As galectinas são proteínas que se ligam a -galactosídeos por meio do domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD do inglês, Carbohydrate Recognition Domain) e que participam de vários processos de reconhecimento celular, sinalização, adesão e destinação intracelular de proteínas recém-sintetizadas. A primeira galectina, Galectina-1 (Gal-1), foi identificada em 1976 e possui um papel importante na progressão e proliferação tumoral, angiogênese, resistência a drogas e processos inflamatórios. Assim, é interessante a construção de dispositivos com Galectinas imobilizadas, preservando o CRD para o estudo de mecanismos e/ou detecção destas doenças. Neste trabalho a produção e caracterização de uma proteína recombinante fusionada, a MBP-Gal-1, foi descrita. A proposta do projeto foi pautada na hipótese de que a fusão da MBP à Gal-1 seria uma excelente estratégia para imobilização orientada da proteína de interesse, (Gal-1), sobre eletrodos modificados com filme polimérico, auxiliando na preservação da atividade da biomolécula imobilizada para posterior desenvolvimento de biossensor. A MBP-Gal-1 foi purificada utilizando 2 colunas com resinas diferentes: sepharose/lactose e amilose onde foi possível comprovar a atividade/preservação dos sítios ativos da Gal-1 e MBP, respectivamente. A proteína fusionada teve seu estado oligomérico estimado e seu raio hidrodinâmico determinado pela técnica Espalhamento Dinâmico da Luz sendo que a mesma se encontrava na forma monomérica com raio hidrodinâmico de 4 nm ± 1,26. A massa molecular de 57,834 kDa para a MBP-Gal-1 foi obtida através da técnica de Espectrometria de Massas MALDI-TOF/TOF. O PPB, material polimérico empregado na modificação dos eletrodos de carbono vítreo e ouro, foi sintetizado e teve sua estrutura confirmada pela técnica de Ressonância Magnética Nuclear; este material foi utilizado para a realização dos ensaios de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) e Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR) para a construção do biossensor. Os ensaios EIE utilizando eletrodo de carbono vítreo modificado com PPB mostraram a importância da imobilização orientada da sonda (MBP-Gal-1) para garantir a preservação da atividade biológica da mesma, uma vez que os resultados relativos ao aumento da Resistência à Transferência de Carga (Rtc), após adição do alvo (lactose), foram da ordem de 80% a mais para a proteína fusionada MBP-Gal-1 quando comparados à proteína nativa Gal-1. Os ensaios de SPR revelaram maior SPR efetiva para a MBP-Gal-1 imobilizada sobre superfície de eletrodo Au-SPR modificado com PPB o qual apresentou bom desempenho na detecção de lactose. / Galectins are proteins that bind to -galactosides by the Carbohydrate Recognition Domain (CRD) and participate in various processes of cell recognition, signaling, adhesion and intracellular destination of newly synthesized proteins. The first galectin, Galectin-1 (Gal-1), was identified in 1976 and plays an important role in tumor progression and proliferation, angiogenesis, drug resistance and inflammatory processes. Thus, it is interesting to desing devices with immobilized Galectins, preserving its CRD for the study of mechanisms and /or detection of such diseases. In this work the production and characterization of a fused recombinant protein, MBP-Gal-1, has been described. The project goal was based on the hypothesis that the fusion of the MBP to Gal-1 would be an excellent strategy for oriented immobilization of the protein of interest, (Gal-1), onto PPB- modified electrodes, promoting the preservation of the biomolecule activity immobilized for further development of a biosensor. MBP-Gal-1 was purified using 2 columns with different resins: sepharose/lactose and amylose and it was possible to prove the activity/preservation of both CRDs from Gal-1 and MBP, respectively. Dynamic Light Scattering showed that MBP-Gal-1 was in a monomeric form and with a hydrodynamic radius of 4 nm ± 1,26. The molecular mass of 57.834 kDa for MBP-Gal-1 was obtained by the technique of MALDI-TOF/TOF Mass Spectrometry. The PPB, a polymeric material used in the modification of glassy carbon and gold electrodes, was synthesized and its structure was confirmed by the Nuclear Magnetic Resonance (NMR); this material was used to carry out the Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) and Surface Plasmon Resonance (SPR) tests for the construction of the biosensor. EIS assays using PPB-modified glassy carbon electrode showed the importance of probe-immobilization (MBP-Gal-1) to ensure the preservation of the biological activity of the protein, since the results related to the increase in Resistance of Charge Transfer (Rct), after addition of the target (lactose), were 80% higher for the fused protein MBP-Gal-1 when compared to the Gal-1 native-form protein. The SPR assays revealed a greater effective SPR for MBP-Gal-1 immobilized onto PPB-modified Au-SPR electrode surface which showed good performance in the detection of lactose.

