Staphylococcus aureus kann bei etwa 25% der gesunden Normalbevölkerung nachgewiesen werden, ohne Symptome zu verursachen. Dieser Keim ist jedoch auch einer der wichtigsten Erreger bei Osteomyelitis und Infektionen von orthopädischen Implantaten wie z. B. von künstlichen Knie- oder Hüftgelenken. Diese Infektionen führen meist zu aufwendigen und risikobehafteten operativen Eingriffen sowie zu einer langfristigen Antibiotikagabe. In der vorliegenden Arbeit sollten S. aureus-Isolate charakterisiert werden, die aus Osteomyelitisherden oder infizierten orthopädischen Implantaten gewonnen wurden. Ziel war es, die Isolate daraufhin zu untersuchen, ob bestimmte Stämme dominieren und ob das Vorhandensein bestimmter Virulenzfaktoren mit einem besonderen Risiko für solche Infektionen korreliert. Für diese Untersuchungen wurden DNA-Arrays eingesetzt, welche es ermöglichen, alle relevanten Virulenzfaktoren in einem Experiment nachzuweisen, einen „genetischen Fingerabdruck“ zu erheben und die Isolate so Verwandtschaftsgruppen (klonalen Komplexen, CC) zuzuordnen. Insgesamt wurden 119 klinische Isolate charakterisiert. Sie gehörten zu 20 verschiedenen klonalen Komplexen. CC8 (19,3%), CC45 (17,7%) und CC30 (12,6%) dominierten. MRSA waren selten nachweisbar. Die sieben MRSA-Isolate gehörten zu den lokal dominierenden Stämmen (Rhein-Hessen, Süddeutscher, Barnimer und Berliner Epidemiestamm sowie Europäischer caMRSA-Klon). Die Populationsstruktur der klinischen Isolate und die Häufigkeiten der untersuchten Virulenz- und Adhäsionsfaktoren entsprachen weitestgehend Isolaten von asymptomatischen Trägern, die in einer früheren Studie bestimmt wurden (Molecular epidemiology of Staphylococcus aureus in asymptomatic carriers; Monecke, Lüdicke, Slickers, Ehricht; Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2009). Es konnte kein molekularer Marker identifiziert werden, der allein für eine Risikostratifizierung eingesetzt werden kann. Das Gen für Staphylokinase (sak) war jedoch bei den klinischen Isolaten (90,8%) häufiger nachzuweisen als in Isolaten von asymptomatischen Trägern (71,6%). Einige andere Gene traten ebenfalls bei Patienten häufiger auf, aber waren insgesamt zu selten, um bei Osteomyelitis und Implantatinfektionen eine signifikante Rolle zu spielen. Ein Beispiel dafür war das Panton-Valentine Leukozidin, das in 0,7% der Isolate von asymptomatischen Trägern und in 3,4% der Patientenisolate gefunden wurde. CC15 war bei Isolaten von asymptomatischen Trägern häufiger vertreten (16.8%) als bei Patientenisolaten (5.9%). Da alle CC15-Isolate sak-negativ waren, könnte auch diese Beobachtung als Indiz für einen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Staphylokinase und Invasivität gewertet werden. CC45 war bei Patientenisolaten (17,7%) häufiger als bei den asymptomatischen Trägern (9,0%) vorhanden. Es konnte jedoch kein CC45-spezifischer Faktor identifiziert werden, der mit einer höheren Virulenz im Zusammenhang stehen könnte. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob S. aureus in infizierten orthopädischen Implantaten endogenen Ursprungs ist. Bei 23 Patienten mit Infektionen von Knie- oder Hüfttotalendoprothesen konnten parallel Nasenabstriche genommen und untersucht werden. Fünfzehn von ihnen (65,2%) waren Träger von S. aureus und bei neun (39,1%) waren die Isolate aus Nasenabstrichen und den infizierten Endoprothesen identisch. Dies weist darauf hin, daß Träger von S. aureus ein erhöhtes Risiko haben, Infektionen von Knie- oder Hüfttotalendoprothesen zu erleiden und daß ein großer Teil dieser Infektionen endogenen Ursprungs ist. Deshalb sollten Patienten vor Implantation von Knie- oder Hüfttotalendoprothesen auf Trägerschaft von S. aureus untersucht werden. Falls S. aureus nachgewiesen wird, sollte dieser Keim generell präoperativ eradiziert werden, um das Risiko endogener Infektionen zu verringern. Eine prospektive Studie zu diesem Thema wird empfohlen. / Staphylococcus aureus is asymptomatically carried by approximately 25% of a normal population. It is also one of the most important causes of osteomyelitis and infections of orthopedic implants such as total hip or knee replacements. Such infections usually lead to complicated and risky surgical procedures as well as to long-term antibiotic treatment. In the present work, S. aureus isolates from osteomyelitis or implant infections were to be characterised. The aim of the study was to prove whether certain strains were overrepresented among patient isolates, and whether the presence of certain virulence factors might correlate with these infections. DNA arrays where used which facilitate to screen for all relevant virulence factors within a single experiment and which allow typing by obtaining a genetic fingerprint of the examined isolate. By this method, it was also possible to assign isolates to phylogenetic clusters, so-called clonal complexes. 119 clinical isolates were characterised in this way. They belonged to 20 different clonal complexes (CC). CC8 (19.3%), CC45 (17.7%) and CC30 (12.6%) dominated. MRSA were rarely detected. The seven MRSA isolates belonged to locally predominant epidemic strains (ST5-MRSA-II, ST228-MRSA-I, ST22-MRSA-IV, ST45-MRSA-IV and ST80-MRSA-IV). The population structure of the clinical isolates and the relative abundances of the examined virulence and adhesion factors corresponded largely to isolates from asymptomatic carriers, which has been examined in an earlier study (Molecular epidemiology of Staphylococcus aureus in asymptomatic carriers; Monecke, Lüdicke, Slickers, Ehricht; Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2009). No molecular maker was detected which could alone be used for risk assessment. The gene for staphylokinase (sak) was clearly more common among clinical isolates (90.8%) than in isolates from asymptomatic carriers (71.6%). Some other genes were also found to be more common in patient isolates, but were very rare so that a significant role in bone and implant infection appeared to be unlikely. An example is Panton-Valentine leukocidin, which was detected in 3.4% of patient isolates and 0.7% of carrier isolates. CC15 was more commonly detected among healthy carriers (16.8%), than among patients (5.9%). Since all CC15 isolates were negative for sak, this also might be related to a possible role of staphylokinase in pathogenesis of invasive disease. CC45 was more abundant in patient samples (17.7%) than in swabs of healthy carriers (9.0%). However, it was not possible to identify a CC45-specific factor which might have been related to a higher virulence. Another aim of the study was to investigate whether S. aureus from orthopaedic implant infections were of endogenous origin. For 23 patients with S. aureus infections of total knee or hip prosthetics, it was possible to obtain nasal swabs in order to detect and type possible S. aureus carriage strains. Fifteen of them (65.2%) carried S. aureus. In nine patients (39.1%), isolates from nasal swabs and foci of infection were identical. This indicates that carriers of S. aureus are at risk of developing infections of total knee or hip prosthetics, and that a considerable proportion of these infections are of endogenous origin. Therefore, patients should generally be screened for S. aureus carriage prior to joint replacement. In case of detection, S. aureus should be eradicated in order to decrease the risk of endogenous infection. A prospective study is recommended.

