La pathologie de la fibrose kystique (FK) est causée par des mutations du gène codant pour le canal Cl- CFTR. Au niveau respiratoire, cette dysfonction du transport transépithélial de Cl- occasionne une altération de la composition et du volume du liquide de surface des voies aériennes. Une accumulation de mucus déshydraté favorise alors la colonisation bactérienne et une réponse inflammatoire chronique, entraînant des lésions épithéliales sévères au niveau des voies aériennes et des alvéoles pouvant culminer en défaillance respiratoire. Le principal objectif de mon projet de maîtrise était d’étudier les processus de réparation de l’épithélium alvéolaire sain, l’épithélium bronchique sain et FK à l’aide d’un modèle in vitro de plaies mécaniques. Nos résultats démontrent la présence d’une boucle autocrine EGF/EGFR contrôlant les processus de migration cellulaire et de réparation des lésions mécaniques. D’autre part, nos expériences montrent que l’EGF stimule l’activité et l’expression des canaux K+ KATP, KvLQT1 et KCa3.1 des cellules épithéliales respiratoires. L’activation de ces canaux est cruciale pour les processus de réparation puisque la majeure partie de la réparation stimulée à l’EGF est abolie en présence d’inhibiteurs de ces canaux. Nous avons également observé que les cellules FK présentent un délai de réparation, probablement causé par un défaut de la réponse EGF/EGFR et une activité/expression réduite des canaux K+. Nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation des processus de réparation de l’épithélium sain et FK. De plus, ils ouvrent de nouvelles options thérapeutiques visant à promouvoir, à l’aide d’activateurs de canaux K+ et de facteurs de croissance, la régénération de l’épithélium respiratoire chez les patients atteints de FK. / The cystic fibrosis pathology (CF) is caused by mutations of the gene coding for the Cl- channel, CFTR. In the lungs, the dysfunction of transepithelial ion transport leads to an alteration of airway surface liquid volume and composition. Dehydrated mucus accumulation then favors chronic bacterial colonisation and inflammatory response, inducing severe epithelial injuries in the airways and the alveoli and then, respiratory failure. The main objective of my master degree project was to study normal alveolar, normal and CF bronchial epithelia repair processes using an in vitro model of mechanical wound-healing. Our results reveal the presence of an EGF/EGFR autocrine loop that controls cell migration and wound-healing. Our results show also that EGF signaling stimulate KATP, KvLQT1 and KCa3.1 K+ channel activity and expression in epithelial cells. K+ channel activation is crucial for repair processes since K+ channel inhibitors prevent most of EGF-stimulated wound-healing. We also observed that CF cells present delayed repair processes, probably caused by an EGF signaling defect and reduced K+ channel activity and expression. Our results allow us to better understand the regulatory mechanisms of normal and CF epithelial repair processes. Futhermore, our results open to new therapeutic options that promote, with K+ channel activators and growth factors, respiratory epithelium regeneration in CF patients.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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La reperfusion complète et précoce est le moyen le plus efficace pour limiter l'extension de l'infarctus cérébral et les séquelles neurologiques. Le traitement de l'infarctus cérébral a été révolutionné par la thrombectomie mécanique intra-artérielle en permettant une recanalisation dans plus de 70% des cas et une réduction significative de la morbidité comparativement à la thrombolyse seule pour le territoire carotidien. Le pronostic des occlusions basilaires reste dramatique et aucun essai n'a démontré le bénéfice de l'approche intra-artérielle à l'heure actuelle. Dans la première partie du travail, nous avons réalisé une méta-analyse sur la thrombectomie par «stent-retriever» des occlusions basilaires, à partir des résultats publiés dans MEDLINE entre novembre 2010 et avril 2014: recanalisation angiographique (TICI≥2b)=81% (IC 95%: 73-87); hémorragie cérébrale symptomatique à 24 heures=4% (IC 95%: 2-8); évolution neurologique favorable (mRS≤2 à 3 mois)=42% (IC 95%: 36-48); mortalité=30% (IC 95%: 25-36). L'approche intra-artérielle ouvre une nouvelle ère thérapeutique, cependant un modèle animal adapté et pertinent est nécessaire pour l'évaluation pré-clinique. Dans la deuxième partie du travail, nous avons caractérisé l'évolution spatio-temporelle précoce de l'infarctus par IRM multimodale dans un modèle d'ischémie cérébrale focale transitoire réalisé par occlusion sélective intra-artérielle de l'artère cérébrale moyenne chez le rat adulte. Une occlusion complète de l'artère cérébrale moyenne proximale était observée dans 75% des 16 rats opérés, et un mismatch diffusion/perfusion dans 77% des cas. Le volume ischémique durant l'occlusion artérielle, définie sur la séquence de diffusion, était de 90±64 mm3 et de 57±67 mm3 à 24 heures sur la séquence T2. La recanalisation artérielle s'associe à une reperfusion tissulaire dans 36% des cas. L'hypoperfusion persistait chez la majorité des animaux 3 heures après recanalisation. L'infarctus était de localisation cortical dans 31%, striatale dans 25%, et cortico-striatale dans 44%. Tous les animaux étaient en vie à 24 heures confirmant le caractère mini-invasif de ce modèle. Bien que la reperfusion sauve incontestablement une partie du parenchyme ischémique, elle s'accompagne également de lésions irréversibles spécifiques, dites de reperfusion, s'ajoutant aux lésions initiales. Limiter l'importance des lésions de reperfusion représente un objectif thérapeutique majeur. Dans la troisième partie, nous avons testé l'effet neuroprotecteur de la Cyclosporine A sur la réduction du volume de l'infarctus cérébral et sur le pronostic clinique. Une procédure d'ischémie reperfusion cérébrale de 60 minutes a été réalisée chez 48 animaux, puis ont été randomisés en quatre groupes (groupe témoin, pré-conditionnement, postconditionnement intraveineux et intra-artériel avec la Cyclosporine A à la dose de 10 mg/kg dans les 30 secondes suivant la reperfusion). Sur les 43 animaux inclus dans l'analyse, il n'a pas été observé de réduction du volume ischémique ni une amélioration du pronostic après injection intraveineuse ou intra-artérielle de Cyclosporine A. La Cyclosporine A ne permet pas non plus de limiter l'extension des lésions de reperfusion au sein de la zone à risque à 24 heures de la reperfusion cérébrale / Early and complete reperfusion is the most effective therapy to limit the extent of brain infarction. The treatment of acute anterior ischemic stroke has been revolutionized by the intra-arterial mechanical thrombectomy allowing a 70% recanalization rate and a significant reduction of morbidity compared with thrombolysis alone. The prognosis of basilar artery occlusion remains catastrophic, and to date any trial has demonstrated the benefit of intra-arterial approach. In the first part of the work, we conducted a systematic review and meta-analysis of all previous studies of stent retriever thrombectomy in basilar artery occlusion patients between November 2010 and April 2014: recanalization (TICI≥2b)=81% (95% CI: 73-87); symptomatic intracranial haemorrhage at 24 hours=4% (95% CI 2-8); favorable neurological outcome (mRS≤2 at 3 months)=42% (95% CI: 36-48); mortality=30%(95% CI 25-36). Intra-arterial approach opens new avenues for the developement of treatments for brain infarction, but a relevant animal model of acute ischemic stroke is required for preclinical evaluation. In the second part of the work, we evaluated the spatiotemporal evolution of cerebral ischemia by sequential multimodal MRI in a new minimally invasive model of transient focal ischemia by selective intra-arterial occlusion of the middle cerebral artery in rat. A complete occlusion of the proximal portion of the middle cerebral artery was observed in 75% of 16 operated rats, and a mismatch diffusion/perfusion in 77% of cases. Acute stroke volume during arterial occlusion was 90±64 mm3 on diffusion-weighted imaging, and 57±67 mm3 at 24 hours on T2-weighted imaging. Recanalization is associated with tissue reperfusion in 36% of cases. The hypoperfusion persisted in the majority of animals 3 hours after recanalization. Brain infarction was cortical in 31%, striatal in 25%, and corticalstriatal in 44% of cases. All animals were alive at 24 hours, confirming the minimally invasive nature of the model. Although reperfusion saves a portion of ischemic tissue, it also carries specific irreversible damage, called reperfusion injury, in addition to initial damage caused by ischemia. Limiting the size of infarction is a major objective. In the third part, we tested the neuroprotective effect of Cyclosporine A in reducing the lesion volume and functional outcome. A total of 48 adult rats underwent the intra-arterial ischemia reperfusion procedure, and were randomly assigned to four treatment groups (control, preconditioning, intravenous and intra-arterial postconditioning with Cyclosporine A). Intravenous or intra arterial injection of Cyclosporine A at reperfusion does not either reduce the volume of stroke or improve the neurological outcome. Administation of Cyclosporin A at reperfusion does not limit the extension of reperfusion injuries within the ischemic risk area at 24 hours

L'ischémie myocardique est caractérisée par la survenue de désordres ioniques et métaboliques responsables de la perte de l'intégrité structurale et fonctionnelle cellulaire, notamment au niveau des mitochondries et, en conséquence, de l'altération de l'activité électromécanique cardiaque. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés : 1) à l'étude des lésions d'ischémie-reperfusion (I/R) et des moyens pharmacologiques de cardioprotection avec amlodipine (antagoniste calcique), perindorpilate (Inhibiteur de l'enzyme de conversion). Après avoir mis en évidence les différentes altérations électrophyiologiques, hémodynamiques, structurales et fonctionnelles mitochondriales induite par un épisode d'I/R, les molécules précédemment citées sont administrées seules ou en association, en bolus IV, avant l'induction de l'ischémie myocardique par ligature de l'artère interventriculaire antérieure dans sa partie distale et à une minute seulement après la reperfusion (Etude I, n=36 porcelets domestiques) ; 2) à la cardiotoxicité aigue d'un anesthésique local en l'occurrence la lévobubivacaine à la suite d'une injection intravasculaire (IV). Cette toxicité a été évaluée dans deux situations distinctes : circulation coronaire préservée ou ischémie myocardique. Ces deux situations permettent de « mimer » respectivement une intoxication à la levobupivacaïne chez un sujet sain ou coronarien ; 3) à l'effet bénéfique éventuel des émulsions lipidiques (Intralipid®) dans les mêmes conditions expérimentales. Les émulsions lipidiques ont été administrées quelques minutes après l'injection (IV) de la levobupivacaïne (Etude II, n=48 porcelets domestiques). Ces études ont été menées, in vivo, sur des porcs anesthésiés et ventilés. Les paramètres électrophysiologiques et hémodynamiques ont été déterminés tout au long de l'expérimentation à des intervalles réguliers. A la fin des expériences, les animaux ont été euthanasiés et des fragments de ventricule gauche ont été prélevés pour l'évaluation structurale cellulaire et fonctionnelle mitochondriale / Myocardial ischemia is characterized by the development of ionic and metabolic disorders that result in the loss of the structural and functional cellular integrity, especially within mitochondria and, consequently, in alterations of cardiac electromechanical activity. In the context of this thesis, the following aspects have been investigated: (1) ischemia-reperfusion (I/R) lesions and pharmacological measures of cardioprotection involving the calcium antagonist amlodipine, and the converting enzyme inhibitor perindorpilate. After describing the various electrophysiological, hemodynamic, and mitochondrial (both structural and functional) alterations induced by I/R, amlodipine and perindorpilate were administered either alone or combined, via a bolus IV injection, prior to a distal ligation of the anterior interventricular artery, and then one minute after reperfusion (Study II; n = 36 domestic piglets); (2) the acute cardiotoxicity of the local anesthetic levobupivacaine following an IV injection. Cardiotoxic effects were evaluated in two distinctive situations: preserved coronary circulation and experimental myocardial ischemia. Using both situations allows for mimicking levobupivacaine overdose in a healthy patient or a patient with coronary disease, respectively; (3) the possibly beneficial effect of lipid emulsions (Intralipid®) in both experimental conditions. Lipid emulsions were administered a few minutes following the IV injection of levobupivacaine (Study II, n=48 domestic piglets). These investigations were conducted in vivo on piglets anesthetized and ventilated. Electrophysiological and hemodynamic parameters were measured at given intervals throughout the study. At the end of the study, the animals were sacrificed and tissue samples of the left ventricles were withdrawn to measure the structure and function of mitochondria

Le travail présenté dans ce manuscrit est basé sur l’utilisation de la modélisation moléculaire, de la simulation et de la chimie théorique pour l’étude de la photosensibilisation de l’ADN ; c’est à dire l’augmentation de la sensibilité de l’ADN vis-à-vis de la lumière au travers de l’action d’agents photosensibilisants. Premièrement, les voies photophysiques et photochimiques de plusieurs molécules connues telles que nile bleu, nile rouge, BMEMC ou une base modifiée endogène, Pyo, ont été étudiés dans le but de comprendre leurs mécanismes de photosensibilisation. Les phénomènes associés qui ont été mis en évidence sont des transferts d’électrons et d’énergie, la production d’électrons solvatés et l’activation à deux photons. De plus, deux outils pour l’étude des interactions entre les molécules et l’ADN ont été dévellopés; i) un protocole calculatoire capable de fournir l’énergie libre d’interaction de drogues dans leurs poches; ii) un outil basé sur l’hamiltonien semi-empirique de Frenkel qui permet de modéliser le spectre de dichroïsme circulaire électronique de biomacromolécules. Ensuite, les effets de photolésions sur la structure et la flexibilité de l’ADN ont été étudiés ; i.e. les dimères de pyrimidines, la pyrimidine(6-4)pyrimidone (6-4PP) et les clusters de sites abasiques. Finalement, la reconnaissance de brins d’ADN lésés par des protéines de réparation et le rapport avec leurs activités enzymatiques a été analysé. Le lecteur peut se référer à la première partie de ce manuscrit pour une présentation vulgarisée du contexte de ce projet / The work presented in this manuscript is based on the use of molecular modeling, simulation and theoretical chemistry in order to study the photosensitization of DNA; i.e. the enhancement of the sensitivity of DNA to light through the action of a photosensitizing agent. A first aspect has been to study the photophysical and photochemical pathways of several known sensitizers such as nileblue, nilered, BMEMC or an endogenous modified nucleobase, Pyo, in order to understand their mechanisms of photosensitization. The related phenomena that have been observed are electron transfers, triplet-triplet energy transfers, production of solvated electrons and two-photons activations. Moreover, two tools have been developed to study the interaction between photosensitizing agents and DNA; i) a protocol able to provide the binding free energy of drugs in their interaction pockets; ii) a tool based on the semi-empirical Frenkel Hamiltonian to model the electronic circular dichroism of biomacromolecular systems in a straightforward way. Then the effects of photoinduced lesions on the DNA structure and flexibility have been investigated; i.e. cylcopyrimidine dimers (CPD), pyrimidine(6-4)pyrimidone (6-4PP) and cluster abasic sites. Finally the recognition of damaged DNA strands by repair enzymes is presented and the implication on enzymatic activities has been highlighted. The reader can refer to the first section of the manuscript for a popularized presentation of the project context

L’ADN est une molécule dont l’intégrité est cruciale pour le bon fonctionnement de tous les organismes vivants. Cependant, il est régulièrement soumis à différents stress provenant de sources endogènes ou exogènes, et qui sont capables de générer dans sa structure des dommages de nature variée. Chaque dommage peut être reconnu par une panoplie de protéines, parmi lesquelles nous pouvons retrouver les protéines de réparation, les inhibiteurs de réparation, les facteurs de transcriptions ou encore les protéines de remodelage chromatinien. Ces protéines constituent l’interactome d’une lésion donnée.Les cyclonucléosides sont des dommages complexes de l’ADN qui ont pour particularité d’impliquer à la fois la base et le résidu de sucre, entre lesquels une liaison covalente supplémentaire est créée. La présence de cette liaison a pour conséquence de déformer la double hélice de l’ADN. Ainsi, ces lésions ne sont pas prises en charge par le système de réparation par excision de bases, comme la plupart des dommages d’oxydation, mais elles seraient plutôt reconnues par le système de réparation par excision de nucléotides, ce dernier prenant en charge les lésions volumineuses.L’objectif de cette thèse est d’étudier l’interactome des cyclonucléosides en utilisant différents modèles biologiques : eucaryotes, bactéries ou archées. En utilisant une technique de piégeage de protéines sur des sondes comportant ces lésions, nous avons effectué un screening des interactions entre les cyclonucléosides et des protéines issues d’extraits protéiques HeLa. Nous avons ainsi identifié l’influence négative des cyclonucléosides sur la reconnaissance de sa séquence cible par un facteur de transcription DREF, ainsi que sur les interactions de PARP1 avec l’ADN. Ces résultats ont été confirmés par l’usage des techniques complémentaires.Nous avons également analysé les interactions entre la glycosylase bactérienne Fpg et les cyclonucléosides : cette enzyme possède une affinité pour ces lésions, sans pourtant exercer d’activité d’excision. Cette affinité est inférieure à l’affinité de la Fpg pour les sites abasiques mais reste supérieure à son affinité pour l’ADN non-endommagé. Le rôle que pourraient jouer les cyclonucléosides dans l’ADN est alors discuté suite aux résultats obtenus.Enfin, une archée radiorésistante Thermococcus gammatolerans a été étudiée. Dans un premier temps, la formation des lésions d’oxydation simples et complexes à forte dose d’irradiation (2500 et 5000 Gy) a été évaluée. La 8-oxo-désoxyguanosine, exemple des lésions simples d’oxydation, est formée en grande quantité suite à une forte dose d’irradiation, et rapidement réparée dans les cellules remises dans des conditions optimales de culture. Les cyclonucléosides, quant à eux, ne sont pas détectés même à de très fortes doses d’irradiation, ce qui soulève des questions sur la formation de ces dommages. Ensuite, deux nouvelles glycosylases isolées de Thermococcus gammatolerans ont été étudiées : leur mécanisme d’action ainsi que leur spécificité vis-à-vis des substrats ont été élucidés.Les travaux effectués au cours de cette thèse ont contribué à la meilleure compréhension des interactions entre les cyclonucléosides et les protéines interagissant avec eux. Le développement des techniques de piégeage des protéines sur les sondes lésées, qui a constitué une partie importante des travaux, pourra également servir à étudier l’interactome d’autres lésions complexes de l’ADN. / DNA is a molecule, which integrity is crucial for correct functioning of all the living organisms. However, it is regularly submitted to different stresses coming from endogenous or exogenous sources, which are able to generate various damages in its structure. Each damage may be recognized by multiple proteins, among which one can find repair proteins, inhibitors of DNA repair, transcription factors or proteins of chromatin remodelling. All these proteins constitute the interactome of a given DNA lesion.Cyclonucleosides are complex damages of DNA, which imply the base and the sugar residue at the same time, since an additional covalent bond is generated between these two. The consequence of the presence of this bond is the deformation of the double helix. For this reason, cyclonucleosides are not recognized by the base excision repair system, as the majority of the oxidative lesions are, but rather by the nucleotide excision repair system, which takes in charge bulky lesions.The objective of this thesis is to study the interactome of the cyclonucleosides, by using different biological models: eucaryotes, bacteries and archaea. By using the technique that enables trapping of proteins on the probes holding these lesions, we realised a screening of interactions between cyclonucleosides and proteins issued from the HeLa extracts. We identified the negative influence of cyclonucleosides on the recognition of its target sequence by the transcription factor DREF, as well as on the PARP1 interactions with DNA. These results were then confirmed by complementary techniques.We have also analysed the interactions between the bacterial glycosylase Fpg and cyclonucleosides: this enzyme possesses an affinity for these lesions, without however exerting an excision activity. This affinity is lower than the Fpg affinity for abasic sites, but it is higher than its affinity for non-damaged DNA. The role that could play cyclonucleosides in DNA is discussed following these results.Finally, a radioresistant archaea Thermococcus gammatolerans was studied. First, the formation of simple and complex oxidative lesions at the high radiation doses (2500 and 5000 Gy) was evaluated. 8-oxo-deoxyguanosine, which is an example of simple oxidative lesions, is formed in great quantity at high irradiation dose, and is rapidly repaired once the cells are put in their optimal culture conditions. As for cyclonucleosides, they are not detected even at very high doses of radiation, which raises questions concerning the formation of these damages. Next, two new glycosylases isolated from Thermococcus gammatolerans were studied: their mechanism of action, as well as their specificity against the substrates, were elucidated.The work accomplished during this thesis contributed to the better understanding of the interactions between cyclonucleosides and the proteins that interact with them. Also, the development of the protein trapping techniques on the damaged probes, which constituted an important part of this work, can be applied to study the interactome of other complex DNA lesions.

La cholestase intrahépatique représente environ 40% des lésions hépatiques induites par les médicaments et se caractérise par une accumulation intracellulaire des acides biliaires (AB). Les mécanismes impliqués sont encore mal connus et sa prédiction reste difficile. Le but de ce travail était de caractériser dans la cholestase d’origine médicamenteuse et de développer des méthodes de screening pour sa prédiction précoce, en utilisant la lignée humaine hépatique HepaRG et les hépatocytes humains. Tout d’abord, nous avons démontré que la motilité des canalicules biliaires (CB) est indispensable à la clairance des AB et requiert une alternance de phosphorylation/déphosphorylation de la chaine légère de la myosine (MLC), contrôlé par la voie Rho-kinase/Myosin Light Chain Kinase (ROCK/MLCK). Nous avons ensuite montré pour la première fois que les médicaments cholestatiques altèrent la voie ROCK/MLCK/MLC et la dynamique des CB. En utilisant la famille des antibiotiques résistant à la pénicillinase, dont fait partie la flucloxacilline, responsable de nombreux cas de cholestase, nous avons observé que la dérégulation de ROCK pouvait se faire par activation de HSP27, associée aux voies de signalisation PKC/P38 et PI3K/AKT. Enfin, nous avons montré une capacité variable des médicaments cholestatiques à moduler les profils des AB. En effet, les médicaments cholestatiques majeurs induisent une accumulation préférentielle des AB hydrophobes toxiques, in vitro, dans les premières 24h, qui résulte d’une inhibition de leur amidation. Au total, l’ensemble du travail a permis de progresser dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la cholestase d’origine médicamenteuse et de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs utiles pour sa prédiction. / Intrahepatic cholestasis represents around 40% of drug-induced liver injuries and is characterized by intracellular accumulation of bile acids (BA); mechanisms involved and its accurate prediction remains challenging. The aim of the current work was to characterize the mechanisms involved in drug-induced cholestasis and to develop screening methods for its early prediction, using human differentiated HepaRG and primary human hepatocytes. First, we demonstrated that bile canaliculi (BC) motility is essential for BA clearance and requires alternating phosphorylation/dephosphorylation of myosin light chain (MLC) that is controlled by the Rho-kinase/Myosin Light Chain Kinase (ROCK/MLCK) signaling pathway. Then, we showed, for the first time that cholestatic drugs could alter the ROCK/MLCK/MLC pathway and BC dynamics. Using the penicillinase-resistant antibiotics family, including flucloxacillin that is responsible for many cases of cholestasis, we found that deregulation of ROCK could be modulated by HSP27, associated with PKC/P38 and PI3K/AKT signaling pathways. Finally, we evidenced variable potency of cholestatic drugs to modulate BA profiles. Indeed, the well-known cholestatic drugs induced a preferential accumulation of unconjugated toxic hydrophobic BA in vitro within the first 24h that resulted from inhibition of their amidation. Altogether, these data bring new information on the understanding of the mechanisms involved in drug-induced cholestasis and highlight new morphological and molecular predictive biomarkers of drug-induced cholestasis.

La méthode de préservation d’organes la plus utilisée actuellement en transplantation rénale est la conservation statique en hypothermie. Cependant, ce mode de conservation induit des dommages inhérents aux lésions du syndrome d’ischémie/reperfusion (I/R). Cette étude a eu pour objectif d’identifier de nouvelles conditions de préservation des greffons, afin de limiter les lésions d’I/R, en modulant la température de conservation ou par ajout d’un transporteur d’oxygène. Nous avons utilisé deux modèles : in vitro avec des cellules endothéliales et in vivo en autotransplantation rénale chez le porc.Les résultats ont confirmé les effets délétères de la conservation à 4°C contrairement à des conservations à 19°C, 27°C et surtout 32°C, permettant d’obtenir une activité métabolique, une viabilité et une intégrité cellulaire supérieures ainsi qu’une diminution des marqueurs de l’inflammation et du stress oxydant. Nous avons aussi démontré les bénéfices d'un nouveau transporteur d’oxygène, M101, dans deux des solutions de conservation les plus utilisés, UW et HTK. L'utilisation de M101 en conservation statique permet une meilleure reprise de fonction à court terme et une réduction de la fibrose, cause principale de la perte du greffon. Enfin, nous avons montré une conservation des bénéfices de M101 à des doses réduites et déterminé que cette protection était due à une multifonctionnalité de la molécule, combinant un transporteur d’oxygène, une activité superoxyde dismutase et une taille importante (permettant de réguler la pression oncotique). Ce travail a montré de nouvelles pistes de réflexion vers une préservation, et donc une qualité, supérieure des organes à transplanter. / The most used preservation method in renal transplantation is hypothermic cold storage (CS). However, this method induces damages inherent to the ischemia/ reperfusion (I /R) syndrome.My study was aimed at identifying new grafts preservation conditions, to limit I/R damage, by varying storage temperature or by adding an oxygen carrier.We used two models: in vitro with endothelial cells and in vivo in pig renal autotransplantation. The results confirmed the deleterious effects of 4°C storage in contrast to conservations at 19°C, 27°C and above 32°C, resulting in improved metabolic activity, cellular viability and integrity as well as a significant reduction in markers of inflammation and oxidative stress. Then we demonstrated the benefits of a new oxygen carrier, M101, in the two most used preservation solutions, UW and HTK. Indeed, use of M101 in CS protocols improved short-term function recovery and reduced fibrosis development, main cause of graft loss. Finally, we have shown that the benefits of M101 were preserved at lower doses and we determined that this protection was due to a multifunctionality of the molecule, combining oxygen transport, superoxyde dismutase activity and a large size (regulating oncotic pressure). This work permitted the uncovering of new concepts towards improved organ preservation and quality for transplantation.

Summary<p>Brain dysfunction is a frequent complication of sepsis and is usually defined as “sepsis-associated encephalopathy” (SAE). Its pathophysiology is complex and related to a number of processes and pathways, while the exact mechanisms producing neurological impairment in septic patients have not been completely elucidated. Alterations in cerebral blood flow (CBF) have been suggested as a key component for the development of SAE. Reduction of CBF may be caused by cerebral vasoconstriction, induced either by inflammation or hypocapnia. More importantly, the natural mechanisms that protect the brain from reduced/inadequate CBF can be impaired in septic patients, especially in those with shock, and this further contributes to cerebral ischemia if blood pressure drops below a critical threshold. Hypercapnia is associated with a narrower autoregulatory plateau, which may potentially results in large CBF variations when mean arterial pressure (MAP) varies within usual targets. However, few data are available on the role of PaCO2 on cerebral autoregulation (CA). Finally, as SAE occurs also in patients without hemodynamic instability, alterations in brain tissue perfusion could occur independently from hypotension; thus, alterations in cerebral microcirculation, which largely regulates regional flow and blood-cellular nutrients exchanges, could contribute to SAE. In septic animals, these microcirculatory abnormalities could be implicated in the development of electrophysiological abnormalities observed during sepsis and contribute to neurological alterations. However, these findings were limited by several factors, including the technique used to assess the microcirculation, the short time of observation and the limited amount of fluid resuscitation used in those models. <p>In the first part of this work, I evaluated CA and the potential influence of PaCO2 on CA in patients with septic shock. In 21 mechanically ventilated patients, I observed that 14 of them had impaired CA. All the 7 patients with a PaCO2 ≥ 40 mmHg but only 7 of the 14 patients with a PaCO2 <40 mmHg had an impaired CA (p=0.046). Specifically, 4/9 (44%) patients with PaCO2 < 35 mmHg, 7/9 (77%) with PaCO2 between 35 and 42 mmHg, and 3/3 (100%) with PaCO2 > 42 mmHg had impaired CA. The Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis showed that a PaCO2 threshold of 38 mmHg had a sensitivity of 50% and a specificity of 100% for the prediction of impaired CA, with an area under the ROC curve of 0.76 (95% confidence interval: 0.52–0.91).<p>In the second part of this work, I hypothesized that altered cerebral microcirculation may occur in the early phase of sepsis and contribute to brain hypoxia. In a clinically relevant model of ovine fecal peritonitis, I showed that there was a progressive deterioration of cerebral microvascular flow in septic animals (n=10) when compared to sham animals (n=5), starting already after 6 hours from sepsis induction and becoming significant at 12 hours thereafter. Moreover, changes in the cerebral microcirculation were not related to changes in MAP, cardiac output or blood lactate levels, suggesting that these alterations in the brain may occur even when global perfusion pressure is maintained, i.e. in non-hypotensive conditions. In a second study, including 10 septic and 5 sham animals, I found that cortical microvascular alterations were associated with decreased cerebral oxygenation. Furthermore, cerebral metabolic disturbances compatible with tissue hypoxia (i.e. increased brain lactate/pyruvate ratio, LPR) occurred mostly during shock, suggesting that hypotension is a critical factor in the development of anaerobic metabolism in the septic brain. Nevertheless, I showed in a third study (n=8) that the reversal of hypotension using vasopressor agents, although increased cerebral oxygenation and slightly reduced LPR, did not significantly influence the alterations of cerebral microcirculation and was associated with an increase in glutamate and glycerol, suggesting ongoing excitotoxicity and cellular damage. These alterations in cerebral microcirculation, oxygenation and metabolism may then contribute to the pathogenesis of SAE.<p><p><p><p><p>Résumé<p>La dysfonction cérébrale est une complication fréquente du sepsis et elle est généralement identifiée comme « encéphalopathie associée au sepsis » (sepsis-associated encephalopathy, SAE). La physiopathologie de la SAE est complexe et liée à des nombreux processus et voies de signalisation, même si les mécanismes qui induisent cette dysfonction cérébrale chez les patients en sepsis n’ont pas été clairement élucidés. Des anomalies du débit sanguin cérébral (cerebral blood flow, CBF) ont été proposées comme une des déterminants pour le développement de l’SAE. La réduction du CBF pourrait être induite par une vasoconstriction cérébrale, élicitée pas l’inflammation ou par l’hypocapnie. De plus, les mécanismes qui naturellement règlent le CBF pour qu’il soit ni diminué ni inadéquat aux besoins cellulaires peuvent être altérés pendant le sepsis, particulièrement en cas de choc septique, et ceci pourrait davantage contribuer au développement de zones d’hypoperfusion cérébrale si la pression artérielle diminue au-dessous d’un seuil critique. Un autre point important est que l’hypercapnie est associée à une diminution du plateau d’autorégulation du CBF, ce qui pourrait potentiellement causer des larges variations du CBF endéans des valeurs de pression artérielle considérés comme normaux en pratique clinique; malheureusement, très peu de données sont disponibles sur le rôle de la PaCO2 sur l’autorégulation cérébrale (cerebral autoregulation, CA). Enfin, vu que l’SAE survient aussi chez des patients qui n’ont pas d’instabilité hémodynamique, des anomalies de la perfusion cérébrale régionale pourraient se produire en absence de toute hypotension artérielle ;en effet, des altérations de la microcirculation cérébrale, qui règle le débit sanguin au niveau des tissues et l’échange d’oxygène et nutriments entre la circulation sanguine et le cellules, peuvent aussi contribuer au développement de la SAE. Dans des modelés expérimentaux de sepsis, les altérations microcirculatoires ont été associées à des troubles électrophysiologies et à la présence d’anomalies « cliniques ». Cependant, ces données ont été biaisées par le type de technique utilisée pour évaluer la microcirculation, le temps d’observation très court et la quantité limitée de fluides administrés au cours de la réanimation liquidienne dans ces modelés. <p>Dans la première partie de ce travail, j’ai décrit les anomalies de la CA et l’impact de la PaCO2 sur la CA chez des patients en choc septique. En étudiant 21 patients en ventilation mécanique, j’ai pu observer que 14 d’entre eux avaient une CA altérée, y compris 7/14 avec une PaCO2 < 40 mmHg et 7/7 avec une PaCO2 ≥ 40 mmHg (p = 0.046). De plus, 4/9 (44%) avec PaCO2 < 35 mmHg, 7/9 (77%) avec PaCO2 between 35 and 42 mmHg, and 3/3 (100%) avec PaCO2 > 42 mmHg avaient une CA altérée. L’analyse selon la « Receiver Operating Characteristic » (ROC) montrait une sensibilité de 50% et une spécificité de 100% pour prédire une CA altérée, avec un seuil de PaCO2 de 38 mmHg (l’aire sous la courbe de l’analyse ROC était à 0.76 [95% ICs: 0.52–0.91]).<p>Dans la deuxième partie de ce travail, j’ai émis l’hypothèse que des anomalies de la microcirculation cérébrale peuvent survenir dans la phase précoce du sepsis et contribuer au développement d’une hypoxie tissulaire. Dans un modelé de péritonite fécale induite chez le mouton, très proche de la situation clinique, j’ai pu montrer que il existe une détérioration progressive de la microcirculation cérébrale chez les animaux septiques (n-=10) quand comparés aux animaux témoins (n=5) qui commence déjà a la sixième heure de l’induction du sepsis and devient significative après 12 heures. De plus, les changement de la microcirculation cérébrale n’étaient pas corrélés à ceux de la pression artérielle, du débit cardiaque ou des taux de lactate, ce qui suggère que ces anomalies peuvent se produire aussi en conditions de stabilité hémodynamique. Dans une deuxième étude comprenant 10 animaux septique et 5 témoins, j’ai observé que les anomalies microcirculatoires étaient associées à une diminution de l’oxygénation cérébrale tissulaire. Toutefois, les anomalies du métabolisme cérébral compatible avec une hypoxie tissulaire (des valeurs élevées du rapport lactate/pyruvate, LPR) se développaient que dans la phase du choc septique, indiquant que l’hypotension artérielle est le facteur déterminant pour ces anomalies métaboliques au cours du sepsis. Cependant, dans une troisième étude sur 8 animaux en sepsis, j’ai démontré que la correction de l’hypotension par administration de vasopresseurs, même si elle était associée à une augmentation de l’oxygénation cérébral et une diminution du LPR, n’améliorait pas de façon significative la microcirculation cérébrale et s’accompagnait par une augmentation des taux de glutamate et glycérol, ce qui plaidait plutôt pour un excitoxicité persistante et une progression des lésions cellulaires. Toutes ces anomalies de microcirculation, oxygénation et métabolisme cérébral pourraient contribuer à la pathogenèse de l’SAE.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished