Orientador: Carla Beatriz Collares-Buzato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T07:00:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos-Silva_JuniaCarolinaRebelo_M.pdf: 6726589 bytes, checksum: 09893d0d795475f8007b857273dde88e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As junções intercelulares são especializações da membrana plasmática através das quais células dentro de um tecido podem interagir e aderirem-se umas às outras. Nas ilhotas pancreáticas, as diferentes células endócrinas se interconectam por meio das junções de oclusão, comunicante, aderente e desmossomos. Tais contatos intercelulares parecem ser cruciais para o perfeito funcionamento deste órgão, porém, pouco se sabe sobre a função fisiopatológica e composição das junções intercelulares no pâncreas endócrino. O objetivo geral desta dissertação foi estudar a importância funcional da adesão e reconhecimento celular mediados pelas junções de oclusão (JO) e de adesão (JA) nos processos de maturação e disfunção da célula beta do pâncreas endócrino, ao longo do desenvolvimento do animal e na patogênese da diabetes tipo 2, respectivamente. Nossos dados mostram que as ilhotas de fetos e recém-nascidos de ratos Wistar, cuja resposta secretora de insulina à glicose é significativamente menor, apresentam uma morfologia menos organizada, caracterizada por um formato menos definido e uma associação mais freqüente com ductos, quando comparadas às ilhotas de jovens e adultos, que são responsivas à esse secretagogo. Na ausência de contato intercelular, quando as células das ilhotas de adultos foram dispersas, a resposta secretora de insulina foi completamente inibida, porém parcialmente restabelecida quando as células foram reagregadas. Quando comparado às ilhotas de adultos, o impacto da ausência de contatos intercelulares sobre a resposta secretora de insulina à glicose foi consideravelmente menor no caso das ilhotas de ratos recém-nascidos. A imunofluorescência para NCAM e pan-caderina revelou uma distribuição diferencial destas moléculas de adesão somente nas células das ilhotas pancreáticas de jovens e adultos, o que pode estar relacionada com a citoarquitetura típica (células beta, ocupando a região central e os outros tipos celulares na periferia da ilhota) adquirida no período pré-natal. Das proteínas associadas à JA e JO estudadas, ?- e ?-cateninas e ZO-1 (mas não a ocludina) foram expressas nas células endócrinas das ilhotas de todos os grupos experimentais. De forma geral, a imunofluorescência para tais proteínas revelou uma marcação intercelular menos definida nas células beta de ilhotas de recém-nascidos e fetos em comparação com os animais jovens e adultos. Isto pode indicar uma menor interação/adesão celular, que por sua vez, pode estar relacionada com a resposta secretora deficitária de insulina das ilhotas pancreáticas verificada na fase perinatal. Como modelo de diabetes do tipo 2, utilizamos camundongos C57, machos, alimentados com dieta hiperlipídica por 8 meses desde os 21 dias de idade. Após este período em dieta, os animais tornaram-se obesos e pré-diabéticos, apresentando moderada hiperglicemia e significativa hiperinsulinemia ao final desta dieta. Não observamos diferenças morfológicas marcantes entre os grupos e nem alterações significativas na distribuição intercelular da ZO-1, ?- e ?-cateninas nas ilhotas do grupo tratado em comparação ao grupo controle. Entretanto, verificou-se uma maior marcação intercelular para Ecaderina e uma maior associação de F-actina à membrana na região de contato intercelular nas células endócrinas das ilhotas do grupo pré-diabético em relação ao controle. Em conclusão, os contatos intercelulares mediados pelas proteínas associadas à JA e à JO parecem desempenhar um papel no processo de maturação do pâncreas do endócrino durante o desenvolvimento animal e na patogênese da diabetes do tipo 2 / Abstract: Intercellular junctions are specializations of the plasma membrane that allow cells within a tissue to interact and adhere to each other. In endocrine pancreas, the different endocrine cells are interconnected by tight, gap and adherens-type junctions. Such intercellular contacts seem to be crucial for the function of this organ, however, little is known about the pathophysiological role and biochemistry of intercellular junctions in the endocrine pancreas. The aim of this thesis was to study the importance of cell-cell recognition and adhesion mediated by proteins associated to tight and adherens junctions in pancreatic islets, with emphasis on the process of insulin secretion, along the animal development and in pathogenesis of type 2 diabetes. Pancreatic islets of foetuses (F) and newborn (N) Wistar rats, that display a relatively poor insulin secretory response to glucose, present an immature morphology and a less defined cytoarchitecture when compared to islets from young (Y) and adult (A) rats, that are responsive to glucose. The immunofluorescence for N-CAM and pan-cadherin, adhesion molecules that are important in cell segregation, revealed a differential distribution of these proteins only in cells of the islets from Y and A. A lower junctional content of ?-and ?-catenins and ZO-1 in islet cells was seen in F and N in comparison with Y and A. In addition, we found that in the absence of intercellular contact, the glucose-stimulated insulin secretion was completely blocked in A islets. In contrast, the impact of the disruption of cell-cell adhesion on insulin secretory response of N islets was relatively small. As a model of type 2 diabetes, we employed male C57 mice, fed on high-fat (HF) diet for 8 months since they were 21 days old. After HF diet, these mice became obese and pre-diabetic (displaying moderate hyperglycemia and marked hyperinsulinaemia). We did not observe marked differences either in morphology either in the intercellular distribution of ZO-1, ?- and ?