Os estudos sobre o mecanismo de enovelamento das proteínas é o resultado de um estudo intenso utilizando métodos bioquímicos, biofísicos e teóricos. \"In vitro\", o estado inicial deste estudo é a proteína desnaturada. Neste trabalho, temos estudado o reenovelamento, após desnaturação térmica, de uma glicoproteína denominada frutalina; da família das lectinas. A característica principal desta classe de proteínas é sua habilidade para interagir com carboidratos e, portanto, combinar-se com glicocomponentes da superfície da célula, induzindo suas propriedades biológicas. A frutalina é uma lectina tetramérica extraída das sementes de Artocarpus incisa. Ela é ligante de D-galactose e o espectro de CD (dicroísmo circular) de sua estrutura nativa foi identificado como sendo dominado por folhas ?. A desnaturação térmica e as etapas do reenovelamento foram monitoradas por espectroscopia de CD, fluorescência e também pela perda da atividade hemaglutinante. As condições de desnaturação utilizadas foram aquecimento à 60°C por 30 a 60 minutos, dependendo do tempo de estocagem (a -18°C) da proteína na forma nativa. Os resultados indicaram que o reenovelamento é promovido por um processo de congelamento na presença de PBS contendo 0,l M de D-galactose seguida por centrífugoconcentração em Centriprep 3. A hemaglutinação positiva ocorreu tanto para a fração nativa quanto para a fração reenovelada. O reenovelamento da frutalina desnaturada também ocorreu com PBS contendo 0,1 M de solução de D-glicose. Quando a forma desnaturada foi concentrada antes do congelamento em PBS sem D-galactose ou em PBS contendo xilose, o reenovelamento não ocorreu. Estes resultados mostraram que o reenovelamento da frutalina foi dependente da ligação com a D-galactose ou D-glicose, bem como a importância do congelamento para obter a forma biologicamente ativa. A análise da estrutura secundária utilizando o programa CCA forneceu um resultado importante: para a forma nativa da frutalina obtivemos 85% de folhas ? paralelas e antiparalelas, incluindo voltas ?, enquanto que para a forma reenovelada obtivemos 73%, mostrando que a estrutura reenovelada, a nível secundário, se aproximou satisfatoriamente da nativa, concordando com os resultados obtidos nos testes de hemaglutinação. / Our current understanding of the protein folding mechanism is the result of intense study employing biophysical, biochemical and theoretical methods. \"In vitro\", the initial state of the protein in this puzzle is its unfolded form. In the present work we have studied the refolding, after thermal denaturation, of the glycoprotein frutalin, a member of the lectin class. The main characteristic of these proteins is their ability to interact with carbohydrates and thus combine with glycocomponents of the cell surface, leading to their biological properties. Frutalin is a tetrameric lectin extracted from the seeds of Artocarpus incisa. It is D-galactose specific and its native CD spectrum was identified as being dominated by ? -sheet. The thermal unfolding and refolding steps were measured by CD and fluorescence spectroscopies together with the loss of hemagglutinating activity. The unfolding conditions used were 60°C for 30 to 60 minutes, depending on the protein storage time. The results indicate that refolding is promoted by the freezing process in the presence of 0,1 M D-galactose-PBS followed by three-fold concentration in a Centriprep 3. Positive hemagglutination occurred for both the native and refolded forms. Refolding of denatured frutalin also occurred with PBS containing 0,1 M D-glucose. When the unfolded form was concentrated before freezing in PBS without D-galactose or in PBS containing xylose, refolding did not occur. These results show that the refolding of frutalin is dependent on the binding of D-galactose or D-glucose, and demonstrate the importance of freezing in order to obtain the biologically activity form. An analysis of secondary structure using the CCA program showed an important result: the native form, presented 85% ? -sheet/ ?-turns, while in the refolded form, this content fell to 73%. These results show that the refolded form is very similar to the native protein, which is in agreement with the hemagglutination results.

A finalidade desse trabalho foi a análise de aspectos estruturais e biológicos de uma lectina do veneno de B. atrox, denominada galatrox. A purificação da galatrox envolveu dois passos cromatográficos, sendo o primeiro por afinidade em coluna de agarose-lactose e o segundo referente a aplicação do material retido no gel de agarose-lactose (LacR), em coluna de Sephadex G-25. As etapas de purificação foram monitoradas por leitura de absorbância em 280nm e SDS-PAGE. Preparações de galatrox foram submetidas à digestão in situ com tripsina e a massa molecular e o sequenciamento dos peptídeos obtidos foram determinados por espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS e ESI-CID-MS/MS). A seqüência N-terminal de aminoácidos da galatrox foi obtida pela reação automatizada de Edman (PROCISE-419®). A atividade lectínica dessa proteína foi caracterizada por meio de testes de aglutinação de eritrócitos humanos, na presença ou ausência de diferentes carboidratos como lactose (4mM) e galactose (20mM), EDTA (5mM) e aquecimento (100ºC/10min). A desgranulação mastocitária foi determinada pela liberação de -Hexosaminidase por células RBL-2H3 sensibilizadas com IgE anti-DNP(dinitrofenil) e estimuladas com galatrox, veneno bruto, fração não retida na coluna de agarose-lactose (Lac-nR), HSA-DNP (controle positivo) ou PBS (controle negativo). O nível de indução de apoptpse e/ou necrose de células RBL-2H3 tratadas com galatrox foi avaliado pela marcação com anexina V-FITC e/ou iodeto de propídeo e analisado por citometria de fluxo (FACScanto®) com o auxílio do software (CBA-DIVA®). A camptotecina foi utilizada como referência de apoptose/necrose. A atividade edematogênica foi testada em camundongos pela injeção intraplantar de galatrox; fração Lac-nR, veneno bruto e PBS. Análise por SDS-PAGE indicou que as preparações de galatrox eram homogêneas e continham bandas de 14.000 e 28.000 de massa molecular relativa em condições redutoras ou não, respectivamente. A seqüência N-terminal foi correspondente aos seguintes aminoácidos: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, e a seqüência de alguns aminoácidos internos corresponderam a KDFSWEWTDR e GHSEVWLGLWDK. A atividade hemaglutinante dessa lectina foi dose-dependente e inibida por EDTA (5mM), aquecimento (100ºC/10min) e lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). Ao contrário do veneno bruto e da fração Lac-nR, esta lectina não foi edematogênica e nem promoveu apoptose e necrose de células RBL- 2H3. A galatrox induziu uma discreta desgranulação mastocitária em comparação com o veneno bruto e a fração Lac-nR. Com base nos dados obtidos sugere-se que a galatrox é uma lectina homodímérica com 28.000 de massa molecular relativa, ligante de -galactosídeos e que apresenta similaridade estrutural com outras lectinas tipo-C do veneno de Bothrops ssp. Além disso, a galatrox comportou-se como um fraco agente pró-inflamatório e não induziu efeitos apoptótico e necrótico significantes. Finalmente, esse trabalho poderá contribuir para o melhor entendimento do impacto biológico da presença