Die Allele (*R1, *R2, *S1 und *S2) des A. gambiae complement-like thioester-containing Protein 1 (TEP1) bestimmen die Fitness der Mücken, welches die männlichen Fertilität und den Resistenzgrad der Mücke gegen Pathogene wie Bakterien und Malaria-Parasiten. Dieser Kompromiss zwischen Reproduktion und Immunnität hat Auswirkungen auf die Größe der Mückenpopulationen und die Rate der Malariaübertragung. Wie die genetische Diversität von TEP1 die genetische Struktur natürlicher Vektorpopulationen beeinflusst, ist noch unklar. Die Zielsetzung dieser Doktorarbeit waren: i) die biogeographische Kartographierung der TEP1 Allele und Genotypen in lokalen Malariavektorpopulationen in Mali, Burkina Faso, Kamerun, und Kenia, und ii) die Bemessung des Einflusses von TEP1 Polymorphismen auf die Entwicklung humaner P. falciparum Parasiten in der Mücke. Die Analysen der TEP1 Polymorphismen zeigten, dass die natürliche Selektion auf Exone, sowie Introne wirkt, was auf eine starke funktionale Beschränkung an diesem Lokus hindeutet. Außerdem zeigen unsere Daten die strukturierte Erhaltung natürlicher genetischer Variation im TEP1 Lokus, in welchem die Allele und Genotypen spezifische evolutionäre Wege verfolgen. Diese Ergebnisse weisen auf die Existenz von arten- und habitatspezifischen Selektionsdrücken hin, die auf den TEP1 Lokus wirken. Resultate haben gezeigt, dass TEP1*S1 und *S2 Mücken gleichermassen empfänglich für Plasmodium-Infektionen sind. Insgesamt tragen die Resultate der biogeographischen Kartographierung des TEP1 Lokus und der Züchtungs- und Infektionsexperimente zu einem besseren Verständnis über den Einfluss der verschiedenen Vektorarten und lokale Umwelteinflüsse auf die Vektorpopulationen und Malariaübertragung bei. Des weiteren kann die hier beschriebene hochdurchsatz-genotypisierungs Methode, zur Studie lokaler A. gambiae Mückenpopulationen, in der Feldforschungsarbeit eingesetzt werden. Dieser neue Ansatz wird die epidemiologisch relevante Überwachung und Vorhersage dynamischer Prozesse in lokalen Malariavektorpopulationen unterstützen, welche die Entwicklung neuer Strategien der Vektorkontrolle ermöglichen könnten. / The alleles (*R1, *R2, *S1 and *S2) and genotypes of A. gambiae complement-like thioester-containing protein 1 (TEP1) determine the fitness in male fertility and the degree of mosquito resistance to pathogens such as bacteria and malaria parasites. This trade-off between the reproduction and the immunity impacts directly on mosquito population abundance and malaria transmission respectively. How TEP1 genetic diversity influences the genetic structure of natural vector populations and development of human malaria parasites is unclear. The aims of this thesis were to: i) map distribution of TEP1 alleles and genotypes in local malaria vector populations in Mali, Burkina Faso, Cameroon and Kenya, and ii) assess the impact of TEP1 polymorphism on development of human P. falciparum parasites in mosquitoes. Analyses of TEP1 polymorphism revealed that natural selection acts in concert on both exons and introns, suggesting strong functional constrains acting at this locus. Moreover, our data demonstrate a structured maintenance of natural TEP1 genetic variation, where the alleles and the genotypes follow distinct evolutionary paths. These findings suggest the existence of species- and habitat-specific selection patterns that act on TEP1 locus. Results revealed that the TEP1*S1 and *S2 mosquitoes are equally susceptible to Plasmodium infections. Collectively, results of my thesis on the biogeographic TEP1 mapping, and on the breeding and infection experiments contribute to a better understanding of how the vector species and local environmental factors, shape vector population structures and malaria transmission. Furthermore, the high throughput TEP1 genotyping approach reported here could be used for field studies of local A. gambiae mosquito populations. This new approach will benefit surveilance and prediction of dynamics in local malaria vector populations that may have epidemiological significance, and therefore inform the development of novel vector control measures.

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Die Mehrzahl der jährlich 400.000 bis 600.000 Krankenhausinfektionen in Deutschland wird von Erregern der sog. ESCAPE-Gruppe (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und verschiedene Enterobacteriaceae, u.a. Klebsiella pneumoniae) verursacht. Besondere Sorge bereitet dabei die Ausbreitung von K. pneumoniae-Stämmen mit enzymvermittelter Resistenz gegenüber Carbapenem-Antibiotika (K. pneumoniae-Carbapenemase, KPC) und die Zunahme von C. difficile-Infektionen (CDI) durch hypervirulente Epidemiestämme (z.B. Ribotyp 027). Die spezifischen Erfahrungen eines prolongierten Ausbruchsgeschehens durch einen KPC-bildenden K. pneumoniae-Stamm (KPC-KP) am Leipziger Universitätsklinikum machen deutlich, dass bei diesem Erregertyp ein hohes Transmissionspotential bei enormer Tenazität (Umweltresistenz) zu berücksichtigen ist, ein Versagen von Standardhygienemaßnahmen in Betracht zu ziehen ist, und Infektionsketten oftmals unklar bleiben. Die Anwendung von Antibiotika ist bei KPC-KP-Infektionen auf einzelne Substanzen (Colistin, Tigecyclin, Gentamicin) beschränkt und vor allem bei immunsupprimierten Patienten (z.B. Lebertransplantierte) mit einem relevanten Risiko des Therapieversagens behaftet. Die Therapie von CDI wird gerade bei Immunsupprimierten durch eine steigende Zahl an Rezidiven erschwert, die teilweise antibiotisch (Vancomycin, Fidaxomicin) nicht beherrschbar sind, so dass alternative Therapieverfahren wie die fäkale Bakterientherapie („Stuhltransplantation“) zur Anwendung kommen. CDI-Rezidive, aber auch eine dauerhafte intestinale Besiedelung mit multiresistenten Enterobakterien wie KPC-KP, scheinen neben wirtsspezifischen Faktoren der Immunantwort durch eine Dysregulation der physiologischen intestinalen Standortflora mit Störung der Kolonisationsresistenz bedingt zu sein. Der Versuch einer Eradikationsbehandlung von Patienten mit persistierender intestinaler Besiedelung durch KPC-KP mittels oraler Applikation der nicht resorbierbaren Antibiotika Colistin und Gentamicin ist mit einem relevanten Risiko der Entstehung von Sekundärresistenzen behaftet. Die Zulassung neuer, besser wirksamer Antibiotika ist für die nächsten Jahre nicht in Sicht, so dass der Infektionsprävention überragende Bedeutung zukommt. Die Erfahrungen der KPC-Ausbruchsbewältigung am Leipziger Universitätsklinikum zeigen, dass nahezu lückenlose Compliance bei der Händedesinfektion, rigoros praktizierte und kontrollierte Barriere- und Isolationsmaßnahmen, Optimierung des Gebrauchs von Breitspektrum-Antibiotika (sog. „Antibiotic Stewardship“) und systematisches mikrobiologisches Erregerscreening dabei unabdingbar sind. Nachhaltige Verbesserungen hinsichtlich der globalen Ausbreitung von multiresistenten Krankenhausbakterien werden sich nur durch grundlegende Umgestaltungen in Umwelt, Landwirtschaft, Tierzucht und Gesundheitswesen mit sparsamer und möglichst gezielter Anwendung von Antibiotika erzielen lassen. Um Risikopopulationen hospitalisierter Patienten vor potentiell lebensbedrohlichen Erregertransmissionen effektiv schützen zu können, sind erweiterte Surveillance und konsequent umgesetzte krankenhaushygienische Maßnahmen erforderlich.

Die Mehrzahl der jährlich 400.000 bis 600.000 Krankenhausinfektionen in Deutschland wird von Erregern der sog. ESCAPE-Gruppe (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und verschiedene Enterobacteriaceae, u.a. Klebsiella pneumoniae) verursacht. Besondere Sorge bereitet dabei die Ausbreitung von K. pneumoniae-Stämmen mit enzymvermittelter Resistenz gegenüber Carbapenem-Antibiotika (K. pneumoniae-Carbapenemase, KPC) und die Zunahme von C. difficile-Infektionen (CDI) durch hypervirulente Epidemiestämme (z.B. Ribotyp 027). Die spezifischen Erfahrungen eines prolongierten Ausbruchsgeschehens durch einen KPC-bildenden K. pneumoniae-Stamm (KPC-KP) am Leipziger Universitätsklinikum machen deutlich, dass bei diesem Erregertyp ein hohes Transmissionspotential bei enormer Tenazität (Umweltresistenz) zu berücksichtigen ist, ein Versagen von Standardhygienemaßnahmen in Betracht zu ziehen ist, und Infektionsketten oftmals unklar bleiben. Die Anwendung von Antibiotika ist bei KPC-KP-Infektionen auf einzelne Substanzen (Colistin, Tigecyclin, Gentamicin) beschränkt und vor allem bei immunsupprimierten Patienten (z.B. Lebertransplantierte) mit einem relevanten Risiko des Therapieversagens behaftet. Die Therapie von CDI wird gerade bei Immunsupprimierten durch eine steigende Zahl an Rezidiven erschwert, die teilweise antibiotisch (Vancomycin, Fidaxomicin) nicht beherrschbar sind, so dass alternative Therapieverfahren wie die fäkale Bakterientherapie („Stuhltransplantation“) zur Anwendung kommen. CDI-Rezidive, aber auch eine dauerhafte intestinale Besiedelung mit multiresistenten Enterobakterien wie KPC-KP, scheinen neben wirtsspezifischen Faktoren der Immunantwort durch eine Dysregulation der physiologischen intestinalen Standortflora mit Störung der Kolonisationsresistenz bedingt zu sein. Der Versuch einer Eradikationsbehandlung von Patienten mit persistierender intestinaler Besiedelung durch KPC-KP mittels oraler Applikation der nicht resorbierbaren Antibiotika Colistin und Gentamicin ist mit einem relevanten Risiko der Entstehung von Sekundärresistenzen behaftet. Die Zulassung neuer, besser wirksamer Antibiotika ist für die nächsten Jahre nicht in Sicht, so dass der Infektionsprävention überragende Bedeutung zukommt. Die Erfahrungen der KPC-Ausbruchsbewältigung am Leipziger Universitätsklinikum zeigen, dass nahezu lückenlose Compliance bei der Händedesinfektion, rigoros praktizierte und kontrollierte Barriere- und Isolationsmaßnahmen, Optimierung des Gebrauchs von Breitspektrum-Antibiotika (sog. „Antibiotic Stewardship“) und systematisches mikrobiologisches Erregerscreening dabei unabdingbar sind. Nachhaltige Verbesserungen hinsichtlich der globalen Ausbreitung von multiresistenten Krankenhausbakterien werden sich nur durch grundlegende Umgestaltungen in Umwelt, Landwirtschaft, Tierzucht und Gesundheitswesen mit sparsamer und möglichst gezielter Anwendung von Antibiotika erzielen lassen. Um Risikopopulationen hospitalisierter Patienten vor potentiell lebensbedrohlichen Erregertransmissionen effektiv schützen zu können, sind erweiterte Surveillance und konsequent umgesetzte krankenhaushygienische Maßnahmen erforderlich.

Obwohl seit der Einführung des Penicillins ein wirksames Medikament gegen Streptokokken der Lancefield Gruppe A (GAS) existiert, bei welchem bislang keine Resistenzen beschrieben wurden, bleiben GAS-Infektionen auch heute noch ein großes gesundheitspolitisches Problem, das sowohl die Morbidität als auch die Mortalität der Menschen weltweit beeinflusst. GAS können ein breites Spektrum an Erkrankungen beim Menschen verursachen. Dazu zählen nicht nur unkomplizierte Racheninfektionen mit und ohne Scharlach oder Hautinfektionen wie Erysipel oder Impetigo, sondern auch invasive sowie Folgeerkrankungen. 1928 wurde als Typ-spezifische, Antikörperbildung-induzierende Substanz das M-Protein beschrieben, welches durch das emm-Gen kodiert und seither zur Beschreibung der Epidemiologie von GAS verwendet wird. Eine der Hauptfunktionen des auf der Oberfläche von GAS verankerten M-Proteins besteht darin, die Phagozytose durch polymorphkernige Leukozyten zu verhindern, was zu den wichtigsten Abwehrmechanismen von Infektionen mit GAS gezählt wird. Obwohl seit einigen Jahrzehnten große Anstrengungen unternommen wurden, bleibt ein sicherer und effektiver Impfstoff bisher ein unerreichtes Ziel. In der hier vorliegenden Studie wurde, anhand der über den Zeitraum vom 11.03.2006 bis 19.05.2012 am Universitätsklinikum Freiburg gesammelten Daten und Isolaten, die regionale Epidemiologie von Infektionen pädiatrischer Patienten durch GAS retrospektiv untersucht. Mit insgesamt 566 Isolaten und zugehörigen klinischen Daten stellt diese Studie die bisher größte unizentrische epidemiologische Untersuchung von pädiatrischen Erkrankungen mit emm-Typisierung von GAS in Deutschland dar. Dabei wurde besonders auf Zusammenhänge zwischen den molekularepidemiologischen Daten, basierend auf der emm-Typisierung, und den anonymisierten klinischen Informationen eingegangen. In die Kohorte konnten insgesamt 566 Fälle eingeschlossen werden. Bei 405 Fällen wurde eine Racheninfektion festgestellt, wovon bei wiederum 75 Fällen zusätzlich die Diagnose Scharlach gestellt wurde, 34 Kinder stellten sich mit einer Hautinfektion vor, 21 mit einer akuten Otitis media, 19 mit einer anogenitalen Infektion, acht mit einer invasiven Infektion und zwei mit einer Harnwegsinfektion. Als Kolonisation durch GAS ohne Krankheitswert wurden 77 Fälle gewertet, davon 48 mit pharyngealer Kolonisation. In der molekularepidemiologischen Untersuchung konnten drei neue emm-subtypen entdeckt werden, welche als emm29.13, emm36.7 sowie emm75.5 erstbeschrieben und deren Sequenzen in der Datenbank des CDC hinterlegt wurden. Über die gesamte Kohorte hinweg wurde Typ emm12 bei 19% aller Fälle gefunden und lag somit am häufigsten vor, gefolgt von emm1 und emm4 mit je 14% sowie emm28 und emm89 mit je 11%. Bei Betrachtung der emm-Cluster zeigte sich E4 mit 31% am häufigsten, danach folgten Cluster A-C4 mit 19%, A-C3 und E1 mit jeweils 14%. Unter den 405 Fällen mit GAS-Tonsillopharyngitis lag emm12 mit knapp 20% am häufigsten vor, gefolgt von emm4 mit 15%, emm1 mit 14%, emm89 mit 13% und emm28 sowie emm3 mit je 9%. Hinsichtlich der Cluster wurde E4 dort mit knapp 30% am häufigsten festgestellt, gefolgt von A-C4 mit 20%, E1 mit 15%und A-C3 mit 14%. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass sich die emm-Typ- sowie die emm-Cluster-Epidemiologie in Abhängigkeit von der klinischen Manifestation unterscheidet. Auch wenn sich die Verteilungen grundsätzlich ähnelten, traten emm4 bzw. die Cluster A-C5 und E1 bei Patienten mit Tonsillopharyngitis mit Scharlach auch nach Bonferroni-Korrektur signifikant häufiger auf als bei solchen mit Tonsillopharyngitis ohne Scharlach. Erste Hinweise hierfür wurden im Rahmen dieser Arbeit in einer Vorabauswertung zu dieser Kohorte 2013 erstmals beschrieben und durch Ergebnisse folgender, internationaler Studien gestützt. Bei anogenitalen Infektionen wurde in knapp 80% der Fälle Cluster E4 und in 58% emm28 festgestellt, so-dass hier ein deutlich eingeengtes Erregerspektrum vorlag. Verglichen zu allen Fällen mit Tonsillopharyngitis wurden bei anogenitaler Infektion Typ emm28 und Cluster E4 signifikant häufiger isoliert. Für Hautinfektionen konnte kein signifikanter Unterschied der emm-Typ-Verteilung im Vergleich zu Racheninfektionen insgesamt gefunden werden. Es zeigte sich jedoch Cluster E4 signifikant häufiger bei Patienten mit einer Hautinfektion als bei solchen mit Scharlach. Insgesamt zeigte sich im konkreten Vergleich zu einer französischen Studie eine weitgehende Übereinstimmung hinsichtlich der Epidemiologie der emm-Typen und -Cluster, jedoch auch einzelne Differenzen. Diese Unterschiede waren signifikant für emm6 und emm22, ebenso wie für Cluster M6. Weiterhin bestätigte unter anderen die Studie von d´Humieres et al. die Häufung von emm4 bei Scharlach-Patienten, was die Aussage der vorgelegten Ergebnisse unter-streicht. Weiterhin wurde zur Untersuchung der longitudinalen Entwicklung der emm-Typen und emm-Cluster die Verteilung des Zeitraumes vom 01.04.2006 und 31.03.2007 mit dem vom 01.05.2011 bis 30.04.2012 verglichen. Zumindest für den vergleichsweise kurzen zeitlichen Abstand konnten nach Adjustierung keine signifikanten Veränderungen der Epidemiologie hinsichtlich einzelner emm-Typen bzw. -Cluster beobachtet werden. In bisherigen Studien wurde die Pathogenität eines Stammes meist anhand des klinischen Erscheinungsbildes bestimmt. In dieser Studie wurde weiterführend untersucht, inwiefern sich einzelne emm-Typen bzw. emm-Cluster auch in quantitativ messbaren Parametern wie u.a. dem C-reaktiven Protein (CRP) sowie der Leukozytenzahl im Blut unterscheiden. Bei Patienten mit Tonsillopharyngitis zeigte sich lediglich Cluster E4 signifikant häufiger mit einem CRP-Wert über 35 mg/l assoziiert. Für die Leukozytenzahl war ein solcher Zusammenhang dagegen nicht nachweisbar. Da die verwendeten Analysen jedoch Störfaktoren unterlagen und ein Kausalzusammenhang zwischen der Pathogenität des Erregers und der Auslenkung der ge-nannten Parameter im Rahmen des Studiendesigns nicht bewiesen werden konnte, lassen diese Ergebnisse keine abschließende Beurteilung zu. Der bereits entwickelte 30-valente Impfstoff zeigte anhand der enthaltenen M-Antigene eine gute Übereinstimmung mit den in dieser Studie gefundenen emm-Typen. Dabei waren die Antigene von 19 der 25 in dieser Studie registrierten emm-Typen in dem Impfstoff enthalten, was jedoch unter Berücksichtigung der Kreuzreaktivitäts-Hypothese für emm-Cluster zu einem Deckungsgrad von 99,8% aller untersuchten Fälle (565 von 566) führt. Insgesamt erwies sich der unizentrische Charakter der hier vorgelegten Studie in gewisser Hinsicht als Vorteil gegenüber multizentrischen Studien, da hierdurch zu bestimmten Fragen Informationen ohne den Einfluss regionaler Besonderheiten ausgewertet werden konnten. Inwiefern regionale Prävalenzen einzelner emm-Typen oder deren Pathogenitätspotential ent-scheidend für die Epidemiologie insbesondere invasiver Infektionen sind, kann anhand dieser Studie nicht abschließend beurteilt werden. Zur näheren Untersuchung dieses Sachverhaltes wären weiterführende Studien in größerem Maßstab notwendig. Zusammenfassend wurde mit dieser Arbeit eine umfassende epidemiologische Untersuchung anhand der molekularepidemiologischen Erregeranalyse unter Einschluss klinischer Aspekte an einer großen pädiatrischen Kohorte durchgeführt. Die gewonnenen Erkenntnisse leisten einen Beitrag zur Aufklärung der regionalen wie auch internationalen Epidemiologie von GAS und bieten wichtige Grundlagen sowie Ansätze für nachfolgende Untersuchungen, insbesondere für die Impfstoffentwicklung gegen GAS.:1 Einleitung 7 2 Theoretische Grundlagen 8 2.1 Epidemiologie 8 2.2 Taxonomie 10 2.3 Infektionspathologie 11 2.4 Aufbau des M-Proteins 14 2.5 Die Bedeutung des M-Proteins 16 2.6 emm-Genetik 18 2.7 Therapie und Prophylaxe 20 3 Ziele der Studie 22 4 Patienten, Material und Methoden 23 4.1 Mikrobiologische Isolate und klinische Daten 23 4.1.1 „Klinische Krankheitsbilder“ 25 4.1.2 Modifizierter Centor-Score 26 4.1.3 Grunderkrankungen 27 4.1.4 Paraklinik 27 4.2 Geräte und Materialien 29 4.2.1 Geräte und Hilfsmittel 29 4.2.2 Verbrauchsmaterialien 30 4.2.3 Molekulare Diagnostiksysteme 31 4.2.4 Primer für PCR und Sequenzierung 31 4.2.5 Medien und Lösungen 31 4.3 Mikrobiologische Methoden 32 4.3.1 Mikrobiologische Proben 32 4.3.2 Kultur von GAS 32 4.3.3 Latex-Agglutinationstest auf Gruppe A Antigen 33 4.3.4 Kryokonservierung der Isolate 34 4.4 Molekulargenetische Methoden 35 4.4.1 DNA-Isolierung 35 4.4.2 Photometrische Bestimmung der DNS-Konzentration und Einstellung 36 4.4.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 37 4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 37 4.4.5 DNA Sequenzierung 39 4.4.6 Sequenz-basierte Typisierung 41 4.5 Statistische Auswertung 42 5 Ergebnisse 43 5.1 Ausgewertete mikrobiologische Proben und retrospektive Daten 43 5.2 Analyse der Kohorte 45 5.2.1 Analyse der Altersverteilung 45 5.2.2 Analyse der Geschlechtsverteilung 48 5.2.3 Analyse der saisonalen Verteilung 49 5.2.4 Analyse der klinischen Symptome 51 5.2.5 Analyse von Vorerkrankungen und Versorgungsform 55 5.3 Laborbefunde 58 5.3.1 Analyse der semiquantitativen Wachstumsdichte der Abstrich-Kulturen 58 5.3.2 Blutparameter: C-Reaktives Protein (CRP) 59 5.3.3 Blutparameter: Leukozytenzahl 59 5.4 Molekulare Epidemiologie des emm-Typs 60 5.5 Erstbeschreibung neuer emm-Subtypen 60 5.6 emm-Typ- bzw. Cluster-Verteilung und klinische Manifestation 61 5.6.1 emm-Verteilung bei Tonsillopharyngitis 61 5.6.2 emm-Verteilung bei akuter Otitis media (AOM) 63 5.6.3 emm-Verteilung bei Hautinfektionen 64 5.6.4 emm-Verteilung bei anogenitalen Infektionen 65 5.6.5 emm-Verteilung bei invasiven Infektionen 68 5.6.6 emm-Verteilung bei asymptomatischer Rachen-Kolonisierung 68 5.7 Analyse der Altersverteilung für emm-Typen und -Cluster 70 5.8 Infektionsparameter und Korrelation zur molekularen Epidemiologie 71 5.8.1 Temperatur: 71 5.8.2 CRP: 72 5.8.3 Leukozytenzahl: 73 5.9 Patienten mit wiederholten Vorstellungen 73 5.9.1 Antibiotische Therapie 75 5.10 Resistenzlage 76 5.11 Analyse der molekularen Epidemiologie über der Zeit 78 6 Diskussion 80 6.1 Vorbemerkung 80 6.2 Kohorte 81 6.2.1 Alter 81 6.2.2 Geschlecht 82 6.2.3 Jahreszeit 82 6.2.4 Vorerkrankungen 83 6.2.5 Klinische Symptome 84 6.2.6 Diagnostischer Wert der semiquantitativen Wachstumsdichte 85 6.2.7 Rezidive 85 6.3 emm-Typ und –Cluster-Epidemiologie 86 6.3.1 emm-Typen und -Cluster bei Tonsillopharyngitis 86 6.3.2 emm-Typen und –Cluster bei Anogenitalinfektionen 86 6.3.3 emm-Typen und -Cluster bei invasiven Infektionen 87 6.3.4 emm-Typ und -Cluster-Epidemiologie im Vergleich zu anderen Studien 87 6.3.5 Longitudinale Betrachtung der emm-Typ-Epidemiologie 91 6.3.6 Vergleich der emm-Typen und Cluster-hinsichtlich des Alters der Patienten 92 6.3.7 emm-Typen und -Cluster hinsichtlich Infektionsparametern 92 6.3.8 Deckungsgrad mit 30-valentem M-Protein-basiertem GAS-Impfstoff 95 6.3.9 emm-Typ / -Cluster – Antibiotika-Resistenz 96 6.4 Ausblick 97 7 Zusammenfassung 98 8 Summary 101 9 Anhang 104 10 Abbildungsverzeichnis 112 11 Tabellenverzeichnis 114 12 Abkürzungsverzeichnis 116 13 Literaturverzeichnis 118 14 Anlage 1 127 15 Anlage 2 129 16 Danksagung 131 / Although - since the introduction of penicillin - there has been an effective drug against strep-tococci of Lancefield Group A (GAS), in which no resistance has been described so far, GAS infections remain a major healthcare policy problem, which affects both morbidity and mortality of people worldwide. GAS can cause a wide range of disorders in humans. These include un-complicated pharyngeal infections with and without scarlet fever as well as skin infections such as erysipelas or impetigo but also invasive as well as secondary complications. In 1928, the M-protein encoded by the emm gene was described as a type-specific, antibody -inducing substance and has since been used to characterize the epidemiology of GAS. One of the main functions of the M protein, anchored on the surface of GAS, is to evade phagocytosis by polymorphonuclear leukocytes, which is one of the most important defense mechanisms against infections by GAS. Although major efforts have been made for several decades, a safe and effective vaccine remains an unreached goal. In this study, the regional epidemiology of infections of pediatric patients by GAS was retro-spectively investigated on the basis of data and isolates collected from 11.03.2006 to 19.05.2012 at the University Medical Center in Freiburg. With a total of 566 isolates and asso-ciated clinical data, the present study provides the largest uni-centric epidemiological study of pediatric diseases with emm-typing of GAS so far in Germany. Particular attention was paid to associations between molecular epidemiology, based on emm-typing, and anonymized clinical data. The total cohort included 566 cases, thereof 405 cases of pharyngeal infection, 75 of which were additionally diagnosed with scarlet fever, 34 children presented with a skin infection, 21 with an acute otitis media, 19 with an anogenital infection, eight with an invasive infection and two with an urinary tract infection. In 77 cases colonization by GAS was estimated as having no clinical relevance of those 48 isolates were isolated from pharyngeal swabs. In the molecular investigation, three new emm subtypes were discovered which were first de-scribed as emm29.13, emm36.7 as well as emm75.5. These sequences were entered into the database of the CDC. Over the entire cohort, emm12 was found in 19% of all cases and was thus the most frequent, followed by emm1 and emm4, with 14% each, emm28 and emm89, with 11% each. When considering emm-clusters, E4 was the most frequent with 31%, followed by cluster A-C4 with 19%, A-C3 and E1 with 14%. Among the 405 cases with GAS-related pharyngeal infection, emm12 was the most common with almost 20%, followed by emm4 with 15%, emm1 with 14%, emm89 with 13% and emm28 as well as emm3 with 9% each. With respect to the clus-ters, E4 was found to be the most common with around 30%, followed by A-C4 with 20%, E1 with 15% and A-C3 with 14%. In the present study it was shown that emm-types as well as emm-clusters differed depending on the clinical manifestation. Although the distributions were basically similar, emm4 as well as clusters A-C5 and E1 were significantly more common in patients with tonsillopharyngitis and scarlet fever, even after Bonferroni correction, than those with tonsillopharyngitis but without the diagnosis of scarlet fever. These findings were first described in a preliminary evaluation of this cohort in 2013 and supported by the results of consecutively published international stud-ies. In anogenital infections, cluster E4 was found in almost 80% and emm28 in 58%, indicat-ing a clearly narrowed spectrum. Compared to cases with tonsillopharygitis, emm28 and clus-ter E4 were significantly more frequently isolated in anogenital infections. For skin infections no significant difference could be found in the emm-distribution compared to tonsillopharyngi-tis. However, cluster E4 was found to be significantly more common in patients with a skin infection than in those with scarlet fever. Overall, in a direct comparison to a French study, there was a wide agreement regarding the epidemiology of emm-types and -clusters, but also some differences. These differences were significant for emm6, emm22, as well as for cluster M6. Furthermore, among others, the study by d´Humieres et al. confirmed the accumulation of emm4 in scarlet fever patients, which un-derlines the statement of the presented results. Furthermore, in order to investigate the longitudinal development of emm-types and emm-clusters, the distribution in the period from 01.04.2006 to 31.03.2007 was compared to that from 01.05.2011 to 30.04.2012. At least for the comparatively short period, no significant changes in the epidemiology of individual emm-types or -clusters could have been observed after adjusting the p-values. In previous studies, the pathogenicity of a strain was determined by its association to the clini-cal picture. In addition, this study investigated the extent to which individual emm-types or emm-clusters also differed in quantitatively measurable parameters such as the C-reactive protein (CRP) and the leukocyte count in the blood. In cases of tonsillopharyngitis, cluster E4 was found significantly associated with a CRP value above 35 mg/l. For the leukocyte count such a difference was not detectable. However, since the values were subject to confounding factors, a causal link between pathogenicity of certain emm-types and the deflection of the mentioned parameters could not be proved within the framework of this study. Therefore, these results do not allow to draw final conclusions. The existing 30-valent M-protein based vaccine would show a good agreement with the corre-sponding emm-types of the cohort used here. The antigens of 19 of the 25 different emm-types registered in this study were included in the vaccination model, which corresponds to a vaccine coverage of 99.8% (565 of 566) of all strains examined here, if cross-reactivity of GAS strains within an emm-cluster was taken into consideration. Overall, the uni-centric character of the study presented here provided in certain aspects an advantage over multi-centric studies, as differences and similarities between different clinical pictures, excluding regional differences as well as comprehensive clinical information on the cases, could be emphasized. The extent to which regional prevalence of individual emm-types or their pathogenicity potential are decisive for the epidemiology of invasive infections could not be conclusively assessed by this study. For a closer look at this issue, further studies on a larger scale would be necessary. In summary, this work presents a comprehensive epidemiological investigation on molecular epidemiologic pathogen analysis including clinical aspects in a large pediatric cohort. The find-ings contribute to the elucidation of the regional an international epidemiology of GAS and pro-vide important basics as well as approaches for subsequent investigations, especially for vac-cine development against GAS.:1 Einleitung 7 2 Theoretische Grundlagen 8 2.1 Epidemiologie 8 2.2 Taxonomie 10 2.3 Infektionspathologie 11 2.4 Aufbau des M-Proteins 14 2.5 Die Bedeutung des M-Proteins 16 2.6 emm-Genetik 18 2.7 Therapie und Prophylaxe 20 3 Ziele der Studie 22 4 Patienten, Material und Methoden 23 4.1 Mikrobiologische Isolate und klinische Daten 23 4.1.1 „Klinische Krankheitsbilder“ 25 4.1.2 Modifizierter Centor-Score 26 4.1.3 Grunderkrankungen 27 4.1.4 Paraklinik 27 4.2 Geräte und Materialien 29 4.2.1 Geräte und Hilfsmittel 29 4.2.2 Verbrauchsmaterialien 30 4.2.3 Molekulare Diagnostiksysteme 31 4.2.4 Primer für PCR und Sequenzierung 31 4.2.5 Medien und Lösungen 31 4.3 Mikrobiologische Methoden 32 4.3.1 Mikrobiologische Proben 32 4.3.2 Kultur von GAS 32 4.3.3 Latex-Agglutinationstest auf Gruppe A Antigen 33 4.3.4 Kryokonservierung der Isolate 34 4.4 Molekulargenetische Methoden 35 4.4.1 DNA-Isolierung 35 4.4.2 Photometrische Bestimmung der DNS-Konzentration und Einstellung 36 4.4.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 37 4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 37 4.4.5 DNA Sequenzierung 39 4.4.6 Sequenz-basierte Typisierung 41 4.5 Statistische Auswertung 42 5 Ergebnisse 43 5.1 Ausgewertete mikrobiologische Proben und retrospektive Daten 43 5.2 Analyse der Kohorte 45 5.2.1 Analyse der Altersverteilung 45 5.2.2 Analyse der Geschlechtsverteilung 48 5.2.3 Analyse der saisonalen Verteilung 49 5.2.4 Analyse der klinischen Symptome 51 5.2.5 Analyse von Vorerkrankungen und Versorgungsform 55 5.3 Laborbefunde 58 5.3.1 Analyse der semiquantitativen Wachstumsdichte der Abstrich-Kulturen 58 5.3.2 Blutparameter: C-Reaktives Protein (CRP) 59 5.3.3 Blutparameter: Leukozytenzahl 59 5.4 Molekulare Epidemiologie des emm-Typs 60 5.5 Erstbeschreibung neuer emm-Subtypen 60 5.6 emm-Typ- bzw. Cluster-Verteilung und klinische Manifestation 61 5.6.1 emm-Verteilung bei Tonsillopharyngitis 61 5.6.2 emm-Verteilung bei akuter Otitis media (AOM) 63 5.6.3 emm-Verteilung bei Hautinfektionen 64 5.6.4 emm-Verteilung bei anogenitalen Infektionen 65 5.6.5 emm-Verteilung bei invasiven Infektionen 68 5.6.6 emm-Verteilung bei asymptomatischer Rachen-Kolonisierung 68 5.7 Analyse der Altersverteilung für emm-Typen und -Cluster 70 5.8 Infektionsparameter und Korrelation zur molekularen Epidemiologie 71 5.8.1 Temperatur: 71 5.8.2 CRP: 72 5.8.3 Leukozytenzahl: 73 5.9 Patienten mit wiederholten Vorstellungen 73 5.9.1 Antibiotische Therapie 75 5.10 Resistenzlage 76 5.11 Analyse der molekularen Epidemiologie über der Zeit 78 6 Diskussion 80 6.1 Vorbemerkung 80 6.2 Kohorte 81 6.2.1 Alter 81 6.2.2 Geschlecht 82 6.2.3 Jahreszeit 82 6.2.4 Vorerkrankungen 83 6.2.5 Klinische Symptome 84 6.2.6 Diagnostischer Wert der semiquantitativen Wachstumsdichte 85 6.2.7 Rezidive 85 6.3 emm-Typ und –Cluster-Epidemiologie 86 6.3.1 emm-Typen und -Cluster bei Tonsillopharyngitis 86 6.3.2 emm-Typen und –Cluster bei Anogenitalinfektionen 86 6.3.3 emm-Typen und -Cluster bei invasiven Infektionen 87 6.3.4 emm-Typ und -Cluster-Epidemiologie im Vergleich zu anderen Studien 87 6.3.5 Longitudinale Betrachtung der emm-Typ-Epidemiologie 91 6.3.6 Vergleich der emm-Typen und Cluster-hinsichtlich des Alters der Patienten 92 6.3.7 emm-Typen und -Cluster hinsichtlich Infektionsparametern 92 6.3.8 Deckungsgrad mit 30-valentem M-Protein-basiertem GAS-Impfstoff 95 6.3.9 emm-Typ / -Cluster – Antibiotika-Resistenz 96 6.4 Ausblick 97 7 Zusammenfassung 98 8 Summary 101 9 Anhang 104 10 Abbildungsverzeichnis 112 11 Tabellenverzeichnis 114 12 Abkürzungsverzeichnis 116 13 Literaturverzeichnis 118 14 Anlage 1 127 15 Anlage 2 129 16 Danksagung 131

Einleitung: Das West Nil-Virus (WNV) und das Usutu-Virus (USUV) zirkulieren seit vielen Jahren in Europa und sind auch in Deutschland endemisch geworden. Beide Viren können schwere Erkrankungen in Vögeln auslösen. Zudem kann insbesondere WNV auch zu schweren neurologischen Erkrankungen bei Menschen und Pferden führen, und unentdeckte WNV-Infektionen sind ein Risiko für die Sicherheit von Blutspenden. WNV und USUV werden von Stechmücken als biologische Vektoren übertragen, wobei sich verschiedene Mückenspezies in ihrer Vektorkompetenz unterscheiden können. Die Kenntnis über die Vektorkompetenz von Mückenspezies ist essentiell für die effiziente Überwachung und Bekämpfung dieser Viren. Weitgehend unbekannt ist jedoch, welche Auswirkungen Ko-Infektionen mit WNV und USUV auf die Vektorkompetenz von Stechmücken haben. Ziele der Untersuchungen: Ziel der ersten Studie war es, die Vektorkompetenz der bislang wenig untersuchten Mückenspezies Aedes punctor für WNV zu bestimmen. Mit der zweiten Studie sollten Mono- und simultane Ko-Infektionen mit WNV und USUV in verschiedenen Stechmückenarten (Culex pipiens Biotyp pipiens, Culex pipiens Biotyp molestus, Aedes vexans) durchgeführt werden, um die Auswirkungen von Ko-Infektionen auf die Übertragung beider Viren zu bestimmen. Tiere, Material und Methoden: Die für die Versuche verwendeten Stechmücken wurden entweder in Deutschland gesammelt oder stammten aus den Laborkolonien am Friedrich-Loeffler-Institut. Die Infektionen erfolgten oral über Blut, welches ein oder beide Viren enthielt und über Wattestäbchen angeboten wurde. Blutgesogene Weibchen wurden über einen definierten Zeitraum unter definierten Umweltbedingungen inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die noch lebenden Tiere durch das Entfernen der Beine und Flügel immobilisiert, um die Gewinnung von Speichel zu ermöglichen. Ein Teil der Speichelprobe wurde auf eine Zellkultur gegeben, um infektiöse Viruspartikel nachzuweisen. Zur Bestimmung der Infektion, Dissemination und potenzieller Übertragung wurden die Körper, die Beine und Flügel, die Speichelproben sowie der Überstand der Zellkultur mit einer quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) auf virale RNA untersucht. Im Falle der Ko-Infektionsstudie wurden zeitgleich Mono-Infektionen durchgeführt und die Ergebnisse verglichen, um potenzielle Veränderungen in Empfänglichkeit oder Übertragung feststellen zu können. Ergebnisse: In der ersten Studie zeigte sich, dass Ae. punctor nicht vektorkompetent für WNV ist. Von insgesamt 155 untersuchten Weibchen waren nur 7 Tiere mit WNV infiziert. In den Speichelproben wurden weder infektiöse Viruspartikel noch virale RNA nachgewiesen. In der zweiten Studie konnte gezeigt werden, dass sowohl Cx. pipiens Biotyp pipiens als auch Cx. pipiens Biotyp molestus effektive Vektoren für WNV und USUV sein können. Im Gegensatz dazu waren Ae. vexans Weibchen nicht empfänglich für eine Infektion durch WNV oder USUV. In den Ko-Infektionen zeigte sich, dass die Empfänglichkeit für USUV in Cx. pipiens Biotyp pipiens verringert und in Ae. vexans erhöht war. In Cx. pipiens Biotyp molestus waren hingegen keine Unterschiede zwischen Mono- und Ko-infektionen festzustellen. Bei Cx. pipiens Biotyp molestus wurden infektiöse Partikel beider Viren in Speichelproben gefunden, was auf eine potenzielle Ko-Übertragung hindeutet. Schlussfolgerung: Aufgrund der Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass Ae. punctor und Ae. vexans derzeit keine Rolle bei der Übertragung von WNV oder USUV spielen und daher vorerst bei Überwachungsprogrammen in Deutschland nicht berücksichtigt werden müssen. Für Cx. pipiens Mücken konnte hingegen die Rolle als Hauptvektoren für WNV und USUV durch Infektionsstudien bestätigt werden. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen WNV und USUV in der Stechmücke speziesabhängig variiert. Aufgrund dessen ist eine Untersuchung von Ko-Infektionen in weiteren potenziellen Vektorspezies notwendig, um ein besseres Verständnis der Interaktionen zu bekommen. Die Studie zeigt auch, dass unter Umständen auch nicht vektorkompetente Spezies durch eine Ko-Infektion eine Rolle in der Übertragung der Viren spielen könnten. In Gebieten, in denen WNV und USUV sympatrisch zirkulieren, sollte diese Erkenntnis in den Überwachungs- und Bekämpfungsstrategien berücksichtigt werden. Eine potenzielle Ko-Übertragung beider Viren wurde zwar beobachtet, trat innerhalb dieser Studie aber selten auf und scheint daher eher eine geringe Rolle spielen. / Introduction: West Nile virus (WNV) and Usutu virus (USUV) have been circulating in Europe for many years and have also become endemic in Germany. Both viruses can cause severe diseases in birds. In addition, WNV in particular can also lead to severe neurological diseases in humans and horses, and undetected WNV infections pose a risk to the safety of blood donations. Both WNV and USUV are transmitted by mosquitoes as biological vectors, whereby different mosquito species can differ in their vector competence. Knowledge of the vector competence of various mosquito species is essential for efficient surveillance and control of these viruses. What is largely unknown, however, is the impact of co-infections with WNV and USUV on the vector competence of mosquitoes. Objective: The aim of the first study was to determine the vector competence of the mosquito species Aedes punctor for WNV, which has so far been little studied. The second study aimed to perform mono- and simultaneous co-infections with WNV and USUV in different mosquito species (Culex pipiens biotype pipiens, Culex pipiens biotype molestus, Aedes vexans) in order to determine the impact of co-infections on the transmission of both viruses. Animals, material and methods: The mosquitoes used for the experiments were either collected in Germany or were taken from the laboratory colonies at the Friedrich-Loeffler-Institute. Mosquitoes were orally infected via a blood that contained one or both viruses using cotton sticks. Engorged females were incubated over a defined period of time under defined environmental conditions. At the end of the incubation period, surviving animals were immobilized by removing the legs and wings, and saliva was obtained. Part of each saliva sample was placed on cell culture to detect infectious virus particles. To determine infection, dissemination and potential transmission, the bodies, legs and wings, saliva samples and supernatant of the cell culture were analyzed for viral RNA by a quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR). During the co-infection study, mono-infections were carried out at the same time as the co-infections and results were compared in order to be able to determine potential changes in susceptibility or transmission. Results: In the first study, Ae. punctor showed to be not susceptible for WNV. Of a total of 155 females examined, only 7 females were found infected. Neither infectious viral particles nor viral RNA was found in saliva samples. In the second study it could be shown that Cx. pipiens biotype pipiens as well as Cx. pipiens biotype molestus can be effective vectors for WNV and USUV. In contrast, Ae. vexans was not susceptible to an infection with WNV or USUV. In Co-infections, it was shown that the susceptibility to USUV was reduced in Cx. pipiens biotype pipiens and increased in Ae. vexans. In Cx. pipiens biotype molestus, however, no differences were found between mono- and co-infections. In Cx. pipiens biotype molestus mosquitoes, infectious particles of both viruses were found in saliva samples, indicating a potential co-transmission by this species. Conclusion: Based on the results, it can be assumed that Ae. punctor and Ae. vexans do not play a role in WNV and USUV transmission and therefore currently do not need to be included in a surveillance in Germany. In contrast, the role of Cx. pipiens mosquitoes as main vectors for WNV and USUV could be confirmed by infection studies. It could also be shown that the interaction between WNV and USUV in the mosquito vector varies and is species dependent. Therefore, an investigation of co-infections in various potential vector species and even different populations is essential to get a better understanding of the interactions between both viruses within the mosquito. The study also showed that, under certain circumstances, non-vector-competent species might also play a role in the transmission of the viruses in the event of a co-infection. Thus, in areas where WNV and USUV are both endemic, surveillance and control programs should take this knowledge into account. Potential co-transmission of both viruses was observed, but was rare in this study and therefore seems to play a rather minor role.

Background Oxygen is one of the most commonly used drugs by anesthesiologists. The World Health Organization (WHO) gave recommendations regarding perioperative oxygen administration, but the practice of oxygen use in anesthesia, critical emergency, and intensive care medicine remains unclear. Methods We conducted an online survey among members of the European Society of Anaesthesiology and Intensive Care (ESAIC). The questionnaire consisted of 46 queries appraising the perioperative period, emergency medicine and in the intensive care, knowledge about current recommendations by the WHO, oxygen toxicity, and devices for supplemental oxygen therapy. Results Seven hundred ninety-eight ESAIC members (2.1% of all ESAIC members) completed the survey. Most respondents were board-certified and worked in hospitals with > 500 beds. The majority affirmed that they do not use specific protocols for oxygen administration. WHO recommendations are unknown to 42% of respondents, known but not followed by 14%, and known and followed by 24% of them. Respondents prefer inspiratory oxygen fraction (FiO2) ≥80% during induction and emergence from anesthesia, but intraoperatively < 60% for maintenance, and higher FiO2 in patients with diseased than non-diseased lungs. Postoperative oxygen therapy is prescribed more commonly according to peripheral oxygen saturation (SpO2), but shortage of devices still limits monitoring. When monitoring is used, SpO2 ≤ 95% is often targeted. In critical emergency medicine, oxygen is used frequently in patients aged ≥80 years, or presenting with respiratory distress, chronic obstructive pulmonary disease, myocardial infarction, and stroke. In the intensive care unit, oxygen is mostly targeted at 96%, especially in patients with pulmonary diseases. Conclusions The current practice of perioperative oxygen therapy among respondents does not follow WHO recommendations or current evidence, and access to postoperative monitoring devices impairs the individualization of oxygen therapy. Further research and additional teaching about use of oxygen are necessary.

In der vorliegenden Arbeit wurde anhand der im Rahmen des Vermont-Oxford-Neonatal-Networks erhobenen Daten an der Berliner Klinik für Neonatologie der Charité Campus Mitte und der Abteilung für neonatologische Intensivmedizin der Universitätskinderklinik in Innsbruck ein Benchmarking-Projekt für die Jahre 1997 bis 2001 durchgeführt. Nach der Analyse des Outcomes wurde eine Analyse der externen Evidenz anhand von Literatursuche in PubMed und der Cochrane Datenbank für systematische Reviews durchgeführt. Danach wurde ein Fragebogen entworfen, der gezielt Handlungsstrategien und -richtlinien bezüglich der relevanten Outcome-Parameter erfragt. Für das Benchmarking-Projekt wurden das Atemnotsyndrom, die nekrotisierende Enterokolitis und die bakteriellen Infektionen ausgewählt. Die Analyse der Handlungsstrategien durch den Fragebogen zeigte, dass in den drei Bereichen respiratorische Interventionen, Nahrung und Ernährung sowie im Infektionsmanagement Unterschiede vorlagen. In der Diskussion zeigte sich, dass in vielen Bereichen noch Bedarf nach guter externer Evidenz und weiterer Forschung besteht. / This dissertation presents the results of a 1997 - 2001 benchmark project in co-operation with the "Berliner Klinik für Neonatologie der Charité Campus Mitte" and the "Abteilung für neonatologische Intensivmedizin der Universitätskinderklinik" in Innsbruck. The study is based on the Vermont-Oxford-Neonatal-Network''s data. After analysing the results, further evidence was analysed by way of literary research in PubMed and the Cochrane Database of Systematic Reviews. Afterwards, a questionnaire was created, lining out the clinical guidelines of the relevant outcome parameters. The respiratory distress syndrom, the necrotising enterocolitis and the bacterial infections were selected for the benchmark. The internal guidelines'' analysis showed that there were differences between the two clinics'' results in respiratory interventions, feeding and the management of infections. The discussion made clear that research based on further evidence is necessary in many fields.