting contra antígenos solúveis de T. gondii. O ELISA teve reatividade para IgG, IgM e IgA específicos, respectivamente, em 136 (47,9%), 20 (6,9%), 8 (2,8%) das amostras de soro e em 133 (46,0%), 23 (7,9%), 8 (2,8%) das amostras de colostro. Também foi observada correlação significativa entre os níveis de anticorpos anti-T. gondii das amostras de soro e colostro. O Immunoblotting mostrou que foi possível detectar os três isótipos de anticorpos específicos a diferentes antígenos de T. gondii em ambas amostras. Anticorpos IgG presentes em amostras de soro e colostro reconheceram mais frações antigênicas comparado com IgM e IgA. IgG sérica detectou mais frações antigênicas do que anticorpos IgG presentes no colostro da mesma paciente. Em contraste, IgA específica presente no colostro reconheceu maior número de antígenos do que IgA presente em amostras de soro da mesma paciente. Adicionalmente, mostramos que a fração de 60 kDa pode ser um bom marcador de diagnóstico para infecção aguda, pois ela foi reconhecida frequentemente por anticorpos IgG de baixa avidez de ambas amostras; e a fração de 39 kDa pode ser um marcador de diagnóstico de toxoplasmose congênita. Nossos resultados demonstraram uma associação significativa entre anticorpos específicos a T. gondii presentes em amostras de soro e leite, evidenciando que é possível diagnosticar toxoplasmose usando leite humano, uma forma não invasiva de obter amostra biológica. / Mestre em Imunologia de Parasitologia Aplicada