Submitted by Tiago Leiva (tiagoleiva@ig.com.br) on 2018-07-03T13:48:11Z No. of bitstreams: 1 Defesa de doutorado.pdf: 1294142 bytes, checksum: 70e060f09f4c44070af39cc3bfc4e7df (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2018-07-03T14:16:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 leiva_t_dr_botfca.pdf: 1190417 bytes, checksum: 4e2b70666e9a1f29a89be39bd8a7ed08 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-03T14:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 leiva_t_dr_botfca.pdf: 1190417 bytes, checksum: 4e2b70666e9a1f29a89be39bd8a7ed08 (MD5) Previous issue date: 2018-06-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Dois experimentos foram conduzidos para avaliar o efeito de diferentes fontes de energia e da suplementação com cromo nas variáveis relacionadas a resistência à insulina, produção de leite e índices reprodutivos de vacas leiteiras lactentes consumindo excesso de energia que foram distribuídas em um arranjo fatorial 2 × 2. No primeiro estudo, vacas foram designadas a receber: 1) concentrado a base de milho moído (CRN; n = 13) ou polpa cítrica (PLP; n = 13) e 2) suplementação (n = 14) ou não (n = 12) de 10 mg/vaca/dia de propionato de cromo. No segundo estudo vacas receberam: 1) concentrado a base de milho moído (CRN; n = 20) ou com inclusão de 8% (matéria seca) de gordura de palma protegida (CSPO; n = 20), e suplementação (n = 20) ou não (n = 20) de 10 mg/dia de propionato de cromo. Para a condução de ambos os estudos, foram utilizados animais não gestantes, Holandeses × Gir, lactantes (dias de leite inicial = 80 ± 3), alimentados com silagem de milho oferecida de maneira ad libitum e concentrado visando atender 160% dos requerimentos energéticos de mantença. Amostras de leite e sangue foram colhidas semanalmente e produção de leite foi mensurada diariamente. Para o primeiro estudo, escore de condição corporal (ECC) e peso corporal (PC) foram avaliados semanalmente ao longo do estudo (D0 ao 182), enquanto que no segundo estudo ECC e PC foram avaliados no primeiro e no último dia (d0 e d203, respectivamente) do estudo. Ingestão de matéria seca foi avaliada apenas no segundo estudo através da diferença entre o ofertado e a sobra. Para tal, vacas foram distribuídas em cinco grupos de oito vacas (duas vacas de cada grupo experimental) e alocadas individualmente em 8 baias por 3 dias. No final desse período os animais retornavam aos piquetes e um novo grupo de animais passavam pelo mesmo processo. Testes de tolerância a glicose (TTG; 0,5g de glicose/kg de PC) foram realizadas no d -3, 60, 120, e 180 para o primeiro estudo, e nos dias -3, 100 e 200 para o segundo estudo. Aspiração folicular para produção de embrião in vitro foi realizada nos d -1, 82 e 162 para o primeiro estudo e nos d -1, 98 e 198 para o segundo estudo. Os resultados obtidos no primeiro estudo foram: não foram detectadas diferenças (P ≥ 0,25) para PC e ECC durante o experimento. Dentro das colheitas semanais de sangue, concentrações séricas de insulina e glicose assim como relação insulina:glicose foram similar entre os tratamentos (P ≥ 0,19). Animais do grupo CRN tiveram menor (P < 0,01) concentrações plasmáticas de ácidos graxos não esterificados comparados com PLP (0,177 × 0,215 mmol/l, respectivamente; EMP = 0,009). Durante o TTG não foram detectadas diferenças (P ≥ 0,16) para concentrações de glicose, taxa de desaparecimento de glicose, tempo de meia vida de glicose e relação insulina:glicose. Concentrações séricas de insulina foram menor (P = 0,04) em vacas CRN suplementadas com propionato de cromo compradas com vacas CRN não suplementadas com propionato de cromo (8.2 × 13,5 μUI/ml, respectivamente; EMP = 1,7), enquanto que a suplementação com propionato de cromo não impactou (P = 0,70) concentrações séricas de insulinas em vacas PLP. Produção de leite, gordura no leite e concentrações de sólidos totais foram similares (P ≥ 0,48) entre os tratamentos. No entanto, CRN tiveram maior (P < 0,01) concentrações de proteína no leite comparadas com PLP (3,54 × 3,14%, respectivamente; EMP = 0,08). Não foram encontradas diferenças (P ≥ 0,35) no número de oócitos coletados e embriões produzidos dentro de cada aspiração. Concluindo, fornecimento de concentrado contendo polpa cítrica peletizada para vacas leiteiras lactantes consumindo excesso de energia não melhorou as variáveis relacionadas com resistência à insulina, produção de leite e índices 0,03) concentrações séricas de glicose, insulina, ácidos graxos e relação insulina:glicose comparadas com vacas CSPO, sugerindo aumento na sensibilidade a insulina em vacas CRN. Durante o TTG, variáveis relacionadas a sensibilidade a insulina foram maiores em vacas CRN quando comparadas a vacas CSPO. Suplementação com propionato de cromo resultou em menores (P ≤ 0,09) concentrações séricas de insulina e relação insulina:glicose apenas em vacas CRN, indicando que suplementação com propionato de cromo melhora a sensibilidade a insulina em vacas CRN mais não em vacas CSPO. Durante o TTG, no entanto, suplementação com propionato de cromo reduziu as concentrações de insulina e a relação insulina:glicose em vacas CSPO e CRN. Produção de leite, assim como número de oócitos viáveis coletados e embriões produzidos dentro de cada aspiração não foram afetados (P ≥ 0,24) pelos tratamentos. Em conclusão, utilização de gordura de palma protegida não melhorou a sensibilidade a insulina em vacas Holandesas x Gir consumindo excesso de energia durante o meio e o final da lactação, enquanto que suplementação com propionato de cromo foi efetivo em melhorar a sensibilidade basal da insulina em vacas CRN. / 2014/14512-6 / 2015/21224-0

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O Diabetes mellitus (DM) é um grande problema de saúde pública, projeções indicam que em 2030, 366 milhões de indivíduos sofrerão da doença. Durante os últimos anos, tornou-se evidente que a ausência de células produtoras de insulina é um denominador comum em todos os tipos de DM. Assim, várias pesquisas têm procurado desenvolver células produtoras de insulina in vitro. A betacelulina (BTC) é uma proteína ligante de EGFR, relacionada com a proliferação de células β pancreáticas in vitro e, com o aumento no metabolismo da glicose em modelos animais do diabetes. As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes, presentes na medula óssea, e vastamente estudadas para terapia celular. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da superexpressão do gene da betacelulina sobre células MSCs de ratos. Foi estabelecida uma cultura de longo termo de células MSCs. Após caracterização, estas foram submetidas à transfecção gênica com o gene da BTC por eletroporação. Células transfectadas foram cultivas em meio de cultivo D-MEM suplementado de 10mM Nicotinamida. Análises de radioimunoensaio demonstraram que 104 MSCs transfectadas com o gene da BCT foram capazes de produzir até 0,45 ng/mL de insulina in vitro. In vivo, as células MSC superexpressando BTC foram capazes de diminuir a hiperglicemia induzida por Streptozotocina em ratos. Nossos resultados demonstraram que os efeitos positivos da superexpressão de BTC em MSCs. / Betacellulin (BTC), a ligand of the epidermal growth factor receptor, has been shown to promote growth and differentiation of pancreatic β-cells and to improve glucose metabolism in experimental diabetic rodent models. Mesenchymal stem cells (MSCs) have already been proved to be multipotent. Recent work has attributed to rat and human MSCs the potential to differentiate into insulin secreting cells. Our goal was to evaluate the effects of betacellulin overexpression in rat MSCs. MSCs were characterized by flow cytometry and mesoderm differentiation markers. MSCs were electroporated with a plasmid containing BTC cDNA. Transfected cells were cultivated in H-DMEM with 10mM Nicotinamide. Radioimmunoassay analysis showed that 104 MSC-BTC cells produced up to 0,4ng/mL of insulin, in contrast, MSCs transfected with the empty vector produced insignificant levels of insulin. Also MSC-BTC cells were positive for insulin in immunohistochemistry. RT-PCR showed expression of pancreatic marker genes. When transplanted to streptozotocin diabetic rats, MSC-BTC cells could revert hyperglycemia. Our results demonstrate that BTC overabundance enhances glucose-induced insulin secretion in mesenchymal stem cells in vitro as well as in vivo.

Introdução: A apneia do sono causa hipóxia intermitente (HI), que tem sido implicada na resistência à insulina. A proteína desacopladora 2 (UCP2) no pâncreas é reguladora negativa da secreção de insulina. Objetivos do Estudo: Avaliar se a exposição animal ao modelo de apneia do sono influencia na produção de insulina via expressão do mRNA da UCP2. Desenho e intervenções: Camundongos C57BL machos foram expostos durante 35 dias à hipóxia intermitente (HI; n = 18) ou HI simulada (HIS; n = 18). Durante 8 horas diárias o grupo HI foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva a um nadir da fração inspirada de oxigênio de 8 ± 1%, seguido por 30 segundos de normóxia. Métodos e Resultados: A expressão do mRNA da UCP-2 no pâncreas, avaliada por PCR em tempo real, foi 18% mais baixa no grupo HI do que no grupo HIS (P = 0,14). Imunohistoquímica identificou maior número de células beta no grupo HI do que no HIS (P = 0,14). Os níveis de glicose no soro medidos por métodos colorimétricos enzimáticos foram menores no grupo HI do que no grupo HIS (P = 0,025). Níveis significativamente maiores de insulina no soro, quantificados por ELISA, e níveis significativamente mais baixos de glucagon, quantificados por EIA, foram observados no grupo HI, quando comparado ao grupo HIS. Os cálculos do modelo de avaliação da homeostase (HOMA) para a resistência à insulina sugerem maior sensibilidade em HI do que em camundongos HIS (P = 0,09). A função das células beta, avaliada por HOMA - β foi maior em camundongos HI do que nos HIS (P = 0,014). O peso corporal, ajustado ao consumo alimentar, foi relativamente estável durante o experimento. Não foram encontradas diferenças significativas no perfil lipídico. Conclusões: Estes resultados sugerem que a HI provoca alterações na função pancreática que não podem ser relacionadas com a expressão do mRNA da UCP2. / Background: Sleep apnea causes intermittent hypoxia (IH) that has been implicated in insulin resistance. Pancreatic uncoupling protein-2 (UCP2) is a negative regulator of insulin secretion. Study Objectives: To evaluate whether exposure to an animal model of sleep apnea influences insulin output via UCP2 expression. Design and interventions: Male C57BL mice were exposed during 35 days to intermittent hypoxia (IH; n=18) or to sham IH (SIH; n=18). During 8 hours daily the IH group underwent a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1% followed by 30 seconds of normoxia. Measurements and Results: The expression of pancreatic UCP-2 mRNA assessed by real-time PCR was 18% lower (P=0.14) in the IH than in the SIH group. Immunohistochemistry identified higher number of beta cells in IH than in SIH group (P=0.14). Glucose levels measured in serum by enzymatic colorimetric methods was lower in IH than in SIH group (P=0.025). Significantly higher serum insulin quantified by ELISA and lower glucagon levels quantified by EIA were seen in the IH group when compared with SIH. Calculations of homeostasis model assessment (HOMA) for insulin resistance suggest higher sensitivity in IH than in SIH mice (P=0.09). HOMA for beta-cell function was higher in IH than in SIH mice (P=0.014). Body weight, adjusted for food intake, was relatively stable during the experiment. No significant differences in lipid profile were encountered. Conclusions: These results suggest that IH causes changes in pancreatic function that may be not related to expression of mRNA UCP2.

Resumo não disponível.

O dano ao ADN pode estar associado com o diabetes mellitus tipo II (T2DM) e suas complicações, incluindo estresse oxidativo. Os parâmetros bioquímicos relacionados com o metabolismo glicídico (glicose, insulina, TTG e TSI) e parâmetros corporais (peso corporal, tecido adiposo) foram avaliados após 12 meses de tratamento com dieta hiperlipídica e dieta hiperlipídica aquecida. Após o período experimental, os ratos tratados com dietas hiperlipídicas obtiveram aumento de peso corporal e aumento de glicemia e insulinemia quando comparado ao grupo controle normolipídico. A dieta hiperlipídica (HFD) e a dieta hiperlipídica aquecida (HFTD) também levaram a uma redução na sensibilidade à insulina e na tolerância à glicose, independentemente dos tempos estudados. Interessantemente, somente os animais submetidos à dieta aquecida demonstraram redução na oxidação de glicose pelo tecido adiposo epididimal. Mostramos que ambas as dietas hiperlipídicas tem a capacidade de reduzir a síntese de glicogênio pelas vias, direta e indireta. A dieta aquecida acarretou um aumento significativo na peroxidação lipídica no fígado em relação aos demais grupos. Utilizando o ensaio cometa, verificamos um aumento significativo de dano ao ADN em sangue e hipocampo dos ratos submetidos às dietas hiperlipídicas, tendo o grupo HFTD aumento maior em relação ao HFD. Estes resultados sugerem que uma correlação positiva entre dieta hiperlipídica, alteração no metabolismo glicídico, estresse oxidativo e dano ao ADN. Contudo, o aquecimento da dieta parece agravar tais resultados. / Many studies have demonstrated that DNA damage may be associated with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and its complications. The goal of this study was to evaluate the effects of the potential relationship between fat (thermolyzed) intake, glucose dyshomeostasis and DNA injury in rats. Biochemical parameters related to glucose metabolism (i.e., blood glucose levels, insulin tolerance tests, glucose tolerance tests and fat cell glucose oxidation) and general health parameters (i.e., body weight, retroperitoneal and epididymal adipose tissue) were evaluated in rats after a 12-month treatment with either a high fat or a high thermolyzed fat diet. The high fat diet (HFD) and high fat thermolyzed diet (HFTD) showed increased body weight and impaired insulin sensitivity at the studied time-points in insulin tolerance test (ITT) and glucose tolerance test (GTT). Interestingly, only animals subjected to the HFTD diet showed decreased epididymal fat cell glucose oxidation. We show which high fat diets have the capacity to reduce glycogen synthesis by direct and indirect pathways. HFTD promoted an increase in lipid peroxidation in the liver, demonstrating significant damage in lipids in relation to other groups. Blood and hippocampus DNA damage was significantly higher in animals subjected to HFDs, and the highest damage was observed in animals from the HFTD group. Striatum DNA damage was significantly higher in animals subjected to HFDs, compared with the control group. These results show a positive correlation between high fat diet, glucose dyshomeostasis, oxidative stress and DNA damage.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2012 / Bibliografia: f. [47], 56 / Introdução: A busca de uma fonte renovável e de fácil obtenção de células com capacidade de produção e secreção de insulina de modo regulado, para reposição das células perdidas no Diabetes Melito tipo 1 (DM1), é um tema de enorme interesse e uma alt / Introduction: The search for a renewable source of cells with insulin-producing capacity to replace cells destroyed by the autoimmune process in Type 1 Diabetes Mellitus, is a very interesting subject and a promising therapeutic alternative for this

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2009 / Bibliografia: f. 64-73 / Introdução: a busca de uma fonte renovável e de fácil obtenção, de células com capacidade de produção e secreção de insulina de modo regulado, para reposição das células ß perdidas no Diabetes Melito tipo 1, é um tema de enorme interesse e uma alternativa / Introduction: the search for a renewable source of cells with insulin-producing capacity to replace ß cells destroyed by the autoimmune process in Type 1 Diabetes Mellitus, is a very interesting subject and a promising therapeutic alternative for this dis

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2009 / Bibliografia: f.48-54 / Introdução: A busca de uma fonte renovável e de fácil obtenção de células com capacidade de produção e secreção de insulina de modo regulado, para reposição das células ß perdidas no Diabetes Melito tipo 1 (DM1), é um tema de enorme interesse e uma altern / Introduction: The search for a renewable source of cells with insulin-producing capacity to replace ß cells destroyed by the autoimmune process in Type 1 Diabetes Mellitus, is a very interesting subject and a promising therapeutic alternative for this dis

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-01-20T13:50:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1066929 bytes, checksum: 6fba09d20e0a47560175c7acd46b586e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-20T13:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1066929 bytes, checksum: 6fba09d20e0a47560175c7acd46b586e (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nesta pesquisa, estudamos o tempo de eficiência das insulinas de DNA recombinante via modelos para os testes de vida acelerados. Para isso, foi avaliada, periodicamente, a perda de potência dessas insulinas, submetidas às condições de temperatura de 8ºC, 25ºC e 37ºC, inseridas num contexto de ensaios acelerados. Essa proposta envolveu a utilização da metodologia para os testes de vida acelerados em estudos de dados reais através dos softwares R e Minitab. Ela teve como objetivos: o estudo da influência da temperatura no tempo da perda de potência das insulinas; a aplicação de técnicas gráficas e do teste da razão de verossimilhança para escolha do modelo que melhor se ajuste aos dados; a extrapolação das estimativas obtidas em momentos de estresse para as condições normais de uso e a apresentação ao mundo acadêmico de uma aplicação desses testes aos dados reais da engenharia genética. A análise, de abordagem classica, tomou como referência os estudos de alguns pesquisadores que, para tratar a censura intervalar presente nos dados, passaram a considerar os intervalos censurados como tempos exatos de falha. Os resultados mostraram que, por meio dos testes de vida acelerados, os fabricantes não só serão capazes de produzir insulinas com mais qualidade e confiabilidade, em tempo recorde, bem como poderão ter os prejuízos minimizados por calcular o prazo de garantia e a validade desses produtos com estimativas de tempos de falha confiáveis, oferecendo, assim, produtos com mais eficiência. / Dans cette recherche, nous étudions la durée (le temps) de éfficacité de lºinsuline dºADN recombinant par les modeles de testes de vie accélérés. Raison pour laquelle a été avaliée, périodiquement, la perte de lºefficacité de ces insulines que sont sumises a des conditions de température de 8ºC, 25ºC et 37ºC, inserées dans un contexte de testes accélérés. Cette proposition a impliquée lºutilisation de la méthodologie par les testes de vie accélérés et les études de données réelles par moyen softwares R et Minitab. Ayant ainsi pour objectifs: lºétude de lºinfluence de la temperature au moment de la perte dºefficacité des insulines; lºapplication de techniques graphiques et du teste de la raison de vraissemblance pour le choix du modele que mieux sºajuste aux données; lºextrapolation des estimatives obtenues au moment du stress (tension) pour les conditions normales dºusage et la présentation au monde académique dº une application de ces testes aux données réelles de lº ingénierie génétique. Lºanalyse, de lºapproche classique, a pris pour référence les études de quelques chercheurs qui pour traiter la censure entre intervale présent dans les données, sont passés a considérer les intervales censurées comme temps exacte de faille. Les résultats ont montré que, par moyen de testes de vie accélérés, les fabricants ne seront pas seulement capables de produire des insulines de bonnes qualités et fiables, en temps record, mais aussi aurons leurs préjudices assez minimisés en ce qui concerne le délai de validité de ces produits avec les estimatives de la durée de faille confiable, tout en offrant ainsi, de produits plus efficace. / We have studied in the present research the efficiency rate of recombinant DNA insulin through models for accelerated life testing. For this purpose, we have periodically assessed the power loss for this type of insulin when it is subjected to temperature conditions of 8ºC, 25ºC, and 37ºC, and inserted in a context of accelerated life testing. This plan involved the use of a methodology for accelerated life testing and real data study by means of the softwares R and Minitab. This research had as its objectives: the study of the influence of temperature on the rate of insulin power loss; the application of graphical techniques and of likelihood-ratio testing in choosing the best suited model for the data; the extrapolation of estimations made in moments of stress to include normal usage conditions, and the presentation to academia of an instance of application of these tests to a real data from genetic engineering. The analysis, which was made in a classical approach, had as reference the research of a number of researchers-who, in order to cope with the interval censoring in the data, started to consider the censored intervals to be exact failure times. The results show that by means of the accelerated life tests not only the manufacturers will be able to produce insulin in record time with greater quality and reliability, but they will also manage to incur minimized losses, given that they will have the ability to calculate their products” dates of expiration and warranty periods based on reliable failure times and, therefore, to provide more efficient products. / Sem lattes