O estresse oxidativo e a enzima NADPH oxidase-2 (NOX2) estão associados com a diminuição da massa funcional de células-β em pacientes com diabetes do tipo 2 (DT2). Neste estudo, testamos o papel da NOX2 sobre a glicotoxicidade em células-β. Ilhotas de camundongo C57BL/6J nocautes ou não para NOX2 (NOX2-KO e WT, respectivamente) foram isoladas e cultivadas por até 3 semanas em 10 ou 30 mmol/l de glucose (G10 e G30, respectivamente). A secreção de insulina foi maior nas ilhotas NOX2-KO vs. WT sem apresentar diferenças metabólicas ou do potencial redox da glutationa citosólica (EGSH). O cultivo de ilhotas em G30 aumenta a concentração de H2O2 e a oxidação de tióis no compartimento citosólico, seguido por aumento de apoptose de células-β, mas, preservando a reposta máxima secretória. Estas respostas foram quase idênticas em ambos os tipos de ilhotas. Em conclusão, a NOX2 regula negativamente a secreção de insulina em ilhotas de camundongos C57BL/6J, mas não é um componente crítico para a sobrevivência de células β em um modelo in vitro de glicotoxicidade. / Oxidative stress and NADPH oxidase-2 (NOX2) enzyme are associated to the decline of the functional β-cell mass in type 2 diabetes (T2D). Here, we tested the role of NOX2 on β-cell glucotoxicity. NOX2 knockout (NOX2 KO) and wild type (WT) C57BL/6J mice islets were isolated and cultured up to 3 weeks at 10 or 30 mmol/l glucose concentrations (G10 and G30, respectively). The insulin secretion was higher in NOX2-KO vs. WT islets despite similar metabolic and cytosolic glutathione-redox potential (EGSH) changes. The prolonged culture at G30 increases the H2O2 concentration and cytosolic thiol oxidation, followed by increased βcell apoptosis but preserving maximal secretory response. These responses were almost identical in both types of islets. In conclusion, NOX2 is a negative regulator of insulin secretion in C57BL/6J mouse islets, but is not a critical component for β-cell survival in a model of glucotoxicity in vitro.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:18:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5170.pdf: 1490860 bytes, checksum: e55ec88b5e46f4a697f05f0b01a4a9a5 (MD5) Previous issue date: 2013-04-24 / The literature presents many alternatives of physical training and frequently reiterates the use of animal models for studies on the effect of training, as the results in animals are similar to those in humans. There is also the possibility of evaluating variables such as volume and intensity. In addition, many studies have reported beneficial effects of estrogen as an important resource to minimize the deleterious effects of aging. As a means of understanding estrogen action and its influence on aerobic and anaerobic exercise, four experiments were carried out in this context. The first study was called The behavior of glycogen reserves in female rats denervated muscle, with different doses of estrogen and aimed at evaluating the estrogen action on the glycogenic profiles of denervated skeletal muscle.Methods: The animals were divided in 6 experimental groups (n=6): control (C), denervated for 15 days (D), denervated and treated with estrogen 20mg/weight/day (E20), denervated and treated with estrogen 40mg/weight/day (E40), denervated and treated with estrogen 80mg/weight/day (E80) and denervated and treated with estrogen 160mg/weight/day (E160). The treatment was realized by 15 days and the choice substance was estradiol cipionate. The following analyses were carried out: glycogen reserves in soleus (S), white (WG) and red gastrocnemius (RG), body and soleus weights. The statistical analysis included the Kolmogorov-Smirnov test, ANOVA and post-hoc Tukey test (p<0.05). Results: The denervation induced a reduction in glycogen content in the S, WG and RG muscles. The groups treated with estrogen we observed a progressive elevation in glycogen reserves concomitant with the elevation of dose and reinstate the glycogen reserves, but the dose that shows a better action is 160mg/weight/day were we observed the greatest quimiometabolic responses. Conclusions: These results suggest that estrogen may be an effective resource to minimize the metabolic compromising that follows the skeletal muscle atrophy induced by denervation. Subsequently, we conducted a study called Estrogen modulation of insulin secretion in isolated rat pancreatic islets , whose goal was to evaluate the sensitivity to glucose in pancreatic islets isolated from female rats treated with estradiol cypionate (160 mg/body weight/ 15 days) as well as its effect on concentration of protein kinase C and protein kinase A in isolated islets. For this purpose, islets were isolated from rats by the collagenase method to evaluate the secretory process in the presence of different concentrations of glucose. On the other hand, the concentration of the enzymes PKC and PKA was also performed by Western blotting. Statistical analysis was applied to normality test (Kolmogorov-Smirnov test) followed by Tukey test, p <0.05. The results showed that the group treated with estradiol cypionate had greater insulin secretion against the same concentration of glucose, and increase of concentration of PKA and PKC enzymes, compared to control. The results show insulinotropic properties of estrogen in synergy with glucose, which is the main insulin secretagogue, since the hormone did not alter the secretion at concentrations normoglycaemia. Possibly the focus of the secretagogue action of estrogen involves the activation of cytosolic enzyme pathways that determine the exudation of insulin. From these observations, we conducted the third study entitled "Electrocardiographic profile of aged rats trained and treated with estrogen , whose goal was to assess the eletrocardiographic profile of rats treated with the association of estrogen and physical activity. We used Wistar rats at 1 year of age, which were submitted to two programs of aerobic exercise (swimming 3 sessions weekly / 8 weeks) and anaerobic (climbing stairs of 80 cm, 3 sessions weekly / 8 weeks). We evaluated blood pressure and ECG intervals considering the QRS, QTc and PR. Data were compared by Student's t test followed by Tukey test, p <0.05. The findings of this study showed that the group treated with estrogen values were 21% lower compared to the control group. With respect to training, we observed that aerobic training promoted 25% reduction in FC, which reached 37.2% reduction in the presence of estrogen. In anaerobic training, we observed 28% reduction, which was accentuated to 40% when estrogen was present. Thus we conclude that treatment with estrogen alone or associated with physical activity was effective in maintaining and improving conditions in the metabolic and functional heart in the cardiac changes that accompany the aging process. Subsequently, we held the fourth paper entitled "Metabolic actions of estrogen in rats subjected to two types of physical training . The purpose of this study was to evaluate whether rats supplemented with estrogen show better responses to the aerobic and anaerobic physical activity. We used aged Wistar rats (13 months), placed under ideal conditions of bioterism and divided into experimental groups called Control and Treated with estrogen (E, 160&#956;g/100g), Aerobically and Anaerobically trained, and Treated with estrogen or not. Blood samples were collected for biochemical evaluation and samples of different muscles of the anterior and posterior were collected for glycogen content assessment by the phenol sulfuric method. The outcomes show that both estrogen and the different workout programs promoted increase in muscle glycogen reserves. Besides, the association of hormone with exercise promoted an additional effect with further enhances in energy conditions. Additionally, we found lower plasma free fatty acids and abdominal fat, and there was also an increase in total protein concentration indicating adjustments in metabolic homeostasis, an important condition to be preserved in the aging process. / A literatura científica apresenta diversas maneiras de treinamento físico e constantemente reitera que a utilização de modelos animais em estudos sobre o efeito do treinamento visto a possibilidade de avaliar variáveis como volume e intensidade, já que as respostas encontradas nos animais são similares às encontradas em humanos. Por outro lado, diversos estudos têm relatado efeitos benéficos do estrógeno como um recurso importante para minimizar os efeitos deletérios do envelhecimento. Nesse contexto, com o objetivo precípuo de compreender as ações estrogênicas e suas influências no exercício aeróbio e anaeróbio foram realizados 2 trabalhos. O primeiro trabalho intitulado Perfil eletrocardiográfico de ratas envelhecidas treinadas e tratadas com estrógeno , cujo objetivo foi avaliar o perfil eletrocardiográfico de ratas tratadas com a associação de estrógeno e atividade física. Foram utilizadas ratas wistar com 1 ano e meio de idade, as quais foram submetidas a dois programas de exercício físico aeróbio (natação 3 sessões semanais/8 semanas) e anaeróbio (escalada em escada de 80 cm, 3sessões semanais/8 semanas), incluindo um período de 2 semanas de adaptação para cada protocolo de treinamento. Foram avaliados a pressão arterial e o ECG considerando os intervalos QRS, QTc e PR. Os dados foram comparados através do teste T de student seguido do teste de Tukey, p<0,05. Os resultados desse estudo mostraram que o grupo tratado com estrógeno apresentou valores 21% menores se comparado ao controle. Com relação ao treinamento foi observado que o treinamento aeróbio promoveu redução 25% na FC, redução que atingiu 37,2% na presença do estrógeno. No treinamento anaeróbio foi observado redução de 28% sendo acentuado para 40% quando o estrógeno esteve presente. Dessa forma conclui-se que nas alterações cardíacas que acompanham o processo de envelhecimento, o tratamento com estrógeno isoladamente ou associado a prática de atividade física mostrou-se eficiente na manutenção bem como na melhora das condições metabólicas cardíacas. Seqüencialmente foi realizado o segundo trabalho intitulado Ações metabólicas do estrógeno em ratas submetidas a dois tipos de treinamento físico. A proposta deste estudo foi avaliar se ratas suplementadas com estrógeno apresentam melhores respostas frente à atividade física aeróbia e anaeróbia. Foram utilizadas ratas Wistar envelhecidas (1 ano e meio de idade) acondicionadas sob condições ideais de bioterismo e divididas em grupos experimentais denominados Controle e Tratadas com estrógeno (E,160&#956;g/100g), Treinado aeróbio e treinado anaeróbio tratados ou não com estrógeno. Foram coletadas amostras de sangue para avaliação bioquímica e amostras de diferentes músculos dos membros anteriores e posteriores para avaliação do conteúdo de glicogênio pelo método do fenol sulfúrico. Os resultados mostram que tanto o estrógeno quanto os diferentes treinamentos promoveram elevação nas reservas musculares de glicogênio, por outro lado, na associação do hormônio com o exercício físico, foi verificado um efeito aditivo que promoveu a melhora ainda mais expressiva nas condições energéticas. Associado a isto, foi verificado menores concentrações plasmáticas de ácidos graxos livres e gordura abdominal e ainda houve elevação na concentração de proteínas totais indicando ajustes na homeostasia metabólica, condição importante a ser preservada no processo de envelhecimento.

Orientadores: Everardo Magalhães Carneiro, Marcia Queiroz Latorraca / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:35:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Veloso_RobertoVilela_D.pdf: 1133010 bytes, checksum: ae2bb8d027240ebc20854087fa364a1b (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A restrição protéica materna reduz o crescimento e promove alterações permanentes na estrutura e função de órgãos da prole, contribuindo para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, obesidade e diabetes. O consumo de alimentos à base de soja está associado a um menor risco de desenvolver diabetes pelo seu conteúdo de isoflavonas e pela composição de aminoácidos de sua proteína que contribuem para uma melhora na secreção de insulina. Tem sido sugerido que a genisteína, uma isoflavona da soja, modula a secreção de insulina através das vias AMPc/PKA e PLC/PKC. Deste modo, nós avaliamos o valor biológico da dieta à base de farinha de soja e seus efeitos sobre o crescimento de órgãos, o perfil de aminoácidos, insulina e metabólitos séricos em ratos submetidos à restrição protéica na infância e recuperados com essa dieta após o desmame, bem como o efeito da dieta à base de soja sobre a secreção de insulina em resposta a glicose e a ativadores do adenilato ciclase e proteína quinase C, além da expressão da PKAa e PKCa em ilhotas pancreáticas de ratos adultos. Ratos de mães alimentadas com 17% ou 6% de proteína (caseína) durante a gestação e lactação foram mantidos com dieta contendo 17% de proteína à base de caseína (grupos CC e RC) ou dieta com 17% de proteína à base de farinha de soja (grupos CS e RS) e dieta com 6% de proteína (grupo HP). Após 90 dias de idade, proles de mães alimentadas com dieta hipoprotéica exibiram déficit permanente de peso corpóreo e de concentrações séricas de insulina, taurina, glutamina, fenilserina e lisina, porém apresentaram um aumento no peso relativo dos órgãos, exceto do fígado. A dieta à base de farinha de soja reduziu o peso relativo do fígado e aumentou as concentrações séricas de insulina, taurina, ornitina e fenilserina. Embora ratos recuperados com soja (RS) tenham ingerido mais dieta proporcionalmente ao peso corpóreo do que os ratos recuperados com caseína (RC) eles mostraram menor coeficiente de eficácia alimentar, e resultou em peso corpóreo final similar entre esses grupos. As concentrações séricas de albumina e proteínas totais não diferiram entre os grupos RS e RC. A dieta à base de soja melhorou a resposta de células beta de ratos controles em concentrações fisiológicas de glicose, enquanto em ilhotas de ratos recuperados isso ocorreu na presença de concentrações suprafisiológicas de glicose. A presença de PMA induziu uma resposta secretória com potência similar em ilhotas dos grupos RS e CS e a expressão de PKC foi similar em todos os grupos, exceto no grupo HP, que expressou menores concentrações dessa proteína. A adição de forskolin ao meio de incubação aumentou a secreção de insulina em ratos recuperados e naqueles mantidos com caseína e a expressão de PKAa foi maior no grupo RS em relação ao grupo CS. Esses resultados sugerem que dieta à base de farinha de soja é capaz de promover a recuperação nutricional em animais submetidos à restrição protéica em fases críticas de desenvolvimento, melhorando o perfil de aminoácidos séricos que estimulam a secreção de insulina. Além disso, a melhora na secreção de insulina parece não ser devido a ativação das vias AMPc/PKA e inositol fosfato/PKC / Abstract: Maternal protein restriction leads to reduction in the growth of organs, permanent changes in their structure and functions contributing to development of cardiovascular disease, obesity and diabetes. Consumption of soy-based foods is associated to lower risk of diabetes by its isoflavone content and amino acid composition of its protein that contribute to improve of insulin secretion. It has been suggested that genistein, soy isoflavone, modulates the insulin secretion through of cAMP/PKA and PLC/PKC pathways. Thus, we evaluated the biological value of soybean flour diet and its effects on organ growth, serum amino acids, insulin and metabolites profile in rats submitted to protein restriction in early life and recovered with those diet after weaning, as well as, the effect of soybean diet on insulin secretion in response to glucose and activators of adenylate cyclase and PKC, besides the expression of PKA and PKC in pancreatic islets from adult rats. Rats from mothers fed with 17% or 6% protein (casein) during pregnancy and lactation were maintained with 17% casein (CC and CR groups) or soybean (SC and SR groups) diet and with 6% casein (LP groups) diet. At 90d of age offspring of protein-restricted-mothers exhibited permanent deficit of body weight, serum insulin, taurine, glutamine, phenylserine and lysine concentrations, but increased relative organs¿ weight, except liver. Soybean flour diet reduced the relative liver weight and increased serum insulin, taurine, ornithine and phenylserine concentrations. Although SR rats had eaten proportionally to body weight more diet than CR rats they showed lower feed conversion efficiency which resulted in the final body weight similar between these groups. The SR and CR also exhibited similar serum albumin and protein concentrations. Soybean diet improved the response of ß-cells from control rats to a physiological concentration of glucose, whereas in islets from recovered rats this occurred in presence of a supra-physiological glucose concentration. PMA induced similar potent secretory response in islets from SR and SC groups and PKC expression was similar in all groups, except LP that expressed lower levels this protein. Forskolin increased the insulin secretion in recovered rats and in those maintained with casein diet and PKA expression was higher in SR than in SC rats. These results suggest that soybean flour diet is able to promote the nutritional recovery in animals submitted to protein restriction in critical phase of development improving serum amino acid levels that have the stimulatory effect on insulin release. Moreover the improve of insulin secretion seemed does not to be due the activation of the cAMP/PKA and inositol phosphate/PKC pathways / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carla Beatriz Collares-Buzato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T07:00:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos-Silva_JuniaCarolinaRebelo_M.pdf: 6726589 bytes, checksum: 09893d0d795475f8007b857273dde88e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As junções intercelulares são especializações da membrana plasmática através das quais células dentro de um tecido podem interagir e aderirem-se umas às outras. Nas ilhotas pancreáticas, as diferentes células endócrinas se interconectam por meio das junções de oclusão, comunicante, aderente e desmossomos. Tais contatos intercelulares parecem ser cruciais para o perfeito funcionamento deste órgão, porém, pouco se sabe sobre a função fisiopatológica e composição das junções intercelulares no pâncreas endócrino. O objetivo geral desta dissertação foi estudar a importância funcional da adesão e reconhecimento celular mediados pelas junções de oclusão (JO) e de adesão (JA) nos processos de maturação e disfunção da célula beta do pâncreas endócrino, ao longo do desenvolvimento do animal e na patogênese da diabetes tipo 2, respectivamente. Nossos dados mostram que as ilhotas de fetos e recém-nascidos de ratos Wistar, cuja resposta secretora de insulina à glicose é significativamente menor, apresentam uma morfologia menos organizada, caracterizada por um formato menos definido e uma associação mais freqüente com ductos, quando comparadas às ilhotas de jovens e adultos, que são responsivas à esse secretagogo. Na ausência de contato intercelular, quando as células das ilhotas de adultos foram dispersas, a resposta secretora de insulina foi completamente inibida, porém parcialmente restabelecida quando as células foram reagregadas. Quando comparado às ilhotas de adultos, o impacto da ausência de contatos intercelulares sobre a resposta secretora de insulina à glicose foi consideravelmente menor no caso das ilhotas de ratos recém-nascidos. A imunofluorescência para NCAM e pan-caderina revelou uma distribuição diferencial destas moléculas de adesão somente nas células das ilhotas pancreáticas de jovens e adultos, o que pode estar relacionada com a citoarquitetura típica (células beta, ocupando a região central e os outros tipos celulares na periferia da ilhota) adquirida no período pré-natal. Das proteínas associadas à JA e JO estudadas, ?