Orientador: Raquel Mantuaneli Scarel Caminags / Banca: Rui Barbosa de Brito junior / Banca: Karina Gonzales Silverio Ruiz / Banca: Daniela Leal Zandim Barcelos / Banca: Joni Augusto Cirelli / Resumo: / Abstract: / Doutor

Es requereix la Interleucina 6 (IL-6) per a la regeneració normal del fetge però la font específica d'aquest factor de creixement roman desconeguda.En aquest estudi s'ha investigat si el senyal s'origina del macròfag resident al fetge, la cèl.lula de Kupffer. Per a dur a terme aquesta recerca, s'ha utilitzat un model animal de trasplantament de moll d'os en ratolins. Específicament, s'han remplaçat les cèl.lules derivades del moll d'os del receptor que inclouen, per tant, les cèl.lules de Kupffer, per les del donant amb les seves corresponents característiques genotípiques. Els receptors, en aquest cas, eren ratolins deficients genèticament en la seva capacitat de producció d'IL-6, ratolins knockout IL-6 (KO IL-6), i dels que havia quedat abastament demostrat a la literatura que eren incapaços de tenir una regeneració hepàtica normal. Aquests ratolins s'irradiaven amb una dosi coneguda letal de 1000 RADs i se'ls rescatava amb el trasplantament del moll d'os de ratolins de la mateixa soca però genèticament normals (IL-6 +/+), és a dir amb capacitat de producció d'IL-6. D'aquesta manera, es pretén la creació d'un animal quimera, en el que l'única font d'IL-6 provingués de les seves cèl.lules derivades del moll d'os. Es trasplantaven un total de 107 cèl.lules. Inversament, es feia el mateix procediment amb el trasplantament de cèl.lules d'animals KO a animals genotípicament normals. L'èxit de l'empeltament es demostrava inicialment amb la supervivència de l'animal més enllà de 6 setmanes. La comprovació experimental d'aquest empeltament es feia inicialment amb la demostració del fragment SRY del cromosoma Y en els fetges d'animals femella als que s'havien trasplantat cèl.lules d'animals mascle. Posteriorment, s'objectivava l'expressió in situ d'IL-6 per part de les cèl.lules de Kupffer en els animals receptors KO i la producció d'IL-6 per part dels esplenòcits d'aquest animals després de l'estimulació amb lipopolisacàrid. L'aïllament de les cèl.lules de Kupffer en animals femelles KO trasplantat amb moll d'os de mascle IL-6 +/+ va demostrar la presència del locus SRY i de la IL-6 en aquestes cèl.lules mentre que els aïllats d'aquestes cèl.lules en els animals mascles que han rebut moll d'os dels animals femella s'hi observen els senyals de l'al.lel interromput d'IL-6 que identifica les cèl.lules de l'animal KO i no s'hi objectivava la presència del fragment SRY com s'esperava si totes les cèl.lules de Kupffer de l'animal fossin del donant femella. El remplaçament d'aquestes cèl.lules en animals KO amb el trasplantament del moll d'os d'animals IL-6 +/+ restaura la capacitat de resposta regenerativa hepàtica després d'hepatectomia parcial tal com s'inidica per la activació del senyal de transducció i activador de transcripció 3 (STAT-3) i la replicació del DNA hepatocitari. Per contra, la substitució completa de les cèl.lules de Kupffer en animals IL-6 +/+ per cèl.lules d'animal KO inhibia significativament la regeneració hepàtica i l'administració d'IL-6 endovenosa en restituïa la capacitat.Finalment, per a demostrar que de les cèl.lues derivades del moll d'os, les úniques realment necessàries per a permetre uqe la regeneració hepàtica es dugués a terme es va avaluar la regeneració hepàtica post-hepatectomia parcial en animals SCID i Rag-1 KO (mancats de limfòcits T i B) i SCID-beige (Mancats de limfòcits T, B i cèl.lules Natural Killer). Prèviament a la pràctica de l'experiment, es demostrava per citometria de flux que cap animal d'aquestes soques contenia una població intrahepàtica extratímica de limfòcits anomenada limfòcit T Natural Killers (NK T). La regeneració es mostrava normal en les tres soques d'animals tant per la producció d'IL-6, activació d'STAT3 com per la replicació d'ADN, per tant, la presència de línia macrofàgica era l'única línia derivada del moll d'os, la presència de la qual era la mínima necessària per a la regeneració hepàtica.El conjunt de les dades aportades per aquest estudi demostren que les cèl.lules de Kupffer a través de l'expressió d'IL-6 regulen la capacitat regenerativa de l'hepatòcit. / Interleukin-6 (IL-6) is required for normal liver regeneration, but the specific cellular source of this growth factor is unknown. We investigated whether this signal originates from the resident macrophage, the Kupffer cell. Using a murine model of bone marrow transplantation, we replaced recipient bone marrow-derived cells, including Kupffer cells, with cells of donor genetic phenotype. Recipients deficient in IL-6 (IL-6(-/-)) were lethally irradiated, then rescued with 107donor bone marrow cells capable of expressing IL-6 (IL-6(+/+)). Conversely, IL-6(+/+) recipients received IL-6(-/-) marrow. Successful engraftment was measured by the presence of the Y chromosome SRY locus in the livers of female recipients receiving male marrow, in situ IL-6 expression by Kupffer cells, and up-regulation of IL-6 in splenocytes after activation with lipopolysaccharide (LPS). Kupffer cell isolation in IL-6(-/-) females receiving IL-6(+/+) male marrow clearly showed the presence of the SRY locus and IL-6 allele, whereas males receiving female marrow demonstrated IL-6 disrupted gene and no SRY, confirming the extent of replacement. Replacement of these cells in IL-6(-/-) mice with IL-6(+/+) bone marrow successfully restored the regenerative response after partial hepatectomy (PHx) as indicated by signal transduction and activator of transcription 3 (STAT3) activation and hepatocyte DNA replication. Alternatively, complete replacement of Kupffer cells in IL-6(+/+) mice by transplantation with IL-6(-/-) cells significantly inhibited liver regeneration and was partially restored by administration of IL-6. In order to demonstrate that the only bone-marrow-derived cells needed to support a normal hepatic regeneration are the ones from macrophage origin, the regenerative response in some immunodeficient animals was assessed. Previously, the presence of the intrahepatic extrathymic population of immune cells called T Natural Killer lymphocytes was ruled out by flux citometry. A partial hepatectomy was performed to SCID and Rag-1 KO (neither T nor B cells) and SCID-beige (neither T nor B nor Natural Killer cells) mice. The hepatic regeneration was normal in all those animals as shown by the production of IL-6, STAT-3 activation and hepatocyte DNA replication. This investigation demonstrates a paracrine mechanism by which cells of bone marrow origin, most likely Kupffer cells, regulate the regenerative capacity of the hepatocyte through IL-6 expression.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citocinas do tipo 2 estão presentes em fases mais avançadas do desenvolvimento de diversos tumores humanos, funcionando em alguns casos como fatores prognósticos de neoplasias. O desenvolvimento do melanoma murino B16F10 está relacionado a um aumento na produção de IL-10 por células NK e linfócitos T CD4+ e uma diminuição acentuada na produção de IFN- por essas células, nas fases mais avançadas da progressão tumoral. Embora o modelo singeneico do melanoma murino B16F10-Nex2 apresente baixa imunogenicidade in vivo, uma pequena porcentagem de camundongos C57Bl/6 são naturalmente resistentes ao desenvolvimento subcutâneo desse tumor, mesmo após mais de uma inoculação das células tumorais. Animais naturalmente resistentes produziram maiores concentrações de IFN- e animais susceptíveis ao tumor produziram maiores concentrações de interleucinas anti-inflamatórias, IL-10 e IL-6. Confirmando o papel imunoregulador negativo da IL-10 na resposta imune protetora natural desse modelo, camundongos geneticamente deficientes em IL-10 (IL-10KO) foram mais resistentes à implantação subcutânea de células B16F10-Nex2. Animais que resistiram à progressão tumoral produziram uma resposta protetora com perfil de citocinas do tipo 1 (IFN- e IL-12), e a proteção foi dependente de IFN- . Macrófagos e células dendríticas de animais IL-10KO após estímulo in vitro com antígenos do melanoma B16F10-Nex2 apresentaram maior produção de citocinas pró-inflamatórias (IFN- , TNF- e IL-12) e uma maior expressão de marcadores de ativação celular (MHCII, CD40, CD80 e CD86). Com a transferência adotiva de células dendríticas IL-10KO, mas não IL-10 competentes, associadas a um lisado de células B16F10-Nex2, animais C57Bl/6 foram protegidos contra o desenvolvimento tumoral, sugerindo que células dendríticas que não expressam IL-10 sejam responsáveis pela indução da resposta protetora natural mais eficiente observada em animais IL-10KO. Tendo em vista o papel imunossupressor da IL-10 na resposta protetora induzida pelo melanoma B16F10-Nex2, foi construído um vetor plasmidial eucariótico contendo o mini-gene referente à porção extracelular do receptor da IL-10 murina, a ser utilizado em protocolos de terapia gênica para neutralização da IL-10 in vivo pela expressão de um receptor decoy da interleucina. Animais tratados com o plasmídeo recombinante apresentaram aumento na sobrevida, em um efeito dependente de IFN- e potencializado pela associação de uma terapia gênica adjuvante para produção de IL-12. Células dendríticas de animais C57Bl/6 foram transfectadas com esse plasmídeo recombinante, associadas a antígenos tumorais e transferidas adotivamente à animais C57Bl/6, que foram subsequentemente desafiados com células tumorais subcutaneamente. Essas células, que tiveram o IL-10 neutralizado pelo receptor decoy, induziram resposta protetora significativamente mais eficiente que as células controle transfectadas com o plasmídeo vazio, sugerindo que essas células estejam envolvidas in vivo na indução da resposta protetora observada após a imunização com o plasmídeo recombinante e neutralização da IL-10 sistêmica. Concluímos que a terapia gênica desenvolvida foi eficaz na neutralização da IL-10 sistêmica, podendo ser aplicada como uma nova alternativa imunoterapêutica antitumoral. / Type 2 cytokines are increased in late phases of several human tumors, and in some cases are considered prognostic factors for these neoplasias. Late development phases of murine melanoma B16F10 correlate with an increased production of IL-10 by NK cells and CD4+ T lymphocytes, and also with a decreased production of IFN- by these cells. Syngeneic murine melanoma B16F10-Nex2 shows low immunogenicity in vivo, however, a small percentage of C57Bl/6 mice are naturally resistant to subcutaneous tumor development, even after several tumor cell inoculations. Naturally resistant animals produced higher concentrations of IFN- and tumor susceptible animals produced higher concentrations of anti-inflammatory cytokines, IL-10 and IL-6. The immunoregulatory role of IL-10 on the natural protective immune response induced in this model was confirmed by the increased resistance to tumor development observed in IL-10 genetically-deficient mice (IL- 10KO) subcutaneously inoculated with B16F10-Nex2 cells. A type 1 immune reponse (IFN- and IL-12) was induced in resistant IL-10KO animals, and the protection was IFN- -dependent. IL-10KO macrophages and dendritic cells stimulated in vitro with B16F10-Nex2 melanoma antigens secreted higher concentrations of proinflammatory cytokines (IFN- , TNF- e IL-12), and expressed an increased amount of surface activation markers (MHCII, CD40, CD80 e CD86). Adoptive transfer of IL-10KO dendritic cells, but not IL-10-competent cells, in association with tumor antigens, induced a protective response in C57Bl/6 mice, suggesting that IL-10-negative dendritic cells induce the efficient protective response observed in IL-10KO animals. As IL-10 showed a clear immunosuppressive role on the natural protective response induced by B16F10-Nex2 cells, we constructed an eukaryotic plasmidial vector carrying the murine IL-10 receptor extracellular portion gene, to be used in gene therapy protocols for IL-10 neutralization in vivo by the expression of a decoy receptor. Recombinant plasmid-treated animals showed an IFN- -dependent increased survival, and this protective effect was augmented by the association with an adjuvant IL-12 gene therapy Dendritic cells from C57Bl/6 animals were transfected with recombinant plasmid, adoptively transferred to C57Bl/6 mice, and treated animals were challenged subcutaneously with B16F10-Nex2 tumor cells. Interleukin-10-neutralized dendritic cells induced a significantly increased survival, as compared to IL-10-containing dendritic cells, suggesting that dendritic cells induce the protective response observed in vivo after recombinant plasmid immunization and systemic IL-10 neutralization. We concluded that gene therapy using a plasmid expressing the IL-10 receptor extracellular region was effective on systemic IL-10 neutralization, and this tool could be used as a novel antitumor immunotherapeutic alternative. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-08T18:14:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 598809 bytes, checksum: da4fcddb92f744134bf824e490839654 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-08T18:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 598809 bytes, checksum: da4fcddb92f744134bf824e490839654 (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-28T15:38:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604063 bytes, checksum: 33f2042850962bea522205a8088c5d7f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T15:38:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604063 bytes, checksum: 33f2042850962bea522205a8088c5d7f (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN- , IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-02T13:40:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604067 bytes, checksum: 51a4b0b58210591c4a63d6fe7c4dc919 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T13:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604067 bytes, checksum: 51a4b0b58210591c4a63d6fe7c4dc919 (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN- , IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

No presente estudo, procurou-se investigar a aplicação terapêutica potencial de AdhIL-10 em um modelo de transplante em grandes animais, buscando-se avaliar a quantidade necessária de hIL-10 transferida aos pulmões para se ter uma resposta eficiente mensurável e clinicamente relevante. Mostrou-se, inicialmente, que a transfecção de 4x1010 pfu/ml de Ad5E1RSVhIL-10 em pulmão esquerdo logrou alcançar tal objetivo(p<0.001). Numa segunda etapa, 2 estudos foram desenvolvidos. Estudo A - 15 animais foram alocados aleatoriamente em 3 grupos: 1- diluente (CONTROLE, n=5), 2- vetor vazio (VV, n=5), e 3- Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=5). A AdhIL-10 (4x1010 pfu/ml) foi administrada ao doador por via endobrônquica, usando-se um broncoscópio flexível, e os animais foram ventilados por 12h antes da retirada dos pulmões. Os pulmões foram então armazenados por 18h antes de serem transplantados, e os parâmetros fisiológicos foram seguidos por 2h depois da reperfusão. Estudo B - também foram alocados randomicamente 7 animais em 2 grupos: diluente (CONTROLE, n=3), e Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=4). A administração foi realizada do mesmo modo descrito previamente, os animais foram mantidos acordados e com ventilação espontânea durante 24 horas antes da retirada do órgão. Os pulmões foram a seguir armazenados durante 24 horas então serem transplantados, e avaliados por 2h após a reperfusão. Todas a citocinas foram medidas por ELISA no tecido pulmonar transplantado ao término do tempo de isquemia fria, do tempo de isquemia morna, e depois de 1h e 2h de reperfusão. Os animais doadores toleraram a entrega de gene IL-10 humano via endobrônquica sem incidentes, permanecendo hemodinamicamene estáveis ao longo do período de observação. PaO2 e PaCO2 dos doadores não foram significativamente diferentes entre grupos na hora de retirada do órgão. Depois de 2h de reperfusão, entretanto, o pulmão transplantado mostrou oxigenação arterial sistêmica melhorada em ambos os estudos: 511±71 mmHg em AdhIL-10 versus 256±182 e 423±173 mmHg em VV e CONTROLE, respectivamente (p <0.05 AdhIL-10 versus controle). Além disso, o pico de pressão nas vias aéreas mostrou-se mais baixo (25±0.8 cmH2O em AdhIL-10 contra 30.4±1.6 e 37.3±3.1 cmH2O em VV e CONTROLE, respectivamente), e a relação de peso úmido-seco foi melhorada no grupo AdhIL-10 (6.1±0.6 mg contra 7.5±0.8 e 6.3±0.8 mg em VV e CONTROLE, respectivamente). A expressão de IL-10 humana (hIL-10) foi 35.2±13.4 e 100.1±7.7 pg/mg de proteína 12h e 24h após a transfecção, respectivamente. A expressão gênica de hIL-10 no tecido pulmonar transplantado depois de 2 horas de reperfusão foi 12.4±13.8 pg/mg de proteína no grupo AdhIL-10 (versus 0 e 0 pg/mg de proteína no grupos VV e CONTROLE; p <0.05). No estudo B ocorreram os mesmos achados, considerando-se PaO2: O grupo AdhIL-10 manteve uma oxigenação sangüínea (396±166 mmHg) contra uma baixa oxigenação arterial no grupo de controle (104±38 mmHg); p <0.05). A razão de peso úmido-seco (6.1±0.4 contra 10.1±0.8 mg) e o pico de pressão nas vias aéreas (24.5±4.9 contra 32.1±8.4 cmH2O) mostraram-se ambos significativamente mais baixos no grupo AdhIL-10 (p<0.05). A IL-8 porcina permaneceu estável nos grupos VV (92.41±37.1 e 102.8±130.5 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente) e CONTROLE (106.6±37.5 e 95.6±49.9 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente); porém, tendeu a diminuir no grupo AdhIL-10 depois da reperfusão (94.9±28.7 e 79.5±38.9 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente). A IL-6 porcina demontrou uma tendênciaa redução no estudo A, porém sem significado estatístico VV (0.17±0.2 e 129.5±41.4 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente) e CONTROLE (zero e 75.6±49.1 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente); porém, tendeu a diminuir no grupo AdhIL-10 depois da reperfusão (zero e 60.4±51 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente). No estudo B, a sIL-8 demonstrou uma redução estatisticamente significativa após 2 horas de reperfusão no tecido pulmonar (p<0.02). 171.7±92 pg/mg de proteína no grupo CONTROLE e 56.2±23.5 pg/mg de proteína no grupo AdhIL- 10.Da mesma forma, demonstrou-se uma redução dos níveis de sIL-6 no estudo B 2 horas após a reperfusão pulmonar, tanto no tecido pulmonar (p<0.03), quanto no plasma do receptor( p<0.002). / In the present study, it was tried to investigate the potential therapeutic application of AdhIL-10 in a transplant model in large animals, in order to evaluate the necessary amount of hIL-10 transferred to the lungs to have a measurable and clinically relevant gene transfection. We proved that 4x1010 pfu/ml of Ad5E1RSVhIL-10 into left lung reached this goal (p<0.001).Secondly, we runned 2 studies: study A -15 animals were randomly allocated into 3 groups: 1: diluent (CONTROL, n=5), 2: empty vector (EV, n=5), and 3: Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=5). AdhIL-10 (4x1010 pfu/ml) was administered endobronchially via fiberoptic bronchoscope to the donor and animals were ventilated for 12h prior to lung retrieval. The lungs were then stored for 18h prior to transplantation, and followed by 2h of reperfusion. Study B – 7 animals were also randomly allocated into 2 groups: diluent (CONTROL, n=3), and Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=4). The administration was done as the same way described previously, but tha animals were kept awake for 24 hours prior to lung retrieval. The lungs were stored for 24 hours prior to transplatation and followed 2h of reperfusion All cytokines were measured by ELISA in transplanted lung tissue at the end of the warm ischemic time, and after 1h and 2h of reperfusion. Donor animals tolerated the endobronchial gene delivery without incident and remained hemodynamically stable throughout the observation period. Donor PaO2 and PaCO2 were not significantly different between groups at the time of retrieval. After 2h of reperfusion, the transplanted lung showed improved oxygenation in both studies (511±71 mmHg in AdhIL-10 group vs. 256±182 and 423±173 mmHg in EV and CONTROL respectively p<0.05 AdhIL-10 versus control). In addition, the peak airway pressure was lower (25±0.8 cmH2O in AdhIL-10 versus 30.4±1.6 and 37.3±3.1 cmH2O in EV and CONTROL, respectively), and the wet-to-dry weight ratio was improved in the AdhIL-10 group (6.1±0.6 mg versus 7.5±0.8 and 6.3±0.4 in EV and CONTROL, respectively). Human IL-10 (hIL-10) expression was 35.2±13.4 and 100.1±7.7 pg/mg protein after 12h and 24h of transfection, respectively. hIL-10 gene expression in transplanted lung tissue after 2 hours of reperfusion was 12.4±13.8 pg/mg protein in the AdhIL-10 group (vs. 0 and 0 pg/mg in EV and CONTROL groups p<0.05).In study B occurred the same findings regarding PaO2: ;the AdhIL-10 group showed a maintaned blood oxygenation (396±166 mmHg) versus a poored oxygenated arterial blood in CONTROL group (104±38, p<0.05). The wet and dry ratio (6.1±0.4 versus 10.1±0.8) and Peak Airway Pressure (24.5±4.9 versus 32.1±8.4) were lower in AdhIL-10 group (p<0.05). Swine IL-8 remained stable in EV (92.41±37.1 and 102.9±130.5 before and after 2h reperfusion, respectively) and CONTROL (106.6±37.5 and 95.6±49.9 before and after 2h reperfusion, respectively), whereas it tended to decrease in AdhIL-10 group after reperfusion (94.9±28.7 and 79.5±38.9 before and after 2h reperfusion, respectively). Porcine IL-6 had showed a tendency for reduction in the study A, even so without statistical meaning EV (0.17±0.2 and 129.5±41.4 pg/mg of protein before and after 2 hours of reperfusion, respectively) and CONTROL (zero and 75.6±49.1 pg/mg of protein before and after 2 hours of reperfusion, respectively). However, it tended to decrease in the AdhIL-10 group after the reperfusion (zero and 60.4±51 protein pg/mg XVI before and after 2 hours of reperfusion, respectively). In the study B, sIL-8 demonstrated a statistically significant reduction after 2 hours of reperfusion in the lung tissue (p <0.02). 171.7±92 pg/mg of protein in the CONTROL group and 56.2±23.5 pg/mg of protein in the AdhIL-10 group.The same findings, a reduction of the levels of sIL-6 was demonstrated in the study B 2 hours after the lung reperfusion, as much in the lung tissue (p <0.03), as in the plasma of the receptor (p <0.002).

Introdução - Diversos estudos têm apontado que uma modulação imunoinflamatória possa desempenhar papel importante na fisiopatologia da insuficiência cardíaca, através da determinação de aumento dos níveis séricos de várias citoquinas em pacientes com a síndrome. No entanto, o sítio da produção aumentada destas moléculas ainda não está claro. Métodos - Foram estudados 18 pacientes com insuficiência cardíaca classe III ou IV com fração de ejecão ≤ 35% (47±11 anos; 14/18 com etiologia não isquêmica) e 7 indivíduos controles (38±9 anos). Foram analisadas as concentrações de TNF-α, seus receptores solúveis I e II, da interleucina 6 e do receptor solúvel da interleucina 2 pelo método de ELISA no sangue periférico e sangue do seio coronário de todos os indivíduos. Resultados - Nos pacientes, as concentrações periféricas do TNF-α, e dos receptores solúveis I e II do TNF-α foram significativamente maiores do que nos indivíduos controles (3,9 ± 2,7 vs. 0,6 ± 1,9 pg/ml, p = 0,009; 1477 ± 489 pg/ml vs. 965 ± 214 pg/ml, p = 0,01; 3149 ± 983 pg/ml vs.1700 ± 526 pg/ml, p = 0,001; respectivamente). Apenas o TNF-α e a interleucina 6 apresentaram maior concentração periférica quando comparada ao sangue do seio coronário (3,9 ± 2,7 vs. 2,7 ± 2,1 pg/ml, p = 0,007 e 4,5 ± 2,8 vs. 3,6 ± 2,8 pg/ml, p = 0,01, respectivamente) em pacientes com insuficiência cardíaca. Além disto, foi observada correlação inversa entre a concentração periférica do TNF-α (r = - 0,5, p = 0,01) e seus receptores solúveis I e II (r = - 0,46, p = 0,02 e r = - 0,59, p = 0,001, respectivamente) e a fração de ejeção, bem como a concentração no seio coronário dos receptores solúveis I e II do TNF-α e a fração de ejeção (r = - 0,46, p= 0,02 e r = - 0,58, p = 0,002, respectivamente). Conclusões - A existência de maiores concentrações de TNF-α e interleucina 6 no sangue periférico do que no seio coronário em pacientes com insuficiência cardíaca sugere que a produção destas citoquinas seja predominantemente periférica. O TNF-α e seus receptores solúveis I e II correlacionaram-se inversamente com a fração de ejeção.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-12-21T13:06:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Patrícia Oliveira Meira Santos.pdf: 1780569 bytes, checksum: 07577642b382657dbf6d08692335e772 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-21T13:06:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Patrícia Oliveira Meira Santos.pdf: 1780569 bytes, checksum: 07577642b382657dbf6d08692335e772 (MD5) / Visando contribuir para o desenvolvimento de uma vacina contra leishmaniose visceral canina, no presente trabalho, foi avaliada a resposta imune de cães após a imunização com dois antígenos recombinantes de L. chagasi/L. infantum (denominados Lc9 e Lc13) misturados a saponina em associação ou não com plasmídeo codificando IL-12 canina de cadeia única (pcDNA3.1-scca-IL-12). Os antígenos foram injetados por via subcutânea e o plasmídeo pcDNA3.1-scca-IL-12 foi administrado diretamente no linfonodo poplíteo drenante, nos dias 0, 21, 42 e 170 do experimento. Nos animais, a geração de anticorpos séricos da classe IgG anti-Leishmania, a proliferação e a produção de interferon gama (IFN-γ) por células mononucleares de sangue periférico, após estimulação específica in vitro, foram avaliadas. Os cães imunizados com Lc9 e Lc13, associados ou não a pcDNA3.1-scca-IL-12, produziram anticorpos específicos da classe IgG reativos com o extrato total de antígenos de L. chagasi/L. infantum e com cada antígeno recombinante separadamente. Contudo, tais animais, não apresentaram resposta proliferativa e tampouco revelaram produção de IFN-γ, após estimulação com extrato total de antígenos de L. chagasi/L. infantum, indicando que pcDNA3.1-scca-IL-12 falhou em induzir resposta imune do tipo TH1 a antígenos coadministrados. Por causa disso, experimentos adicionais foram realizados visando à definição, em caráter preliminar, de condições apropriadas para uso de plasmídeo codificando IL-12, capazes de promover resposta imune TH1 a antígenos co-administrados, na ausência de efeitos tóxicos. Para isso, camundongos da linhagem C3H/Hej e C57Bl/6 foram injetados duas vezes (50 μg / dose) com plasmídeo codificando IL-12 murina de cadeia única (pcDNA3.1-scmu- IL-12) e eletroporação local foi realizada. Os camundongos C3H/Hej revelaram aumento na concentração plasmática de IFN-γ, esplenomegalia, aumento do linfonodo inguinal e aumento do índice de proliferação dos esplenócitos frente a estímulo in vitro por concanavalina A. Além disso, os camundongos C3H/Hej apresentaram, histologicamente, expansão da polpa vermelha associada a grande pleomorfismo celular, aumento no número de macrófagos vacuolados, de megacariócitos e de células apoptóticas. Os camundongos C57Bl/6 exibiram aumento na concentração plasmática de IFN-γ, esplenomegalia e aumento dos linfonodos inguinal e poplíteo. Esses dados sugerem que as quantidades de pcDNA3.1-scmu-IL-12 utilizadas promovem efeitos tóxicos e menores doses do plasmídeo devem ser avaliadas em experimentos para modificação da resposta imune em camundongos.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-11-10T03:06:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 335890.pdf: 4250281 bytes, checksum: 004bb973ec3e808464d0a46de21270f5 (MD5) Previous issue date: 2015 / A dor neuropática que surge em decorrência da lesão de nervos espinais é caracterizada por uma resposta anormal das vias de transmissão da dor. Além disso, as alterações geradas pela desnervação muscular prejudicam a função motora, que juntamente com a dor neuropática diminuem a qualidade de vida dos pacientes. O exercício físico regular é capaz de beneficiar positivamente a saúde física e mental, melhorando a qualidade de vida e diminuindo a incidência de doenças crônicas relacionadas ao estilo de vida sedentário. O exercício físico também é eficaz na reabilitação de pacientes após lesões de nervos espinais, por manter as propriedades musculares e promover a recuperação funcional. No entanto, apesar da grande relevância clínica, poucos estudos identificaram o efeito benéfico do exercício na dor neuropática e recuperação funcional, bem como os seus mecanismos neurobiológicos. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito anti-hiperalgésico e neuroregenerativo do exercício físico de baixa intensidade, realizado na esteira, após a lesão por esmagamento do nervo isquiático em camundongos. Para isto, camundongos Swiss e BALB/cJ selvagens (WT) e BALB/cJ knockouts para IL-4 (IL-4-/-) machos foram submetidos à lesão do nervo isquiático, e, três dias após a lesão, foram submetidos a um programa de exercício físico de baixa intensidade na esteira (30 min/dia, velocidade de 10 m/min, 5 dias/semana), por duas semanas. O exercício físico apresentou importante efeito anti-hiperalgésico reduzindo os comportamentos relacionados à dor neuropática quando avaliados nos testes de von Frey, fuga/esquiva e campo aberto. Parte do efeito neurobiológico do exercício físico é dependente das células do sistema imunológico que migram para o nervo lesionado, pois, a analgesia produzida pelo exercício foi prevenida pela fucoidina (100 µg/animal, i.p.), a qual inibe a migração de leucócitos da circulação sanguínea para o local da lesão. Além disso, o exercício físico promoveu o aumento das concentrações das citocinas anti-inflamatórias, IL-4 e IL-1ra, e das neurotrofinas BDNF e ß-NGF, no nervo isquiático, e IL-4, IL-5 e IL-1ra na medula espinal, bem como, reduziu as concentrações do BDNF e ß-NGF na medula espinal. O efeito anti-hiperalgésico do exercício físico observado em camundongos BALB/cJ WT foi reduzido em camundongos IL-4-/-, confirmando o importante papel da IL-4 neste efeito. Ademais, foi demonstrado que a IL-4 pode modular o perfil fenotípico de macrófagos, pois, camundongos WT exercitados mostraram maior marcação para macrófagos M2a/c, enquanto os camundongos IL-4-/- exercitados apresentaram maior marcação para macrófagos M1. Estes achados fornecem evidências de que o exercício físico promove a alteração fenotípica de macrófagos via liberação da IL-4, o que pode induzir uma resposta das células Th2 e reduzir a dor neuropática, a inflamação e auxiliar no processo de regeneração nervosa. Além disso, foi observado o aumento da expressão da PMP22 no nervo isquiático de animais exercitados, indicando maior concentração de mielina nos axônios em regeneração. O efeito anti-hiperalgésico do exercício físico foi dependente da redução da ativação de astrócitos e microglia na medula espinal. A analgesia causada pelo exercício físico também foi prevenida pelo PCPA (100 mg/kg i.p., um inibidor da síntese de serotonina [5-HT]), mas não pelo AMPT (100 mg/kg i.p., um inibidor da síntese de catecolaminas), sugerindo importante papel do sistema serotoninérgico no efeito do exercício. Ademais, o exercício físico promoveu aumento da concentração de 5-HT e seu metabólito, o ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HIAA) no tronco encefálico, e este efeito foi prevenido pelo PCPA. O conteúdo de noradrenalina (NA) foi aumentado com o exercício físico, mas não o de dopamina (DA), e o PCPA também preveniu este aumento, demonstrando a interação entre os sistemas serotoninérgico e noradrenérgico. No entanto, a expressão gênica das enzimas triptofano hidroxilase 2 (Tph2) e dopamina beta hidroxilase (Dbh) não foram alteradas após a lesão, nos animais submetidos ou não ao exercício físico. O exercício também foi capaz de aumentar a expressão gênica dos receptores 5-HT1AR, 5-HT1BR, 5-HT2AR, 5-HT2CR e 5-HT3AR no tronco encefálico. Por fim, o exercício físico reduziu a densidade dos transportadores de serotonina (SERT) nos núcleos da rafe (RPa, RMg e Rob), os quais estavam aumentados após a lesão, sendo este efeito dependente da redução da IL-1ß e do TNF-a, no tronco encefálico. Em conjunto, estes resultados mostram o efeito terapêutico do exercício físico na redução da dor neuropática e regeneração nervosa, através de mecanismos que dependem da ativação do sistema neuroimunológico no local da lesão e na medula espinal, bem como a ativação do sistema endógeno descendente de controle da dor, em especial, da neurotransmissão serotoninérgica no tronco encefálico.<br> / Abstract : Neuropathic pain which arises as a result of spinal nerve injury is characterized by an abnormal response of the pain transmission routes. In addition, changes generated by muscle denervation impair motor function, which together with neuropathic pain reduce the quality of life of these patients. Regular physical exercise can positively benefit physical and mental health, improving the quality of life and reducing the incidence of chronic diseases associated with sedentary lifestyle. Physical exercise is also effective in the rehabilitation of patients after spinal nerve injuries through support muscle properties and promotes functional recovery. However, despite the great clinical relevance, few studies have identified the beneficial effect of exercise on neuropathic pain and functional recovery, as well as it neurobiological mechanisms. The aim of this work was to study the anti-hyperalgesic and neuroregenerative effect of low-intensity exercise, performed on the treadmill, after the sciatic nerve crush injury in mice. Then, Swiss and BALB/cJ wild-types (WT) and BALB/cJ IL-4 knockouts (IL-4-/-) males mice were subjected to sciatic nerve injury, after that, three days after injury, mice performed low-intensity exercise on the treadmill (30 min/day, speed of 10 m/min, 5 days/week), for two weeks. Physical exercise showed significant anti-hyperalgesic effect reducing neuropathic pain-related behaviors when assessed by von Frey, escape/avoidance and open field test. Part of the neurobiological effect of physical exercise is dependent on immune cells that migrate to the injured nerve, because the analgesia produced by exercise was prevented by fucoidin (100 µg/mouse, i.p.), that inhibits leukocytes migration from bloodstream to the site of injury. Furthermore, physical exercise promoted increasing concentrations of anti-inflammatory cytokines levels, IL-4 and IL-1ra, and neurotrophins BDNF and ß-NGF, in the sciatic nerve, and IL-4, IL-5 and IL-1ra in the spinal cord, as well as it reduced ß-NGF and BDNF levels in the spinal cord. The noted analgesic effect of physical exercise in BALB/cJ WT mice was reduced in IL-4-/- mice, it confirming the important role of IL-4 on this effect. Furthermore, it was shown that IL-4 can modulate the phenotypic profile of macrophages, because WT exercised mice showed stronger staining for M2a/c macrophages, while IL-4-/- exercised mice presented marked staining for M1 macrophages. These findings provide evidence that physical exercise promotes the phenotypic switch of macrophages by release of IL-4, which can induces Th2 cells response and reducing neuropathic pain, inflammation and helps nerve regeneration process. Furthermore, an increased PMP22 level in the sciatic nerve of exercised animals was observed, indicating higher concentration of myelin in regenerating axons. The anti-hyperalgesic effect of physical exercise was dependent on reduction of astrocytes and microglia activation in the spinal cord. The analgesia caused by physical exercise was also prevented by PCPA (100 mg/kg i.p., an inhibitor of serotonin [5-HT] synthesis), but not by AMPT (100 mg/kg i.p., an inhibitor of catecholamine synthesis), it suggesting the important role of the serotonergic system in the effect of exercise. Furthermore, physical exercise promotes increased 5-HT concentration and its metabolite, the 5-hydroxy-indoleacetic acid (5-HIAA) in the brainstem, and its effect was prevented by the PCPA. The noradrenaline (NA) content was increased by physical exercise, but not the dopamine (DA) content, and the PCPA also prevented this increase, demonstrates the interaction between serotonergic and noradrenergic systems. However, tryptophan hydroxylase 2 (Tph2) and dopamine beta hydroxylase (Dbh) enzymes gene expression were not changed after injury, in the animals submitted or not to physical exercise. The exercise was also able of increasing 5-HT1AR, 5-HT1BR, 5-HT2AR, 5-HT2CR e 5-HT3AR receptors gene expression in the brainstem. Finally, physical exercise reduced serotonin transporter (SERT) density in the raphe nuclei (RPa, RMg and ROb), which were increased after injury, and this effect was dependent of IL-1ß and TNF-a reduced levels in the brainstem. Together, these results demonstrate the therapeutic effect of physical exercise on neuropathic pain reducing and nerve regeneration, through mechanisms that depending on the neuroimmune system activation at the site of injury and spinal cord, as well as the activation of endogenous descending pain control system, especially of serotonergic neurotransmission in the brainstem.