Orientador: Doris Hissako Sumida / Banca: Carlos Antonio de Miranda Bomfim / Banca: Rossana Abud Cabrera Rosa / Resumo: A programação fetal sugere que estímulos adversos quando aplicados durante o início do desenvolvimento fetal podem alterar o metabolismo da prole, aumentando o risco de doenças na sua vida adulta. Estudos demonstraram que a doença periodontal materna em ratas promove resistência insulínica (RI) em sua prole adulta. Entretanto, estudos que investigaram os efeitos da lesão periapical (LP) materna sobre a saúde da prole são escassos. A LP é uma inflamação no ápice da raiz dental ocasionada geralmente a partir de infecção por bactérias advindas do sistema de canal radicular. Esta patologia está associada com o aumento de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) que pode estimular quinase do inibidor kappa B (IKK) e c-Jun amino-terminal quinase (JNK), as quais promovem a fosforilação do substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1) em resíduos de serina, resultando na atenuação do sinal insulínico (SI), contribuindo com a RI. Nesse contexto, tornou-se fundamental investigar se a LP materna também promove RI em sua prole adulta. Em vista disso, os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos da LP materna em ratas sobre as concentrações plasmáticas de glicose, insulina e TNF-α, sensibilidade à insulina e as vias insulínica e inflamatória no músculo gastrocnêmio (MG) e tecido adiposo branco periepididimal (TABp) de sua prole adulta. Para tanto, as 15 ratas Wistar (2 meses de idade) foram distribuídas em 3 grupos: 1) ratas controle; 2) ratas com uma LP induzida em primeiro molar superi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fetal programming suggests that adverse stimuli applied during early fetal development can alter metabolism of the offspring, increasing the risk of disease in adulthood. Studies have shown that maternal periodontal disease in rats promotes insulin resistance (IR) in their adult offspring. However, there is a scarcity of research that investigated the relationship between maternal periapical lesion (PL) and health of offspring. PL is inflammatory process around the apex of a tooth root, caused by bacterial infection of the pulp and root canal system. This pathology is associated with increased tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) which may stimulate inhibitor of kappa B kinase (IKK) and c-Jun amino-terminal kinase (JNK), which promote phosphorylation of substrate insulin receptor 1 (IRS-1) on serine residues, resulting in insulin signal (IS) attenuation, contributing to IR. In this context, it has become essential to investigate whether maternal PL also promotes IR in their offspring. This study aimed to investigate the effects of maternal PL in rats on plasma concentrations of glucose, insulin and TNF-α, insulin sensivity and the insulin and inflammatory signaling pathways in gastrocnemius muscle (GM) and periepididimal white adipose tissue (pWAT) of their adult offspring. Fifteen female Wistar rats (2 months old) were distributed in 3 groups: 1) control rats; 2) rats with 1 PL, which was induced in the right maxillary first molar; 3) rats with 4 PL, which were induced in the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tesis para optar al Grado de Doctor en Nutrición y Alimentos. / Introducción: El glucagón, junto con la insulina, son las principales hormonas responsables de mantener la glicemia dentro de rangos fisiológicos durante el día. Pese a que desde hace largo tiempo se sabe que la secreción de glucagón aumenta en respuesta a disminuciones de la glicemia, los mecanismos mediante los cuales ésta regula la secreción de glucagón no son del todo claros. El Zn es un mineral que se encuentra altamente concentrado en las vesículas de secreción de insulina de las células β, siendo liberado en grandes cantidades junto con ésta y pudiendo contribuir a la supresión de la secreción de glucagón mediante distintos mecanismos, incluyendo la interacción con canales iónicos específicos y a través de sus propiedades insulino-miméticas. Distintos estudios señalan que los pacientes con DM presentan una desregulación de la secreción de glucagón caracterizada por un aumento absoluto o relativo de su secreción así como por una disminución de su supresión en respuesta a la glucosa. A su vez, distintos estudios han mostrado que pacientes con DM2 tienden a presentar una deficiencia de Zn, mientras que estudios de suplementación muestran que éste contribuye a un mejor control de la glicemia. Considerando lo anterior, se decidió evaluar el efecto que tiene la suplementación con Zn sobre la secreción de glucagón, la relación entre éste y la glicemia e insulina y sobre la regulación de la glicemia, postulándose la hipótesis de que la suplementación crónica con Zn en pacientes con DM2 disminuye en un 10% la secreción de glucagón, lo cual está asociado a un aumento en la expresión del transportador de Zn ZnT-8 y a un aumento en la secreción de y en la sensibilidad a la insulina. Materiales y Método: Treinta y seis individuos fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos, uno de los cuales recibió un suplemento con 30 mg/día de Zn durante un año mientras que el otro recibió un placebo. Al ingreso y al año se evaluaron a través de un “screening” tanto la ingesta de Zn como distintos indicadores de estado nutricional de Zn, además del control glicémico, el estado inflamatorio, el estado de estrés oxidativo y una serie de parámetros antropométricos y bioquímicos. También se evaluaron mediante una curva modificada de tolerancia a la glucosa con muestreo frecuente, tanto la concentración plasmática de glucagón, insulina y glicemia, como distintos parámetros relativos a la homeostasis de la glucosa, los cuales fueron determinados de acuerdo con el modelo mínimo de Bergman. Resultados: No hubo diferencias significativas en la concentración plasmática de glucagón, insulina o glicemia ni en la supresión de la secreción de glucagón en respuesta a la suplementación con Zn. Sin embargo, mientras el grupo control presentó correlaciones significativas entre la concentración plasmática de glucagón en respuesta a la infusión de insulina y la resistencia a la insulina, el índice de masa corporal, la circunferencia de cintura, la concentración plasmática de colesterol LDL y la concentración plasmática de Proteína C Reactiva ultrasensible, estas correlaciones no se presentaron o fueron atenuadas en respuesta a la suplementación con Zn. xiv Conclusión: La suplementación con Zn disminuye el efecto de la resistencia a la insulina en células α de pacientes con DM2 / Introduction: Glucagon and insulin are the main hormones responsible for keeping blood glucose within physiological range throughout the day. Although it is known since long time ago that glucagon rises in response to blood glucose decrease, the mechanisms involved are still less clear. Zn is a mineral highly concentrated in insulin-containing vesicles from β cells, being released in substantial amounts together with such hormone and it possibly contributes to suppress glucagon secretion by distinct mechanisms, including the interaction with specific ionic channels and through its insulin-mimetic properties. Different studies pointed out that patients with DM show a dysregulation of glucagon secretion, characterized by an absolute or relative increased secretion and by a decreased suppression in response to glucose. In addition, several studies have shown that patients with T2DM have Zn deficiency, and that Zn supplementation improves glycemic control. Considering the aforementioned, we investigated the effect of Zn supplementation on glucagon secretion, the relationship between glucagon, insulin and glycemia, and on glycemic control, postulating the hypothesis that chronic Zn supplementation in T2DM patients decreased in 10% glucagon secretion, which is related with an increase in the expression of Zn transporter ZnT-8 and to an increase in the secretion and sensitivity to insulin. Materials and methods: Thirty six subjects were randomly assigned to one of two groups; one received a 30 mg/day Zn supplement during a year while the other received a placebo. Zn intake and nutritional status, glycemic control, inflammatory and oxidative stress indicators as well as anthropometric and biochemical parameters were investigated at the beginning and at the end of the study. Plasma glucagon and insulin concentration, glycemia and different parameters relatives to glucose homeostasis and calculated according to Bergman’s minimal model were also investigated by using the modified Frequently Sampled Intravenous Glucose Tolerance Test. Results: There were no significant differences in plasma glucagon or insulin concentration, glycemia, or glucagon suppression in response to Zn supplementation. However, while the placebo group showed significant positive correlations between plasma glucagon after insulin infusion and insulin resistance, body mass index, waist circumference, LDL-cholesterol and ultrasensitive C Reactive Protein, those correlations were absent or attenuated in response to Zn supplementation. Conclusion: Zn supplementation decrease insulin resistance in α cells of T2DM patients

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la insulinoresistencia como marcador pronóstico en cirrosis hepática avanzada en pacientes que han acudido al consultorio externo de gastroenterología del Hospital Alberto Sabogal Sologuren, así como aquellos pacientes hospitalizados en el Servicio de Especialidades Médicas 2 a cargo de gastroenterología durante el periodo de marzo del 2013 a marzo del 2014. Estudio prospectivo, descriptivo, observacional, correlacional. Se analizaron 125 pacientes con un promedio de edad de 61,70 años (DS: 43,84). Obtiene que el 58% (73) del total de los pacientes bajo estudio fueron mujeres; el 65% (81) presentaron edades entre 61 a 80 años y el 24% (30) edades entre 51 a 60 años. El 50% (63) presentaron etiología de cirrosis hepática desconocida, el 15% (19) presentaron etiología alcohólica y hepatitis C crónica, respectivamente y el 12% (15) hepatitis crónica B; el 44% (55) presentaron como escala de Child Pugh la B y el 35% (44) la A; el 63% (79) tuvieron valores de HOMAR-IR, menor a 3,2; el 62% (78) presentaron como valores de potasio 3,7 a 5,2 mEq/l. El 77% (96) del total de pacientes bajo estudio tuvieron valores de fósforo sérico menor de 2,4 a 4,1 mg/dl, el 14% (17) mayor a 4,1 mg/dl y el 53% (10) del total de pacientes con cirrosis por alcohol tuvieron valores de fósforo sérico menor de 2,4 mg/dl y el 26% (5) mayor a 4,1 mg/dl. Existe relación y correlación moderada inversa entre los valores de HOMAR-IR y escala de Child Pugh; y, existe relación y correlación leve inversa entre los valores de potasio y escala de Child Pugh con un p=0.000, respectivamente. Concluye que la insulinoresistencia se encuentra en estadios Child Pugh avanzados, pudiéndose considerar como marcador pronóstico, La hipokalemia está presente en estadios avanzados, siendo mecanismo desencadenante en estos pacientes, la hipofosfatemia se encuentra presente en cirrosis alcohólica, siendo el mecanismo patogénico de Insulinoresistencia en estos pacientes. / Trabajo académico

A crescente incidência de disfunções metabólicas, como resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), está correlacionada com a elevação da ocorrência de obesidade e sobrepeso. Em busca da melhora da saúde e de um corpo ideal segundo os padrões estéticos propagados atualmente, um número cada vez maior de indivíduos adere às dietas da moda que prometem rápida redução do peso corporal, ao invés de adotar uma alimentação balanceada e a prática regular de exercícios físicos. Uma dieta bastante divulgada e até recomendada por profissionais da saúde é o jejum intermitente (JI), que consiste em alternar períodos de jejum de até 24 horas com períodos de ingestão alimentar. Diversos estudos experimentais têm relatado alterações metabólicas em consequência do JI, como modificações da glicemia e da tolerância à glicose, porém, os resultados encontrados na literatura são conflitantes e, além disso, o impacto do jejum intermitente, em longo prazo, sobre as ilhotas pancreáticas ainda não foi devidamente elucidado. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo caracterizar os impactos de doze semanas de JI em ratas Wistar. Para tal, ratas Wistar com 30 dias de idade foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos: controle, com livre acesso à ração balanceada; e jejum intermitente, submetido a 24 horas de jejum intercalado com 24 horas de livre acesso à ração balanceada. Foi observado que os animais submetidos ao JI, apresentaram menor ganho de peso corporal, redução do comprimento da tíbia e da distância naso-anal, e alteração da composição corporal, incluindo diminuição da massa muscular e aumento do tecido adiposo. Em média, o consumo de ração do grupo JI foi menor, porém, no dia que era disponibilizado alimento, os animais apresentaram hiperfagia o que resultou em grande aumento das dimensões do estômago. O jejum intermitente reduziu os valores plasmáticos do colesterol total, triglicérides, LDL, HDL e glicemia, e aumentou a concentração basal da insulina plasmática, bem como a secreção da insulina após o estímulo com glicose. Foi observada redução significativa da massa de ilhotas pancreáticas e aumento da porcentagem de células dispersas de ilhotas em apoptose. Ainda nas células dispersas de ilhotas pancreáticas, houve aumento do conteúdo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial e total, e do peróxido de hidrogênio (H2O2), além de aumento da expressão do sistema antioxidante. Assim, nossos dados sugerem que esse protocolo estudado de 24 horas de jejum intercalados com 24 horas de alimentação à vontade não seja saudável em longo prazo. Mais estudos em longo prazo são necessários para investigar qual seria o melhor protocolo de jejum intermitente de forma a reduzir os efeitos colaterais e melhorar a saúde, para então o JI ser considerado uma boa alternativa para perda e manutenção do peso. / The increasing incidence of metabolic dysfunctions, such as insulin resistance and type 2 diabetes mellitus (T2DM), is correlated with increased occurrence of obesity and overweight. In pursuit of improved health and an ideal body according to today\'s aesthetic standards, an increasing number of individuals adhere to fad diets that promise a rapid reduction of body weight, instead of adopting a balanced diet and regular practice of physical exercises. A well-publicized diet and even recommended by health professionals is intermittent fasting (IF), which consists of alternating fasting periods of up to 24 hours with periods of food intake. Several experimental studies have reported metabolic changes as a consequence of IF, such as changes in glucose and glucose tolerance, but the results found in the literature are conflicting and, in addition, the impact of intermittent fasting in the long term on pancreatic islets has not yet been properly elucidated. Thus, the present study aimed to characterize the effects of twelve-week IF on Wistar rats. For this, 30-day-old Wistar rats were randomly assigned to two groups: control, with free access to balanced chow; and intermittent fasting, subjected to 24-hour fast intercalated with 24 hours of free access to the balanced chow. It was observed that the animals submitted to IF presented lower body weight gain, reduced tibia length and naso-anal distance, and altered body composition, including decreased muscle mass and increased adipose tissue. On average, the dietary intake of the IF group was lower, but on the day that food was available, the animals presented hyperphagia which resulted in a large increase in the stomach size. Intermittent fasting reduced plasma levels of total cholesterol, triglycerides, LDL, HDL, and glycaemia, and increased basal plasmatic insulin level, as well as insulin secretion after stimulation with glucose. We observed significant reduction in pancreatic islet mass and increase in percentage of islet-dispersed cells in apoptosis. Still in islet-dispersed cells, there was an increase in mitochondrial and total reactive oxygen species content, and of hydrogen peroxide (H2O2), in addition to an increase in expression of antioxidant system. Thus, our data suggest that this protocol of 24-hour fasting intercalated with 24-hour feed at will is not healthy in the long run. More long-term studies are needed to investigate the best intermittent fasting protocol in order to reduce side effects and improve health, so IF be considered a good alternative for weight loss and maintenance.

Los pacientes con Diabetes tipo 1 (DM1) e hipoglucemias graves de repetición presentan de manera generalizada una alteración en la percepción y la respuesta sintomática ante las mismas. La utilización de sistemas de infusión subcutánea contínua de insulina mejora ambas alteraciones y estas mejoras se producen sin objetivarse un deterioro en el control glucémico evaluado por hemoglobina glucosilada (HbA1c) junto con una mejoría en los parámetros de variabilidad glucémica. Asimismo, su uso se asocia a una mejoría en la calidad de vida de estos pacientes. Inclusive en un grupo de pacientes jóvenes con DM1, la presencia de un mayor grado de aterosclerosis preclínica se asocia fundamentalmente a la edad y a la duración de la enfermedad. Las alteraciones pueden observarse en diferentes territorios vasculares y se asocian a defectos en la función endotelial. Aquellos pacientes con un mayor grado de aterosclerosis preclínica tienden a presentar peores perfiles de control metabólico y de parámetros de inflamación crónica. Los episodios repetidos de hipoglucemia confieren además de lo ya mencionado, un peor pronóstico cardiovascular a estos pacientes. / Title: “Continuous subcutaneous insulin infusion and continuous glucose monitoring systems in Type 1 Diabetes. Cardiovascular risk profile in patients with labile glycemic control due to repeated severe hypoglycemia” Short running title: “Hypoglycemia and atherosclerosis in Type 1 Diabetes” Abstract: Type 1 diabetic (T1D) patients with repeated severe hypoglycemic episodes usually show a reduced ability to recognize hypoglycemic signs and symptoms. The use of continuous subcutaneous insulin infusion not only improves both alterations but also is associated with a non deletereous effect in metabolic control evaluated in terms of glycated hemoglobin (HbA1c) and with an improvement in glycemic variability. Moreover, the use of these systems is associated with an improvement in self-reported quality-of-life. Even in a group of young adult patients with T1D, the presence of atherosclerosis is mostly related to age and disease duration. Both endothelial dysfunction and structural damage in different territories might be present in these subjects. Patients with higher degrees of atherosclerosis present worse glycemic control and alterations in different inflammation parameters. Repeated episodes of hypoglycemia are also associated with a worse cardiovascular prognosis in these subjects.

A pesar de que el concepto de diabetes gestacional (DMG) como lo entendemos actualmente data de 1979, las primeras referencias que nos constan son del siglo XIX (Bennewitz 1824, Duncan 1882), y antes de 1979 ya se hab'an publicado estudios de cribaje, diagnóstico y mortalidad perinatal (Hoet 1954, Wilkerson 1957, O'Sullivan y Mahan 1964, Pedersen 1967, Mestman 1971). En la actualidad, la DMG se define como la intolerancia a la glucosa de gravedad variable con inicio o primer reconocimiento durante la gestación. Este concepto fue incluido en la clasificación diagnóstica de la diabetes mellitus (DM) por el National Diabetes Data Group (NDDG) en 1979 (NDDMG 1979), y por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1980 (WHO 1985). En el primer Workshop sobre DMG en 1980 (ADA 1980) ya se adoptó dicha ón, y en el segundo, se añadió el concepto de que debe aplicarse independientemente de si es necesario el tratamiento insulínico o de si persiste la alteración metabólica en el posparto (ADA 1985). Estas consideraciones se han mantenido también en el tercer y cuarto Workshops. Ello no obvia la necesidad de reclasificar la tolerancia a la glucosa en el posparto en todas las mujeres afectas. La prevalencia de la DMG en diferentes poblaciones oscila entre el 0,15 y el 15% (tabla 1), interpretándose las diferencias por variaciones geográficas y étnicas (King 1998) además de la influencia de la utilización de diferentes métodos de cribaje y diagnóstico (Oats 1988, Dornhorst 1990, O'Sullivan 1991, Schwartz 1999). Así, en un grupo de 8857 mujeres gestantes, el diagnóstico de DMG se realizó en el 3,21% utilizando los criterios de NDDG y en el 4,95% según los de Carpenter y Counstan (Schwartz 1999). El riesgo de DMG aumenta con la edad materna, el sobrepeso, la paridad, los antecedentes familiares de DM y el antecedente de resultados adversos en embarazos previos, observándose además un aumento de prevalencia en los últimos años (King 1998). Esta entidad se asocia a un aumento de la morbilidad materna y fetal tanto en el período perinatal como a largo plazo. Se ha descrito un mayor riesgo de preeclampsia, hidramnios y parto por cesárea, además de un mayor riesgo en el feto de macrosomía, traumatismo obstétrico, síndrome de distrés respiratorio y alteraciones bioquímicas transitorias (O'Sullivan 1973, Gyves 1977, Kitzmiller 1978, Widness 1985). La DMG también se acompaña de un mayor riesgo de diabetes DMNID a largo plazo en la madre (Mestman 1988, O'Sullivan 1991) y de diabetes, obesidad y alteración del desarrollo intelectual y psicomotor en sus hijos (Freinkel 1980, Pettitt 1991, Silverman 1998). Dado que tanto las repercusiones perinatales como a largo plazo se han asociado a un ambiente metabólico intrauterino adverso (Pettitt 1993, De Veciana 1995, Silverman 1998) es importante tanto el diagnóstico como su tratamiento para prevenirlas.

La función de las caveolas y de la caveolina in vivo ha sido motivo de controversia, de hecho se han implicado en procesos de endocitosis y transcitosis, transporte de colesterol y ácidos grasos, regulación de procesos de transducción de señales y tumorigénesis (Liu et al., 2002). Sin embargo, la generación de los ratones KO de caveolina-1 (Drab et al., 2001; Razani et al., 2001a) mostraba que estos ratones eran perfectamente viables y fértiles, aunque estudios posteriores relacionaban a caveolina-1 con la homeostasis lipídica (Razani et al., 2002a).A partir de estos antecedentes, el objetivo general de esta tesis ha sido: · Definir la función de las caveolas/ caveolina-1 en la fisiología del adipocitoNos planteamos así, nuestro primer objetivo:1- Obtención de líneas 3T3L1 deficientes en caveolina-1 mediante silenciamiento génico posttranscripcional.2- Analizar la presencia de caveolas y la distribución de la caveolina-1 remanente en las membranas de los adipocitos y estudiar la estructura y composición de los rafts lipídicos/caveolas en estos adipocitos deficientes en caveolina-1.3- Analizar la diferenciación adipocitaria de los preadipocitos 3T3L1 deficientes en caveolina-1. 4- Analizar la acción de la insulina en los adipocitos deficientes en caveolina-1, 5- Estudiar el papel de caveolina-1 en el metabolismo lipídico del adipocito.A partir de los objetivos planteados conseguimor obtener las siguientes conclusiones en el desarrollo de esta tesis:1. Se ha conseguido la transducción eficiente de adipocitos 3T3L1 maduros usando estas partículas lentivirales que expresan transgenes, aunque no se ha logrado transducir los adipocitos maduros eficazmente en el caso de los lentivirus que expresan moléculas de siRNA.2. Los preadipocitos 3T3L1 son eficientemente transducidos usando las partículas lentivirales que permiten la expresión tanto de transgenes como de moléculas de siRNA. Mediante esta técnica hemos generado líneas estables 3T3L1 que expresan moléculas de siRNA de caveolina-1 y que presentan una reducción en la expresión de la proteína caveolina-1 de más del 93%.3. La disminución de la proteína caveolina-1 en más de un 93% en adipocitos 3T3L1 provoca una disminución equivalente en el número de caveolas en la membrana plasmática.4. La deficiencia en caveolina-1 en los adipocitos 3T3L1 no afecta a la localización de los marcadores proteicos y lipídicos característicos de los rafts lipídicos, que continúan recuperándose en las fracciones ligeras de los extractos celulares durante el aislamiento bioquímico de los rafts lipídicos. 5. La deficiencia en caveolina-1 y caveolas no afecta a la diferenciación de los preadipocitos 3T3L1 a adipocitos maduros, ni tampoco a las características morfológicas y el contenido lipídico (triacilglicéridos y colesterol) de los adipocitos maduros. 6. Los adipocitos 3T3L1 con una disminución del 93% en la expresión de caveolina-1, presentan una reducción del 50% en la expresión de las proteínas GLUT4 y del 40% en el caso del receptor de insulina, sin que este hecho responda a una menor cantidad de sus RNA mensajeros, sino a una disminución en la vida media de estas proteínas. Este dato sugiere que caveolina-1 participe en la estabilidad de estas proteínas.7. El déficit de caveolina-1 en los adipocitos 3T3L1 no afecta a las vías de señalización de la insulina (dependiente de PI3K y dependiente de Cbl-TC10) ni tampoco a la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática inducida por la insulina ni a la estimulación del transporte de glucosa. 8. La presencia de caveolas/caveolina-1 no es necesaria para la correcta internalización de GLUT4 durante la reversión de la acción de la insulina.9. Las caveolas/caveolina-1 tampoco son necesarias para la acción de la insulina inhibiendo o activando la lipólisis y la lipogénesis en los adipocitos 3T3L1, respectivamente.10. La deficiencia de caveolina-1 y caveolas no altera el transporte de ácido palmítico a través de la membrana plasmática de adipocitos 3T3L1.Esta deficiencia tampoco altera la activación lipolítica por los efectores beta-adrenérgicos: Isoproterenol 10mu-M e IBMX 0,5mM en los adipocitos 3T3L1.PALABRAS CLAVE: Cavelonia-1, Caveola, Adipocito, Insulina, GLUT4, Receptor de insulina / Caveolae are a specialized type of lipid rafts that are stabilized by oligomers of caveolin protein. Caveolae are particularly enriched in adipocytes. Here we analyzed the effects of caveolin-1 knockdown and caveolae ablation on adipocyte function. To this end, we obtained several multiclonal mouse 3T3-L1 cell lines with a reduced expression of caveolin-1 (95% reduction) by a small interfering RNA approach using lentiviral vectors. Control cell lines were obtained by lentiviral infection with lentiviral vectors encoding appropriate scrambled RNAs. Caveolin-1 knockdown adipocytes showed a drastic reduction in the number of caveolae (95% decrease) and cholera toxin-labeling was reorganized in dynamic plasma membrane microdomains. Caveolin-1 depletion caused a specific decrease in GLUT4 glucose transporter and insulin receptor protein levels. This reduction was not the result of a generalized defect in adipocyte differentiation or altered gene expression but was explained by faster degradation of these proteins. Caveolin-1 knockdown adipocytes showed reductions in insulin-stimulated glucose transport, insulin-triggered GLUT4 recruitment to the cell surface and insulin receptor activation. In all, our data indicate that caveolin-1 loss-of-function reduces maximal insulin response through lowered stability and diminished expression of insulin receptors and GLUT4. We propose that caveolin-1/caveolae control insulin action in adipose cells.

La resistencia a la insulina es un estado patológico que se define como la incapacidad del organismo de responder normalmente a las acciones de la insulina. Este estado está ligado a la obesidad, al estilo sedentario de vida y es responsable en gran medida de la aparición de la diabetes de tipo 2. Aunque tradicionalmente el estudio de esta patología se había centrado en el metabolismo de carbohidratos, en las últimas décadas se ha producido un cambio hacia el estudio del metabolismo de ácidos grasos como principal promotor de esta enfermedad. De este modo, se ha demostrado una correlación entre la acumulación de lípidos en tejidos periféricos (hígado y músculo principalmente) y la aparición de resistencia a la insulina.El músculo es el responsable de la mayor parte del metabolismo de la glucosa en situaciones de estimulación por insulina. Esto confiere al músculo una vital importancia en el desarrollo de la resistencia a la insulina así como para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Numerosos estudios han descrito que la acumulación de especies derivadas de ácidos grasos en músculo, ya sea debido a un aporte excesivo de lípidos o a un fallo en su oxidación, conducen a una resistencia a la insulina. Estas especies derivadas de ácidos grasos actúan interfiriendo en la señalización de la insulina mediante la activación de una serie de proteínas, conduciendo a una desensibilización del músculo a las acciones de la insulina.En esta tesis se ha estudiado si un aumento en la oxidación de ácidos grasos en músculo es capaz de impedir la acumulación de sus derivados lipídicos y por lo tanto evitar la resistencia a la insulina ocasionada por ellos. Con este objetivo se han usado dos aproximaciones experimentales. En primer lugar, se ha evaluado el efecto de la sobreexpresión de la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT I), que es la enzima responsable del control del transporte de ácidos grasos a la mitocondria, donde serán oxidados, y en segundo lugar, se ha estudiado el efecto del C75, un activador de la CPT I recientemente descrito. Además, también se ha estudiado el papel de otra proteína recientemente involucrada en el control de la oxidación de ácidos grasos en músculo, la FAT/CD36. Todo esto se ha llevado a cabo usando como modelo de estudio células de músculo esquelético de rata L6E9.Los resultados presentados en esta tesis demuestran que la sobreexpresión de CPT I ha resultado efectiva en el aumento de la oxidación de ácidos grasos, impidiendo su acumulación y por lo tanto protegiendo a la célula de la resistencia a la insulina. En cambio, se ha demostrado que el C75, a través de su activación a C75-CoA, se comporta como un inhibidor de la CPT I y por lo tanto de la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. Por último, no se ha podido demostrar que FAT/CD36 juegue un papel importante en la oxidación de ácidos grasos en las condiciones de estudio utilizadas. Estos resultados confirman la importancia del metabolismo lipídico en la resistencia a la insulina en músculo y describen la CPT I como una posible diana farmacológica para el tratamiento de la resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 2. Por otro lado describen una nueva acción del C75 sobre la actividad CPT I y sugieren la necesidad de realizar más estudios para esclarecer el papel de FAT/CD36 en la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. / Skeletal muscle is responsible for 70-80% of whole-body insulin-stimulated glucose uptake and is therefore generally considered the most important site of insulin resistance. Insulin resistance in skeletal muscle plays a major role in the pathogenesis of type 2 diabetes although the mechanism responsible remains unclear. Intramuscular lipid accumulation is evident in a wide set of experimental models, including humans, rodents and muscle cells in culture. These observations have promoted the so-called lipotoxic model of skeletal muscle insulin resistance, which proposes that high plasma fatty-acid levels observed in the obese or insulin-resistant state lead to muscle lipid accumulation, which in turn causes a predisposition towards decreased insulin sensitivity and worsening of the disease.In this thesis we have tested the hypothesis that increases in fatty-acid oxidation should protect from fatty acid induced-insulin resistance by reducing lipid accumulation in the muscle cell. For this purpose we have used two experimental approaches: a) the overexpression of carnitine palmitoyltransferase I (CPT I), the rate-limiting enzyme in fatty acid import into mitochondria for oxidation, and b) study the effect of C75, a recently described CPT I agonist, in fatty-acid oxidation in muscle cells. Moreover we have studied the role of FAT/CD36, a protein recently described to be involved in beta-oxidation in muscle, in the rat skeletal muscle cultured cell line L6E9.Overexpression of LCPT I in L6E9 myotubes increased CPT I activity and palmitate oxidation, preventing lipid accumulation. As a result insulin sensitivity was completely restored. In contrast, C75 acted as an inhibitor of CPT I activity and palmitate oxidation, instead of an activator, both in muscle cells and in mice muscle in vivo. Finally, FAT/CD36 had not an important role in the control of fatty-acid oxidation in L6E9 myoutbes under our experimental conditions. These data confirm the importance of lipid metabolism in muscle insulin resistance and describe CPT I as a possible pharmacologic target for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes. Moreover, we describe a new role of C75 over CPT I activity and fatty-acid oxidation in skeletal muscle.

La obesidad y la diabetes tipo 2 son patologias en las cuales se ha demostrado una desregulación del metabolismo de ácidos grasos. Una acumulación de lípidos en otros tejidos distintos del tejido adiposo, entre los que sobresalen el músculo, páncreas e hígado conduce a la aparición de la resistencia a la insulina en el músculo, una secreción incontrolada de insulina en el páncreas y al desarollo de una esteatosis hepática. Estas enfermedades apuntan a la importancia del metabolismo de los ácidos grasos.Los ácidos grasos se oxidan mayoritariamente en mitocondrias y peroxisomas y este paso está facilitado por las carnitina acitransferasas. En esta tesis estudiaremos un miembro de esta familia, la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1). CPT1 es un enzima que facilita el transporte de ácidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondrial, donde serán oxidados. Este proceso esta regulado por malonil-CoA, el inhibidor fisiológico de CPT1. El objetivo de este trabajo es identificar mediante análisis bioinformáticos y cinéticos la ubicación del malonil-CoA en las isoformas hepática y muscular de CPT1 (CPT1A y CPT1B). Con un buen modelo malonil-CoA/CPT1 se podrían diseñar fármacos para regular la β-oxidación de algunos ácidos grasos como palmitato y oleato, ya que sus niveles están estrechamente relacionados con patologías como la obesidad y la diabetes tipo 2.Aún no se ha resuelto el cristal de CPT1, posiblemente por ser una proteína integral de membrana. Por ello hemos recurrido a una aproximación bioinformática y análisis de "Docking" in silico, como método predictivo de las posibles interacciones de malonil-CoA con CPT1. El modelo 3D obtenido presenta dos sitios de unión de malonil-CoA, situados de forma opuesta en el canal catalítico, sitio A y sitio O. La validez de este modelo de "Docking" ha sido confirmada mediante estudio cinético de competición del inhibidor con los sustratos de CPT1A, carnitina y palmitoil-CoA y también mediante análisis de mutantes de CPT1A. Malonil-CoA es un inhibidor competitivo de CPT1 respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor mixto lineal de CPT1A respecto a la carnitina. Estos datos están de acuerdo con el modelo 3D propuesto de interacción de malonil-CoA, carnitina y palmitoil-CoA.En este trabajo proponemos por vez primera un modelo 3D de la isoforma muscular, CPT1B que ha resultado muy similar, como era de esperar, al de la isoforma hepática. Mediante estudios de mutagénesis dirigida hemos confirmado la ubicación de los residuos catalíticos y de un residuo implicado en la sensibilidad a malonil-CoA.Diversos estudios presentan al enzima CPT1 como potencial diana para el tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. También el enzima ácido graso sintasa (FAS) se ha propuesto como diana para el tratamiento de la obesidad. En este trabajo hemos demostrado que C75, una lactona ciclica de origen sintético, no solo actúa sobre FAS sino también sobre CPT1 y hemos aportado nueva información sobre el mecanismo de acción de esta molécula sobre la actividad CPT1 in vitro e in vivo. Los análisis por MALDI-TOF y HPLC-MS/MS y los estudios cinéticos y estructurales confirman que C75 es transformado in vitro e in vivo en su derivado CoA, el C75-CoA y bajo esta forma actúa como un inhibidor potente y reversible de CPT1. Además C75-CoA es un inhibidor competitivo respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor competitivo mixto respecto al sustrato carnitina. Los resultados del análisis de Docking de una molécula de C75-CoA en CPT1A confirman los resultados cinéticos obtenidos. Este estudio abre las puertas para el diseño de nuevos fármacos basados en la molécula de C75. / Carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) is an ezyme that facilitates the transport of long chain fatty acids into the mitochondrial matrix for their oxidation. This process is regulated by malonyl-CoA, the physiological inhibitor of CPT1. The aim of this work is to identify by biocomputing and kinetic analyses the location of malonyl-CoA in the hepatic and muscular isoforms of CPT1 (CPT1A and CPT1B). The use of a good structural model of malonyl-CoA/CPT1 interaction might be useful for the design of drugs to control the regulation of β-oxidation of some fatty acids as palmitate and oleate, since their levels are closly linked whith pathologies such as obesity and diabetes type 2.Herein we propose a 3D model for CPT1 that presents two different binding sites for malonyl-CoA, situated in opposite sides in the catalytic channel, as shown by molecular Docking analisis. The validity of this Docking has been confirmed by competition kinetics studies of malonyl-CoA with both CPT1A substrates, carnitine and palmitoyl-CoA and also by analysis of specific CPT1A mutants. Malonil-CoA is a competitive inhibitor and a mixed linear inhibitor of CPT1 with regard to palmitoyl-CoA and carnitine respectively. These data are in accordance with the 3D model proposed for the interactions of these molecules with CPT1.Several studies reported that CPT1 is a potential target for the treatment of obesity and type 2 diabetes. Here we show that C75, a synthetic inhibitor of the fatty acid synthase (FAS) not only acts on this enzyme but also on CPT1. We have given new information about the mechanism of action of C75 on CPT1 activity in vitro and in vivo. MALDI-TOF and HPLC-MS/MS analyses and kinetic and structural studies confirm that C75 is transformed in vitro and in vivo in its CoA derivative, C75-CoA and under this form acts as a powerful and reversible inhibitor of CPT1. Also, C75-CoA is a competitive inhibitor and a competitive mixed inhibitor with regard to palmitoyl-CoA and carnitine respectively. The Docking analysis of C75-CoA in CPT1A confirm the kinetic results obtained. This study gives more informations for the design of new medicines based on the C75 molecule.

L'obesitat és una malaltia crònica que es caracteritza per una acumulació ectòpica excessiva de greix associada a la inflamació del fetge i del teixit adipós. A més és el principal factor de risc pel desenvolupament de malalties com la diabetis tipus 2 o malalties cardiovasculars. En els darrers temps, degut a la ingesta de dietes enriquides en greixos i al sedentarisme l'obesitat i el sobrepès han adquirit dimensions de pandèmia, fins el punt que la OMS l'ha etiquetat com l'epidèmia del segle XXI on mil milions de persones en tot el món pateixen algun tipus de sobrepès i uns 300 milions de persones es consideren que són obeses com a conseqüència de la sobrenutrició o sobrealimentació permanent en els països industrialitzats.El fetge és l'òrgan responsable de mantenir la homeostasi energètica de tot l'organisme i responsable en gran part del metabolisme de la glucosa i del metabolisme lipídic. A més, el fetge juga un paper fonamental en el desenvolupament de l'obesitat i en la desregulació metabòlica conseqüent. Nombrosos estudis han descrit l'acumulació d'espècies derivades d'àcids grassos en el fetge com a causants dels problemes associats a l'obesitat, ja sigui degut a una aportació excessiva de lípids o a una fallada en l'oxidació. En els individus obesos tot i tenir alts nivells de greix presenten una oxidació d'àcids grassos disminuïda. Per això, en aquesta tesi s'ha estudiat si un augment en l'oxidació d'àcids grassos en el fetge a llarg termini és capaç de reduir l'acumulació lipídica i per tant disminuir l'obesitat ens diferents models d'animals obesos. Per dur a terme aquest objectiu s'ha avaluat l'efecte de la sobreexpressió de la carnitina-palmitoïltransferasa (CPT) 1A, que és l'enzim responsable del control del transport d'àcids grassos en el mitocondri per ser oxidats, mitjançant l'administració de virus adenoassociats (AAVs). Els AAVs són una molt bona eina per utilitzar com a teràpia gènica per la seva capacitat d'expressar els gens que introdueixen durant llargs períodes de temps i per la resposta pràcticament nul·la del sistema immunitari de l'organisme el qual infecten. Els resultats presentats en aquesta tesi demostren que la sobreexpressió de la CPT1A i d'una forma mutada de CPT1A (CPT1AM), insensible al seu inhibidor fisiològic el malonil-CoA, és suficient per augmentar l'oxidació d'àcids grassos en el fetge, reduir l'acumulació lipídica i la inflamació en el fetge i en el teixit adipós. Per tan, la sobreexpressió de la CPT1A i en un major grau la CPT1AM protegeix a l'organisme enfront l'obesitat i els seus problemes associats. Aquests resultats obren un ventall de possibilitats en la recerca de noves teràpies gèniques contra l'obesitat. / Obesity-induced insulin resistance is associated with both ectopic lipid deposition and chronic, low-grade adipose tissue inflammation. Despite their excess fat, obese individuals show lower fatty-acid oxidation (FAO) rates. This has raised the question of whether burning off the excess fat could improve the obese metabolic phenotype. Here, we used human-safe non-immunoreactive adenoassociated viruses (AAV) to mediate long-term hepatic gene transfer of carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A), the key enzyme in fatty-acid β-oxidation, or its permanently active mutant form CPT1AM, to high-fat diet-treated and genetically obese mice. High-fat diet CPT1A- and, to a greater extent, CPT1AM-expressing mice showed an enhanced hepatic FAO which resulted in increased production of CO2, ATP and ketone bodies. Notably, the increase in hepatic FAO not only reduced liver triacylglyceride content, inflammation and ROS levels but also affected systemically to decrease epididymal adipose tissue weight and inflammation and to improve insulin signaling in liver, adipose tissue and muscle. Obesity-induced weight gain, increase in fasting blood glucose and insulin levels, and augmented expression of gluconeogenic genes were restored to normal only 3 months after AAV treatment. Thus, CPT1A- and, to a greater extent, CPT1AM-expressing mice were protected against obesity-induced weight gain, hepatic steatosis, diabetes and obesity-induced insulin resistance. In addition, genetically obese db/db mice that expressed CPT1AM showed reduced glucose and insulin levels, and liver steatosis. A chronic increase in liver FAO improves the obese metabolic phenotype, which indicates that AAV-mediated CPT1A expression could be a potential molecular therapy for obesity and diabetes.