- e ?-cateninas e ZO-1 (mas não a ocludina) foram expressas nas células endócrinas das ilhotas de todos os grupos experimentais. De forma geral, a imunofluorescência para tais proteínas revelou uma marcação intercelular menos definida nas células beta de ilhotas de recém-nascidos e fetos em comparação com os animais jovens e adultos. Isto pode indicar uma menor interação/adesão celular, que por sua vez, pode estar relacionada com a resposta secretora deficitária de insulina das ilhotas pancreáticas verificada na fase perinatal. Como modelo de diabetes do tipo 2, utilizamos camundongos C57, machos, alimentados com dieta hiperlipídica por 8 meses desde os 21 dias de idade. Após este período em dieta, os animais tornaram-se obesos e pré-diabéticos, apresentando moderada hiperglicemia e significativa hiperinsulinemia ao final desta dieta. Não observamos diferenças morfológicas marcantes entre os grupos e nem alterações significativas na distribuição intercelular da ZO-1, ?- e ?-cateninas nas ilhotas do grupo tratado em comparação ao grupo controle. Entretanto, verificou-se uma maior marcação intercelular para Ecaderina e uma maior associação de F-actina à membrana na região de contato intercelular nas células endócrinas das ilhotas do grupo pré-diabético em relação ao controle. Em conclusão, os contatos intercelulares mediados pelas proteínas associadas à JA e à JO parecem desempenhar um papel no processo de maturação do pâncreas do endócrino durante o desenvolvimento animal e na patogênese da diabetes do tipo 2 / Abstract: Intercellular junctions are specializations of the plasma membrane that allow cells within a tissue to interact and adhere to each other. In endocrine pancreas, the different endocrine cells are interconnected by tight, gap and adherens-type junctions. Such intercellular contacts seem to be crucial for the function of this organ, however, little is known about the pathophysiological role and biochemistry of intercellular junctions in the endocrine pancreas. The aim of this thesis was to study the importance of cell-cell recognition and adhesion mediated by proteins associated to tight and adherens junctions in pancreatic islets, with emphasis on the process of insulin secretion, along the animal development and in pathogenesis of type 2 diabetes. Pancreatic islets of foetuses (F) and newborn (N) Wistar rats, that display a relatively poor insulin secretory response to glucose, present an immature morphology and a less defined cytoarchitecture when compared to islets from young (Y) and adult (A) rats, that are responsive to glucose. The immunofluorescence for N-CAM and pan-cadherin, adhesion molecules that are important in cell segregation, revealed a differential distribution of these proteins only in cells of the islets from Y and A. A lower junctional content of ?-and ?-catenins and ZO-1 in islet cells was seen in F and N in comparison with Y and A. In addition, we found that in the absence of intercellular contact, the glucose-stimulated insulin secretion was completely blocked in A islets. In contrast, the impact of the disruption of cell-cell adhesion on insulin secretory response of N islets was relatively small. As a model of type 2 diabetes, we employed male C57 mice, fed on high-fat (HF) diet for 8 months since they were 21 days old. After HF diet, these mice became obese and pre-diabetic (displaying moderate hyperglycemia and marked hyperinsulinaemia). We did not observe marked differences either in morphology either in the intercellular distribution of ZO-1, ?- and ?-catenins in islets between the HF-treated and control groups. However, there was a stronger immunoreaction for Ecadherin at the cell-cell contact site and an increased association of F-actin to the plasma membrane of islet endocrine cells from pre-diabetic mice as compared to control ones. In conclusion, the intercellular contacts mediated by adherens and tight junction and their constitutive proteins seem to play a role in the developmental maturation of the endocrine pancreas and in the pathogenesis of type 2 diabetes / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:23:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trevisan_Amon_M.pdf: 3520740 bytes, checksum: 90ddd0dc662586a0279a2c1e1f000b3b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os canais de cálcio voltagem-dependentes (CaV) são proteínas de membrana plasmática que conduzem cálcio, e são ativados pela despolarização da mesma promovendo influxo do íon, que serve como um segundo mensageiro intracelular, transformando sinais elétricos em químicos. Esse processo controla diversos eventos intracelulares, como exocitose, endocitose, contração muscular, transmissão sináptica e metabolismo. Em células beta (B), a secreção de insulina estimulada por glicose e/ou leucina ocorre por diversos sinais que levam à despolarização da membrana e influxo de cálcio, que age no processo de acoplamento estímulo/secreção dos grânulos contendo insulina. É possível a existência de efeitos sinérgicos entre o metabolismo da leucina e glicose, permitindo um controle fino da expressão gênica, produção e secreção de insulina em células B. Recentemente demonstramos que animais que sofreram um processo de restrição protéica modificam o mecanismo de secreção de insulina alterando a resposta secretória para diferentes secretagogos (glicose, aminoácidos, etc.). Nesse trabalho, buscamos elucidar o envolvimento dos íons cálcio nos processos de secreção de insulina, bem como avaliar a expressão gênica e protéica das subunidades alfa1 e beta2 do canal nos diferentes grupos estudados. Observamos uma redução na expressão gênica das duas subunidades do CaV em ilhotas de animais desnutridos e uma tendência de recuperação na expressão protéica da subunidade ?1 em animais desnutridos suplementados com leucina. As áreas abaixo das curvas (AUC) de cálcio das ilhotas não apresentaram diferença entre os grupos quando estimulados com alta (16,7 mM) glicose e 40 mM de K+, porém, há um aumento na área abaixo da curva quando estimuladas com tolbutamida no grupo desnutrido suplementado com leucina (LPL). As secreções de insulina frente a inibidores de canal de cálcio apresentaram resultados similares frente a alta glicose e tolbutamida, porém apresentando valores absolutos menores. Ilhotas provenientes de animais LPL apresentaram recuperação da taxa de liberação de insulina quando estimuladas com ácido ketoisocapróico, atingindo valores similares aos controles. Essa recuperação não foi observada quando estimulamos as ilhotas com cloreto de potássio. Observamos também uma redução na área das ilhotas de animais desnutridos, com recuperação a valores equivalentes aos controles quando há suplementação com leucina. Nossos dados sugerem que o manejo dos íons cálcio possa não estar diretamente envolvido na melhora da secreção de insulina por ilhotas de animais desnutridos suplementados com leucina, mesmo havendo uma melhora na expressão protéica da subunidade alpha1 do Cav em ilhotas de animais LPL, através de uma possível modulação pós-transcricional. / Abstract: Voltage-dependent calcium channels (CaV) are plasma membrane proteins that lead calcium, and are activated by depolarization of the same by promoting the influx of this ion, which serves as an intracellular second messenger, turning electrical signals into chemical. This process controls several intracellular events such as exocytosis, endocytosis, muscle contraction, synaptic transmission and metabolism. In beta cells (B), insulin secretion stimulated by glucose and/or leucine occurs by several signs that lead to membrane depolarization and calcium influx, which acts on the coupling process stimulus/secretion of granules containing insulin. It is possible that there are synergistic effects between the metabolism of glucose and leucine, allowing fine control of gene expression, production and insulin secretion in B cells. We have shown that animals which have undergone a process of protein restriction alter the mechanism of insulin secretion by altering the secretory response to different secretagogues (glucose, amino acids, etc.). In this paper we elucidate the involvement of calcium ions in the process of insulin secretion, as well assess the gene and protein expression of alpha1 and beta2 subunits of the channel in different groups. Observed a decrease in gene expression of two subunits of CaV in islets of malnourished animals and a recovery trend in protein expression of ?1 subunit in malnourished animals supplemented with leucine. The areas under the curve (AUC) for calcium of islets did not differ between groups when stimulated with high (16.7 mM) glucose and 40 mM K +, however, there is an increase in area under the curve when stimulated with tolbutamide in undernourished group supplemented with leucine (LPL). The secretions of insulin compared to calcium channel inhibitors showed similar results compared to high glucose and tolbutadima, although a smaller absolute values. Islets from LPL animals showed recovery of the rate of insulin release when stimulated with ketoisocaproic acid (KIC), reaching values similar to controls. This recovery was not observed when we stimulate the islets with potassium chloride. We also observed a reduction in the area of the islets of malnourished animals, with recovery to similar values for controls when supplementation with leucine. Our data suggest that the management of calcium ions can not be directly involved the improvement of insulin secretion by islets of malnourished animals supplemented with leucine, even with an improvement in protein expression of the alpha1 subunit of the Cav in islets of animals LPL, through a possible post-transcriptional modulation. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Kleber Luiz de Araujo e Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:13:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roma_LeticiaPrates_D.pdf: 1071638 bytes, checksum: 52777a4c39261ec7137298200cb2b319 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo:Introdução/Objetivos. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) faz parte de diversos processos fisiológicos. Nos últimos anos, o aumento de EROs têm sido associado ao desenvolvimento de diversas doenças, dentre elas o Diabetes Mellitus Tipo 2. As células beta pancreáticas são notadamente mais suscetíveis ao estresse oxidativo devido a sua baixa capacidade antioxidativa, resultado da menor expressão e atividade de enzimas antioxidantes como superóxido dismutase e peroxidases. A dexametasona, um glicocorticóide sintético, tem efeitos diabetogênicos e citotóxicos em células produtoras de insulina e ilhotas pancreáticas. Entretanto, os mecanismos pelos quais a dexametasona atua sobre as células-alvo não estão bem esclarecidos. Dessa forma, nosso objetivo foi analisar se a dexametasona induz estresse oxidativo em células produtoras de insulina RINm5F e ilhotas pancreáticas. Utilizamos três modelos: 1) células RINm5F controle, que são extremamente sensíveis ao estresse oxidativo; 2) células RINm5F superexpressando a enzima catalase (RINm5F.Cat), que são resistente ao estresse oxidativo e 3) ilhotas de ratos adultos cultivadas por 72 h com dexametasona (Dexa) e ilhotas tratadas concomitantemente com dexametasona e o antioxidante N-acetilcisteína (Dexa+NAC). Resultados: Aumento na produção de EROs foi observado em células RINm5F tratadas com dexametasona. O tratamento com dexametasona aumentou a atividade/clivagem da caspase-3 e apoptose em células RINm5F após 3 dias de cultura. Expressão protéica e atividade de Cu/ZnSOD estava aumentada após o tratamento com dexametasona, enquanto que a expressão/atividade de MnSOD não foi modulada pelo corticóide. A superexpressão da catalase em linhagens de célula beta previniu todos os efeitos citotóxicos da dexametasona, inclusive a morte celular. Elevados níveis de Cu/ZnSOD podem favorecer o aumento na geração de EROs e conseqüentemente, apoptose. Da mesma forma, ilhotas tratadas com dexametasona apresentaramaumento na produção de EROs, efeito que foi revertido quando as ilhotas foram tratadas concomitantemente com dexametasona e NAC. Redução na secreção de insulina estimulada por glicose foi observada em ilhotas cultivadas com dexametasona. O tratamento com dexametasona e NAC restaurou a secreção de insulina a níveis próximos aos controles. Uma menor produção deNAD(P)H no grupo Dexa foi observado, sendo que o grupo Dexa+NAC mostrou níveis semelhantes ao grupo controle. Não ocorreram diferenças nas concentrações intracelulares de cálcio estimulado por glicose em nenhum dos grupos. A dexametasona reduziu a expressão gênica da sinaptotagmina VII, enquanto no grupo Dexa+NAC houve um aumento da expressão desse gene em ilhotas pancreáticas. Interessantemente, o tratamento com NAC diminuiu a expressão gênica da Cu/ZnSOD. Conclusões: Nossos resultados indicam que as ações da dexametasona em células produtoras de insulina e ilhotas pancreáticas são mediadas através do aumento do estresse oxidativo, sendo a Cu/ZnSOD importante nesse processo. A superexpressão da catalase e o uso do antioxidante n-acetilcisteína previnem contra os efeitos citotóxicos do glicocorticóide. / Abstract: Introduction/Aims: Reactive oxygen species (ROS) play a dual role on living organisms, being involved in many physiological processes and also being linked to the development of several pathologies, including the type 2 diabetes mellitus. Pancreatic beta cells are very sensitive to oxidative stress because of their low antioxidant capacity, wich results from their low expression and activity of antioxidant enzymes, especially peroxidases. Dexamethasone is a synthetic diabetogenic glucocorticoid that induces cytotoxic effects on pancreatic beta cells. However, the precise mechanisms of dexamethasone toxicity on target cells are not fully understood. The aim of the present study was to analyzed whether dexamethasone induces oxidative stress in insulinproducing cells and pancreatic islets. Experimental design: The experiments were performed using 3 models: 1) RINm5F control cells, extremely sensitive to oxidative stress; 2) RINm5F cells overexpressing the enzyme catalase (RINm5F.Cat), very resistant to oxidative stress and 3) rat pancreatic islets cultured for 72 h with dexamethasone (Dexa) or cultured concomitantly with dexamethasone and the antioxidant N-acetylcysteine (Dexa+NAC). Results: An increased generation of reative oxygen species (ROS) was observed in dexamethasone-treated insulinproducing cells together with an increase in caspase-3 activity and apoptosis rate. Interestingly, exposure to dexamethasone increased the cytosolic superoxide dismutase Cu/ZnSOD protein expression and activity, while the mitochondrial MnSOD isoform was not affected by the glucocorticoid. Overexpression of catalase in insulin-producing cells prevented all the cytotoxic effects of dexamethasone. Pancreatic islets cultured in the presence of dexamethasone (Dexa) for 72 h showed increased ROS production. Glucose-stimulated insulin secretion was decreased after Dexa treatment. Intracellular ROS levels were decreased and the insulin secretion capacitywas recovered by concomitant treatment with Dexa+NAC. The total insulin content and intracellular Ca+2 levels were not modulated in either Dexa or Dexa+NAC groups. There was a decrease in the NAD(P)H production rate, used as an indicator of viability, after dexamethasone treatment. Concomitant incubation with NAC returned viability to control levels. Dexamethasone also decreased SYT VII gene expression; in contrast, the Dexa+NAC group showed increased expression of SYT VII compared to controls. Surprisingly, treatment with NAC decreased the gene expression of the antioxidant enzyme, Cu/ZnSOD. Conclusions: The cytotoxic effects of dexamethasone in RINm5F insulin-producing cells and pancreatic islets are primarily ROS-mediated. High levels of expression and activity of the Cu/ZnSOD might favour the generation of ROS. The overexpression of catalase and the use of the antioxidant Nacetylcysteine counteract the cytotoxic effects of dexamethasone. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:31:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_CarolinaPradodeFranca_D.pdf: 11012408 bytes, checksum: 13da099b8bd43a93f7783c961a08d48f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O objetivo central dessa tese foi estudar o papel das junções comunicantes (GJs) no processo de maturação da célula B e na patogênese da diabetes tipo 2. Para isso, foram utilizados dois modelos animais. No modelo in vivo de maturação da célula B e do processo secretório de insulina foram empregados ratos em vários estágios do desenvolvimento (fetal, neonatal, jovem e adulto). No modelo de diabetes tipo 2 foram utilizados camundongos C57BL/6, wild-type e knockout para o gene do receptor de LDL (LDLR -/-), alimentados com dieta hiperlipídica. No primeiro modelo de estudo, observamos, por técnicas morfológicas (imunocitoquímica) e de biologia molecular (Western Blot, RT-PCR semi-quantitativo e qPCR) que a expressão gênica e protéica de Cx36 e Cx43, se altera durante o desenvolvimento. Os dados de microinjeção intracelular de traçadores confirmam tais resultados que sugerem que ilhotas de ratos recém-nascidos apresentam menor número de canais intercelulares associados à membrana e, conseqüentemente, um menor acoplamento intercelular mediado pelas junções comunicantes em comparação às ilhotas de adultos. Esses resultados estão de acordo com a observação de que a célula B durante o período perinatal mostra uma menor resposta secretória à glicose e sugerem a participação da comunicação intercelular mediada pelas junções comunicantes no processo de maturação da célula B. No caso do modelo in vivo de diabetes tipo 2, o estudo iniciou com a caracterização do quadro metabólico e de aspectos da morfologia e morfometria do pâncreas endócrino de animais submetidos ao tratamento com a dieta hiperlipídica. Os dados obtidos demonstram que os animais submetidos a essa dieta por um curto período de tempo já apresentam alterações metabólicas típicas da fase inicial da diabetes (hiperglicemia moderada, hiperinsulinemia, intolerância á glicose e resistência à insulina), bem como modificações de parâmetros da morfometria do pâncreas endócrino. Posteriormente, foi analisada a expressão e localização celular das proteínas juncionais (Cx36, Cx43 e ZO-1) e o aspecto funcional dos canais formados pela GJ, através da microinjeção de marcadores intracelulares. Observamos que os animais tratados com dieta hiperlipídica apresentam tendência de diminuição de expressão de Cx36 acompanhada por alteração no padrão de marcação para essa proteína. Esses dados estão de acordo os de microinjeção que revelam uma pequena diminuição do grau de acoplamento celular após o tratamento com a dieta hiperlipídica. As alterações observadas para Cx36 foram acompanhadas por modificações no grau de expressão e de localização celular de ZO-1, proteína envolvida em processos como a organização dos canais intercelulares da GJ na membrana e no turnover de vários subtipos de conexina. Esses resultados indicam que a comunicação intercelular, particularmente a mediada por canais formados pela Cx36 parecem desempenhar importante papel na patogênese da diabetes tipo 2, desde sua fase inicial. / Abstract: Intercellular communication and adhesion among pancreatic B-cells are crucial for a proper insulin biosynthesis and secretion. The aim of this work was to investigate the role of gap junction (GJ) mediated-intercellular communication in the processes of maturation and dysfunction of B-cells. It is well known that fetal and neonatal rat pancreatic B-cells exhibit a reduced insulin secretory response to glucose and to other secretagogues as compared to adult ones. Based on this finding, we have used Wistar rats at different stages of development (fetal, neonatal, young and adult) as a model of B-cell maturation. As a model of type 2 diabetes, C57BL/6 mice (wild-type) and LDL receptor-deficient mice were fed a high fat diet up to 60 days. The cellular expression of GJ connexin (Cx) subtypes found in the endocrine pancreas (Cx36, Cx43 and Cx45) was assessed by immunohistochemistry, Western Blot, quantitative and semi-quantitative RTPCR. Our results indicate that young and adult endocrine pancreas express relatively high levels of Cx36 on B-cells in comparison with the other groups. Meanwhile, fetal and neonatal islets express predominantly Cx43 on non B-cells located at the islet periphery. Islet microinjection of GJ tracers revealed that neonatal B-cells display lower intercellular exchange of the cationic molecule Ethidium Bromide (EB) in comparison with the adult ones, which is in accordance with their differences in Cx36 expression. No significant differences were found in expression and localization of Cx45 among all animal groups. Regarding the animal type 2 diabetic model, a metabolic characterization showed that the high-fat diet for 60 days induces glucose intolerance, insulin resistance, hyperinsulinemia and moderate hyperglycemia in both mice groups (LDLr knockout and wild-type groups). High-fat fed mice showed a subtle decrease in Cx36 islet expression and in the B-cell intercellular exchange of EB in comparison with the chow-fed group (control). We also observed an alteration in the pattern of Cx36 labeling in immunohistochemistry assays. The high-fat diet induced a redistribution of Cx36 within the islets from a disorganized pattern (more commonly seen in control mice) to a sub domain-pattern where Cx36 plaques demarcate groups of B-cells. These changes in Cx36 islet distribution observed in high-fat fed mice were accompanied by a similar pattern of immunolabeling for ZO-1, but an increase in its islet expression, a tight junctional protein that seem to be involved in Cx turnover and membrane organization of Cx-made channels. Taken all together, these findings suggest that cell-cell coupling mediated by GJ may play an important role in the pancreatic B-cell maturation observed during endocrine pancreas development as well as in the early stages of type 2 diabetes pathogenesis. / Doutorado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A Arginina (Arg) regula a secreção de GH e insulina, e é o único precursor biológico do NO. Previamente demonstramos que animais tratados cronicamente com Arg (35mg/dia) desenvolvem resistência à insulina (RI), e o presente estudo investigou as suas bases moleculares. A RI baseou-se na redução da atividade e/ou expressão do IRS 1/2 e Akt, e do conteúdo de GLUT4; sendo o GH crucial na gênese desses efeitos. Doses mais elevadas de Arg (70mg/dia/30 dias), a maior geração de NO e a melhora do fluxo sangüíneo reverteram este quadro. Experimentos com células musculares demonstraram que a Arg estimula o metabolismo de glicose e lipídios, via NO/c-GMP. Esses achados indicam que a Arg pode ser benéfica para o tratamento de distúrbios metabólicos, como obesidade e DM2; e que ao estimular a secreção de GH, em doses adequadas, seria eficaz na terapia de distúrbios da secreção deste hormônio. Todavia, estudos adicionais são necessários para investigar a melhor dose e os efeitos crônicos in vivo da Arg, uma vez que o GH em excesso apresenta um efeito diabetogênico importante. / Arginine (Arg) regulates the secretion of GH and insulin, and it is the main biological precursor of NO. We have previously shown that animals chronically-treated with Arg (35 mg/day) developed insulin resistance (IR), and this study investigated its molecular basis. The RI relies on the reduction of the activity and/or expression of IRS 1/2 and Akt, and of the GLUT4 content; and GH has a crucial role in the genesis of these effects. Higher doses of Arg (70 mg/dia/30 days), the increased NO generation and the improvement of the blood flow reversed the RI. Experiments with muscle cells showed that Arg stimulates glucose and lipids metabolism, via NO/c-GMP activation. These findings indicate that Arg may be beneficial for the treatment of metabolic disorders, such as obesity and T2DM, and by stimulating GH secretion, Arg can, in appropriate doses, be effective for the therapy of GH secretion disorders. However, further studies are needed to investigate the best dose and the chronic effects of Arg in vivo, since that GH in excess is potentially diabetogenic.

Neste projeto, demonstramos a modulação da enzima NAD(P)H oxidase pela glicose, palmitato e interleucina - 1? através da análise da expressão protéica do componente p47PHOX e pela atividade dessa enzima via produção de superóxido e peróxido de hidrogênio. Demonstramos também a participação da enzima NAD(P)H oxidase no processo de secreção de insulina induzido pela glicose pois a inibição da enzima pelo DPI e oligonucleotídeo anti p47PHOX promoveu uma diminuição da secreção do hormônio. A partir desse dado passamos a avaliar o mecanismo de ação da enzima no processo secretório e demonstramos que a inibição dessa enzima promove uma inibição de genes essenciais no processo de secreção de insulina como GLUT-2 e glicocinase.Assim podemos concluir que a enzima NAD(P)H oxidase é modulada pela glicose, palmitato e interleucina 1? e que essa enzima participa do processo de secreção insulina modulando genes essenciais para o processo secretório como GLUT-2 e glicocinase. / The expression and activity of the componenents of NAD(P)H oxidase in pancreatic islets were described for the first time in our laboratory (OLIVEIRA, HR et ai, 2003). It was shown the gene and protein expression of the components of this enzyme in Seta cells and that enzyme activation is mediated by glucose. Glucose induced insulin secretion was followed by increase in EROS generation and this increase was in part mediated by NAD(P)H oxidase activation (the same mechanism observed in phagocytes). In this study, the modulation of NAD(P)H oxidase activity by glucose, palmitate and interleukin 1ß as investigated through protein expression of p47phox vity of this enzyme through superoxide and hydrogen peroxide production. To determinate the role of NAD(P)H oxidase in the process of glucoseinduced insulin secretion the enzyme was inhibited by DPI and oligonucleotide anti p47phox, in the both cases the enzyme inhibition produced a decrease on insulin secretion. In order to investigated NAD(P)H oxidase mechanism of action in insulin secretion, we shown that the inhibition enzyme by DPI reduced the GLUT-2 and glucokinase gene expression. We can concluded hat NAD(P)H oxidase was modulated by glucose, palmitate and interleukin 1ß and that enzyme participed in process of glucoseinduced insulin secretion through modulation of GLUT-2 and glucokinase gene expression.

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Luiz Fernando de Rezende / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:18:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_GustavoJorge_D.pdf: 3129731 bytes, checksum: b00bd77f6b06be14f135a76b6977ca47 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: A Cálcio-Calmodulina quinase II (CaMKII) atua tanto na regulação da secreção de insulina com de neurotransmissores pela mesma via de sinalização. Além disso, a CaMKII é conhecida por ser a "molécula da memória", pois sua atividade é fundamental em sua formação. Portanto, hipotetizamos que células ß pancreática tem a capacidade de adquirir e estocar informações contidas em pulsos de cálcio, formando uma memória metabólica. Métodos: Para comprovar nossa hipótese, desenvolvemos um novo paradigma de exposição de células ? a pulsos de 30 mM de glicose, seguido de uma período de consolidação (24 hrs) para excluir qualquer efeito agudo do metabolismo da glicose. Após esse período analizamos a secreção de insulina (RIA), expressão proteica (Western blot), a resposta secretória frente a uma "rampa de glicose" e o Ca2+ citoplasmático induzido por glicose. Resultados: Células ß expostas a pulsos de glicose (30 mM) mostraram maior secreção de insulina estimulada por glucose, evidenciando a memória metabólica a qual foi totalmente dependente a CaMKII. Esse fenômeno foi refletido na expressão proteica de proteínas importantes na sinalização do cálcio e na secreção de insulina. Além disso, células expostas ao regime de pulsos de glucose apresentaram maior expressão do MAFA, um fator de transcrição chave para a função da célula ß. Conclusão: Em suma, assim como neurônios, células ß tumorais (MIN6), ilhotas de camundongos e de humanos são capazes de adquirir, estocar e evocar informações / Abstract: Backgroun: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) functions both in regulation of insulin secretion and neurotransmitter release through common downstream mediators. Memory is the ability to acquire, to store and to evocate any kind of information. In CNS, the process behind this phenomenon in the Long-Term Potentiation (LTP) and is known that it requires Ca2+ to occur. In additional, CaMKII is necessary to store information during LTP. In pancreatic ß-cells, CaMKII plays pivotal role during GSIS process. Therefore, we hypothesized that pancreatic ß-cells acquire and store the information contained in Ca2+ pulses as a form of "metabolic memory", just as neurons store cognitive information. Methods: To test this hypothesis, we developed a novel paradigm of pulsed exposure of mice and human ß-cells to intervals of high glucose, followed by a 24-hour consolidation period to eliminate any acute metabolic effects. After this period, we analyzed insulin secretion (by RIA), protein expression (by Western blot), response to a glucose-ramp and the glucose-induced Ca2+ influx. Results: Strikingly, ß-cells exposed to this high-glucose pulse paradigm exhibited significantly stronger insulin secretion. This metabolic memory was entirely dependent on CaMKII. We also observed, in pulse group, an increase in Ca2+ influx induced by glucose. In additional, metabolic memory was reflected on the protein level by increased expression of proteins involved in GSIS and Ca2+-dependent vesicle secretion, such as GCK, Cav1.2, SNAP25, pCaMKII and pSynapsin. Finally, we observed in human islet elevated levels of the key ß cell transcription factor MAFA. Discussion: Based on or findings we conclude that pancreatic ß cells, either from mice or humans, have the ability to acquire, store and retrieve information. This process is CaMKII-dependent and is due to modifications in the glucose-sensing machinery of the cell, since we observed an increase in GSIS and Ca2+ influx together with an increase in several proteins involved in this process. Our findings suggests that MAFA is the key effector in this memory, since (a) it is a potent activator of insulin gene, (b)is activated by CaMKII and (c) its expression is increased even 24 hours after the last pulse. Conclusion: In summary, like neurons, human and mouse ß-cells are able to acquire and retrieve information / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular