Memoria para optar al título de Bioquímico / La periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica de las estructuras que soportan las piezas dentales, la cual está asociada a un proceso infeccioso causado por un cambio en la ecología local de la biopelícula bacteriana oral. Un 90% de la población chilena presenta signos clínicos de esta patología. Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) se ha propuesto como un agente etiológico clave en la periodontitis. En nuestro laboratorio, se obtuvieron aislados clínicos de P. gingivalis provenientes de individuos sanos, en los que se vio ausencia de la región del antígeno O (AgO) del lipopolisacárido (LPS). En cambio, en aislados clínicos provenientes de pacientes con periodontitis, el LPS está completo. Además, se ha observado anteriormente que cuando células de epitelio gingival (GECs, por sus siglas en inglés) eran infectadas con una cepa silvestre de P. gingivalis (W50) había un aumento del ARNm del Toll-like receptor 4 (TLR4), a diferencia de lo que ocurre cuando son infectadas con una mutante isogénica carente de AgO polimérico (cepa ΔPG1051), sugiriendo que el AgO sería importante para el reconocimiento de la bacteria. Una de las consecuencias de la activación de TLRs es el incremento en los niveles de citoquinas pro-inflamatorias. Esto se ha relacionado con un aumento en la capacidad migratoria en varios tipos celulares, incluyendo a GECs, donde la migración favorece la formación de saco periodontal / Periodontitis is a highly prevalent chronic inflammatory disease in Chile and worldwide that mainly affects the tissues supporting de teeth. This disease is associated with an infectious process caused by a change in the local ecology of the subgingival biofilm. It has been proposed that the bacterium Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) plays a key role in disease onset and progression because this bacterium induces dysbiosis that contributes to the inflammatory process. In a previous study from our group, we observed that the O antigen (OAg) region of the lipopolysaccharide contributes to the inhibition of apoptosis induced by P. gingivalis in epithelial cells, which correlates with an increase in the expression of TLR4. One of the consequences of the activation of TLRs is the increase in the levels of pro-inflammatory cytokines. This has been related to an increase in the migratory capacity of several cell types, including human oral epithelial cells, where enhanced migration is associated with formation of periodontal pockets. Considering this background, the objective was to determine if TLR4 activation mediated by AgO can increase the levels of pro-inflammatory cytokines and to promote migration an oral epithelial cell line OKF6 / TERT2. For this, the level of TLR4 (flow cytometry), TNF-α, IL-8 and IL-1β (multiplex) and migration (Boyden's chamber) were measured after infecting with the previously mentioned strains. Our results show that infection with P. gingivalis does not change the TLR4 levels on the surface of OKF6 / TERT2 cells, independent of the presence or absence of AgO. On the other hand, levels of IL-8 decreased only with the virulent strain of P. gingivalis W50, unlike the isogenic mutant in LPS that does not produce AgO, which does not change them. These changes are independent of TLR4. Finally, the strain with a complete LPS (W50) produces an increase in migration. However, in the absence of AgO there are not significant changes with respect to uninfected cells. In conclusion, in this work we found that the AgO of P. gingivalis participates in the modulation of pro-inflammatory marker levels (IL-8) and cell migration, which could contribute to the development of periodontitis / CONICYT-FONDAP 15130011; Fondecyt 1170925; FIOUCH 17/020

O quelóide é um tumor fibroso benigno que ocorre durante a cicatrização da pele em indivíduos geneticamente predispostos. A cicatrização é um processo biológico complexo e depende da interação de diferentes estruturas teciduais e de um grande número de tipos celulares residentes e infiltrativos, que produzem citocinas. A interleucina 8 (IL-8), citocina pró-inflamatória, é super-expressa pelos fibroblastos durante o desenvolvimento do tecido de granulação, acelerando o processo de cicatrização. Como o quelóide resulta de uma reparação tecidual anormal após lesão da pele, o presente estudo teve por objetivo determinar a expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e CXCR2, e a capacidade proliferativa, pelo ciclo celular, dos fibroblastos queloideanos cultivados e extraídos ex vivo, por citometria de fluxo. Fibroblastos de cicatriz queloideana e de pele normal foram obtidos de 21 pacientes da raça negra, com idade variando entre 10 e 40 anos, de lesões com até 2 anos de evolução. Em nosso estudo constatamos expressão reduzida dos receptores para a IL-8, CXCR1(35,7%±11,2) e CXCR2 (27,8%±11,3), em fibroblastos de cicatriz queloideana cultivados, comparando com a pele normal (44,1±16,2 e 46,3±27,1 respectivamente). Entretanto, essa diferença só foi significante para o receptor CXCR2. A baixa expressão desses receptores poderia ser decorrente da atividade de metaloproteinases, que regulam a expressão de proteínas da superfície celular, através de clivagem enzimática, ou a capacidade reduzida de internalização e a reciclagem de receptores, mantida por filamentos de actina do citoesqueleto, que nos fibroblastos do quelóide estão diminuídos. Em relação ao ciclo celular de fibroblastos cultivados do quelóide e da pele normal, verificamos diferenças não significantes da capacidade de replicação (fase S do ciclo celular) e de apoptose. No quelóide observamos significante aumento de células na fase G2/M, indicando aumento da velocidade de divisão celular. Para confirmar esses achados estudamos o ciclo celular de fibroblastos extraídos ex vivo, da porção periférica e central do quelóide e da pele normal. Os fibroblastos da porção periférica apresentaram porcentagem significantemente maior de células com capacidade replicativa, fase S do ciclo (22,9% ± 11,6), em relação à porção central (4,7% ± 2,9) e à pele normal (6,8% ± 4,9), e maior velocidade de divisão celular, fase G2/M (18,6 ± 12,0), em relação à porção central (35,6 ± 7,0) e pele normal (32,3 ± 6,9). Verificamos que a porção central apresentou maior porcentagem de células em apoptose (7,0% ± 2,1), comparado à porção periférica (4,9% ± 1,9) e pele normal (2,0% ± 0,86). Esses dados indicam que as células da porção periférica do quelóide parecem ser responsáveis pela elevada taxa de proliferação, justificando o crescimento expansivo a partir das margens da cicatriz queloideana, com desenvolvimento de lesão semelhante a tumor, bem como a porção central ser responsável pela fibrose, contendo células quiescentes e apoptóticas. Esses resultados sugerem modulação diferencial das reações celulares através das vias de sinalização para proliferação ou morte celular programada. Neste sentido, a baixa expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e principalmente de CXCR2, nos fibroblastos do quelóide sugere capacidade reduzida da IL-8 em promover cicatrização acelerada. A baixa atividade da IL-8 sobre os fibroblastos queloideanos estaria promovendo desregulação da resposta inflamatória e com isso atraindo novas células inflamatórias para o local e produzindo sinais alterados, como grande produção da citocina TGFβ. Essa desregulação do processo de cicatrização, com alteração de citocinas e da matriz extracelular, poderia ser responsável pelas duas populações de fibroblastos, uma proliferativa na periferia e outra quiescente e apoptótica na porção central. Finalizando, podemos concluir que nossos resultados correspondem às alterações histológicas e clínicas do quelóide que se expande nos limites da lesão. / A keloid is a benign fibrous tumor that occurs during wound healing in genetically predisposed individuals. Healing is a complex biological process and depends on the interaction of different tissue structures and a great number of resident and infiltrative cell types. The interleukin-8 (IL-8), a proinflammatory chemokine, showed higher expression in fibroblasts during the development of the granulation tissue, promoting more rapid tissue maturation. Since keloids result from abnormal wound healing, the objective of the present study was to determine the expression of CXCR1 and CXCR2, IL-8 receptors, and the proliferation capacity, throughout the cell cycle, of the keloid fibroblasts extracted ex vivo and those submitted to in vitro cultivation. Normal skin and keloid scar fibroblasts were obtained from 21 African-Brazilian patients, aged from 10 to 40 years, whose lesions had evolved for no longer than 2 years. Expression of receptors and the cell cycle was assessed by flow cytometry. We showed lower expression of the CXCR1 (35,7% ± 11,2) and CXCR2 (27,8%±11,3) in keloid fibroblasts, when compared with normal skin (44,1 ± 16,2 e 46,3 ± 27,1 respectively), but the difference was not significant for the CXCR1 receptor. This lower expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could be due to the action of metalloproteinases, which regulate the surface protein enzymatically, or fibroblastic cytoskeleton conditions, which influence receptor internalization and recycling. The distribution assessment of cell cycle phases of fibroblasts cultivated from keloid scars and normal skin did not show significant difference in replication capacity and apoptosis. The keloid fibroblasts presented a significantly higher proportion of cells in the G2/M phase, suggesting higher rate of cell division. To confirm these results we studied the cell cycle of fibroblasts extracted ex vivo, now separated by central and peripheral portions of keloid and normal skin. The peripheral fibroblasts showed significant high cell proportions in phase S (22,9% ± 11,6), compared with the central portion (4,7% ± 2,9) and normal skin (6,8% ± 4,9), and higher cells in division phase G2/M (18,6% ± 12,0), compared with the central portion (35,6% ± 7,0) and normal skin (32,3% ± 6,9). The central portion showed higher proportion of apoptosis (7,0% ± 2,1), compared with the peripheral portion (4,9% ± 1,9) and normal skin (2,0% ± 0,86). These results suggest that the keloid peripheral cells could be responsible for the proliferation rate, justifying the expansive keloid growth at the borders of the keloid scar, in a similar fashion to tumor development and the central portion being responsible for fibrosis, with quiescent and apoptotic cells. These results suggest a differentiated modulation of cell reactions by signal pathways for programmed cellular proliferation or death. In this sense, the low expression of the IL-8 receptors CXCR1 and CXCR2 in keloid fibroblasts suggests a diminished capacity of IL-8 to promote accelerated healing. This low expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could promote the dysregulation of the inflammatory response and thus attract more inflammatory cells to the site, producing different signals, such as a high production of the TGFβ cytokine. This dysregulation of the healing process, with changed cytokine and extracellular matrix expression, could be responsible for two different cell populations of fibroblasts, one proliferation at the periphery and the other fibrotic at the center of the lesion, with apoptotic and quiescent cells. Finally, we conclude that our results correspond to the histological and clinical changes of keloids that grow beyond the wound boundaries.

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é causada nas Américas, pelo protozoário intracelular obrigatório Leishmania infantum e os cães domésticos são os principais reservatórios urbanos do parasita e em áreas endêmicas, o aumento da LV em humanos tem sido associado ao aumento da infecção canina. Os atuais medicamentos disponíveis para a Leishmaniose Canina (CanL) não são completamente eficientes e meses após o tratamento a maioria dos cães apresentam recidiva, indicando a necessidade de buscar formas alternativas de tratamento. Na CanL, cães desenvolvem uma resposta imune celular (Th1) ineficiente para combater o parasita e a estimulação das vias de citocinas em células de defesa com proteínas recombinantes, tem o potencial de se tornar parte de métodos imunoterapêuticos eficazes. Neste estudo, as citocinas recombinantes caninas (IL-12, IL-2, IL-15 e IL-7) e o receptor solúvel de IL-10R1 (sIL-10R1), com atividade antagonista, foram avaliadas pela primeira vez em combinações (IL-12/IL- 2, IL-12/IL-15, IL-12/sIL-10R1, IL-15/IL-7) ou isoladamente (sIL-10R1) quanto à capacidade imunomodulatória em células mononucleares do sangue periférico (sigla em inglês PBMC) de cães com leishmaniose. Todas as combinações de proteínas recombinantes testadas mostraram melhorar a resposta linfoproliferativa. Além disso, as combinações de IL-12/IL-2 e IL-12/IL-15 promoveram a diminuição na expressão da proteína “Programed Cell Death 1” (PD-1) nos linfócitos. Estas mesmas combinações de citocinas e IL-12/sI... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral Leishmaniasis (LV) is caused in the Americas by the obligate intracellular protozoan Leishmania infantum and domestic dogs are the major urban reservoirs of the parasite and in endemic areas, and increase LV in humans has been associated with increased canine infection. The current medications available for Canine Leishmaniasis (CanL) are not completely effective and months after treatment most dogs present with relapse, indicating the necessity to looking for alternative forms of treatment. In CanL, dogs develop an ineffective cellular immune response (Th1) to combat the parasite. Then, the stimulation of cytokine pathways in defense cells with recombinant proteins, has the potential to become part of effective immunotherapeutic methods. In this study, the canine recombinant cytokines (IL-12, IL-2, IL-15 and IL-7) and the soluble receptor of IL-10R1 (sIL-10R1) with antagonistic activity, were evaluated for the first time in combinations IL-12/IL-2, IL-12/IL-15, IL12/sIL-10R1, IL-15/IL-7) or alone (sIL-10R1) for their immunomodulatory capacity in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from dogs with leishmaniasis. All combinations of recombinant proteins tested were shown to improve lymphoproliferative response. Further, combinations of IL-12/IL-2 and IL-12/IL-15 promoted decrease in programmed cell death protein 1 (PD-1) expression in lymphocytes. These same combinations of cytokines and IL-12/casIL-10R1 induced IFN-y production in PBMC. Furthermore, the combinat... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo:hgghj / Abstract:hjkhjkhjk / Orientador: Juliana Regina Peiró / Banca:Flávia de Almeida Lucas / Banca:Márcia Marinho / Doutor

A atividade física intensa pode induzir resposta inflamatória subclínica e aumento nos níveis plasmáticos de citocinas pró-inflamatórias. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre a liberação de citocinas (IL-1β, IL-6, e TNF-α), o exercício físico agudo e o exercício regular em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Foram estudados 18 pacientes do sexo masculino com DPOC moderada a muito grave, divididos em dois grupos: 11 pacientes foram incluídos em programa de reabilitação pulmonar (RP) durante 8 semanas e 7 pacientes sem atividade física regular foram incluídos como grupo controle (C). Todos os pacientes realizaram espirometria, teste de exercício cardiopulmonar incremental máximo e teste de endurance em cicloergômetro com carga constante (60% da carga máxima do teste incremental) no início do projeto e após oito semanas. Foi coletado sangue venoso periférico para dosagem de citocinas, antes e 15 minutos após os testes de endurance (TE1 e TE2). IL-1β, IL-6, e TNF-α foram dosadas com kits ELISA específicos (Quantikine®, R&D Systems). Os pacientes submetidos à RP liberaram menos IL-1β que os controles após o treinamento (RP: TE1 0,96±0,66; TE2 -0,24±0,27 pg/ml; grupo C: TE1 -1,48±1,14; TE2 0,66±0,61 pg/ml; p=0,03). Não houve diferença significativa na liberação de IL-6 quando comparados os dois testes de endurance (RP: TE1 0,44±1,21; TE2 0,80±1,24 pg/ml; grupo C: TE1 0,88±0,85; TE2 0,78±0,95 pg/ml; p=0,68). Não foi observada diferença na liberação de IL-6 entre os dois grupos. Apenas cinco pacientes (quatro no grupo da RP) liberaram TNF-α e o exercício não modificou o seu padrão de liberação (RP: TE1 2,86±1,18; TE2 2,57±1,37pg/ml; grupo C: TE1 4,98; TE2 6,84 pg/ml; p=0,14). Não houve associação significativa entre intensidade de exercício e liberação de citocinas (IL-1β r=0,10; IL-6 r=-0,23). Houve maior liberação de IL-6 após o TE2 nos pacientes que apresentaram exacerbação da DPOC (exacerbados 9,59±1,32; estáveis 6,31±0,92 pg/ml; p=0,03) e não houve diferença nos níveis de IL-1β. Apenas pacientes com exacerbação da DPOC liberaram TNF-α (2,82±1,48 pg/ml). Concluiu-se que o exercício físico regular reduz a liberação de IL-1β e as exacerbações estimulam a liberação de IL-6 e TNF-α em pacientes com DPOC.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T16:35:40Z No. of bitstreams: 1 Bianca_Petitinga_de_Paiva. Produção e avaliação...2011.pdf: 1434436 bytes, checksum: f5c3b8722c06f5784b6ec44bc9937084 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T16:35:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianca_Petitinga_de_Paiva. Produção e avaliação...2011.pdf: 1434436 bytes, checksum: f5c3b8722c06f5784b6ec44bc9937084 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A maioria dos cães com leishmaniose visceral submetida à quimioterapia convencional apresenta recaída após a interrupção do tratamento, talvez, pelo fato desses animais desenvolverem resposta imune celular específica apenas transitoriamente. Uma vez que as citocinas IL-7 e IL-15 são descritas na literatura como sendo capazes de promover resposta imune celular de longa duração (memória), o presente trabalho teve como objetivo a clonagem, a expressão e a avaliação da atividade biológica de IL7 e IL-15 recombinantes caninas (rca-IL-7 e rcaIL-15). Diversos estudos têm demonstrado o papel essencial da IL-7 e IL-15 na homeostase de células-T. A Interleucina-7 é um fator de crescimento e anti-apoptótico de linfócitos T, sendo essencial para a sobrevida de células T maduras, naïve e células de memória, especialmente CD4+. IL-15 apresenta um amplo espectro de atividades biológicas. É crucial para o desenvolvimento, proliferação, sobrevivência e diferenciação de múltiplas células tanto da imunidade inata, quanto da imunidade adaptativa, e apresenta papel essencial na manutenção de células T CD8+ de memória. Nesse trabalho descreveu-se a clonagem do DNA complementar (cDNA) e a expressão de IL-7 e IL-15 recombinantes caninas biologicamente ativas em Escherichia coli. Para expressão em E. coli foram realizadas as clonagens do cDNA de IL-7 e de IL-15 no vetor pRSET, gerando as construções pRSET-caIL-7 e pRSET-caIL-15. O sucesso da clonagem em ambos os vetores de expressão foi confirmado a partir do sequenciamento. As proteínas foram expressas como proteína de fusão com seis moléculas de histidina na extremidade amina da cadeia polipeptídica e após serem solubilizadas com uréia, as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade e renaturadas por diálise. A avaliação da atividade biológica de IL-15 canina purificada foi realizada em células CTLL-2 e foi demonstrada uma relação dose dependente na faixa de concentração proteica de 0,9 ng/mL até 1 µg/mL. O mesmo efeito foi demonstrado quando essas células foram cultivadas na presença de diferentes diluições de T-STIM (controle positivo do ensaio). Visando determinar as condições em que rca-IL-7 e rca-IL-15 são capazes de induzir efeitos biológicos in vitro, foram realizados experimentos com diferentes doses de ambas as citocinas e demonstrado pela primeira vez que tanto IL-7 quanto IL-15 são capazes de induzir a proliferação de CMNSP de cães pré-ativadas com PHA. Adicionalmente, as citocinas foram avaliadas quanto à capacidade de estimulação da proliferação de CMNSP de cães sem estímulo prévio ou concomitante e foi possível observar que rca-IL-7 foi capaz de manter a proliferação dessas células por até 12 dias de cultivo, enquanto rca-IL-15 foi capaz de fazê-lo por até 14 dias. Diante dos resultados obtidos a rca-IL-7 e rca-IL-15 poderão ser utilizadas no futuro em estudos que visam o estabelecimento de uma resposta de longa duração em cães com LVC submetidos à quimioterapia convencional. / Most dogs with LV subjected to conventional chemotherapy has relapsed after discontinuation of treatment, possibly due these animals develop specific cellular immune response transiently. Since IL-7 and IL-15 are described in the literature asbeing capable of promoting cellular immune response of long-term (memory), this study aimed at cloning, expression and biological activity evaluation of rca-IL7 and rca IL-15. Many studies have demonstrated the essential role of IL-7 and IL- 15 in the homeostasis of T-cells. The Interleukin-7 is a growth and anti-apoptotic factor of T lymphocytes, essential for the occurrence of mature, naive, and memory T cells, especially CD4+. IL-15 presents a wide spectrum of biological activities. It is crucial for the development, proliferation, survival, and differentiation of multiple cells of innate immunity as well as of adaptive immunity, and presents an essential role in the maintenance of CD8+ memory T cells. This work describes the cloning of complementary DNA (cDNA) and the expression of IL-7 and IL-15 canine recombinants biologically active in Escherichia coli. For expression in E. coli, we cloned cDNA of IL-7 and IL- 15 in the vector pRSET, generating the constructions pRSET-caIL7 and pRSETcaIL- 15. The success of the cloning in both the expression vectors was confirmed from the sequencing. The proteins were expressed as fusion protein with six molecules of histidine in the amine extremity of the polypeptide chain and afterwards were solubilized with urea, the proteins were purified by affinity chromatography and renatured by dialysis. The evaluation of the biological activity of purified canine IL-15 was achieved in CTLL-2 cells and a dose-dependent relation in the range of protein concentration of 0.9 ng/mL to 1 ƒÊg/mL was demonstrated. The same effect was demonstrated when these cells were cultivated in the presence of different dilutions of T-STIM (positive control of the test). With the goal of determining the conditions in which rca-IL-7 and rca-IL-15 are capable of inducing biological effects in vitro, we carried out experiments with different doses with both the cytokines and demonstrated for the first time that IL-7 as well as IL- 15 are capable of inducing proliferation of PBMC of dogs pre-activated with PHA. Also, the cytokines were evaluated as to the capacity of stimulation of the proliferation of PBMC of dogs without previous or concomitant stimulation and it was possible to observe that rca-IL-7 was capable of maintaining the proliferation of these cells for up to 12 days of cultivation, while rca-IL-15 was capable of doing it for 14 days. Considering the results obtained rca-rca-7 and IL-IL-15 may be used in future studies that aim to establish a long-termresponse in dogs with CVL undergoing conventional chemotherapy

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2010 / Bibliografia: f. 52-63 / Introdução: Estudos demonstram diferente resposta imune nos pacientes submetidos à laparoscopia comparados aos submetidos à laparotômia. Os níveis de citocinas como as interleucinas 6 e 10 demonstram a ativação do sistema imune ao trauma. Objetivos: Corre / Introduction: Studies show different immune response in patients underwent laparoscopic cholecystectomy compared with those submitted to the open technique. The levels of the cytokines like IL-6 and IL-10 show activation of the immune system related to tr

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-09-04T16:57:00Z No. of bitstreams: 1 Tiago Landim d'Avila Administração de plasmídeos....pdf: 1447180 bytes, checksum: b65ad3c9ece2b6f29cc032b2fa22c49a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-04T16:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiago Landim d'Avila Administração de plasmídeos....pdf: 1447180 bytes, checksum: b65ad3c9ece2b6f29cc032b2fa22c49a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A interleucina-12 (IL-12) é uma glicoproteína heterodímerica, codificada por dois genes distintos co-expressados na mesma célula. IL-12 precisa ser glicosilada para exibir atividade funcional. Essa glicoproteína promove a diferenciação de células T e é capaz de estimular a proliferação de células T ativadas e células NK. Além disso, IL-12 promove a produção IFN-γ por células NK e o aumento da atividade lítica de células NK e linfócitos T CD+ citotóxicos. Várias das atividades de IL-12 são desempenhadas ou são amplificadas pela associação com IL-2. Em nosso laboratório, foi gerada uma construção plasmideal capaz de expressar IL-12 canina, na forma de proteína de fusão de cadeia única (pcDNA3.1-scca-IL-12), e outra construção plasmideal capaz de expressar IL-2 canina (pcDNA3.1-ca-IL-2) em células de mamífero. Experimentos preliminares, a combinação de IL-12 e IL-2 expressas em sobrenadantes de células COS-7 mostrou-se capaz de promover produção de IFN-γ em células mononucleares de sangue periférico (CMNSP) de cães sadios. Visando a avaliação do potencial do uso de IL-12 e/ou IL-2 para o desenvolvimento de vacina ou método imunoterapico, no presente trabalho, grupos de cães sadios foram injetados três vezes, com intervalo de 2 dias entre cada duas doses consecutivas, com plasmídeo pcDNA3.1-scca-IL-12 e/ou pcDNA3.1-ca-IL-2 por via muscular por eletroporação. Em seguida, os cães foram submetidos à avaliação clinica, clinico-laboratorial (hemograma, determinação da concentração de transaminases, proteínas, ureia e creatinina no soro) e ensaios foram realizados para a detecção da expressão das proteínas recombinantes (sensibilização de CMNSP para produção de IFN-γ e determinação da concentração de IL-2 no soro). Não foram observadas diferenças nos parâmetros avaliados entre os grupos de animais. Visando a produção de IL-12, células BTI-Tn-5B1-4 foram infectadas com baculovírus recombinante contendo cDNA scca-IL-12 e capazes de adicionar uma cauda de 6 histidinas na extremidade carboxila. Para isso, duas construções diferentes em baculovírus foram elaboradas nosso laboratório, sendo uma delas no presente trabalho. Células BTI-Tn-5B1-4 infectadas com as construções em baculovírus apresentaram a proteína recombinante: a) parcialmente degradada e em grande quantidade no sedimento celular e b) integra e em baixa quantidade no sobrenadante da cultura; de acordo com os resultados de obtidos por SDS-PAGE e Western blot. / Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric glycoprotein, encoded by two distinct genes co-expressed in the same cell. IL-12 needs to be glycosylated to display functional activity. This glycoprotein promotes differentiation of T cells and is capable of stimulating proliferation of activated T cells and NK cells. In addition, IL-12 promotes IFN-γ production by NK cells and increased lytic activity of NK cells and cytotoxic Tlymphocyte CD +. Several of the activities of IL-12 are held or amplified by the association with IL-2. In our laboratory, a plasmideal construction was generated to express canine IL-12 like single-chain fusion protein (pcDNA3.1-scca-IL-12), and other construction to express canine IL-2 (pcDNA3.1-CA-IL-2) in mammalian cells. Preliminary experiments, the combination of IL-12 and IL-2 supernatants expressed in COS-7 cells was able to promote IFN-γ in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy dogs. To assess the potential of using IL-12 and/or IL-2 for the development of vaccine or immunotherapy method, in this study, groups of healthy dogs were injected three times with an interval of 2 days between each two consecutive doses with plasmid pcDNA3.1-scca-IL-12 and/or pcDNA3.1-ca-IL-2 intramuscularly by electroporation. Then the dogs were submitted to clinical evaluation, clinical and laboratory (blood count, determination of the concentration of transaminases, proteins, urea and serum creatinine) and tests were performed to detect the expression of recombinant proteins (PBMC sensitization to produce IFN-γ concentration and determination of serum IL-2). No differences were observed in all evaluated parameters between the groups of animals. Aiming the production of IL-12 cells, BTI-Tn-5B1-4 were infected with recombinant baculovirus containing cDNA scca-IL-12 and capable of adding a tail of 6 histidines at the carboxyl end. For this, two different constructs were prepared in our laboratory baculovirus, one of them in this work. Cells BTI-Tn-5B1-4 infected with the constructs presented in the recombinant baculovirus: a) partially degraded in large quantities in the sediment cell and b) incorporates and in low quantities in the culture supernatant, according to the results obtained by SDS-PAGE and Western blo

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-11-01T14:31:00Z No. of bitstreams: 1 karis_maria_p_rodrigues_ioc_bp_0027_2011.pdf: 37180086 bytes, checksum: 5edafa91606122063b098c48eb81a834 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-01T14:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karis_maria_p_rodrigues_ioc_bp_0027_2011.pdf: 37180086 bytes, checksum: 5edafa91606122063b098c48eb81a834 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença que se caracteriza pela presença de lesões cultâneas (LCL) e, em um número pequeno de pacientes, pelo desenvolvimento de lesão mucosa (ML). A evolução clínica e a resposta ao tratamento dependem de múltiplos fatores, incluindo o equilíbrio entre as citocinas Th1 e Th2, influenciando no controle parasitário e na extensão da lesão. Nesse equilíbrio complexo é possível que outras citocinas inflamatórias como IL-17 e IL-18, bem como fatores que influenciem na diferenciação de queratinócitos e nos processos inflamatórios da pele, como o sistema Notch, também possam se relacionar ao prognóstico das lesões. IL-18 é uma potente citocina indutora de IFN-γ, já tendo sido observado efeito protetor em doenças por protozoários. IL-17 é produzida por uma linhagem de células T descritas mais recentemente, que são consideradas essenciais em processos inflamatórios de vários tecidos e em doenças auto-imunes. O sistema de sinalização Notch é composto por um grupo de proteínas transmembrana que regulam processos decisórios em diversos tecidos, tanto no período embrionário como na vida adulta, incluindo a diferenciação de queratinócitos e de linfócitos T, na dependência do ligante envolvido em sua ativação (Delta-like – DLL1/DLL3/DLL4 ou Jagged 1 e 2). Estudamos a expressão das proteínas do sistema Notch e das citocinas IL-17 e IL-18 em lesões e sangue de pacientes com LTA causada por Leishmania (Viannia) braz possa estar associado com reação inflamatória mais intensa e retardo na resolução das lesões. Nas lesões mucosas foi observada maior expressão do receptor Notch3 e dos ligantes Delta-like (DLL1 e DLL4). O sistema Notch está associado à homeostase da pele regulando a diferenciação de queratinócitos e a cicratização. Nas células do sistema imune, quando linfócitos T CD2+ expressando Notch são ativados por células apresentadoras de antígenos expressando ligantes Delta-like, uma resposta Th1 ou Th17 é gerada. Nesse sentido, o papel do sistema Notch nas lesões de LTA pode ser associado tanto à homeostase do tecido cutâneo quanto ao sistema imune ou a ambos, além de poder estar correlacionado ao aumento de IL-17 observado no mesmo grupo de pacientes. A alta expressão de receptores Notch, ligantes Delta-like e das citocinas inflamatórias IL-17 e IL-18 sugere que o aumento desses fatores pode indicar pacientes para os quais esteja indicado um esquema terapêutico mais agressivo, ou pelo menos, um acompanhamento mais rigoroso

Submitted by PRISCILA DALMAGRO null (pridmagro@gmail.com) on 2016-02-04T21:39:33Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO PRISCILA DALMAGRO - FMVA.pdf: 1395003 bytes, checksum: 7cf46631afb2b9992d84269869e9aa10 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-05T12:33:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dalmagro_p_dr_araca.pdf: 1395003 bytes, checksum: 7cf46631afb2b9992d84269869e9aa10 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-05T12:33:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dalmagro_p_dr_araca.pdf: 1395003 bytes, checksum: 7cf46631afb2b9992d84269869e9aa10 (MD5) Previous issue date: 2016-02-01 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A resposta imune inata é a principal responsável pela defesa do hospedeiro contra endotoxinas de bactérias Gram-negativas. Tal resposta se dá através dos receptores Toll-like-4 e -2, seja pela via MyD88–dependente, TRIF-dependente ou ambas. Entretanto, uma resposta exagerada pode resultar em muitos danos para o organismo e levar até mesmo ao choque séptico. Uma das formas de controle desta resposta se dá através da tolerância à endotoxina (TE). Por isso o presentes estudo tem por objetivo investigar a indução diferencial dos receptores TLR-4 e 2, suas vias de sinalização MyD88 e TRIF-dependentes e avaliar outros possíveis genes relacionados a estas vias após indução da TE. Foi coletado sangue total de cavalos saudáveis (n=6), o qual foram estimulados com diferentes doses (0, 1 ou 10ng de LSP/mL) LPS de E.coli no momento 0 e 4 horas após o primeiro estímulo e 4 horas após o segundo estímulo. O “pool” (n=6) de RNA das amostras, coletado 0, 2, 4 e 8 horas, foi utilizado para a transcrição do cDNA. A hibridização do cDNA marcado com Cy-3 foi realizada em uma lâmina 4x44 contendo sequências específicas da espécie equina. Foi identificado durante a TE, nas diferentes doses de LPS, um aumento de transcritos dos receptores TLR-4 e -2, TNFAIP3 e IL-10 e uma diminuição de outros transcritos de genes importantes, tais como: MyD88, IL1-B, TNF-a, TRAM2, o que caracteriza e esclarece, de certa forma, as alterações na sinalização do TLR nas condições de tolerância à endotoxina. / The innate immune response is the main responsible for the host's defense against endotoxins from Gram-negative bacteria. Such response occurs via Toll-like-4 and -2 receptors, MyD88–dependent pathway, TRIF-dependent pathway or both. However, an exaggerated reponse can induce many damages to the organism, including septic shock. One way to control this exacerbated response is through endotoxin tolerance (ET). The goals of the present study were to investigate TLR-4 and 2 receptors, their signaling through MyD88 e TRIF-dependent pathways and evaluate other possible genes related to this ways after ET induction. Blood samples were collected from healthy horses (n=6) which were stimulated with different doses (0, 1 or 10ng of LSP/mL) of LPS from E.coli, for 0 and 4 hours after the first stimulus and 4 hours after second stimulus. The pool (n=6) of RNA, extracted from the samples collected at 0, 2, 4 e 8 hours, was used for the transcription of the cDNA. The hybridization of the cDNA marked with Cy-3 was done in one slide 4x44 containing specific sequences from the equine species. We identified during the ET, on the different doses of LPS, an increase of transcripts for the receptors TLR-4 and -2, TNFAIP3 and Il-10 and a reduction of transcripts of other important genes, such as: MyD88, IL1-B, TNF-a, TRAM2, what characterizes and enlightens the changes in TLR signaling during endotoxin tolerance. / FAPESP: 2010/34567-8