Orientadores: Lea Rodrigues Simioni, Maria Alice da Cruz-Holing / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:17:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_PriscilaRandazzode_M.pdf: 4111122 bytes, checksum: 4edbe32ec7d6b0ac303c94e564c0a4e6 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os efeitos miotóxicos dos venenos botrópicos são inquestionáveis pela exuberante manifestação clínica e são extensivamente relatados na literatura. Já os efeitos neurotóxicos têm sido descritos sob condições in vitro, em preparações neuromusculares, com pouca ou nenhuma evidência clínica. O objetivo do presente trabalho foi o de contribuir para o conhecimento sobre a farmacologia da bothropstoxina-I (BthTX-I), o principal componente do veneno de Bothrops jararacussu, em suas dimensões pré- e pós-sinápticas. Esta toxina reproduz os mesmos efeitos in vitro do veneno bruto, quais sejam, bloqueio neuromuscular e mionecrose. Como ferramenta farmacológica utilizou-se o íon manganês ('Mn POT.2+¿), capaz de prevenir o efeito bloqueado r da BthTX-I, mas não ainda investigado o seu efeito protetor sobre a miotoxicidade da BthTX-I. Para isso foram utilizadas as preparações nervo frênico-diafragma (NFD) e extensor digitorum longus (EDL) de camundongos. A neurotoxicidade foi avaliada pelas técnicas mio gráfica e eletrofisiológica, enquanto a miotoxicidade pelas técnicas histológica (determinação da porcentagem das fibras lesadas e determinação da área transversal das fibras musculares) e bioquímica (determinação da creatinoquinase, CK). ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Various Bothrops snake venoms produce neuromuscular blockade in avian and mammalian nerve-muscle preparations in vitro that is partly mediated by myotoxins. Bothropstoxin-I (BthTX-I) is the principal myotoxin present in Bothrops jararacussu venom and contributes to the neuromuscular blockade and myonecrosis caused by the venom in vitro. In this work, we investigated the ability of manganese (Mn2+) to prevent the neuromuscular blockade caused by BthTX-I in mouse phrenic nerve-diaphragm (pND) and extensor digitorum longus (EDL) preparations. Conventional electrophysiological and myographic techniques were used to study the neurotoxicity while myotoxicity was assessed based on the release of creatine kinase (CK) and on histological analysis. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientadores: Lea Rodrigues Simioni, Maria Alice Cruz-Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T06:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cogo_JoseCarlos_D.pdf: 14244533 bytes, checksum: f92b7d3b01d031de9913d42d8deaa4ea (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Duas frações com atividade fosfolipásica ('PLA IND. 2¿) foram isoladas do veneno total de Bothrops insularis através de 2 processos de fracionamento: gel de Sephadex G-75 em tampão formato de amônio 50 mM, pH 3,5 e gel de Sephadex G-150 em tampão fosfato salina (PBS) 0,1M, pH 7,2 seguido por cromatografia de troca iônica em DEAE Sephadex em tampão bicarbonato de amônio 0,01 M, pH 8,0. A fração isolada em pH ácido mostrou-se menos efetiva que a fração obtida em pH neutro. Esta última reproduziu todos os efeitos farmacológicos observados com o veneno total. Estes foram associados apenas à atividade ('PLA IND. 2¿) pois a fração é desprovida de atividades esterásica, coagulante e caseinolítica. Utilizando técnicas de eletrofisiologia, miografia, determinação dos níveis de creatino quinase (CQ) e estudos das alterações morfológicas (músculos incubados com r- a fração ('PLA IND. 2¿) ou injetados com o veneno e fração ('PLA IND. 2¿) e comparando nossos resultados com aqueles existentes na literatura, chegamos às seguintes conclusões: 1) Alterações miográficas induzidas pela fração ('PLA IND. 2¿) isolada em pH neutro,caracterizam-se pela facilitação da neurotransmissão (aumento da amplitude de contração muscular e aumento da freqüência dos potenciais em miniatura da placa terminal) seguida por bloqueio das contrações musculares. O bloqueio induzido por esta fração, mostrou-se dose-tempo dependente e irreversível após a lavagem da preparação. A ('PLA IND. 2¿) isolada em pH ácido promoveu a facilitação da neurotransmissão mas não promoveu o bloqueio das contrações musculares. 2) Os efeitos da redução da temperatura de incubação e da substituição de Ca2+por Sr2+ no meio nutritivo, inibindo o efeito bloqueador da fração ('PLA IND. 2¿), sugere a existência de uma relação entre as atividades enzimática e farmacológica. 3) A ('PLA IND. 2¿) foi capaz de liberar CQ dos músculos biventer cervicis incubados, em consonância com os efeitos observados diretamente nos músculos incubados tanto em microscopia óptica como nos músculos injetados, analisados com microscopia eletrônica. 4) O soro anti-botrópico (comercial) neutralizou apenas parcialmente a liberação de CQ e bloqueio das contrações musculares. A existência de componentes específicos, que não se encontram nos venenos botrópicos utilizados na imunização, põe novamente em destaque a alta especialização alcançada pela Bothrops insularis. 5) As alterações ultraestruturais induzidas pelo veneno bruto atingem a junção neuromuscular, os axônios mielínicos e as fibras musculares. Incluem também alterações vasculares e vasculotóxicas com conseqüente efeitos hemorrágicos. 6) As alterações ultraestruturais induzidas pela fração ('PLA IND. 2¿) são mais brandas. Atingem tanto a porção pré-sináptica, como a porção do músculo. No músculo afetam principalmente o retículo sarcoplasmático (distúrbio iônico provável), o túbulo T (em menor grau), e a organização miofibrilar. Células musculares mionecróticas são em menor número do que as afetadas pelo veneno bruto. Por outro lado, os efeitos hemorrágicos parecem ser mais proeminentes / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Ciências Biológicas

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2016-06-24T17:05:01Z No. of bitstreams: 1 Atividade biológica do veneno de Rhinella Icterica Anura Bufonidae sobre o sistema nervoso de vertebrados.pdf: 3606718 bytes, checksum: 4fa3e0cd0db679c55769dcfec4b36b6d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2016-07-21T18:23:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Atividade biológica do veneno de Rhinella Icterica Anura Bufonidae sobre o sistema nervoso de vertebrados.pdf: 3606718 bytes, checksum: 4fa3e0cd0db679c55769dcfec4b36b6d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T18:23:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Atividade biológica do veneno de Rhinella Icterica Anura Bufonidae sobre o sistema nervoso de vertebrados.pdf: 3606718 bytes, checksum: 4fa3e0cd0db679c55769dcfec4b36b6d (MD5) Previous issue date: 2016-03-03 / Os venenos animais são fontes de compostos bioativos com aplicabilidade terapêutica. Os anuros produzem através de glândulas paratóides, uma secreção venenosa rica em compostos de diversas classes químicas, as quais apresentam uma série de atividades farmacológicas de nteresse biotecnológico. Os sapos da espécie Rhinella icterica (Spix, 1824), pertencem a um grupo de animais venenosos presentes no bioma Pampa com carência de estudos macológicos e toxicológicos. Para os ensaios biológicos, os sapos foram coletados na região de Derrubadas, no estado do Rio Grande do Sul. O veneno foi extraído manualmente por compressão das glândulas paratóides, tratado por extração metanólica seguida de liofilização e então foi chamado de MERIV. A neurobiologia do veneno foi avaliada sobre a junção neuromuscular de aves, através da preparação biventer cervicis de pintainhos (BCP) e, através da análise das desidrogenases em fatias hipocampais de camundongos. A incubação de MERIV (5, 10, 20, 40 µg/mL) e Digoxina (6,5; 13; 26 e 52 nM) em fatias hipocampais de camundongos, induziram um efeito dose dependente na viabilidade celular. Apenas MERIV (5 µg/mL) e Digoxina (6,5 e 13 nM) provocaram aumento significativo da viabilidade celular de 36 ± 10%, 52 ± 7% e 57 ± 13%, p<0.05, respectivamente, enquanto nas demais concentrações houve decréscimo na viabilidade celular quando comparados com o controle Hepes (n=6). Em preparações euromusculares BCP, MERIV (5, 10 µg/mL) produziu um efeito facilitatório de 60 ± 15% e 46 ± 6%, respectivamente, seguido de bloqueio neuromuscular em 120 min de registro (n=6, p<0.05). De forma semelhante, a incubação dos músculos com Digoxina 52 nM ou Ouabaína 0,2 nM mimetizou a atividade de MERIV com aumento da amplitude de contração por 19 ± 4% e 27 ± 6%, e diminuição da contração muscular de 80 ± 4% e 91 ± 5%, respectivamente (n=5, p<0.05). MERIV também demonstrouatividade digitalic-like com inibição de 39 ± 3% da Na+,K+-ATPase (n=4, p<0.05). Em BPC, quando MERIV foi incubado 20 min antes da d-Tubocurarina 1,45 µM, houve um reforço do bloqueio neuromuscular, o qual foi completo em 80 min. Enquanto que em preparações BCP curarizadas, MERIV aumentou o tempo de bloqueio em 50 min, semelhante a ação de drogas anticolinesterásicas. Juntos, esses dados indicam que o extrato metanólico do veneno de R. icterica é capaz de interferir com a neurotransmissão provavelmente via inibição das enzimas acetilcolinesterase e Na+-K+- TPase. / Animal poisons are sources of bioactive compounds with therapeutic applicability. Anurans through parotid glands produce a poisonous secretion rich in compounds of different chemicalclasses, that have a range of pharmacological activities of biotechnological interest. oads of the species Rhinella icterica (Spix, 1824), belong to a group of poisonous animals present in the Pampa biome that still need to pharmacological and toxicological studies. Venom collection was made by milking toads obtained at Derrubadas region, Rio Grande do Sul state. The venom was previously treated by methanol extraction followed by lyophilization (thus called MERIV), before the biological assays. The venom neurobiology was evaluated on chicks neuromuscular junction by preparation biventer cervicis (BCP), and by function of mitochondrial dehydrogenases in hippocampal brain slices from mice. Incubation of MERIV (5, 10, 20 and 40 μg/mL) or digoxin (6.5, 13, 26 and 52 nM) with mice hippocampal brain slices induced a dose-dependent effect on cell viability. At low concentration MERIV (5 μg/mL) and digoxin (6.5 and 13 nM) induced a corresponding significative increases in cell viability, 36 ± 10%, 52 ± 7% and 57 ± 13% (p<0.05), respectively, while at higher concentrations there were a decrease in cell viability compared with control Hepes (n=6). In chicks neuromuscular preparation BCP, MERIV (5, 10 µg/mL) produced a facilitatory effect of 60 ± 15% and 46 ± 6%, respectively, followed by neuromuscular blockade in 120 min recordings (n=6, p <0.05). The incubation of BCP with digoxin (52 nM) or ouabain (0.2 nM) mimicked the venom activity by increasing the amplitude of the twitches by 19 ± 4% and 27 ± 6%, respectively, followed by a depression in muscle contraction recorded for 120 min ( 80 ± 4% and 91± 5%, p<0.05, respectively, n=5). MERIV also demonstrated digitalic-like activity inhibiting 39 ± 3% of Na+,K+-ATPase (n = 4, p <0.05). In BCP, when MERIV was incubated for 20 min before d-Tubocurarine (1.45 μM), there was a reinforcement of the neuromuscular blockade, wich was complete at 80 min. However, in preparations “curarizadas”, incubated with d-Tubocurarine (1.45 μM) before MERIV, there was a increase in the blocking time at 50 min, similar to the action of acetylcholinesterase drugs. Altogether, these data indicate that the methanolic extract from R. icterica venom is able to interfere in neurotransmission, probably by inhibiting the enzymes acetylcholinesterase and Na+,K+- ATPase.

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2016-11-16T13:07:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Efeitos do Riluzole no Sistema Nervoso Central e Periférico de vertebrados..pdf: 3331266 bytes, checksum: 695a072e1aef84e61ff2e6ef010514a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-16T13:07:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Efeitos do Riluzole no Sistema Nervoso Central e Periférico de vertebrados..pdf: 3331266 bytes, checksum: 695a072e1aef84e61ff2e6ef010514a2 (MD5) Previous issue date: 2014-05-15 / O Riluzole é quimicamente relacionado aos benzotiazóis e é conhecido como um agente neuroprotetor, possuindo propriedades anticonvulsivantes, analgésicas, anestésicas, e sedativas. A ação neuroprotetora mais conhecida desta droga ocorre através da inibição da transmissão glutamatérgica no sistema nervoso central (SNC). Nesse trabalho, o Riluzole foi ensaiado sobre a junção neuromuscular esquelética (JNM) de aves visando estudar sua interação com o sistema nervoso periférico (SNP). Também foi verificada a ação do Riluzole em fatias de hipocampo de camundongos, comparando os resultados com agentes antiinflamatórios como o extrato de Hypericum brasiliense (HBE) e seu principal composto, quercetina, frente ao veneno de serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt). No SNP, o Riluzole foi ensaiado em preparação músculo biventer cervicis de pintainhos, em banho de órgão isolado, nas doses de 5, 10 e 20 µM. Foram obtidos registros da amplitude da força de contração muscular em presença ou ausência de Riluzole durante 120min, e as curvasresposta à adição exógena de acetilcolina (ACh – 110 µM) e ao cloreto de potássio (KCl – 20 mM), antes e após a incubação com o tratamento. O Riluzole induziu respostas tempo e dosedependentes. Na concentração de 5 µM houve uma diminuição gradativa e significativa da resposta contrátil (p<0.05). Na concentração de 10 µM, houve uma facilitação significativa (p<0.05) da resposta contrátil e das curvas evocadas pelo KCl e ACh. No entanto, na dose de 20 µM houve uma estabilização da contratilidade em relação ao controle. Em todas as doses de Riluzole ensaiadas na JNM houve um aumento significativo da atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE). Na sequência da verificação do mecanismo de ação do Riluzole sobre a placa motora, registros eletromiograficos foram tomados na presença dos inibidores especificos, Neostigmina e d-Tubocurarina, onde foi observada uma reversão dos efeitos quando Riluzole foi adicionado ao meio. Como modelo celular de SNC, a ação do Riluzole foi ensaiada em fatias de hipocampo e a viabilidade destas frente ao veneno de Cdt foi observada por meio da atividade de desidrogenases mitocondriais. Tanto Riluzole, como o extrato da planta HBE e quercetina, aumentaram a viabilidade celular em 1h de incubação a 37˚C na presença do veneno. Quercetina foi mais efetiva do que Riluzole e HBE em neutralizar a lise celular induzida pelo veneno. Assim, estes resultados demonstram a influência do Riluzole no SNC como neuroprotetor de toxinas de veneno de serpente, possivelmente atuando como agente anti-inflamatório, e no SNP, aumentando a atividade da AChE e atuando de maneira dose-dependente sobre a placa motora. / Riluzole is chemically related to benzothiazoles and it is known as a neuroprotective agent with anticonvulsant, analgesic, anesthetic and sedative properties. The neuroprotective drug action is well established being through inhibition of glutamatergic transmission in the central nervous system (CNS). In this study, we have assayed the drug Riluzole at skeletal neuromuscular junction (NMJ) of avian, seeking its interaction with the peripheral nervous system (PNS). We also tested Riluzole in the CNS of mice by comparing its results with anti - inflammatory agents, such as extract of Hypericum brasiliense (HBE) and its main isolated compound, quercetin, against the poison of Crotalus durissus terrificus (Cdt). In the PNS, Riluzole was tested in nerve-muscle preparations in chick biventer cervicis at doses of 5, 10 and 20 μM. It was obtained recordings of the muscle twitch-tension amplitude and the contracture responses to exogenous applied acetylcholine (ACh 110 μM) and potassium chloride (KCl – 20 mM) in the presence or absence of Riluzole during 120 min. Riluzole induced time and dose-dependent responses. At concentration of 5μM there was a gradual and significant decrease in the contractile response (p<0.05). The concentration of 10μM showed a significant facilitation of the contractile response (p<0.05) and an increase in the curve responses evoked by KCl and ACh. However, at a dose of 20 μM there was a stabilization of contractility compared to control. All tested doses of Riluzole showed a significant increase in the activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE). The action mechanism of Riluzole on the endplate was further analysed through the use of specific inhibitors, Neostigmine and dTubocurarine, a reversal of effects those was seen when Riluzole was added to the medium. As a cellular model of CNS, the action of Riluzole was tested in mice hippocampal slices. The cell viability against Cdt venom was observed through the activity of mitochondrial dehydrogenases. Riluzole as much as the plant extract HBE and its active ingredient, quercetin, increased cell viability in 1h incubation at 37˚C in the presence of the poison. However, quercetin showed to be more effective than Riluzole and HBE in neutralizing cell lysis induced by the venom. Thus, these results demonstrate the influence of Riluzole on the CNS, it showed a neuroprotective effect against snake venom toxins, possibly acting as an anti-inflammatory agent. As for the cholinergic system in the NMJ, Riluzole showed an interesting effect by increasing the activity of AChE and by acting in a dose-dependent manner over the endplate.

Submitted by CRISTIANE NEVES ALESSI PISSULIN null (crispissulin@gmail.com) on 2016-11-21T01:07:30Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Unesp.pdf: 3804425 bytes, checksum: 9d8fa5abf38ec477f6f55ef546608792 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-11-24T19:22:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pissulin_cna_dr_bot.pdf: 3804425 bytes, checksum: 9d8fa5abf38ec477f6f55ef546608792 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T19:22:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pissulin_cna_dr_bot.pdf: 3804425 bytes, checksum: 9d8fa5abf38ec477f6f55ef546608792 (MD5) Previous issue date: 2016-10-20 / Não recebi financiamento / A bupivacaina é um anestésico utilizado na prática médica e odontológica para bloqueio do nervo periférico e alívio da dor pré e pós-operatória devido à sua ação analgésica de longa duração. Suas principais limitações são a miotoxicidade, a neurotoxicidade e a inflamação. A laserterapia de baixa potência (LBP) tem sido utilizada para várias propostas terapêuticas, apresentando ação anti-inflamatória, regenerativa e analgésica. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do laser de Arseneto de Gálio (AsGa) sobre a morfologia das junções neuromusculares, fibras musculares e nervo associados ao músculo esternomastóideo de ratos após injeção de bupivacaina. 32 ratos Wistar machos adultos foram divididos em 2 grupos: Grupo Controle (C: n=16) e Grupo Laser (L: n= 16). Os grupos foram subdivididos seguindo os antímeros e substâncias injetadas: direito (bupivacaina 0,5%), esquerdo (Cloreto de sódio 0,9%). Após 24 horas houve aplicação de LBP (AsGa 904nm, 50mW, 4,8J) durante 5 dias consecutivos. A seguir, os animais foram eutanasiados, o sangue foi coletado para determinação da creatina kinase (CK); a porção superficial dos músculos esternomastóideos e os nervos associados foram dissecados, removidos e submetidos às seguintes análises: análise histopatológica e ultraestrutural; análises morfológica e morfométrica das JNMs (reação Esterase inespecífica), microscopia confocal de varredura a laser e análise ultraestrutural; e os nAChRs (alpha, beta e gama) e os níveis de TNF foram quantificados pelo Western Blotting; foi ainda realizada morfometria dos nervos e quantificação da CK muscular. Não foram observadas alterações no antímero que recebeu o cloreto de sódio com ou sem aplicação de laser. Os músculos que receberam bupivacaina apresentaram maiores níveis de inflamação, atrofia e necrose e dos valores de CK muscular; maior número de núcleos central e porcentagem de colágeno, o diâmetro máximo das junções foram menores quando comparado aos músculos que receberam cloreto de sódio, não havendo efeito neurotóxico. Após aplicação do laser terapia houve redução nos scores histopatológicos, no número de núcleos centrais, na porcentagem de colágeno, havendo aumento no diâmetro máximo das JNM. Ultraestruturalmente foi observada redução da mionecrose, havendo recuperação nas dobras juncionais e zona ativa. Através da microscopia confocal houve aumento no perímetro dos nAChR, bem como aumento na área relativa planar. A análise da expressão proteica do nAChR1 mostrou similaridade nos grupos estudados. Houve aumento da expressão proteica da subunidade  após aplicação de LLLT. Os valores de TNF mantiveram-se constantes. A LBP, na dose utilizada, reduziu a fibrose e mionecrose no músculo esternomastóideo desencadeada pela bupivacaina, acelerando o processo de regeneração muscular. Também reduziu as alterações estruturais da JNM e molecular dos nAChRs desencadeadas pela bupivacaina, fornecendo dados importantes para indicação da LBP em protocolos terapêuticos de lesões desencadeadas pelos anestésicos locais.

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:34:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_JosianeCristina_M.pdf: 4378084 bytes, checksum: 410e7a4f1b02b18191d0a4be7945310c (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O veneno total de Botrhops alternatus (10 mg) foi fracionado por meio de coluna m-Bondapack C18 e HPLC de fase reversa resultando em um pico ativo denominado BT II 2. Em SDS-PAGE, a toxina originou uma banda única, isolada de 14 KDa. A fração BT II 2 (0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10,0 e 20,0 mg/mL n=7) induziu um bloqueio irreversível da resposta contrátil, em preparações músculo biventer cervicis de pintainho, sendo esse dose-dependente. As respostas contraturantes a adição exógena de acetilcolina e cloreto de potássio não foram significativamente diferentes do controle.Os tempos necessários para se obter bloqueio neuromuscular de 50 e 90% foram de 66 _+10 para 0,1mg/mL,44_+3 para 0,5mg/mL ,para 1 mg/mL foi de 38 _+4, 54_+5 para 5mg/mL o tempo foi de 24_+1, 34_+1, para 10mg/mL foi de 22_+2, 35_+2 e para 20mg/mL foi de 24_+5,33_+6 respectivamente. Fig. 9. Alterações morfológicas foram observadas nas fibras musculares. Entretanto, a concentração da fração BTII2, 1 µg/mL, foi mais potente para induzir a hipercontração e desorganização fibrilar que o veneno bruto (100 mg/ml). Isto se deve provavelmente ao fato de que a fração está totalmente desprovida de algumas impurezas ( elementos) que pudessem eventualmente inibir este efeito no veneno total. Estes resultados sugerem que a fração BT II 2 do veneno de B. altenatus tem um importante fator neurotóxico e uma ação predominantemente pré-sináptica / Abstract: Crude venom from Bothrops alternatus (10 mg) was fractionated by reverse-phase HPLC by a C-18 m-bondapack column resulting in an active peak called BT II 2. In SDS-PAGE, the toxin migrates as a single band with a 14 kDa. In the chick biventer cervicis preparation, BT II 2 (0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 and 20.0 mg/mL, n=7) induced a concentration-dependent and irreversible twitch-tension blockade without causing any effect on the muscle responses to ACh and KCl. The time (in min) required for producing 50% neuromuscular blockade was 65 ± 0.9; 41 ± 0.4; 35 ± 0.6; 24 ± 0.3; 22 ± 0.4 and 20 ± 0.8 respectively after a 120 min incubation. Morphological alterations was seen in muscle fibers. However, BT II 2 ( 1 mg/ml) was more potent in inducing hyprecontraction and myofibril desorganization than was the crude venom (100 mg/ml) in the same experimental conditions. Taking together, these results suggest that BT II 2 is a neurotoxic factor of the venom of B. alternatus with a preponderant presynaptic action / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientadores: Angelica de Fatima de Assunção Braga, Franklin Sarmento da Silva Braga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T22:04:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_VanessaHenriques_M.pdf: 2016873 bytes, checksum: ed79870ad9763d6497595ceb7fdcf4ba (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Os anestésicos locais podem interagir com os bloqueadores neuromusculares e modificar as suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas, no entanto o mecanismo dessa interação é controverso. Este estudo experimental, realizado em preparação nervo frênico - diafragma de ratos e musculo biventer cervicis de pintainhos, teve por objetivo avaliar o efeito de diferentes anestésicos locais na transmissão neuromuscular e sua influência no bloqueio produzido pelo rocurônio. Foram avaliados os seguintes parâmetros: efeito dos anestésicos locais (lidocaína, bupivacaína racêmica, mistura em excesso enantiomérico de bupivacaína) e do rocurônio empregados isoladamente, na transmissão neuromuscular; o bloqueio produzido pelo rocurônio em preparações expostas aos anestésicos locais; a ação dos anestésicos locais na resposta contraturante da acetilcolina; seus efeitos nos potenciais de membrana e nos potenciais de placa terminal em miniatura. Os resultados foram expressos em médias e desvios padrão e analisados através dos testes t de Student, Mann-Whitney , Wilcoxon, Kruskall-Wallis e Anova com teste para comparação múltipla de Tukey. Adotou-se um nível de significância de 5% (p<0,05). Nas preparações nervo frênico -diafragma de rato, os anestésicos locais nas concentrações empregadas, não alteraram a amplitude das respostas musculares mas, potencializaram o efeito do rocurônio. Nas preparações biventer cervicis de pintainho os anestésicos locais promoveram diminuição na resposta contraturante da acetilcolina evidenciando um efeito pós-juncional. Não causaram alteração significativa nos potenciais de membrana, não demonstrando ação despolarizante na fibra muscular. A lidocaína promoveu um aumento inicial dos potenciais de placa terminal em miniatura (pptm) seguida de bloqueio e, a bupivacaína nas duas formulações causou diminuição na amplitude e na freqüência dos pptm, caracterizando um efeito pré-juncional. Os resultados obtidos neste estudo demonstram um sinergismo entre as drogas comprovado por efeitos pré e pós-juncionais / Abstract: Local anesthetics can interact with neuromuscular blockers and modify their pharmacokinetics and pharmacodynamics properties but this mechanism of interaction is very controversial. This experimental study performed in rat phrenic nerve diaphragm preparation and chick biventer cervicis muscle, had the objective to evaluate the effect of different local anesthetics in neuromuscular transmission and their influence in the block promoted by rocuronium. The parameters evaluated were that: the effect of local anesthetics (lidocaine, racemic bupivacaine, enantiomeric mixture of bupivacaine) and the rocuronium isolated in neuromuscular transmission; the block promoted by rocuronium in local anesthetics exposed preparations; the action of local anesthetics in contracture response of acetylcholine; their effects in membrane potentials and miniature end plate potentials. The results were expressed in average and standard deviation and analysed using T Student test, Mann-Whitney, Wilcoxon, Kruskall-Wallis and Anova with Tukey multiple comparative test. We adopted a level of significance of 5% (p<0,05). In rat phrenic nerv diaphragm preparation, local anesthetics in the concentrations employed did not caused alterations in the amplitude of muscle responses but potentialized the effect of rocuronium. In chick biventer cervicis preparations local anesthetics promoted a decrease in acetylcholine contracture response indicating a postjunctional effect. They did not cause significant alterations in membrane potential so they did not demonstrate depolarizing action in muscle fiber. Lidocaine promoted an initial increase in miniature end plate potentials (meps) followed by block and bupivacaine in the two formulations caused a decrease in the amplitude and frequency of meps, characterizing a prejunctional effect. The results obtained in this study demonstrate a synergism of the drugs confirmed by pre and postjunctional effects / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Léa Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T21:13:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_SandroRostelato_D.pdf: 2167840 bytes, checksum: f1dd1c4722a358caf196b8ef326c3b3f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Rhinella schneideri, conhecido previamente como Bufo paracnemis, é um sapo comum em muitas regiões do Brasil. O veneno destas espécies exerce importante efeito cardiovascular em humanos e animais, mas pouco se sabe sobre sua atividade neuromuscular. Neste trabalho, nós avaliamos a neurotoxicidade do veneno de R. schneideri em preparações neuromusculares de pintainho e camundongo. Através da compressão manual das glândulas parótidas localizadas atrás dos olhos, coletou-se a secreção e então realizada a extração com metanol. O extrato metanólico foi liofilizado e testado em preparações biológicas. Preparações biventer cervicis (BC) de pintainho e nervo frênico diafragma (NFD) de camundongo foram utilizadas para o registro miográfico através de estimulação elétrica indireta para medidas eletrofisiológicas, análise morfológica e microscopia eletrônica de transmissão. Frações ativas do extrato metanólico foram obtidas submetendo-se à coluna de fase reversa Luna PFP (250 x 4,6 mm). O extrato metanólico (50 ?g/ml) causou somente facilitação da neurotransmissão em preparações NFD. Ao contrário, causou bloqueio neuromuscular significativo em preparações BC que foram concentração-dependente (3, 10 and 30 ?g/ml; a 37º C) com tempo para 50% de bloqueio, média ± erro padrão: 84±10, 51±3 e 12±0,8 min com 3, 10 e 30 ?g/ml, respectivamente; n=6-8 cada, precedido por facilitação da neurotransmissão. Não houve inibição significativa das respostas contraturantes à ACh (110 ?M) ou KCl (20 mM) após bloqueio completo em qualquer concentração testada. Em preparações BC incubadas com o extrato metanólico (10 ?g/ml) a 22º C por 70 min não observou-se qualquer alteração das respostas musculares (117±3%; n=5), mas quando a temperatura do banho foi elevada a 37º C, 50% de bloqueio ocorreu após 92±3 min (n=5; p<0.05). A incubação de preparações BC curarizadas (d-Tc, 1 ?g/ml) com o extrato metanólico (10 ?g/ml) resultou em completo e irreversível bloqueio enquanto que as preparações tratadas somente com curare mostraram a reversão completa da resposta contrátil após várias lavagens. Não houve aumento significativo nos níveis de liberação de creatinoquinase (90±21 vs. 80±15 U/l, antes e após 120 min de incubação com o extrato, respectivamente, n=5) além da ausência de alterações na morfologia das fibras musculares ou na porcentagem de danos na fibra (2.4±0.9 vs. 2.3±0.5 %, antes e após 120 min de incubação com o extrato, respectivamente, n=5). O extrato metanólico (50 ?g/ml) aumentou a resposta contrátil mas não alterou o potencial de membrana em repouso (-81±1 mV e -78±1 mV para controle e preparação tratada após 60 min). Registros eletrofisiológicos mostraram que houve um aumento progressive na frequência dos potenciais de placa terminal em miniatura (PPTM) de 34±3,5 (controle) para 88±15 (após 60 min de incubação com o extrato); houve também um aumento nos valores do conteúdo quântico, de 128±13 (controle) para 272±34 e 171±11 após 5 min e 60 min, respectivamente, em preparações tratadas com o extrato metanólico. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou que o volume ocupado pelas vesículas sinápticas foi significativamente reduzida (32±5%; p<0.05) após 5 min mas este efeito foi reversível após 60 min de incubação para as preparações tratadas com 50 ?g/ml do extrato metanólico. Não houve dano estrutural distinguível na membrana do terminal nervoso e nas mitocôndrias das preparações tratadas com o extrato, quando comparada com as preparações controle. O pré-tratamento das preparações NFD com ouabaína (1 ?g/ml), um inibidor da bomba de Na+/K+-ATPase, por 5 min antes da incubação com o extrato, preveniu o aumento do conteúdo quântico comparado com preparações controle (118±18, 117±18 e 154±33 para preparações controle-ouabaína e tratadas com ouabaína e incubadas com o extrato por 5 min e 60 min, respectivamente). A cromatografia por HPLC do extrato metanólico resultou em 24 frações, das quais 4 (frações 20, 21, 22 e 24) causaram bloqueio neuromuscular em preparações BC. A fração 20 (3 ?g/ml) foi escolhida por ser 3 vezes mais potente que as demais e causou bloqueio neuromuscular significativo (p<0.05; tempo para 50% de bloqueio: 43±4 min; n=4) precedido por facilitação em preparações BC a 37º C. A fração 20 não inibiu as respostas contraturantes à ACh (110 ?M) ou KCl (20 mM) após completo bloqueio neuromuscular em preparações BC. Em preparações NFD, a fração (15 ?g/ml) aumentou significativamente os valores do conteúdo quântico de 117±18 (controle) para 236±44 após 5 min de incubação (n=4; p<0.05). Estes resultados indicam que o extrato metanólico do veneno de R. schneideri é capaz de interferir com a neurotransmissão por ativar e/ou bloquear a liberação da acetilcolina nos sítios pré-sinápticos, provavelmente envolvendo a bomba de Na+-K+-ATPase, sem causar qualquer dano à musculatura / Abstract: Rhinella schneideri, previously known as Bufo paracnemis, is a common toad in many regions of Brazil. The venom of this species exerts important cardiovascular effects in humans and animals, but little is known of its neuromuscular activity. In this work, we examined the neurotoxicity of R. schneideri venom in chick and mouse neuromuscular preparations. Venom was collected by manual compression of the large parotid glands behind the eyes and then extracted with methanol. The extract was lyophilized prior to testing in biological preparations. Chick biventer cervicis (BC) and mouse phrenic nerve-diaphragm (PND) preparations were mounted for conventional twitch-tension recording in response to indirect stimulation, for electrophysiological measurements, morphological analysis and transmission electronic microscope. Also, an active fraction of this methanolic extract obtained by reverse phase HPLC on a Luna PFP (250 x 4.6 mm) column. The methanolic extract (50 ?g/ml) caused facilitation but no neuromuscular blockade in PND preparations. In contrast, significant (p<0.05) concentration-dependent (3, 10 and 30 ?g/ml) neuromuscular blockade (time for 50% blockade, mean±S.E.M.: 84±10, 51±3 and 12±0.8 min with 3, 10 and 30 ?g/ml, respectively; n=6-8 each) preceded by facilitation was seen in BC preparations at 37oC. There was no inhibition of contractures to exogenous ACh (110 ?M) or KCl (20 mM) after complete blockade by any of the concentrations tested. Incubation of BC preparations with methanolic extract (10 ?g/ml) at 22oC for 70 min did not affect neuromuscular transmission (117±3%; n=5), but when the bath temperature was increased to 37oC, 50% blockade occurred within 92±3 min (n=5; p<0.05). Incubation of curarized (d-Tc, 1 ?g/ml) BC preparations with methanolic extract (10 ?g/ml) resulted in complete, irreversible blockade whereas preparations treated with curare alone showed complete reversion in the twitch-tension after washing. There was no significant increase in creatine kinase levels (90±21 vs. 80±15 U/l, before and after a 120 min incubation with extract, respectively; n=5) and no significant alterations in muscle fiber morphology or in the percentage of damaged fibers (2.4±0.9 vs. 2.3±0.5 % before and after a 120 min incubation with extract, respectively; n=5). The methanolic extract (50 ?g/ml) increased the twitch-tension but did not alter the membrane resting potential (-81±1 mV and -78±1 mV for control and poison-treated preparations after 60 min). Electrophysiological measurements showed that there was a progressive increase in the frequency of miniature end-plate potentials (MEPPs) from 34±3.5 (control) to 88±15 (after a 60 min incubation with extract); there was also an increase in the end-plate potentials (based on the quantal content) from 128±13 (control) to 272±34 and 171±11 after 5 min and 60 min, respectively, in extract-treated preparations. TEM showed that the fractional volume occupied by synaptic vesicles was significantly reduced (32±5%; p<0.05) after a 5 min but this effect was reversible after 60 min of incubation to 50 ?g/ml of methanolic extract. There was no structural damage to the membrane of the terminal boutons and the mitochondria of extract-treated preparations were indistinguishable from those of control preparations. Pretreatment of the preparations with ouabain (1 ?g/ml), a Na+/K+-ATPase pump inhibitor, for 5 min prior to incubation with methanolic extract prevented the increase in quantal content compared to preparations without extract (118±18, 117±18 and 154±33 for ouabain-treated controls and ouabain-treated preparations incubated with venom for 5 min and 60 min, respectively). HPLC of the methanolic extract resulted in 24 fractions, of which four (fractions 20, 21, 22 and 24) produced blockade in BC preparations. Fraction 20 (3 ?g/mL) was chosen because was the most potent of the four fractions and caused significant (p<0.05) neuromuscular blockade (time for 50% blockade: 43±4 min; n=4; mean±SEM) preceded by facilitation in BC preparations at 37oC. Fraction 20 did not inhibit contractures to exogenous ACh (110 ?M) or KCl (20 mM) after complete neuromuscular blockade in BC preparations. In PND preparations, fraction 20 (15 ?g/mL) significantly increased the quantal content value from 117±18 (control) to 236±44 after 5 min (n=4; p<0.05). These results indicate that the methanolic extract of R. schneideri is capable to interfere with the neurotransmission by activing and/or blocking the pre-synaptic acetylcholine release by an activity involving the Na+-K+-ATPase pump, without damaging the muscle membrane / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientadores: Lea Rodrigues Simioni,Yoko Oshima Franco / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T13:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bueno_LilianGobbodeFreitas_M.pdf: 986839 bytes, checksum: 048ec75c1469d547de311f325aab2cc3 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Manganês, um bloqueador neuromuscular com atividades pré e pós-sinápticas, foi utilizado neste trabalho com o objetivo de estudar a neurotoxicidade e miotoxicidade induzida pelos venenos das serpentes Crotalus durissus terrificus (Cdt) e Bothrops jararacussu (Bjssu) em preparações biventer cervicis de pintainho (BCp). O pré-tratamento das preparações com Mn2+ (0,66 e 1,6 mM) não impediu o bloqueio neuromuscular induzido pelo veneno de Cdt, reduziu parcialmente a resposta contraturante à adição exógena de ACh, mas não à de KCl. Embora o bloqueio neuromuscular induzido pelo veneno de Bjssu seja irreversível, o pré-tratamento com ambas as concentrações de Mn2+ (0,66 e 1,6 mM) tornou o bloqueio parcialmente reversível após a lavagem das preparações com solução de Krebs, e somente nas preparações pré-tratadas com 1,6 mM Mn2+ houve redução do bloqueio da resposta contraturante à adição exógena de ACh (p<0,05). Os tipos de miotoxicidade induzidos pelos venenos de Cdt e Bjssu interferiram diferentemente na resposta contrátil. Em preparações pré-tratadas com Mn2+ (1,6 mM) houve redução parcial da porcentagem de dano muscular e da atividade miotóxica (CC, U/L) induzida por ambos os venenos. Os resultados desta pesquisa indicam que: Mn2+ interfere na contratura induzida pela ACh nos receptores nicotínicos; Mn2+ não evitou a neurotoxicidade do veneno de Cdt, mas reduziu parcialmente sua miotoxicidade in vitro, por sua ação estabilizante da membrana muscular; Mn2+ reduziu parcialmente a miotoxicidade e o bloqueio neuromuscular induzido pelo veneno de Bjssu. A dupla ação do Mn2+, pré- e pós-sináptica, é considerada útil para o estudo dos venenos de serpentes, uma vez que a maioria desses venenos apresenta também estas ações. Além disso, com a utilização deste cátion foi possível resgatar a coerência entre a interpretação dos resultados experimentais e clínicos / Abstract: In this study, we examined the effects of Mn2+, a neuromuscular blocker with pre and postsynaptic actions, on the neurotoxicity and myotoxicity induced by Crotalus durissus terrificus and Bothrops jararacussu venoms in chick biventer cervicis preparations. Pretreating the preparations with Mn2+ (0.66 or 1.6 mM) did not affect the blockade induced by C. d. terrificus venom or KCl-induced contractures, but partially reduced ACh-induced contractures. On the other hand, both concentrations of Mn2+ partially prevented the blockade induced by B. jararacussu venom (seen after washing the preparations with Krebs solution), whereas only 1.6 mM Mn2+ significantly restored ACh-induced contractures. Pretreatment with Mn2+ (1.6 mM) partially prevented the muscle damage and the release of creatine kinase induced by both venoms. These results show that Mn2+ did not prevent the neurotoxicity of Cdt venom, but partially reduced its myotoxicity, whereas this metal partially attenuated the myotoxicity and neuromuscular blockade caused by B. jararacussu venom. The pre- and postsynaptic actions of Mn2+ may be useful for studying snake venoms that show one or both of these activities / Mestrado / Mestre em Farmacologia

INTRODUÇÃO: A técnica de eletromiografia de fibra única (EMGFU), mediante análise do jitter, é o método neurofisiológico mais sensível para a confirmação do distúrbio da junção neuromuscular na miastenia gravis (MG). Os registros são tradicionalmente obtidos com agulha de fibra única, de alto custo e reutilizável. Por causa da necessidade atual do uso de material descartável, a agulha concêntrica vem sendo utilizada em substituição à agulha de fibra única. A técnica utilizada é semelhante, porém os potencias de ação para a análise do jitter são obtidos com eletrodo de agulha concêntrica (Eletromiografia de fibra única - jitter com agulha concêntrica, EMGFU-JAC). Contudo, os estudos são escassos e as metodologias utilizadas são heterogêneas com a utilização dessa agulha. OBJETIVOS: Este estudo tem por objetivo mensurar os valores de jitter obtidos com agulha concêntrica, no músculo Orbicularis Oculi, em sujeitos saudáveis e em pacientes com MG autoimune adquirida e avaliar a validade do método nas formas generalizada e ocular da doença. MÉTODOS: Foram estudados 20 sujeitos saudáveis, 20 pacientes com miastenia gravis forma generalizada (grupo MGG) e 13 com a forma ocular da doença (grupo MGO). A EMGFU-JAC foi realizada em todos os participantes, idealmente com 20 medidas de jitter em cada estudo. O jitter foi expresso como a média das diferenças consecutivas (MCD). Em todos os pacientes do estudo foram realizados o teste de estimulação repetitiva e dosagem sérica de anticorpo antirreceptor de acetilcolina (ac-AChR) no momento da análise do jitter. Nos pacientes soronegativos para ac-AChR, foi pesquisado o anticorpo antimúsculo específico tirosina-quinase (ac-MuSK). Foram definidos o limite superior da normalidade (LSN) para a média do MCD de cada estudo e para valores individuais de MCD. Os critérios de anormalidade foram: (1) média do MCD acima do LSN; ou (2) mais de 10% dos valores individuais de MCD acima do LSN. A definição do LSN para valores individuais de MCD baseou-se no conceito de que dois entre 20 valores de MCD acima do LSN são aceitáveis em um músculo saudável, para a técnica de contração voluntária. Portanto, estimou-se o LSN para o 18o valor mais alto de MCD (18o par). Para análise da acurácia do método, foram construídas duas curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) para as variáveis média do MCD e 18o par, no grupo de pacientes (MGG e MGO) versus controle. RESULTADOS: No grupo controle a média das médias do MCD foi (19,0 ± 2,4)us e a média do 18o valor mais alto de cada estudo foi (24,5 ± 3,6)us. Esses valores obtidos apresentaram distribuição Gaussiana e o LSN foi definido como a média desses valores + 2 DP. O LSN para a média do MCD foi 24us, e 32?s para valores individuais de MCD. No grupo MGG, a análise do jitter foi anormal em todos os 20 pacientes por ambos os critérios de anormalidade, exceto em um paciente que apresentou anormalidade por apenas um dos critérios. No grupo MGO, apenas um dos 13 pacientes não preencheu os critérios de anormalidade. No grupo de pacientes, a positividade da EMGFU-JAC foi maior do que o teste de estimulação repetitiva e dosagens de anticorpos. Nas curvas ROC para as variáveis médias do MCD e 18o par, o valor de melhor sensibilidade (93,9%), sem resultados falsos positivos, foi 24,7us e 33,1us, respectivamente. CONCLUSÕES: A EMGFU-JAC apresenta alta sensibilidade e especificidade na identificação de distúrbio da transmissão neuromuscular em pacientes com MG. A utilização da agulha concêntrica é válida para a análise do jitter, como alternativa à agulha de fibra única / INTRODUCTION: Single fiber electromyography (SFEMG) technique, through jitter analysis, is the most sensitive neurophysiological method for confirmation of neuromuscular junction disorder in myasthenia gravis (MG). Records are traditionally obtained with single fiber needle, which is reusable and has a high-cost. Due to the current need of using disposable material, concentric needle has been used to replace single fiber needle. The technique is similar, but the action potential for jitter analysis is obtained with concentric needle electrode (SFEMG - concentric needle jitter, SFEMG-CNJ). However, studies are scarce and methodologies used are heterogeneous with the use of this needle. OBJECTIVES: This study aims to measure jitter values obtained with concentric needle in the Orbicularis Occuli muscle in healthy subjects and in patients with autoimmune acquired MG and to assess the validity of the method in generalized and ocular forms of the disease. METHODS: 20 healthy subjects, 20 patients with generalized myasthenia gravis (GMG group) and 13 with the ocular form of the disease (OMG group) were studied. SFEMG-CNJ was performed on all participants, ideally with 20 jitter values in each study. Jitter was expressed as the mean consecutive difference (MCD). Repetitive nerve stimulation and serum acetylcholine receptor antibody (AChR-ab) were performed in all patients in the study, by the time of jitter analysis. Tyrosine kinase specific antibody muscle antibodies (MuSK-ab) were performed in AChR-ab negative patients. The upper limit of normality (ULN) for the mean MCD and for individual jitter values were defined. The abnormality criteria were: (1) mean MCD above ULN; or (2) more than 10% of individual jitter values above ULN. The definition of ULN for individual jitter values was based on the concept that two out of 20 jitter values above ULN are acceptable in a healthy muscle for voluntary contraction technique. Therefore, the ULN for the 18th highest jitter value (18 pair) was estimated. To analyze the method\'s accuracy, two ROC curves (Receiver Operating Characteristic) for the mean MCD and 18th pair in the group of patients (MGG and MGO) versus control were constructed. RESULTS: In the control group the mean of MCD means was (19.0 ± 2.4)us and the mean of the 18 highest value of each study was (24.5 ± 3.6)us. These values showed Gaussian distribution and the ULN was set as the mean of these values + 2 SD. The ULN for the mean MCD was 24us, and 32us for individual values of MCD. In GMG group, jitter analyses were abnormal in all 20 patients based on both abnormality criteria, except in one patient, who had abnormalities in only one of the criteria. In OMG group, only one patient from 13 met neither of the abnormality criteria. In patients, the positivity of SFEMG-CNJ was higher than repetitive nerve stimulation test and antibody detection. The ROC curve threshold showing the best sensitivity (93.9%) with no false positive results was 24.7Us for the mean MCD and 33.1us for individual pairs, respectively. CONCLUSIONS: SFEMG-CNJ has high sensitivity and specificity in identifying neuromuscular transmission disorder in patients with MG. The use of concentric needle is valid for jitter analysis as an alternative to single fiber needle