-catenins in islets between the HF-treated and control groups. However, there was a stronger immunoreaction for Ecadherin at the cell-cell contact site and an increased association of F-actin to the plasma membrane of islet endocrine cells from pre-diabetic mice as compared to control ones. In conclusion, the intercellular contacts mediated by adherens and tight junction and their constitutive proteins seem to play a role in the developmental maturation of the endocrine pancreas and in the pathogenesis of type 2 diabetes / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Kleber Luiz de Araujo e Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:13:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roma_LeticiaPrates_D.pdf: 1071638 bytes, checksum: 52777a4c39261ec7137298200cb2b319 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo:Introdução/Objetivos. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) faz parte de diversos processos fisiológicos. Nos últimos anos, o aumento de EROs têm sido associado ao desenvolvimento de diversas doenças, dentre elas o Diabetes Mellitus Tipo 2. As células beta pancreáticas são notadamente mais suscetíveis ao estresse oxidativo devido a sua baixa capacidade antioxidativa, resultado da menor expressão e atividade de enzimas antioxidantes como superóxido dismutase e peroxidases. A dexametasona, um glicocorticóide sintético, tem efeitos diabetogênicos e citotóxicos em células produtoras de insulina e ilhotas pancreáticas. Entretanto, os mecanismos pelos quais a dexametasona atua sobre as células-alvo não estão bem esclarecidos. Dessa forma, nosso objetivo foi analisar se a dexametasona induz estresse oxidativo em células produtoras de insulina RINm5F e ilhotas pancreáticas. Utilizamos três modelos: 1) células RINm5F controle, que são extremamente sensíveis ao estresse oxidativo; 2) células RINm5F superexpressando a enzima catalase (RINm5F.Cat), que são resistente ao estresse oxidativo e 3) ilhotas de ratos adultos cultivadas por 72 h com dexametasona (Dexa) e ilhotas tratadas concomitantemente com dexametasona e o antioxidante N-acetilcisteína (Dexa+NAC). Resultados: Aumento na produção de EROs foi observado em células RINm5F tratadas com dexametasona. O tratamento com dexametasona aumentou a atividade/clivagem da caspase-3 e apoptose em células RINm5F após 3 dias de cultura. Expressão protéica e atividade de Cu/ZnSOD estava aumentada após o tratamento com dexametasona, enquanto que a expressão/atividade de MnSOD não foi modulada pelo corticóide. A superexpressão da catalase em linhagens de célula beta previniu todos os efeitos citotóxicos da dexametasona, inclusive a morte celular. Elevados níveis de Cu/ZnSOD podem favorecer o aumento na geração de EROs e conseqüentemente, apoptose. Da mesma forma, ilhotas tratadas com dexametasona apresentaramaumento na produção de EROs, efeito que foi revertido quando as ilhotas foram tratadas concomitantemente com dexametasona e NAC. Redução na secreção de insulina estimulada por glicose foi observada em ilhotas cultivadas com dexametasona. O tratamento com dexametasona e NAC restaurou a secreção de insulina a níveis próximos aos controles. Uma menor produção deNAD(P)H no grupo Dexa foi observado, sendo que o grupo Dexa+NAC mostrou níveis semelhantes ao grupo controle. Não ocorreram diferenças nas concentrações intracelulares de cálcio estimulado por glicose em nenhum dos grupos. A dexametasona reduziu a expressão gênica da sinaptotagmina VII, enquanto no grupo Dexa+NAC houve um aumento da expressão desse gene em ilhotas pancreáticas. Interessantemente, o tratamento com NAC diminuiu a expressão gênica da Cu/ZnSOD. Conclusões: Nossos resultados indicam que as ações da dexametasona em células produtoras de insulina e ilhotas pancreáticas são mediadas através do aumento do estresse oxidativo, sendo a Cu/ZnSOD importante nesse processo. A superexpressão da catalase e o uso do antioxidante n-acetilcisteína previnem contra os efeitos citotóxicos do glicocorticóide. / Abstract: Introduction/Aims: Reactive oxygen species (ROS) play a dual role on living organisms, being involved in many physiological processes and also being linked to the development of several pathologies, including the type 2 diabetes mellitus. Pancreatic beta cells are very sensitive to oxidative stress because of their low antioxidant capacity, wich results from their low expression and activity of antioxidant enzymes, especially peroxidases. Dexamethasone is a synthetic diabetogenic glucocorticoid that induces cytotoxic effects on pancreatic beta cells. However, the precise mechanisms of dexamethasone toxicity on target cells are not fully understood. The aim of the present study was to analyzed whether dexamethasone induces oxidative stress in insulinproducing cells and pancreatic islets. Experimental design: The experiments were performed using 3 models: 1) RINm5F control cells, extremely sensitive to oxidative stress; 2) RINm5F cells overexpressing the enzyme catalase (RINm5F.Cat), very resistant to oxidative stress and 3) rat pancreatic islets cultured for 72 h with dexamethasone (Dexa) or cultured concomitantly with dexamethasone and the antioxidant N-acetylcysteine (Dexa+NAC). Results: An increased generation of reative oxygen species (ROS) was observed in dexamethasone-treated insulinproducing cells together with an increase in caspase-3 activity and apoptosis rate. Interestingly, exposure to dexamethasone increased the cytosolic superoxide dismutase Cu/ZnSOD protein expression and activity, while the mitochondrial MnSOD isoform was not affected by the glucocorticoid. Overexpression of catalase in insulin-producing cells prevented all the cytotoxic effects of dexamethasone. Pancreatic islets cultured in the presence of dexamethasone (Dexa) for 72 h showed increased ROS production. Glucose-stimulated insulin secretion was decreased after Dexa treatment. Intracellular ROS levels were decreased and the insulin secretion capacitywas recovered by concomitant treatment with Dexa+NAC. The total insulin content and intracellular Ca+2 levels were not modulated in either Dexa or Dexa+NAC groups. There was a decrease in the NAD(P)H production rate, used as an indicator of viability, after dexamethasone treatment. Concomitant incubation with NAC returned viability to control levels. Dexamethasone also decreased SYT VII gene expression; in contrast, the Dexa+NAC group showed increased expression of SYT VII compared to controls. Surprisingly, treatment with NAC decreased the gene expression of the antioxidant enzyme, Cu/ZnSOD. Conclusions: The cytotoxic effects of dexamethasone in RINm5F insulin-producing cells and pancreatic islets are primarily ROS-mediated. High levels of expression and activity of the Cu/ZnSOD might favour the generation of ROS. The overexpression of catalase and the use of the antioxidant Nacetylcysteine counteract the cytotoxic effects of dexamethasone. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:31:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_CarolinaPradodeFranca_D.pdf: 11012408 bytes, checksum: 13da099b8bd43a93f7783c961a08d48f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O objetivo central dessa tese foi estudar o papel das junções comunicantes (GJs) no processo de maturação da célula B e na patogênese da diabetes tipo 2. Para isso, foram utilizados dois modelos animais. No modelo in vivo de maturação da célula B e do processo secretório de insulina foram empregados ratos em vários estágios do desenvolvimento (fetal, neonatal, jovem e adulto). No modelo de diabetes tipo 2 foram utilizados camundongos C57BL/6, wild-type e knockout para o gene do receptor de LDL (LDLR -/-), alimentados com dieta hiperlipídica. No primeiro modelo de estudo, observamos, por técnicas morfológicas (imunocitoquímica) e de biologia molecular (Western Blot, RT-PCR semi-quantitativo e qPCR) que a expressão gênica e protéica de Cx36 e Cx43, se altera durante o desenvolvimento. Os dados de microinjeção intracelular de traçadores confirmam tais resultados que sugerem que ilhotas de ratos recém-nascidos apresentam menor número de canais intercelulares associados à membrana e, conseqüentemente, um menor acoplamento intercelular mediado pelas junções comunicantes em comparação às ilhotas de adultos. Esses resultados estão de acordo com a observação de que a célula B durante o período perinatal mostra uma menor resposta secretória à glicose e sugerem a participação da comunicação intercelular mediada pelas junções comunicantes no processo de maturação da célula B. No caso do modelo in vivo de diabetes tipo 2, o estudo iniciou com a caracterização do quadro metabólico e de aspectos da morfologia e morfometria do pâncreas endócrino de animais submetidos ao tratamento com a dieta hiperlipídica. Os dados obtidos demonstram que os animais submetidos a essa dieta por um curto período de tempo já apresentam alterações metabólicas típicas da fase inicial da diabetes (hiperglicemia moderada, hiperinsulinemia, intolerância á glicose e resistência à insulina), bem como modificações de parâmetros da morfometria do pâncreas endócrino. Posteriormente, foi analisada a expressão e localização celular das proteínas juncionais (Cx36, Cx43 e ZO-1) e o aspecto funcional dos canais formados pela GJ, através da microinjeção de marcadores intracelulares. Observamos que os animais tratados com dieta hiperlipídica apresentam tendência de diminuição de expressão de Cx36 acompanhada por alteração no padrão de marcação para essa proteína. Esses dados estão de acordo os de microinjeção que revelam uma pequena diminuição do grau de acoplamento celular após o tratamento com a dieta hiperlipídica. As alterações observadas para Cx36 foram acompanhadas por modificações no grau de expressão e de localização celular de ZO-1, proteína envolvida em processos como a organização dos canais intercelulares da GJ na membrana e no turnover de vários subtipos de conexina. Esses resultados indicam que a comunicação intercelular, particularmente a mediada por canais formados pela Cx36 parecem desempenhar importante papel na patogênese da diabetes tipo 2, desde sua fase inicial. / Abstract: Intercellular communication and adhesion among pancreatic B-cells are crucial for a proper insulin biosynthesis and secretion. The aim of this work was to investigate the role of gap junction (GJ) mediated-intercellular communication in the processes of maturation and dysfunction of B-cells. It is well known that fetal and neonatal rat pancreatic B-cells exhibit a reduced insulin secretory response to glucose and to other secretagogues as compared to adult ones. Based on this finding, we have used Wistar rats at different stages of development (fetal, neonatal, young and adult) as a model of B-cell maturation. As a model of type 2 diabetes, C57BL/6 mice (wild-type) and LDL receptor-deficient mice were fed a high fat diet up to 60 days. The cellular expression of GJ connexin (Cx) subtypes found in the endocrine pancreas (Cx36, Cx43 and Cx45) was assessed by immunohistochemistry, Western Blot, quantitative and semi-quantitative RTPCR. Our results indicate that young and adult endocrine pancreas express relatively high levels of Cx36 on B-cells in comparison with the other groups. Meanwhile, fetal and neonatal islets express predominantly Cx43 on non B-cells located at the islet periphery. Islet microinjection of GJ tracers revealed that neonatal B-cells display lower intercellular exchange of the cationic molecule Ethidium Bromide (EB) in comparison with the adult ones, which is in accordance with their differences in Cx36 expression. No significant differences were found in expression and localization of Cx45 among all animal groups. Regarding the animal type 2 diabetic model, a metabolic characterization showed that the high-fat diet for 60 days induces glucose intolerance, insulin resistance, hyperinsulinemia and moderate hyperglycemia in both mice groups (LDLr knockout and wild-type groups). High-fat fed mice showed a subtle decrease in Cx36 islet expression and in the B-cell intercellular exchange of EB in comparison with the chow-fed group (control). We also observed an alteration in the pattern of Cx36 labeling in immunohistochemistry assays. The high-fat diet induced a redistribution of Cx36 within the islets from a disorganized pattern (more commonly seen in control mice) to a sub domain-pattern where Cx36 plaques demarcate groups of B-cells. These changes in Cx36 islet distribution observed in high-fat fed mice were accompanied by a similar pattern of immunolabeling for ZO-1, but an increase in its islet expression, a tight junctional protein that seem to be involved in Cx turnover and membrane organization of Cx-made channels. Taken all together, these findings suggest that cell-cell coupling mediated by GJ may play an important role in the pancreatic B-cell maturation observed during endocrine pancreas development as well as in the early stages of type 2 diabetes pathogenesis. / Doutorado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A Arginina (Arg) regula a secreção de GH e insulina, e é o único precursor biológico do NO. Previamente demonstramos que animais tratados cronicamente com Arg (35mg/dia) desenvolvem resistência à insulina (RI), e o presente estudo investigou as suas bases moleculares. A RI baseou-se na redução da atividade e/ou expressão do IRS 1/2 e Akt, e do conteúdo de GLUT4; sendo o GH crucial na gênese desses efeitos. Doses mais elevadas de Arg (70mg/dia/30 dias), a maior geração de NO e a melhora do fluxo sangüíneo reverteram este quadro. Experimentos com células musculares demonstraram que a Arg estimula o metabolismo de glicose e lipídios, via NO/c-GMP. Esses achados indicam que a Arg pode ser benéfica para o tratamento de distúrbios metabólicos, como obesidade e DM2; e que ao estimular a secreção de GH, em doses adequadas, seria eficaz na terapia de distúrbios da secreção deste hormônio. Todavia, estudos adicionais são necessários para investigar a melhor dose e os efeitos crônicos in vivo da Arg, uma vez que o GH em excesso apresenta um efeito diabetogênico importante. / Arginine (Arg) regulates the secretion of GH and insulin, and it is the main biological precursor of NO. We have previously shown that animals chronically-treated with Arg (35 mg/day) developed insulin resistance (IR), and this study investigated its molecular basis. The RI relies on the reduction of the activity and/or expression of IRS 1/2 and Akt, and of the GLUT4 content; and GH has a crucial role in the genesis of these effects. Higher doses of Arg (70 mg/dia/30 days), the increased NO generation and the improvement of the blood flow reversed the RI. Experiments with muscle cells showed that Arg stimulates glucose and lipids metabolism, via NO/c-GMP activation. These findings indicate that Arg may be beneficial for the treatment of metabolic disorders, such as obesity and T2DM, and by stimulating GH secretion, Arg can, in appropriate doses, be effective for the therapy of GH secretion disorders. However, further studies are needed to investigate the best dose and the chronic effects of Arg in vivo, since that GH in excess is potentially diabetogenic.

Orientadores: Bruno Geloneze Neto, José Carlos Pareja / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:08:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasques_AnaCarolinaJunqueira_D.pdf: 3885114 bytes, checksum: 5657b34693061e6340e284a0a3940e64 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Objetivo: avaliar o efeito da cirurgia de derivação biliopancreática (DBP) na função da célula-beta de mulheres obesas grau I e II portadoras de diabetes mellitus tipo 2 (DM2), utilizando estímulos com glicose oral e intravenosa. Material e métodos: foram avaliadas 68 mulheres na menacme que compuseram três grupos: Controle magro - CMagro (n = 19, IMC = 23,0 ± 2,2 kg/m²), Controle obeso - CObeso: 18 mulheres obesas (IMC = 35,0 ± 4,8 kg/m²), ambos normotolerante à glicose; e Obeso com DM2 - ObesoDM2 (n = 31; IMC: 36,3 ± 3,7 kg/m²). No grupo ObesoDM2, 64% das mulheres foram submetidas à cirurgia de DBP (n = 20, IMC: 36,5 ± 3,7 kg/m²). Os 68 pacientes passaram por todas as avaliações uma única vez. Os pacientes submetidos à DBP foram reavaliados um mês após a cirurgia. A avaliação da célula-beta foi realizada por testes dinâmicos com estímulo oral (teste de tolerância à glicose oral) e intravenoso (clamp hiperglicêmico). Foram dosados glicose, insulina e peptídeo-C plasmáticos. A aplicação das técnicas de modelagem matemática aos dados possibilitou avaliar as secreções de insulina basal, dinâmica e estática (estímulo oral); a primeira e a segunda fase de secreção de insulina (estímulo intravenoso); a secreção de insulina total; a sensibilidade à insulina (SI), a extração hepática de insulina (EH) e o tempo de atraso ou tempo de atraso para a célula-beta recrutar novos grânulos de insulina para compor o reservatório de grânulos prontamente liberáveis em resposta a determinada glicemia. Resultados: após a DBP houve melhora substancial na SI no TTOG e no teste de clamp, com o grupo cirúrgico alcançando níveis semelhantes aos do grupo CMagro e mais elevados que do grupo CObeso (p < 0,05). A EH de insulina apresentou aumento significante após a DBP, com o grupo cirúrgico mantendo-se semelhante ao CMagro e com níveis aumentados em relação ao CObeso (p < 0,05). A secreção de insulina basal do grupo cirúrgico alcançou níveis de normalidade, assemelhando-se ao CMagro. Houve melhora da função da célula-beta estimulada (p < 0,05), independente da via de acesso utilizada para estimular a célula-beta com glicose (oral e intravenosa). O tempo de atraso não apresentou modificação após a DBP. Conclusão: Ocorreram diversas adaptações fisiológicas positivas após a DBP. Estas adaptações estão relacionadas à restauração na SI, à melhora na EH de insulina e à melhora nas diversas etapas do processo de síntese e secreção de insulina, explicando a melhora aguda no nível de tolerância à glicose e no controle glicêmico desses indivíduos. A não melhora no tempo de atraso evidencia as características do DM2 como doença crônica, progressiva e irreversível, uma vez que o tratamento cirúrgico contribui para a remissão e não resolução da doença. A compreensão dos mecanismos de mudança no metabolismo após a DBP ajudará a definir o papel do intestino na fisiopatologia do DM2, contribuindo para o desenvolvimento de novas abordagens clínicas e cirúrgicas para o tratamento da doença / Abstract: Objective: to assess the effect of biliopancreatic diversion surgery (BPD) in beta-cell function of obese grade I and II women with type 2 diabetes mellitus (T2DM), using an oral and an intravenous stimuli with glucose. Research Design and Methods: sixty eight premenopausal women were assessed and divided into three groups: lean control - LeanC (n = 19; BMI: 23.0 ± 2.2 kg/m²), obese control - ObeseC (n = 18; BMI: 35.0 ± 4.8kg/m²), both with normal glucose tolerance; and obese with type 2 diabetes - ObeseT2DM (n = 31; BMI: 36.3 ± 3.7 kg/m²). In ObeseDM2 group, 64% of women underwent BPD (n = 20, BMI: 36.5 ± 3.7 kg/m²). The 68 volunteers underwent all assessments once. The volunteers those underwent BPD were reassessed one month after surgery. The assessment of beta-cell function was performed by dynamic tests with an oral (oral glucose tolerance test) and an intravenous stimulation test (hyperglycemic clamp). Serum glucose, insulin and C-peptide were determined. The application of mathematical modeling techniques to data allowed to evaluate basal, dynamic and static (oral stimulus) insulin secretion; the first and second phase of insulin secretion (intravenous stimulus); the total insulin secretion; the insulin sensitivity (IS); the hepatic extraction of insulin (EH) and the delay time for the beta-cell to recruit new insulin granules to form the pool of readily releasable granules in response to a given plasma glucose. Results: after BPD, there was a dramatic improvement on IS during the OGTT and during the clamp test, with the surgical group reaching normalized levels compared to those observed in LeanC group and higher levels than ObeseC group (p < 0.05). The EH of insulin showed significant improvement after BPD, with the surgical group reaching similar levels to LeanC and with increased levels in comparison to ObeseC (p < 0.05). The basal insulin secretion achieved normalized levels, with the surgical group resembling the LeanC group. There was improvement in stimulated beta-cell function (p < 0.05), independent of the route of glucose administration (oral and intravenous). The delay time presented no improvement after BPD. Conclusion: several positive physiological adaptations occurred after BPD surgery. These adaptations are related to restoration of the IS, improvement in EH of insulin and normalization in beta-cell function at the various stages of the synthesis secretion process of insulin, explaining the improvement on glucose tolerance and on the glycemic control. The lack of improvement on the delay time highlights the characteristics of T2DM as a chronic, progressive and irreversible disease, once the surgical treatment contributes to the remission and not for the resolution of the disease. Understanding the mechanisms of the change in metabolism after BPD should help define the role of the gut in the physiopathology of T2DM, and help to develop new clinical and surgical approaches to treat the disease / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Helena Coutinho Franco de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T07:29:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_JaneCristinade_D.pdf: 1851485 bytes, checksum: 9bc182bf9f44ff62ddc24d9ea9603f71 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Alterações no conteúdo de colesterol celular podem contribuir para o mau funcionamento das células-beta pancreáticas. Camundongos knockout para o receptor de LDL (LDLR-/-) possuem maior teor de colesterol nas ilhotas pancreáticas e secretam menos insulina em comparação a camundongos selvagens (WT). Neste estudo, investigamos a associação entre o conteúdo de colesterol, a secreção de insulina e a movimentação de cálcio citoplasmático nessas ilhotas. Além disso, analisamos o efeito da dieta rica em gordura (HFD) sobre a homeostasia glicêmica, secreção e ação da insulina nesses camundongos. Os resultados mostraram que a primeira e segunda fase de secreção de insulina assim como a movimentação de Ca2+, estimuladas por glicose, foram reduzidas nos LDLR-/-. Camundongos LDLR-/- também apresentaram menor conteúdo de proteínas envolvidas com a extrusão dos grânulos de insulina tais como: VAMP-2 e SNAP-25 (p<0,05). A remoção do excesso de colesterol pelo uso da metil-beta-ciclodextrina (M?CD) normalizou a secreção de insulina, estimulada por glicose (GSIS) ou tolbutamida, assim como a movimentação de cálcio estimulada por glicose. A remoção do colesterol das ilhotas WT com 0.1 e 1 mmol/L de M?CD reduziu a secreção bem como a movimentação de cálcio. No entanto, ilhotas incubadas com 10 mmol/L de M?CD apresentaram aumento significativo na secreção de insulina, apesar da redução na movimentação de cálcio. A dieta hiperlipídica (H) promoveu maior ganho de peso e acúmulo de gordura visceral nos camundongos LDLR-/-H em relação aos WTH. A dieta aumentou a glicemia tanto no jejum quanto alimentado, porém não houve alterações nas concentrações plasmáticas de insulina nos camundongos LDLR-/-H. Já nos camundongos WTH, a dieta causou aumento nas glicemias de jejum e alimentado bem como na insulinemia. A área sob a curva glicêmica durante o oGTT foi 30% maior nos camundongos LDLR-/-H. A GSIS não foi significativamente alterada pela dieta hiperlipídica em ambos os grupos. Camundongos LDLR-/- em dieta padrão apresentaram maior fosforilação do receptor de insulina (IR?) e da AKT em fígado e músculo. O conteúdo da enzima que degrada a insulina (IDE) se mostrou reduzido nos LDLR-/-. A dieta hiperlipídica reduziu a sinalização da insulina em fígado, músculo e tecido adiposo dos camundongos LDLR-/-H. Nos camundongos WTH essa dieta promoveu apenas uma redução na fosforilação do IR? no músculo. A análise conjunta dos resultados nos permitiu concluir que, tanto o aumento de colesterol verificado em ilhotas LDLR-/- quanto a diminuição excessiva do conteúdo de colesterol em ilhotas WT (tratadas com M?CD) alteram a movimentação de cálcio e conseqüentemente a secreção de insulina. A redução do colesterol nas ilhotas dos camundongos LDLR-/- corrigiu a redução da secreção de insulina, apesar das concentrações reduzidas de VAMP-2 e SNAP-25. Camundongos LDLR-/-, alimentados com dieta padrão, são mais sensíveis à insulina, provavelmente como um mecanismo adaptativo a menor secreção de insulina. No entanto, estas adaptações não são suficientes para manter a homeostase glicêmica visto que estes animais são intolerantes à glicose. Quando alimentados com dieta hiperlipídica, os LDLR-/-H se tornam resistentes à insulina provavelmente devido ao aumento do tecido adiposo visceral / Abstract: Changes in cellular cholesterol levels may contribute to beta cell dysfunction. Islets from LDL receptor knockout (LDLR-/-) possess higher cholesterol content and secrete less insulin than wild type (WT) mice. Here, we investigated the association between cholesterol content, insulin secretion and Ca2+ handling in these islets. In addition, we analyzed the effects of highfat- diet (HFD) on glucose homeostasis, insulin secretion and action in these mice. Both first and second phase of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) were lower in LDLR-/- compared with WT islets. This lower secretion was paralleled by impairment in Ca2+ handling in these islets. The contents of SNAP-25 and VAMP-2 proteins, which participate in the extrusion of the insulin containing granules, were reduced in LDLR-/- compared with WT islets. Removal of the excess of cholesterol from LDLR-/- islets (Methyl-?-cyclodextrine, M?CD) normalized glucose- and tolbutamide-induced insulin release. Glucose-stimulated Ca2+ handling was also normalized in cholesterol-depleted LDLR-/- islets. Cholesterol removal from WT islets by 0.1 and 1.0 mmol/L M?CD impaired both GSIS and Ca2+ handling. However, 10 mmol/L M?CD markedly increased insulin secretion induced by glucose or tolbutamide in WT islets, despite a significant reduction in Ca2+ handling. The HFD promoted higher body weight gain and visceral fat pad depot in LDLR-/-H than in WTH. LDLR-/-H mice showed fasted and fed glucose levels significantly higher whereas no changes in fasted plasma insulin levels were observed. WTH mice also showed an increase in fasted and fed glucose levels, but a higher fasted plasma insulin level (p<0.05) was noticed. The area under the curve of the oGTT in LDLR-/-H, but not in WTH, was increased (30%) by HFD. GSIS was not significantly altered by HFD in both groups. LDLR-/- mice showed higher IR? and AKT phosphorylation in liver and skeletal muscle. Insulin degrading enzyme (IDE) protein content was lower in liver of LDLR-/-. The HFD reduced insulin signaling in liver, skeletal muscle and adipose tissue in LDLR-/-H. In WTH the HFD reduced only the IR? phosphorylation in muscle. In conclusion, our results indicate that abnormal high (LDLR-/- islets) or low (WT islets treated with M?CD) cholesterol contents alter both GSIS and Ca2+ handling. Normalization of islet cholesterol content improved Ca2+ handling and insulin secretion in LDLR-/- islets, despite the lower expression of SNAP-25 and VAMP-2. LDLR-/- mice, fed a chow diet, are more sensitive to insulin probably due adaptive mechanisms that compensate the low insulin secretion. However, these changes are not sufficient to promote glucose homeostasis since these mice were glucose intolerants. When fed a high-fat diet, they became also insulin resistant probably due to an increase in the mass of the visceral adipose tissue / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Alex Rafacho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:53:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Purificacao_ThaisAlmeida_M.pdf: 1255549 bytes, checksum: 5142cacf6ca932aa0dd1a86b9eef5074 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Administração de glicocorticóides em roedores e humanos aumenta a resistência à insulina (RI). A RI, provocada por dexametasona, leva a hiperinsulinemia por aumento da secreção do hormônio pelas ilhotas pancreáticas. Recentemente, demonstrou-se que a AS160, uma GAP (proteína ativadora de GTPase), participa no tráfego de vesículas em diferentes tipos celulares que, por sua vez, pode ser alterado por dexametasona. Neste trabalho, avaliamos possível participação da AS160 na secreção de insulina em ilhotas de ratos RI por dexametasona, para isto foram avaliadas proteínas envolvidas no processo de secreção; pAS160, Akt e AMPK. Ratos Wistar adultos foram tratados com o glicocorticóide (DEX) com 1mg/kg (ip) de peso corporal, ou salina (CTL), durante 5 dias. Ao final do período de tratamento, os ratos foram submetidos a um Teste de Tolerância à Glicose intraperitoneal (ipGTT) e, após sacrifício, amostras de sangue foram coletadas para dosagem de insulina. As ilhotas pancreáticas foram isoladas por digestão do pâncreas com colagenase. As proteínas insulares foram avaliadas por Western Blot e os genes por RCP-TR. A insulina, contida nas amostras de sangue e nas incubações de ilhotas, foi medida por radioimunoensaio (RIA). A razão pAS160/AS160 foi aumentada nas ilhotas DEX (P<0,05). Nestas ilhotas, resultados semelhantes foram observados para a razão pAkt/Akt (P<0,05). O tratamento com DEX também aumentou a expressão gênica e protéica da Rab27A (P<0,05), contudo, reduziu significativamente sua associação com a AS160 (P<0,05). A associação entre essas duas proteínas foi observada pela primeira vez nas ilhotas neste trabalho. O tratamento com DEX também reduziu as expressões gênica e protéica bem como a fosforilação da AMPK. A secreção de insulina foi maior nas ilhotas DEX comparado à CTL e, em ambas, a secreção foi diminuída pela wortmanina (inibidor da PI3K). Ilhotas de ratos CTL e DEX, tratados com anti-sense anti-AS160, tiveram o conteúdo protéico da AS160 reduzido em ± 80%, comparado ao CTL (P<0,05). Nas ilhotas de ratos CTL knockdown, a secreção de insulina foi maior que nos CTL e, nas ilhotas dos DEX knockdown a secreção foi semelhante às DEX. Concluindo, o aumento da secreção de insulina em ilhotas de ratos RI por dexametasona envolve a participação da AS160 e, essa potencialização parece ser mediada pela via PI3K/Akt. Esse aumento de secreção parece também ser diretamente proporcional ao aumento da dissociação entre a Rab27A e a AS160 / Abstract: It is well known that glucocorticoids induce insulin resistance (IR). It is also known that dexamethasone-induced IR is linked to increased levels of plasma insulin due to higher insulin secretion by pancreatic islets. Recent findings show that the Rab-GTPase AS160 plays a role in the traffic of vesicles in different cells type that, in turn, may be affected by dexamethasone. Here, we evaluated the participation of AS160 in the insulin secretion in islets from dexamethasone treated rats. Adult rats were treated with dexamethasone (DEX) with 1.0 mg/kg, body weight (ip) or saline (CTL) for 5 consecutive days. Insulin resistance was evaluated by intraperitoneal Glucose Tolerance Test (ipGTT). After, the rats were sacrificed and the islets isolated by the digestion of their pancreases with collagenase. Protein was measured by Western- Blot, and insulin by RIA. AS160 expression, phosphorylation, and the pAS160/AS160 ratio were increased in DEX islets (P<0.05). Similar results were observed for Akt (P<0.05). Dexamethasone also increased Rab27a protein and gene expression but significantly reduced its association with AS160. The association between these two proteins was observed in pancreatic islets for the first time in this work. AMPK gene and protein expression as well as phosphorylation were reduced by Dexamethasone (P<0.05). The insulin secretion was higher in DEX compared with CTL islets (P<0.05). Both secretions were reduced by wortmanin. Islets from CTL and DEX rats, treated with anti-sense anti-AS160, showed ± 80% reduction on its expression. The CTL knockdown islets secreted more insulin than CTL and the DEX knockdown secreted similar amount of insulin than DEX islets. In conclusion, these results indicated that AS160 participates in the increased insulin secretion in islets from DEX rats, and this effect seems to be dependent on the activation of the PI3K/Akt pathway. The increase in insulin secretion also depends on the dissociation between Rab27a and AS160 / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Bruno Geloneze Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T00:23:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_MarceloMirandadeOliveira_D.pdf: 3942273 bytes, checksum: 81f08c914cf4cc2a6a59c186b12b161e (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A obesidade visceral está associada à resistência à insulina, à presença de síndrome metabólica, à presença do diabetes tipo 2 e risco cardiovascular e a mortalidade elevados. Entretanto, não está claro se existe uma relação causal. A ressecção cirúrgica (exérese) do tecido adiposo visceral (TAV) é um modelo ideal para esclarecer esta questão. Em modelos animais, este procedimento melhora a tolerância a glicose, a sensibilidade à insulina (SI), a função de célula beta, o perfil lipídico e o perfil de adipocinas. A omentectomia tem sido combinada com a cirurgia bariátrica em humanos para estudar seus efeitos sobre estes parâmetros metabólicos, com resultados controversos. Para investigar o papel do TAV no metabolismo, este estudo prospectivo randomizado avaliou vinte mulheres, em menacme, com obesidade grau III e Síndrome metabólica, randomizadas para submeterem-se ao bypass gástrico (RYGBP) isolado (grupo-controle, CT) ou combinado à omentectomia total (grupo OM). Sensibilidade à insulina (SI: índice M, obtido por clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico), resposta aguda da insulina à glicose (acute insulin response = AIR, obtida pelo teste de tolerância à glicose intravenosa), disposition index (DI = AIR ? M), perfil lipídico, perfil de adipocinas (leptina, adiponectina, resistina, visfatina, interleucina-6, TNF-?, MCP-1), proteína C-reativa ultra-sensível (PCR), composição corporal e ecografia da gordura abdominal foram estudados pré-cirurgia (basal) e 1, 6-8 e 12-15 meses pós-cirurgia. A omentectomia foi associada a maior perda de peso em todos os tempos avaliados [OM vs CT, 1, 6-8 e 12-15 meses pós cirurgia, respectivamente: -12,6 (2,5) vs -9,3 (2,5) kg (p < 0,05); -34,2 (4,3) vs -28,4 (6,2) kg (p < 0,05); -42,8 (5,4) vs -35,5 (6,8) kg (p < 0,05)]. A SI melhorou de forma similar em ambos os grupos [M (umol/kg massa magra/min) em OM vs CT - basal, 1, 6-8, and 12-15 meses pós-cirurgia, respectivamente: 25,0 (7,6) vs 28,2 (6,5); 22,4 (8,3) vs 22,7 (3,5) (não significante vs basal, em ambos os grupos); 46,6 (13,2) vs 38,6 (9,4); 54,6 (11,1) vs 50,1 (17,6) (p<0,01 vs basal, em ambos os grupos, 6-8 e 12-15 meses pós-cirurgia)]. A omentectomia foi associada a níveis menores de PCR 12-15 meses pós-cirurgia mas não influenciou adipocinas e outros parâmetros metabólicos. Entre os pacientes sem diabetes, a omentectomia foi associada a manutenção da AIR após 12-15 meses, em relação ao basal (em oposição a diminuição no grupo-controle) e maior DI após 6-8 e 12-15 meses. Embora a omentectomia não tenha potencializado o efeito do RYGBP sobre a SI e as adipocinas, ela foi associada a maior secreção de insulina, maior perda de peso e menores níveis de PCR / Abstract: The visceral fat is linked to insulin resistance, the metabolic syndrome, type 2 diabetes and an increased cardiovascular risk, but it is not clear whether it has a causative role. Surgical resection of this fat depot is a research model to address this issue. In animal models, it has been shown to improve glucose tolerance, insulin sensitivity (IS), beta cell function, lipids and adipokine profile. The omentectomy has been combined to bariatric surgery in humans in order to study its effects on these metabolic parameters with controversial results. To approach the metabolic role of the visceral fat tissue, twenty premenopausal women with metabolic syndrome and grade III obesity were prospectively randomized to undergo Roux-en-Y gastric bypass (RYGBP) either alone or combined with omentectomy. Insulin sensitivity (IS: M index, from the euglycemic-hyperinsulinemic clamp), acute insulin response to glucose (AIR; intravenous glucose tolerance test), disposition index (DI = AIR ? M), lipid profile, adipokine profile (leptin, adiponectin, resistin, visfatin, interleukin-6, TNF-?, MCP-1), ultra-sensitive C-reactive protein (CRP), body composition, and abdominal fat echography were assessed prior to surgery and 1, 6-8, and 12-15 months post-surgery. Omentectomy was associated with greater weight loss at all time points [OM vs CT, 1, 6-8, and 12-15 months post-surgery, respectively: -12.6 (2.5) vs -9.3 (2.5) kg (p <0.05); -34.2 (4.3) vs -28.4 (6.2) kg (p <0.05); -42.8 (5.4) vs -35.5 (6.8) kg (p <0.05)]. IS improved similarly in both groups [M (umol/kg free fat mass/min) in OM vs CT, at baseline, 1, 6-8, and 12-15 months post-surgery, respectively: 25.0 (7.6) vs 28.2 (6.5); 22.4 (8.3) vs 22.7 (3.5) (no significant difference vs baseline, for both groups); 46.6 (13.2) vs 38.6 (9.4); 54.6 (11.1) vs 50.1 (17.6) (p<0.01 vs baseline, for both groups at 6-8 and 12-15 months post-surgery)]. Omentectomy was associated to lower CRP [(0.05 (0.05) vs 0.26 (0.23) mg/L, p <0.001] after 12-15 months but it did not influence adipokines and other metabolic parameters. Among non-diabetic subjects, omentectomy was associated with a maintanance of baseline AIR after 12-15 months (as opposed to lowering of AIR in the control group) and a greater DI after 6-8 and 12-15 months. Although omentectomy did not enhance the effect of RYGBP on insulin sensitivity and adipokines, it was associated with a greater insulin secretion, a greater weight loss, and lower CRP / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Débora Cristina Damasceno / Coorientador: Yuri Karen Sinzato / Banca: Mara Sandra Hoshida / Banca: Luciane Dias Alargão Dias Melicio / Resumo: Introdução:Muitos estudos mostram a regeneração pancreática em um ambiente diabético e não exploram este processo no organismo saudável. Para compreender melhor os mecanismos envolvidos na regeneração das ilhotas pancreáticas sem o envolvimento do diabete. Objetivo:Avaliar a estrutura morfológicadas ilhotas pancreáticas desde o período neonatal até a idade adulta de ratas. Metodologia:Recém-nascidos do sexo feminino foram distribuídos aleatoriamente em diferentes grupos de estudo para coleta do pâncreas e soro em diferentes períodos de vida (5, 15, 90 dias de vida e no 18,5º dia de prenhez). Para a análise histopatológica, foram considerados os aspectos morfológicos observados na coloração de hematoxilina e eosina (HE). A análise morfométrica foi realizada em sistema computadorizado de imagem (software KS-300, versão 3.0, Zeiss). Para análise imunoistoquímica, foram utilizados os anticorpos anti insulina, anti PDX-1, anti GLP-1, anti Ki-67 e anti caspase-3. A avaliação imunoistoquímica foi realizada por contagem de células positivas através da grade de Weibel modificada. Resultados:Com cinco dias de vida, foi observado menor área comparado a dos outros períodos. Na fase adulta e durante a prenhez, as ratas apresentaram diminuição do número de células positivas para insulina e aumento de células quiescentes comparado às dos dias 5 e 15 de vida pós-natal. Um pico de proliferação celular foi observado no 15°dia de vida e, em todos os momentos estudados, foi observado maior frequência de morte celular das células não-beta (β) das ilhotas pancreáticas (células α, δe PP) em relação às células βpancreáticas. Durante a prenhez, houve diminuição do número de células positivas para GLP-1 em relação aos dias 5 e 15 de vida. Conclusão:As ilhotas pancreáticas apresentaram mudançasem sua morfologia, sobretudo durante os primeiros 15 dias de vida, sendo estas mudanças suficientes para ... / Abstract: Not available / Mestre

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La Diabetes Mellitus es una de las enfermedades crónicas no transmisibles más frecuentes del ser humano de cualquier edad. Se considera un problema de salud pública por su elevada morbilidad y mortalidad. La Diabetes Mellitus tipo 2 es la forma de presentación más común, representando un 85-90% de los casos totales, que se caracteriza por una resistencia insulínica en conjunto con una secreción insuficiente de insulina desde las células β pancreáticas. Se ha descrito que el estrés oxidativo en células β pancreáticas, dado por un aumento en especies reactivas de oxígeno (ROS), provoca alteraciones en estas células, con una disminución en la secreción de insulina, lo que contribuiría a la pérdida del control glicémico. En este trabajo se evaluó el efecto del peróxido de hidrógeno (H2O2), un compuesto químico que puede producir estrés oxidativo, sobre la secreción de insulina y el control de calcio intracelular en células β pancreáticas de rata, evaluando las respuestas a la glucosa y un agonista colinérgico. El H2O2 presentó un efecto dual sobre la secreción de insulina: en condiciones basales de glucosa produjo un aumento en la secreción de insulina, mientras que disminuyó la secreción de insulina inducida por niveles estimuladores de glucosa (GSIS). Las mediciones de calcio indicaron que el aumento en la secreción basal de insulina se debe a un incremento de la concentración de calcio intracelular inducido por el H2O2. Se encontró que la aplicación del antioxidante N-acetil cisteína (NAC) protegió a las células beta pancreáticas contra los cambios en la función secretora en la presencia de H2O2. Sin embargo, NAC en si causó una pérdida parcial de la GSIS. Por otra parte, se observó que el H2O2 no aumentó la secreción basal de insulina cuando el agonista colinérgico, carbacol, estaba presente. Las mediciones de calcio realizadas en células β pancreáticas sugieren que frente a altas concentraciones de H2O2 (100 µM), el estímulo con carbacol podría inducir una disminución de la concentración de calcio intracelular. En presencia de glucosa estimuladora, el H2O2 inhibió la secreción de insulina inducida por carbacol a partir de los 25 µM de H2O2, efecto que se correlacionó con una disminución tanto en la descarga del calcio almacenado como en el porcentaje de células que responden al estímulo colinérgico. Estos efectos podrían ser prevenidos con la aplicación del antioxidante NAC. En conjunto, los datos demuestran que las especies reactivas del oxigeno presentan un rol importante y complejo en la función de las células β pancreáticas. Por una parte, la capacidad de NAC para interferir con la GSIS sugiere que las ROS son necesarias para responder adecuadamente a la glucosa. Por otro lado, un exceso de ROS produce un daño similar a la glucotoxicidad y una inhibición de la respuesta colinérgica, lo que podría afectar en forma negativa la respuesta secretora a nutrientes y señales neuro-hormonales, contribuyendo a la falla del control glicémico asociada con la Diabetes mellitus tipo 2. Se sugiere la realizacion de nuevos experimentos conducentes a dilucidar los componentes de la via colinérgica que se inhiben en presencia de altas concentraciones de H2O2