Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-25Bitstream added on 2014-06-13T19:56:29Z : No. of bitstreams: 1 corbi_sct_me_arafo.pdf: 500522 bytes, checksum: acbb0ada52f0fc0619726c5c3c57e5c5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Doença Periodontal (DP) tem caráter multifatorial, com a influência de fatores como a presença de microrganismos periodontopatogênicos, suscetibilidade genética do hospedeiro, reação do sistema imune, hábito de fumar e presença de doenças sistêmicas. O tecido periodontal inflamado produz várias citocinas, dentre elas a interleucina 8 (IL-8). Estudos recentes realizados por este grupo investigaram polimorfismos no gene IL8 em indivíduos com e sem periodontite crônica, onde foram observados indivíduos com 2 vezes mais predisposição genética à DP. O objetivo do presente estudo foi testar a hipótese de que a maior suscetibilidade genética à periodontite crônica dada pelo haplótipo ATC/TTC no gene IL8 seria acompanhada por diferenças nos índices clínicos periodontais, nos níveis da citocina IL-8 no fluido sulcular (FS) e na resposta ao tratamento periodontal não-cirúrgico. Foram selecionados 79 indivíduos divididos quanto à presença ou não do referido haplótipo no gene IL8, de forma que os indivíduos “suscetíveis” e “não suscetíveis” foram subdivididos quanto à presença ou ausência da periodontite crônica. Os indivíduos selecionados foram submetidos a exame clínico periodontal e coletas de FS antes e após 45 dias de finalizado o tratamento periodontal não-cirúrgico. A citocina IL-8 foi quantificada por meio de teste imunoenzimático (ELISA). Como resultado verificou-se que, comparando indivíduos suscetíveis e não-suscetíveis à DP, não houve diferença estatisticamente significante tanto nos índices clínicos periodontais quanto na resposta ao tratamento periodontal realizado, sendo que apenas o volume do FS, no período baseline, apresentou diferença significativa. Assim, a suscetibilidade genética à DP previamente observada nesses indivíduos não... / Periodontal disease is a multifactorial disease which is influenced by factors such as the presence of periodontopathogenic microorganisms, the reaction of the immune system, smoking, genetic susceptibility and the occurrence of systemic diseases. The inflamed periodontal tissue produces several cytokines like Interleukin 8 (IL-8). Recent studies carried out by our research group investigated polymorphisms in the IL8 gene in patients with and without periodontitis, where it was found individuals with a genetic predisposition to periodontitis. The purpose of this study was to test the hypothesis that the genetic susceptibility to chronic periodontitis given by ATC/TTC haplotype in IL8 gene would be linked to differences in the clinical periodontal parameters, IL-8 cytokine levels in the gingival crevicular fluid (GCF) and the response to non-surgical periodontal therapy. Seventy-nine individuals were selected and grouped according to the presence or not of the haplotype given in the IL8 gene, so that the “susceptible” and “nonsusceptible” individuals were subdivided by the presence or absence of chronic periodontitis. The selected individuals were submitted to periodontal clinical exam and the collection of GCF was done before and 45 days after the non-surgical periodontal therapy. The IL-8 cytokine was quantified through an immunoenzymatic assay (ELISA). As a result, it was verified that, comparing susceptible and non-susceptible individuals to chronic periodontitis, there wasn’t any statistically significant difference as in clinical periodontal parameters as in response to non-surgical periodontal therapy. However, the volume of GCF, at baseline, presented a significant difference. Thus, the genetic susceptibility to chronic periodontitis previously observed in these individuals influenced neither... (Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-20Bitstream added on 2014-06-13T19:36:31Z : No. of bitstreams: 1 kim_yj_me_arafo.pdf: 638831 bytes, checksum: f183603fe99b8b5a6225e19af91a60e9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O estudo investigou se há associação individual dos polimorfismos –353(A/T), -738(T/A) e -845(T/C) na região promotora do gene interleucina 8 (IL8), bem como de seus haplótipos, com suscetibilidade à periodontite em indivíduos Brasileiros. Foram selecionados 500 indivíduos de ambos os gêneros (Grupo Controle n=224 e Grupo Periodontite n=276) que procuraram atendimento na Faculdade de Odontologia de Araraquara. A partir do DNA obtido de células da mucosa oral, os polimorfismos -738(T/A) e -845(T/C) foram analisados por PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism), e o -353(A/T) por SSP-PCR (Sequence Specific Primer – PCR). Os fragmentos obtidos foram submetidos à eletroforese vertical em gel de poliacrilamida a 10%. Para analisar a freqüência dos genótipos e alelos foi utilizado o teste χ2, ou o programa CLUMP para os polimorfismos que mostraram alelos raros. Os haplótipos foram estimados pelo programa ARLEQUIN e a diferença na distribuição deles entre os grupos foi investigada por meio do programa CLUMP. Os resultados da análise individual dos polimorfismos não evidenciaram associação com a periodontite. Em relação aos haplótipos, as freqüências dos mesmos como alelos e/ou genótipos entre Grupo Controle e Grupo Periodontite apresentaram diferenças estatisticamente significantes considerando a população total e também a não fumante. Os indivíduos com o haplótipo CTA apresentaram-se 2,14 vezes mais susceptíveis à doença periodontal (p=0,0012, OR=2,14; 95% CI =1,6-3,38). Concluiu-se que houve associação dos haplótipos formados pelos polimorfismos –845(T/C), –738(T/A) e –353(A/T) no gene IL8 com a suscetibilidade a periodontite na população brasileira estudada. / The purpose of this study was to investigate whether there is an individual association of the –845(T/C), –738(T/A) and –353(A/T) single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the IL8 gene, as well as their haplotypes with susceptibility to periodontitis in Brazilian population. DNA was extracted from buccal epithelial cells from 500 Brazilian individuals (Control group n = 224, Periodontitis group n = 276). The –845 and –738 SNPs were genotyped by PCR-RFLP method (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism). The –353 SNP was investigated using the Sequence Specific Primers Polymerase Chain Reaction method (SSP-PCR). Differences of the allelic and genotypic frequencies were assessed by Chi-squared test or by using the CLUMP program for rare alleles. Haplotypes were estimated using the ARLEQUIN program. Differences in the haplotype frequencies between the studied groups were assessed by the CLUMP program. No differences were observed in the allelic and genotypic distribution of all the investigated SNPs between control and periodontitis groups when they were analysed individually. The haplotypes distribution in the periodontitis and controls groups was significantly different both considering the total casuistic or the non-smokers subgroup only. Individuals with CTA haplotype seemed to be over twice more likely to develop periodontitis than individuals with other haplotypes (OR=2.14, 95% CI =1.36-3.38). The analysis of haplotypes constructed from –845(T/C), – 738(T/A) and –353 (A/T) polymorphisms in the IL8 gene demonstrated association with susceptibility to periodontitis in Brazilian individuals.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1773.pdf: 512334 bytes, checksum: 5ec7ba8077dcdb48d9f2860506bed56e (MD5) Previous issue date: 2008-04-01 / Universidade Federal de Sao Carlos / Introduction: Several investigations have been proposing signaling and immune functions for the cytokines accomplishment of aerobic exercises. However few studies have been related the effect of the exercise resisted with cytokines. Purpose: to evaluate the effect of a resistance training in circuit about the sharp action of the resistance exercise until the exhaustion in the levels of the plasmatic cytokines IL-6, IL-8, IL-10, IL-1, TNF and IL- 12p70. Methods: 14 untrained women (39,8 ± 3,9 years), (60,6 ± 6,6 kg) and (163,6 ± 6,6 cm) accomplished two Fatigue Test (FT) in the exercises Leg Press 45º (LP) and Bench Press (BP), these tests consisted of 3 sets with 50% of 1-RM related until the exhaustion with 1 minute of interval among the sets, before and after 10 weeks of resistance training in circuit. Before and 5 minutes after FT samples of blood were obtained for analysis of the plasmatic levels of the cytokines: interleukin 8 (IL-8), interleukin 10 (IL-10), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12p70 (IL-12p70), interleukin 1 (IL-1) and factor of necrosis tumoral (TNF). Results: The plasmatic concentration of IL-8 for the LP before and after FT in the periods pre and post-training were of (4.38 ± 2.62 and 5.73 ± 0.97 pg/ml) and (6.36 ± 1.35 and 6.47 ± 2.08 pg/ml), respectively. Moreover for the BP (3.68 ± 3.91 and 9.00 ± 2.57 pg/ml) and (5.71 ± 2.21 and 7.06 ± 2.26 pg/ml), not found significant differences among before and after FT, as well as, for pre and post-training for IL-8 in both exercises. The other cytokines did not reach the certain minimum limit of detection for the used kit. Conclusion: Resistance exercise until the exhaustion not provoke enough stress to alter the cytokinemia, before or after 10 weeks of resistance training in circuit. Words Key: CYTOKINES, RESISTANCE EXERCISE, IL-8, STRESS, FATIGUE TEST, EXHAUSTION. / Introdução: Várias investigações têm proposto papeis sinalizadores e imunoregulatórios para as citocinas diante a realização de exercícios aeróbios, entretanto, pouco estudos tem relatado o efeito do exercício resistido nessas substâncias. Objetivo: avaliar o efeito de um programa de treinamento de musculação em circuito sobre a ação aguda do exercício resistido realizado até a exaustão nos níveis das citocinas plasmáticas IL-6, IL-8, IL-10, IL-1β, TNFα e IL- 12p70. Métodos: 14 mulheres destreinadas (39,8 ± 3,9 anos), (60,6 ± 6,6 kg) e (163,6 ± 6,6 cm) realizaram dois testes de fadiga (TF) nos exercícios Leg Press 45° (LP) e Supino Reto (SR), que consistiram de 3 séries com 50% de 1-RM realizadas até a exaustão com 1 minuto de intervalo entre as séries, antes e após 10 semanas de treinamento de musculação em circuito. Antes e 5 minutos após o TF foram realizadas coletas sanguíneas para análise dos níveis plasmáticos das citocinas: interleucina 8 (IL-8), interleucina 10 (IL-10), interleucina 6 (IL-6), interleucina 12p70 (IL-12p70), interleucina 1β (IL-1β) e fator de necrose tumoral (TNF). Resultados: A concentração de IL-8 plasmática para o exercício LP antes e após o TF nos períodos pré e pós-treinamento foram de (4.38 ± 2.62 e 5.73 ± 0.97 pg/ml) e (6.36 ± 1.35 e 6.47 ± 2.08 pg/ml), respectivamente. Bem como, para o exercício SR (3.68 ± 3.91 e 9.00 ± 2.57 pg/ml) e (5.71 ± 2.21 e 7.06 ± 2.26 pg/ml). Não foram encontradas diferenças significativas entre antes e depois do TF, assim como, para pré e pós-treinamento para IL-8 em ambos os exercícios. As demais citocinas não atingiram o limite mínimo de detecção determinado pelo kit utilizado. Conclusão: Exercícios resistidos dinâmicos realizados até a exaustão não provocam estresse suficiente para alterar a citocinemia, antes ou após 10 semanas de treinamento de musculação em circuito. Palavras Chave: CITOCINAS, EXERCÍCIO RESISTIDO, IL-8, ESTRESSE, TESTE DE FADIGA, EXAUSTÃO.

Submitted by REGIS CILIA null (regiscilia@yahoo.com.br) on 2018-03-05T14:56:01Z No. of bitstreams: 1 Níveis de Interleucina-8 e Fator de Necrose Tumoral em pacientes pediátricos com sepse e choque séptico.pdf: 675870 bytes, checksum: bb9108ed4b040596793642cd19c62726 (MD5) / Rejected by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: Necessário fazer as seguintes correções no arquivo submetido: Problema 1: o arquivo submetido não contém capa, item obrigatório de acordo com as normas do seu programa Problema 2: ficha catalográfica A ficha deve ser incluída no arquivo PDF logo após a folha de rosto do seu trabalho. A submissão deve ser feita em arquivo único em formato PDF. Problema 3: resumo e abstract não estão na ordem de apresentação conforme norma estabelecida pelo programa. Assim que tiver efetuado a correção submeta o arquivo em PDF novamente. Agradecemos a compreensão. on 2018-03-06T14:25:02Z (GMT) / Submitted by REGIS CILIA null (regiscilia@yahoo.com.br) on 2018-03-07T13:42:37Z No. of bitstreams: 1 Níveis de IL-8 e TNF alfa em pacientes pediátricos com sepse e choque séptico.pdf: 1115848 bytes, checksum: 30327397c536d06cf1e151b9ae8030c2 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-03-08T19:49:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cilia_r_me_bot.pdf: 1115848 bytes, checksum: 30327397c536d06cf1e151b9ae8030c2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-08T19:49:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cilia_r_me_bot.pdf: 1115848 bytes, checksum: 30327397c536d06cf1e151b9ae8030c2 (MD5) Previous issue date: 2018-03-01 / As dificuldades relacionadas ao diagnóstico de sepse particularmente em pediatria indicam a necessidade de se buscar biomarcadores capazes não somente de distinguir as diferentes causa de inflamação, mas também de indicar a gravidade dos pacientes. Objetivos: avaliar o comportamento da Interleucina-8 (IL-8) e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e sua utilidade em diferenciar crianças com sepse e quadros correlatos. Métodos: crianças sépticas foram incluídas prospectivamente e divididas em dois subgrupos: sepse (GS; n=24) e choque séptico (GCS; n=26). IL-8 e TNF-α foram medidas à admissão (T0) e 12 horas mais tarde (T12h). Resultados: Os níveis plasmáticos de IL-8 diferiram estatisticamente entre os momentos de coleta em ambos os grupos, com diminuição significante tanto no GCS, quanto no GS. No GS, em T0 [GS: 68,5 (4,8 – 412)] e em T12h [GS: 44,9 (4,6 – 229,7)] - p = 0,034. No GCS, em T0 [GCS: 268,8 (17,1 – 508,4)] e em T12h [GCS: 116 (17,5 – 508,4)] - p = 0,001. Também na comparação entre grupos, houve diferença, sendo níveis mais elevados no GCS; em T0: [GS - T0: 68,56 (412,04 – 4,9) vs. GCS - T0: 268,80 (508,36 – 17,1) p=0,008 ] ; em T12h [GS – T12h: 45 (229,72 – 4,6) vs. GCS – T12h: 116,6 (508,4 – 17,5); p=0,005]. Os níveis plasmáticos de TNF-α não diferiram estatisticamente entre os momentos de coleta e entre os grupos. Conclusões: IL-8 parece ser útil no diagnóstico precoce de sepse e choque séptico, sendo relacionada com a gravidade da doença. / The difficulties related to the diagnosis of sepsis, particularly in pediatrics, indicate the need to look for biomarkers capable not only of distinguishing the different causes of inflammation, but also of indicating the severity of the patients. Objectives: To evaluate the behavior of Interleukin-8 (IL-8) and Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) and its usefulness in differentiating children with sepsis and related conditions. Methods: septic children were prospectively included and divided into two subgroups: sepsis (GS; n = 24) and septic shock (GCS; n = 26). IL-8 and TNF-α were measured at admission (T0) and 12 hours later (T12h). Results: Plasma levels of IL-8 differed statistically between the collection times in both groups, with a significant decrease in both GCS and GS. At GS, at T0 [GS: 68.5 (4.8 - 412)] and at T12h [GS: 44.9 (4.6 - 229.7)] - p = 0.034. In the GCS, at T0 [GCS: 268.8 (17.1-508.4)] and at T12h [GCS: 116 (17.5-508.4)] - p = 0.001. Also in the comparison between groups, there was difference, being higher levels in the GCS; in T0: [GS - T0: 68.56 (412.04 - 4.9) vs. GCS-T0: 268.80 (508.36 - 17.1) p = 0.008]; in T12h [GS - T12h: 45 (229.72 - 4.6) vs. GCS-T12h: 116.6 (508.4-17.5); p = 0.005]. Plasma levels of TNF-α did not differ statistically between collection times and between groups. Conclusions: IL-8 seems to be useful in the early diagnosis of sepsis and septic shock, being related to the severity of the disease. / 2004/03776-0

A Interleucina 8 (IL-8) é uma quimiocina CXC angiogênica que tem papel importante no desenvolvimento e progressão de vários tumores malignos, incluindo o câncer de próstata (CaP). O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) -251 T/A da região promotora do gene da IL-8, relativo ao local de início da transcrição deste gene, está associado com a produção desta citocina. O efeito da IL-8 é mediado através de dois receptores de alta afinidade, CXCR1 e CXCR2. O presente estudo investigou a influência da variação dos genes IL-8 e CXCR2 na susceptibilidade e nas características clinicopatológicas do CaP em um grupo de brasileiros. Duzentos e um pacientes e 185 controles saudáveis foram selecionados neste estudo casocontrole. Amostras de sangue foram coletadas para extração de DNA; a tipagem da IL-8 -251 T/A e CXCR2 +1208 C/T foi realizada através da reação em cadeia da polimerase com sequência específica de primers (PCR-SSP), seguida pela eletroforese em gel de agarose. O risco associado entre os genótipos, a susceptibilidade do CaP e as características do tumor, foi estimado pelo odds ratio (OR), com intervalo de confiança de 95%, usando análise de regressão logística e ajustando para idade ao diagnóstico. Encontramos uma associação estatisticamente significativa entre o genótipo heterozigoto CT do gene CXCR2 +1208 e CaP. Este genótipo foi significativamente menos frequente em pacientes com estádio clínico T3-T4 comparado com T1-T2 (56.7% versus 80.5%). Nossos achados sugerem que os portadores do genótipo CT CXCR2 +1208 tiveram um efeito protetor para estádio avançado de CaP (CT versus CC: OR ajustado = 0.25; P = 0.02). Não foi encontrada associação significativa entre o polimorfismo -251 T/A da IL-8 e os parâmetros clinicopatológicos do CaP. Estes resultados indicam que o genótipo CT do CXCR2 +1208 é menos frequente em estádios avançado de CaP, sugerindo que este receptor de quimiocina tenha um papel na patogênese desta doença. / Interleukin-8 (IL-8) is an angiogenic CXC chemokine that plays an important role in both the development and progression of several human malignancies including prostate cancer (PC). A single nucleotide polymorphism (SNP) at -251 upstream of the transcriptional start site of the IL-8 gene has been shown to influence its production. The effects of IL-8 are mediated by two highly related chemokine receptors, CXCR1 and CXCR2. The present study investigated the influence of the IL-8 and CXCR2 gene variation on susceptibility and clinicopathological characteristics of PC in a group of Brazilian subjects. Two hundred and one patients and 185 healthy controls were enrolled in a case-control study. Blood was collected for DNA extraction; typing of IL-8 -251 T/A and CXCR2 +1208 C/T genes was performed by polymerase chain reaction with sequence-specific primers (PCR-SSP), followed by agarose gel electrophoresis. Risk association between the genotypes, PC susceptibility and tumor characteristics was estimated by odds ratio (OR) and 95% confidence intervals (95% CI) using logistic regression analysis, after adjusting for age at diagnosis. A significant association was found between the heterozygous CXCR2 +1208 CT genotype and PC. The CXCR2 +1208 CT genotype was significantly less frequent in patients with clinical stage T3-T4 compared to T1-T2 (56.7 versus 80.5%). Our findings suggest that carriers of the CXCR2 +1208 CT genotype had a protective effect for advanced PC (CT versus CC: adjusted OR = 0.25; P = 0.02). No association was observed between the SNP for IL-8 -251 T/A and clinicopathological parameters of PC. These results indicated that the CXCR2 +1208 CT genotype is less frequent in advanced stages of PC, suggesting that this chemokine receptor plays a role in the pathogenesis of this disease.

O quelóide é um tumor fibroso benigno que ocorre durante a cicatrização da pele em indivíduos geneticamente predispostos. A cicatrização é um processo biológico complexo e depende da interação de diferentes estruturas teciduais e de um grande número de tipos celulares residentes e infiltrativos, que produzem citocinas. A interleucina 8 (IL-8), citocina pró-inflamatória, é super-expressa pelos fibroblastos durante o desenvolvimento do tecido de granulação, acelerando o processo de cicatrização. Como o quelóide resulta de uma reparação tecidual anormal após lesão da pele, o presente estudo teve por objetivo determinar a expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e CXCR2, e a capacidade proliferativa, pelo ciclo celular, dos fibroblastos queloideanos cultivados e extraídos ex vivo, por citometria de fluxo. Fibroblastos de cicatriz queloideana e de pele normal foram obtidos de 21 pacientes da raça negra, com idade variando entre 10 e 40 anos, de lesões com até 2 anos de evolução. Em nosso estudo constatamos expressão reduzida dos receptores para a IL-8, CXCR1(35,7%±11,2) e CXCR2 (27,8%±11,3), em fibroblastos de cicatriz queloideana cultivados, comparando com a pele normal (44,1±16,2 e 46,3±27,1 respectivamente). Entretanto, essa diferença só foi significante para o receptor CXCR2. A baixa expressão desses receptores poderia ser decorrente da atividade de metaloproteinases, que regulam a expressão de proteínas da superfície celular, através de clivagem enzimática, ou a capacidade reduzida de internalização e a reciclagem de receptores, mantida por filamentos de actina do citoesqueleto, que nos fibroblastos do quelóide estão diminuídos. Em relação ao ciclo celular de fibroblastos cultivados do quelóide e da pele normal, verificamos diferenças não significantes da capacidade de replicação (fase S do ciclo celular) e de apoptose. No quelóide observamos significante aumento de células na fase G2/M, indicando aumento da velocidade de divisão celular. Para confirmar esses achados estudamos o ciclo celular de fibroblastos extraídos ex vivo, da porção periférica e central do quelóide e da pele normal. Os fibroblastos da porção periférica apresentaram porcentagem significantemente maior de células com capacidade replicativa, fase S do ciclo (22,9% ± 11,6), em relação à porção central (4,7% ± 2,9) e à pele normal (6,8% ± 4,9), e maior velocidade de divisão celular, fase G2/M (18,6 ± 12,0), em relação à porção central (35,6 ± 7,0) e pele normal (32,3 ± 6,9). Verificamos que a porção central apresentou maior porcentagem de células em apoptose (7,0% ± 2,1), comparado à porção periférica (4,9% ± 1,9) e pele normal (2,0% ± 0,86). Esses dados indicam que as células da porção periférica do quelóide parecem ser responsáveis pela elevada taxa de proliferação, justificando o crescimento expansivo a partir das margens da cicatriz queloideana, com desenvolvimento de lesão semelhante a tumor, bem como a porção central ser responsável pela fibrose, contendo células quiescentes e apoptóticas. Esses resultados sugerem modulação diferencial das reações celulares através das vias de sinalização para proliferação ou morte celular programada. Neste sentido, a baixa expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e principalmente de CXCR2, nos fibroblastos do quelóide sugere capacidade reduzida da IL-8 em promover cicatrização acelerada. A baixa atividade da IL-8 sobre os fibroblastos queloideanos estaria promovendo desregulação da resposta inflamatória e com isso atraindo novas células inflamatórias para o local e produzindo sinais alterados, como grande produção da citocina TGFβ. Essa desregulação do processo de cicatrização, com alteração de citocinas e da matriz extracelular, poderia ser responsável pelas duas populações de fibroblastos, uma proliferativa na periferia e outra quiescente e apoptótica na porção central. Finalizando, podemos concluir que nossos resultados correspondem às alterações histológicas e clínicas do quelóide que se expande nos limites da lesão. / A keloid is a benign fibrous tumor that occurs during wound healing in genetically predisposed individuals. Healing is a complex biological process and depends on the interaction of different tissue structures and a great number of resident and infiltrative cell types. The interleukin-8 (IL-8), a proinflammatory chemokine, showed higher expression in fibroblasts during the development of the granulation tissue, promoting more rapid tissue maturation. Since keloids result from abnormal wound healing, the objective of the present study was to determine the expression of CXCR1 and CXCR2, IL-8 receptors, and the proliferation capacity, throughout the cell cycle, of the keloid fibroblasts extracted ex vivo and those submitted to in vitro cultivation. Normal skin and keloid scar fibroblasts were obtained from 21 African-Brazilian patients, aged from 10 to 40 years, whose lesions had evolved for no longer than 2 years. Expression of receptors and the cell cycle was assessed by flow cytometry. We showed lower expression of the CXCR1 (35,7% ± 11,2) and CXCR2 (27,8%±11,3) in keloid fibroblasts, when compared with normal skin (44,1 ± 16,2 e 46,3 ± 27,1 respectively), but the difference was not significant for the CXCR1 receptor. This lower expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could be due to the action of metalloproteinases, which regulate the surface protein enzymatically, or fibroblastic cytoskeleton conditions, which influence receptor internalization and recycling. The distribution assessment of cell cycle phases of fibroblasts cultivated from keloid scars and normal skin did not show significant difference in replication capacity and apoptosis. The keloid fibroblasts presented a significantly higher proportion of cells in the G2/M phase, suggesting higher rate of cell division. To confirm these results we studied the cell cycle of fibroblasts extracted ex vivo, now separated by central and peripheral portions of keloid and normal skin. The peripheral fibroblasts showed significant high cell proportions in phase S (22,9% ± 11,6), compared with the central portion (4,7% ± 2,9) and normal skin (6,8% ± 4,9), and higher cells in division phase G2/M (18,6% ± 12,0), compared with the central portion (35,6% ± 7,0) and normal skin (32,3% ± 6,9). The central portion showed higher proportion of apoptosis (7,0% ± 2,1), compared with the peripheral portion (4,9% ± 1,9) and normal skin (2,0% ± 0,86). These results suggest that the keloid peripheral cells could be responsible for the proliferation rate, justifying the expansive keloid growth at the borders of the keloid scar, in a similar fashion to tumor development and the central portion being responsible for fibrosis, with quiescent and apoptotic cells. These results suggest a differentiated modulation of cell reactions by signal pathways for programmed cellular proliferation or death. In this sense, the low expression of the IL-8 receptors CXCR1 and CXCR2 in keloid fibroblasts suggests a diminished capacity of IL-8 to promote accelerated healing. This low expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could promote the dysregulation of the inflammatory response and thus attract more inflammatory cells to the site, producing different signals, such as a high production of the TGFβ cytokine. This dysregulation of the healing process, with changed cytokine and extracellular matrix expression, could be responsible for two different cell populations of fibroblasts, one proliferation at the periphery and the other fibrotic at the center of the lesion, with apoptotic and quiescent cells. Finally, we conclude that our results correspond to the histological and clinical changes of keloids that grow beyond the wound boundaries.

Nos últimos anos, notou-se aumento da incidência de carcinoma espinocelular de orofaringe (CECOF) associado ao HPV. Sabe-se que CECOF associado ao HPV apresenta melhor prognóstico do que CECOF não infectado por HPV. Inúmeros estudos em carcinoma cervical demonstram alterações de TLRs, isto provavelmente devido às associações das oncoproteínas E6 e E7 com estes receptores. Em humanos, existem 10 TLRs identificados, os quais colaboram na resposta imune contra bactérias, fungos e vírus, bem como colaboram na promoção ou regressão do tumor. Esta influência do TLR na carcinogênese tem sido alvo de inúmeros estudos devido à ligação entre inflamação e o câncer. O presente trabalho teve como objetivo verificar diferenças na expressão e função de receptores Toll-like em carcinoma espinocelular de orofaringe (CECOF). Para tal, foram utilizados trinta e sete espécimes diagnosticados como CECOF e a expressão imuno-histoquímica das proteínas p16 e TLR4 analisadas. Duas linhagens de CECOF HPV16 + e duas CECOF HPV-. foram utilizadas para análise da expressão de TLR1-10, IL-6 e IL-8, por qPCR. A detecção dos principais TLRs (TLR1, TLR2, TLR6 e TLR4) foi feita por citometria de fluxo. Para ativação da via de sinalização de TLR2, e posterior análise da expressão de IL6 e IL8, as células foram estimuladas com peptidoglicano. Para verificar a expressão e função de TLR4, as células foram estimuladas com LPS e LPS UP para posterior análise de IL-6 e IL-8, por ELISA. Os resultados demonstraram diferenças na expressão gênica de TLR1 e TLR6 entre as linhagens HPV- e o grupo HPV+ e diferenças na expressão proteica de TLR9. TLR2 apresentou aumento da expressão proteica em todas as linhagens e demonstra desencadeamento da resposta imune, com secreção de IL6 e IL8 nas linhagens HPV- (SCC72 e SCC89) e em uma das linhagens HPV+ (SCC2). Interessantemente, TLR4 não apresentou diferenças significativas na expressão gênica e proteica. Entretanto, as linhagens HPV+ não demonstraram resposta pró-inflamatória mesmo quando estimuladas com LPS e LPS ultra puro, agonista específico de TLR4. Assim, este trabalho contribui para estabelecer o perfil da expressão dos receptores Toll-like em linhagens celulares de CECOF HPV- e HPV+, e aponta para alterações ocorridas na via de sinalização mediada por TLR4. Além disso, nossos resultados abrem portas para futuros estudos na avaliação de alterações causadas no sistema imune inato pelo HPV, em carcinomas espinocelulares de orofaringe. / The incidence of HPV- associated oropharynx squamous cell carcinoma (OPSCC) has increased in recent years. HPV- associated OPSCC has a better prognosis than OPSCC not infected with HPV. In cervical carcinoma, HPV oncoproteins E6 and E7 influence the expression of Toll-like receptors (TLR). To date, 10 TLRs have been identified in humans and many are important for the detection of bacteria, fungi and viruses, as well as regression and tumor promotion. This influence of TLR in carcinogenesis has been the subject of numerous studies, due to the connection between inflammation and cancer. This study aimed to determine differences in the expression and function of Toll-like receptor in OPSCC. Thirty-seven tumours were selected and immunohistochemistry for p16 and TLR4 was performed. Two HPV16-associated OPSCC and two OPSCC not associated to HPVcell lines were used. qPCR was performed to analyze the expression of TLR1-10, IL-6 and IL-8. The detection of the main TLRs (TLR1, TLR2, TLR6 and TLR4) was performed by flow cytometry. For activation of the TLR2-signaling pathway and subsequent analysis of IL6 and IL8 expression, cells were stimulated with peptidoglycan. To verify the expression and function TLR4 cells were stimulated with LPS and LPS UP and subsequent analysis of IL-6 and IL-8 by ELISA. The results showed differences in the expression of TLR1 and TLR6 between the HPV- group and the HPV+ group and differences in protein expression of TLR9. TLR2 has increased protein expression in all cell lines and demonstrates the trigger of the immune response, with the secretion of IL6 and IL8 in HPV- cell lines (SCC72 and SCC89) and one HPV+ cell line (SCC2). Interestingly, TLR4 showed no significant differences in gene and protein expression. However, HPV+ cell lines showed no pro-inflammatory response even when stimulated with LPS and LPS UP, a specific agonist of TLR4. This work helps to establish the profile of the expression of Toll-like receptors in OPSCC (SCC72 and SCC89) and HPV- associated OPSCC (SCC2 and SCC90), in vitro, and points to changes in the signaling pathway mediated by TLR4. In addition, our results open new avenues for future studies to assess changes in the innate immune system caused by HPV in oropharynx carcinomas.

Nos últimos anos, notou-se aumento da incidência de carcinoma espinocelular de orofaringe (CECOF) associado ao HPV. Sabe-se que CECOF associado ao HPV apresenta melhor prognóstico do que CECOF não infectado por HPV. Inúmeros estudos em carcinoma cervical demonstram alterações de TLRs, isto provavelmente devido às associações das oncoproteínas E6 e E7 com estes receptores. Em humanos, existem 10 TLRs identificados, os quais colaboram na resposta imune contra bactérias, fungos e vírus, bem como colaboram na promoção ou regressão do tumor. Esta influência do TLR na carcinogênese tem sido alvo de inúmeros estudos devido à ligação entre inflamação e o câncer. O presente trabalho teve como objetivo verificar diferenças na expressão e função de receptores Toll-like em carcinoma espinocelular de orofaringe (CECOF). Para tal, foram utilizados trinta e sete espécimes diagnosticados como CECOF e a expressão imuno-histoquímica das proteínas p16 e TLR4 analisadas. Duas linhagens de CECOF HPV16 + e duas CECOF HPV-. foram utilizadas para análise da expressão de TLR1-10, IL-6 e IL-8, por qPCR. A detecção dos principais TLRs (TLR1, TLR2, TLR6 e TLR4) foi feita por citometria de fluxo. Para ativação da via de sinalização de TLR2, e posterior análise da expressão de IL6 e IL8, as células foram estimuladas com peptidoglicano. Para verificar a expressão e função de TLR4, as células foram estimuladas com LPS e LPS UP para posterior análise de IL-6 e IL-8, por ELISA. Os resultados demonstraram diferenças na expressão gênica de TLR1 e TLR6 entre as linhagens HPV- e o grupo HPV+ e diferenças na expressão proteica de TLR9. TLR2 apresentou aumento da expressão proteica em todas as linhagens e demonstra desencadeamento da resposta imune, com secreção de IL6 e IL8 nas linhagens HPV- (SCC72 e SCC89) e em uma das linhagens HPV+ (SCC2). Interessantemente, TLR4 não apresentou diferenças significativas na expressão gênica e proteica. Entretanto, as linhagens HPV+ não demonstraram resposta pró-inflamatória mesmo quando estimuladas com LPS e LPS ultra puro, agonista específico de TLR4. Assim, este trabalho contribui para estabelecer o perfil da expressão dos receptores Toll-like em linhagens celulares de CECOF HPV- e HPV+, e aponta para alterações ocorridas na via de sinalização mediada por TLR4. Além disso, nossos resultados abrem portas para futuros estudos na avaliação de alterações causadas no sistema imune inato pelo HPV, em carcinomas espinocelulares de orofaringe. / The incidence of HPV- associated oropharynx squamous cell carcinoma (OPSCC) has increased in recent years. HPV- associated OPSCC has a better prognosis than OPSCC not infected with HPV. In cervical carcinoma, HPV oncoproteins E6 and E7 influence the expression of Toll-like receptors (TLR). To date, 10 TLRs have been identified in humans and many are important for the detection of bacteria, fungi and viruses, as well as regression and tumor promotion. This influence of TLR in carcinogenesis has been the subject of numerous studies, due to the connection between inflammation and cancer. This study aimed to determine differences in the expression and function of Toll-like receptor in OPSCC. Thirty-seven tumours were selected and immunohistochemistry for p16 and TLR4 was performed. Two HPV16-associated OPSCC and two OPSCC not associated to HPVcell lines were used. qPCR was performed to analyze the expression of TLR1-10, IL-6 and IL-8. The detection of the main TLRs (TLR1, TLR2, TLR6 and TLR4) was performed by flow cytometry. For activation of the TLR2-signaling pathway and subsequent analysis of IL6 and IL8 expression, cells were stimulated with peptidoglycan. To verify the expression and function TLR4 cells were stimulated with LPS and LPS UP and subsequent analysis of IL-6 and IL-8 by ELISA. The results showed differences in the expression of TLR1 and TLR6 between the HPV- group and the HPV+ group and differences in protein expression of TLR9. TLR2 has increased protein expression in all cell lines and demonstrates the trigger of the immune response, with the secretion of IL6 and IL8 in HPV- cell lines (SCC72 and SCC89) and one HPV+ cell line (SCC2). Interestingly, TLR4 showed no significant differences in gene and protein expression. However, HPV+ cell lines showed no pro-inflammatory response even when stimulated with LPS and LPS UP, a specific agonist of TLR4. This work helps to establish the profile of the expression of Toll-like receptors in OPSCC (SCC72 and SCC89) and HPV- associated OPSCC (SCC2 and SCC90), in vitro, and points to changes in the signaling pathway mediated by TLR4. In addition, our results open new avenues for future studies to assess changes in the innate immune system caused by HPV in oropharynx carcinomas.

SOARES, Denise Josino. Efeitos antioxidante e antiinflamatório da polpa de pitanga roxa (Eugenia uniflora L.) sobre células bucais humanas, aplicando experimentos in vitro e ex vivo. 2014. 98 f. Tese (Doutorado em tecnologia de alimentos)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-07T18:44:53Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_djsoares.pdf: 2572830 bytes, checksum: 5fcdb95b76b4c0c19e882eb36d8865b7 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-21T20:26:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_djsoares.pdf: 2572830 bytes, checksum: 5fcdb95b76b4c0c19e882eb36d8865b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T20:26:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_djsoares.pdf: 2572830 bytes, checksum: 5fcdb95b76b4c0c19e882eb36d8865b7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a tropical fruit found in the region that covers the central part of Brazil to Northern Argentina. This fruit has low lipid content, and is rich in bioactive compounds, such as polyphenols and carotenoids. In view of the use of pitanga tree in folk medicine and the shortage of scientific works about the antioxidative and anti-inflammatory effect of the purple pitanga, the present work aimed to investigate these characteristics in the pulp and in the sweetened tropical juice of purple pitanga, using in vitro and ex vivo experiments. In the present study, purple pitanga pulp was divided into two fractions (volatile and non-volatile), and the main compound of each fraction was identified and quantified. Human gingival cells (from six volunteers) were exposed to purple pitanga sweetened tropical juice and its main volatile and non-volatile compounds and analyzed by the catalase activity, DNA damage and interleukin 8 (IL-8) releases. The experiment was also performed with human gingival fibroblast (HGF-1), where cells were exposed to the individual main compounds from purple pitanga pulp and the IL-8 release was analyzed. Purple pitanga pulp presented mean values of soluble solids (8.33 ± 0.06 °Brix), pH (3.12 ± 0.01), titratable acidity (1.76 ± 0.20 g citric acid/100 mL) and total sugars (9.28 ± 0.60 g glucose/100 mL) within the standards required by current Brazilian law. This pulp also showed significant levels of the bioactive compounds: anthocyanins (24.82 ± 0.46 mg/100 mL), yellow flavonoids (11.33 ± 0.66 mg/100 mL) and total extractable polyphenols (26.85 ± 0.30 mg GAE/100 mL), making this product a good source of natural antioxidants. With regard to the main compound from volatile and non-volatile fractions of purple pitanga pulp, oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-one (85 ± 4.01 µg/mL) was observed in the volatile fraction and cyanidin-3-glucoside (340 ± 4.19 µg/mL )was observed in the non-volatile fraction. The low pH of the purple pitanga sweetened tropical juice decreases catalase activity, while oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-one and cyanidin-3-glucoside did not interfere and were not able to inhibit the activity of this enzyme. Purple pitanga sweetened tropical juice prevented DNA damage in human gingival cells. Due to the low number of volunteers in the experiment with purple pitanga sweetened tropical juice and the main compounds from volatile and non-volatile fractions of purple pitanga pulp, the results regarding the IL-8 release are inconclusive. Cyanidin-3-glucoside and oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-one presented anti-inflammatory effects in HGF-1 cells. / A pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma fruta tropical encontrada na região que compreende a parte central do Brasil e o Nordeste da Argentina. Este fruto possui baixo conteúdo de lipídios, sendo rico em vitaminas e compostos bioativos, como os polifenóis e carotenóides. Devido ao uso da pitangueira na medicina popular e escassez de trabalhos científicos sobre as propriedades antioxidantes e antiinflamatórias da pitanga roxa, o presente trabalho teve como objetivo investigar essas características na polpa e no suco tropical de pitanga roxa adoçado, usando experimentos in vitro e ex vivo. No presente estudo, a polpa de roxa foi separada em duas frações (volátil e não volátil), sendo o composto majoritário de cada fração identificado e quantificado. Células da gengiva humana (provenientes de seis voluntários) foram expostas ao suco tropical de pitanga e ao composto majoritário de cada fração e analisadas quanto a atividade da catalase, o dano do DNA e a liberação da interleucina 8 (IL-8). O experimento também foi realizado em células dos fibroblastos gengivais humanos (HGF-1), cujas células foram expostas aos compostos majoritários das duas frações da polpa de pitanga roxa e a liberação da IL-8 foi analisada. A polpa de pitanga roxa apresentou valores médios de sólidos solúveis (8,33 ± 0,06 °Brix), pH (3,12 ± 0,01), acidez titulável (1,76 ± 0,20 g ácido cítrico/100 mL) e açúcares totais (9,28 ± 0,60 g glicose/100 mL) dentro dos padrões exigidos pela legislação brasileira vigente. A referida polpa apresentou, ainda, níveis consideráveis dos compostos bioativos: antocianinas (24,82 ± 0,46 mg/100 mL), flavonóides amarelos (11,33 ± 0,66 mg/100 mL) e polifenóis extraíveis totais (26,85 ± 0,30 mg GAE/100 mL), fazendo deste fruto uma boa fonte de antioxidantes naturais. Como composto majoritário das frações volátil e não volátil da polpa de pitanga observa-se a oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-ona (85 ± 4,01 µg/mL) e a cianidina-3-glicosídeo (340 ± 4,19 µg/mL), respectivamente. O baixo pH do suco tropical de pitanga roxa adoçado provocou uma redução da atividade da catalase, enquanto a oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-ona e a cianidina-3-glicosídeo não interferiram e não foram capazes de inibir a atividade desta enzima. O suco tropical de pitanga roxa adoçado preveniu o dano do DNA em células da gengiva humana. Devido ao baixo número de voluntários no experimento com o suco tropical de pitanga roxa adoçado e os compostos majoritários das frações volátil e não volátil da polpa de pitanga roxa, os resultados referentes à liberação da IL-8 são inconclusivos. Cianidina-3-glicosídeo e oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-ona apresentaram efeito antiinflamatório em células HGF-1.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A pitanga (Eugenia uniflora L.) à uma fruta tropical encontrada na regiÃo que compreende a parte central do Brasil e o Nordeste da Argentina. Este fruto possui baixo conteÃdo de lipÃdios, sendo rico em vitaminas e compostos bioativos, como os polifenÃis e carotenÃides. Devido ao uso da pitangueira na medicina popular e escassez de trabalhos cientÃficos sobre as propriedades antioxidantes e antiinflamatÃrias da pitanga roxa, o presente trabalho teve como objetivo investigar essas caracterÃsticas na polpa e no suco tropical de pitanga roxa adoÃado, usando experimentos in vitro e ex vivo. No presente estudo, a polpa de roxa foi separada em duas fraÃÃes (volÃtil e nÃo volÃtil), sendo o composto majoritÃrio de cada fraÃÃo identificado e quantificado. CÃlulas da gengiva humana (provenientes de seis voluntÃrios) foram expostas ao suco tropical de pitanga e ao composto majoritÃrio de cada fraÃÃo e analisadas quanto a atividade da catalase, o dano do DNA e a liberaÃÃo da interleucina 8 (IL-8). O experimento tambÃm foi realizado em cÃlulas dos fibroblastos gengivais humanos (HGF-1), cujas cÃlulas foram expostas aos compostos majoritÃrios das duas fraÃÃes da polpa de pitanga roxa e a liberaÃÃo da IL-8 foi analisada. A polpa de pitanga roxa apresentou valores mÃdios de sÃlidos solÃveis (8,33  0,06 ÂBrix), pH (3,12  0,01), acidez titulÃvel (1,76  0,20 g Ãcido cÃtrico/100 mL) e aÃÃcares totais (9,28  0,60 g glicose/100 mL) dentro dos padrÃes exigidos pela legislaÃÃo brasileira vigente. A referida polpa apresentou, ainda, nÃveis considerÃveis dos compostos bioativos: antocianinas (24,82  0,46 mg/100 mL), flavonÃides amarelos (11,33  0,66 mg/100 mL) e polifenÃis extraÃveis totais (26,85  0,30 mg GAE/100 mL), fazendo deste fruto uma boa fonte de antioxidantes naturais. Como composto majoritÃrio das fraÃÃes volÃtil e nÃo volÃtil da polpa de pitanga observa-se a oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-ona (85  4,01 Âg/mL) e a cianidina-3-glicosÃdeo (340  4,19 Âg/mL), respectivamente. O baixo pH do suco tropical de pitanga roxa adoÃado provocou uma reduÃÃo da atividade da catalase, enquanto a oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-ona e a cianidina-3-glicosÃdeo nÃo interferiram e nÃo foram capazes de inibir a atividade desta enzima. O suco tropical de pitanga roxa adoÃado preveniu o dano do DNA em cÃlulas da gengiva humana. Devido ao baixo nÃmero de voluntÃrios no experimento com o suco tropical de pitanga roxa adoÃado e os compostos majoritÃrios das fraÃÃes volÃtil e nÃo volÃtil da polpa de pitanga roxa, os resultados referentes à liberaÃÃo da IL-8 sÃo inconclusivos. Cianidina-3-glicosÃdeo e oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-ona apresentaram efeito antiinflamatÃrio em cÃlulas HGF-1. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a tropical fruit found in the region that covers the central part of Brazil to Northern Argentina. This fruit has low lipid content, and is rich in bioactive compounds, such as polyphenols and carotenoids. In view of the use of pitanga tree in folk medicine and the shortage of scientific works about the antioxidative and anti-inflammatory effect of the purple pitanga, the present work aimed to investigate these characteristics in the pulp and in the sweetened tropical juice of purple pitanga, using in vitro and ex vivo experiments. In the present study, purple pitanga pulp was divided into two fractions (volatile and non-volatile), and the main compound of each fraction was identified and quantified. Human gingival cells (from six volunteers) were exposed to purple pitanga sweetened tropical juice and its main volatile and non-volatile compounds and analyzed by the catalase activity, DNA damage and interleukin 8 (IL-8) releases. The experiment was also performed with human gingival fibroblast (HGF-1), where cells were exposed to the individual main compounds from purple pitanga pulp and the IL-8 release was analyzed. Purple pitanga pulp presented mean values of soluble solids (8.33  0.06 ÂBrix), pH (3.12  0.01), titratable acidity (1.76  0.20 g citric acid/100 mL) and total sugars (9.28  0.60 g glucose/100 mL) within the standards required by current Brazilian law. This pulp also showed significant levels of the bioactive compounds: anthocyanins (24.82  0.46 mg/100 mL), yellow flavonoids (11.33  0.66 mg/100 mL) and total extractable polyphenols (26.85  0.30 mg GAE/100 mL), making this product a good source of natural antioxidants. With regard to the main compound from volatile and non-volatile fractions of purple pitanga pulp, oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-one (85  4.01 Âg/mL) was observed in the volatile fraction and cyanidin-3-glucoside (340  4.19 Âg/mL )was observed in the non-volatile fraction. The low pH of the purple pitanga sweetened tropical juice decreases catalase activity, while oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-one and cyanidin-3-glucoside did not interfere and were not able to inhibit the activity of this enzyme. Purple pitanga sweetened tropical juice prevented DNA damage in human gingival cells. Due to the low number of volunteers in the experiment with purple pitanga sweetened tropical juice and the main compounds from volatile and non-volatile fractions of purple pitanga pulp, the results regarding the IL-8 release are inconclusive. Cyanidin-3-glucoside and oxidoselina-1,3,7(11)-trien-8-one presented anti-inflammatory effects in HGF-1 cells.