de lectinas no veneno e nos envenenamentos, bem como na geração de novos produtos biotecnológicos. / The aim of this work was the analysis of structural and biological aspects of a B. atrox venom lectin, named galatrox. The galatrox purification involved two chromatographic steps, starting with an affinity column of Lactosyl-Sepharose followed by application of the retained material on a Lactosyl-Sepharose gel (LacR) in Sephadex G-25 column. The purification steps were monitored by absorbance at 280nm and SDSPAGE. Galatrox samples were submitted to digestion in situ with trypsin and the sequencing mass of the obtained peptides were determined by mass spectrometry (MALDI-TOF-MS and ESI-CID-MS/MS). The N-terminal sequence of amino acids from galatrox was obtained by automatized Edman degradation (PROCISE-491®). The lectin activity of this protein was characterized by human erytrocytes agglutination test in presence or absence of different carbohydrates as lactose (4mM) and galactose (20mM), EDTA (5mM) and heat. The mast cells degranulation was determined by -hexosaminidase release in RBL-2H3 cells sensibilized with anti-DNP IgE and challenged with galatrox, crude venom in a non retained fraction in Lactosyl-Sepharose (Lac-nR) , HAS-DNP (positive control) or PBS (negative control). The apoptosis and/or necrosi induced level in treated RBL- 2H3 cells with galatrox was evaluated using AnnexinV and/or Propidium iodide and analysed by flow citometry (FACSCanto®) with the help software (CBA-DIVA®). The camptotecin was used with apoptosi/necrosi reference. The edematogenic was tested in mice by the intraplantar injection of galatrox, Lac-nR fraction, crude venom and PBS. SDS-PAGE analyse indicated that the galatrox preparations were homogenous and contained a single band of 14,000 or 28,000 relative molecular weight showed in reducting or non-reducting conditions, respectively. N-terminal amino acid sequence was determined as following: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, and some internal amino acid sequence was obtained which correspond to KDFSWEWTDR and GHSEVWLGLWDK. The hemagglutination activity of this lectin was dose dependent and inhibited by EDTA (5mM), heating (100ºC/10min) and lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). In the other hand, the crude venom and Lac-nR fraction, this lectin was not edematogenic nor promoted apoptosis and necrosi of RBL-2H3 cells. The galatrox induced a discret mast cells degranulation compared with crude venom and Lac-nR fraction. Based in obtained datas is suggested that galatrox is a homodimeric lectin with relative molecular mass of 28,000, -galactoside bindings and that shows structural similarity with other Ctype lectins from Bothrops ssp. venom. Even more the galatrox showed to be a weak proinflamatory agent and did not induced significant apoptotic and necrotic effect. Finally this work would contribute to better understanding of the biological impact that the lectin presence in venom and in poisonings as well in the generation of a new biotechnological products.

O estudo de enovelamento de proteínas tem sido um problema de fundamental importância em biofísica e biologia molecular. Neste trabalho, estudamos os processos de desnaturação e renovelamento das lectinas jacalina e frutalina. Estas lectinas são tetraméricas, apresentam alta homologia estrutural, porém diferem em atividade biológica, sendo a frutalina mais potente. Apesar desta homologia, estas lectinas diferem também nos processos de desnaturação e renovelamento como função da temperatura e o comportamento frente ao desnaturante químico hidrocloreto de guanidina (GndHCl). Ambas proteídas foram desnaturadas pela ação de GndHCl e suas curvas de desnaturação medidas por espectroscopia de fluorescência e CD. As medidas de fluorescência da frutalina deram valores de estabilidade conformacional de 17,12 kJ/mol e 12,34 kJ/mol, na presença e na ausência de D-Galactose, enquanto a jacalina forneceu valores de 8,12 kJ/mol para a transição NI e 5,61 kJ/mol para a transição IU em PBS. Os valores na presença de açúcar foram similares. NOs estudos da frutalina foram separadas as formas nativa, desnaturada, renovelada e uma forma molecularmente distinta chamada mal-enovelada, por cromatografia de exclusão molecular. Estas formas foram analisadas por atividades hemaglutinante e espectroscopias de CD e fluorescência. Todos os resultados obtidos confirmaram a ocorrência do renovelamento de ambas lectinas e que os monômeros renovelados, depois de alcançarem sua estrutura tridimensional, se associam espontaneamente para a formação dos tetrâmeros. / Protein refolding is currently a fundamental problem in biophysics and molecular biology. We have studied the refolding process of jacalin and frutalin. They are tetrameric lectins that present structural homology, buti jacalin shows a more marked biological activity than the latter. These proteins, despite their homology, have different unfolding/refolding behaviors as function of temperature and chemical agents. Both proteins were unfolded induced by guanidine hydrochlroide and their dnaturation curves mesuared by fluorescence emission and CD. Fluorescence measurments of frutalin gave values of conformational stability of 17.12 kJ/mol and 12.32 kJ/mol, in the presence and absence of D-Galactose, while jacaline gave values of 8.12 kJ/mol for NI transition and 5.61 kJ/mol for IU transition in PBS. In sugar presence the values are similar. In the frutalin studies were separeted the native, unfolded, refolded and a distinct molecular form denoted misfolded, by Size Exclusion Chromatography. These forms were analyzed for hemagglutination activity, CD and fluorescence spectroscopy. All the results obtained confirmed the successful refolding of the both lectins and the refolded monomers, after adopting their native three-dimensional structures, spontaneously assembled to form tetramers.

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A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população por conferirem vantagem seletiva aos heterozigotos. Em relação aos 3 principais polimorfismos existentes na região promotora, verificamos ser a variante -221G (Y) a mais frequente (88%) seguida de +4C (P) (73%) e de -550C (L) (67%). Identificamos oito haplótipos em MBL2 num total de 644 cromossomos avaliados, em 30 combinações diferentes, sendo HYPA e LYQA os mais frequentes e HYPD e HYPB os mais raros. Todos os portadores de combinações de haplótipos homozigotos para alelos defectivos apresentaram níveis séricos de MBL indetectáveis. Os genótipos LYQA/LYQA e HYPA/HYPA apresentaram as maiores concentrações médias de MBL no soro. A combinação entre SNPs no éxon 1 e na região promotora do gene MBL2 resulta em grande variação nas concentrações de MBL em indivíduos saudáveis. Consideramos que o conjunto de dados gerados é uma contribuição valiosa que poderá ser expandida para outros cenários. / Visceral leishmaniasis (VL), also known as kalazar, is an endemic, chronic, severe and highly lethal disease when not treated. Studies have shown that the protein Mannose-biding lectin (MBL), encoded by the gene MBL2, is the major player in innate immune system due its role in microbial recognition, elimination and inflammation as well as in the cell death. In the current work, we conducted a case-control study which aimed to investigate the association between variants in the gene MBL2 and the susceptibility to VL in individuals living in endemic areas of the São Luís - MA. 322 individuals participated in this study. Of these, 161 were VL cases being unrelated individuals of both sexes, and inhabitants from endemic areas of the disease in São Luís. The other 161 individuals were uninfected healthy controls, being unrelated and from the same region. The identification of VL cases occurred by visiting reference hospitals and clinics in the city. VL patients were identified in the household environment through the records of FUNASA-MA. Molecular analysis consisted in genotyping six variants located in the promoter region [positions -550 (C> G), -221 (G> C), +4 (C> T)] and coding region [codons 52 (C> T), 54 (G> A) and 57 (G> A)] of the MBL2 gene by polymerase chain reaction and automated DNA sequencing. The concentrations of MBL protein in the serum was performed by ELISA. We found that MBL phenotypes depend on the number of alleles present in the gene MBL2, being clear the consequence of the defective variants in the protein levels. There was no significant difference between cases and controls regarding the distribution of MBL2 genotypes and MBL serum levels. The allele frequencies of exon variants in the overall sample showed that the A allele is the most common (74.8%) and that the defective alleles (B, C and D) are mainly heterozygous (36.6%). This highlights the idea that defective MBL2 alleles are maintained in the population to confer selective advantage to heterozygotes. Concerning the three main existing polymorphisms in the promoter region, we noticed that the variant-221G (Y) is more frequent (88%) followed by +4 C (P) (73%) and 550C-(L) (67%) variants. We identified eight haplotypes in MBL2 in a total of 644 chromosomes evaluated in 30 different combinations, being the HYPA and LYQA the most frequent haplotypes and HYPD and HYPB the rarest ones. All carriers with combinations of homozygous haplotypes for defective alleles had undetectable serum levels of MBL. Genotypes LYQA / LYQA and HYPA / HYPA had the highest mean concentrations of MBL in the serum. Combination between SNPs in exon 1 and in the promoter region of the gene MBL2 results in a great variation of MBL concentrations in healthy individuals. We consider that the data set that was generated is a valuable contribution that can be expanded to others cenarios.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / No presente trabalho à feita a descriÃÃo de trÃs genes distintos que codificam lectinas ou proteÃnas relacionadas à lectina de Vatairea macrocarpa. As sequÃncias foram obtidas pela amplificaÃÃo de DNA genÃmico e cDNA de folhas utilizando primers semi-degenerados construÃdos a partir da informaÃÃo da sequÃncia de aminoÃcidos da lectina VML depositada no GenBank. O resultado do sequenciamento revelou a presenÃa de trÃs contigs. O contig1 corresponde à lectina VML desde que se assuma que a lectina depositada VML contenha heterogeneidades ou ambiguidades decorrentes na degradaÃÃo de Edman. A traduÃÃo dos contigs 2 e 3 mostram identidade de sequÃncia de 77% quando comparadas com VML. As sequÃncias, apesar de apresentar regiÃes conservadas, mostram diferenÃas de aminoÃcidos nos sÃtios de N-glicosilaÃÃo, sÃtios de ligaÃÃo a carboidrato e metais alÃm da presenÃa de resÃduos de cisteÃna sugerindo que tais proteÃnas podem ter outras atividades biolÃgicas. A anÃlise da sequÃncia obtida pelo 3â RACE se mostrou complementar ao contig3. Sendo assim, a sequÃncia hÃbrida contig3/contigA possui 2 resÃduos de cisteÃna alÃm de revelar diferenÃas de aminoÃcidos na regiÃo C-terminal quando alinhada com outras lectinas de leguminosas. AnÃlises filogenÃticas revelaram que os contigs observados formam um grupo monofiletico e tem alta similaridade com as lectinas de Sohora japonica e Robinia pseudoacacia, alÃm da proteÃna relacionada à lectina de Cladrastis lutea. / In this paper is made a description of three distinct genes that encode Vatairea macrocarpa lectin and related proteins. The sequences were obtained by amplification of genomic DNA and cDNA of leaves using semi - degenerate primers constructed from the information of the amino acid sequence of VML lectin deposited in GenBank. The result of sequencing rev eals the presence of three different genes, called contig 1, 2 and 3 . The VML lectin corresponds to contig1 long as one assumes that the lectin contains heterogeneities deposited VML or ambiguities arising in the Edman degradation . The translation of cont igs 2 and 3 show sequence identity of 77% compared to VML. Sequences, despite having conserved regions show differences in amino acid N - glycosylation sites, carbohydrate binding sites and metals and the presence of cysteine residues suggests that these pro teins may have other biological activities . The analysis of the sequence obtained by 3 'RACE proved complementary to contig3. Thus, the sequence contig3/contigA hybrid has two cysteine residues in addition to revealing differences in amino acid C - terminal region when aligned with other legume lectins. Phylogenetic analysis revealed that the observed contigs form a monophyletic group and has high similarity with lectins from Robinia pseudoacacia Sohora japonica and, in addition to the lectin - related protein Cladrastis lutea .

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Lectinas sÃo proteÃnas que atravÃs de ligaÃÃes a resÃduos de carboidratos podem interagir com sistemas biolÃgicos elicitando uma diversidade de efeitos. As lectinas vegetais tÃm sido utilizadas como ferramentas no estudo da inflamaÃÃo devido a sua capacidade de reconhecer resÃduos de carboidratos presentes nas membranas das cÃlulas inflamatÃrias atravÃs de seus domÃnios lectÃnicos. Assim, investigou- se neste trabalho o possÃvel efeito prÃ-inflamatÃrio da lectina de sementes de Dioclea rostrata; ligadora de &#945;-metil-D-manosÃdeo sobre a migraÃÃo de neutrÃfilos (MN) [(in vivo e in vitro)]. Os modelos utilizados foram: peritonite, edema de pata e bolsa de ar subcutÃnea (in vivo), quimiotaxia de neutrÃfilos e cultura de macrÃfagos (in vitro). Foi verificado que a lectina apresentava atividade prÃ-inflamatÃria em todos os estudos realizados. O aumento do nÃmero de macrÃfagos atravÃs do prÃ-tratamento dos animais com tioglicolato potencializou a MN induzida por Dros; a depleÃÃo de mastÃcitos atravÃs do tratamento com o composto 48/80 nÃo interferiu na MN da lectina. Sendo assim sugeriu-se o envolvimento de macrÃfagos e desconsiderou-se o de mastÃcitos. Na modulaÃÃo farmacolÃgica no modelo de peritonite feita atravÃs do prÃ-tratamento dos animais com drogas anti-inflamatÃrias, observou-se que indometacina, dexametasona e talidomida inibiram a MN. A lectina induziu quimiotaxia in vitro, estimulou a sÃntese/liberaÃÃo de citocinas como TNF-&#945; e IL-1, IL-10, desta maneira sugere-se que estudos mais detalhados sejam realizados em continuidades a este trabalho para verificar se esta lectina pode ser utilizada em modelos de imunosupressÃo. O &#945;-metil-D-manosÃdeo reverteu a MN induzida por Dros, desta forma parece que a Dros desencadeia resposta inflamatÃria atravÃs da interaÃÃo de seus domÃnios lectÃnicos com aÃucares presentes na membrana de macrÃfagos / Lectins are proteins possessing a carbohidate moiety that are able to interact with biological systems eliciting a variety of effects. Vegetal lectins have been used as tools in the study of inflammation due to its ability to recognize carbohydrate residues in inflammatory cell membranes by means of its lectin domain. The present work studied the pro-inflammatory effects of the lectin from Dioclea rostrata seeds (Dros), a binder of &#945;-methyl-D-manoside, on neutrophil migration ( NM ) [(in vivo and in vitro)]. The models of peritonitis, paw edema, and subcutaneous air pouch (in vivo), neutrophil chemotaxy and macrophage culture (in vitro) were utilized. It was found that Dros showed a pro-inflammatory activity in all of the above models. The increase in the number of macrophages by the pre-treatment of the animals with thioglycolate potentialized the Dros-induced NM. Also, the depletion of mast cells by the use of the substance 48/80 did not interfere in the lectin-induced NM. The above data suggest the involvement of macrophages but not mast cells in the mechanisms studied. The pre-treatment of the peritoneum with anti-inflammatory drugs like indomethacine, dexamethasone and thalidomide inhibited the NM. Dros induced chemotaxy in vitro and stimulated the synthesis / release of cytokines as TNF-&#945; and IL-1 in addition to IL-10 and this way he/she suggests himself that more detailed studies are accomplished in continuities to this work to verify this lectin can be used in imunosupression models. In the paw edema model the lectin promoted an intense edema and a significant increase in the mieloperoxidase activity (when compared to the control group). The &#945;-methyl-D-manoside reversted the Dros-induced NM and so it seems that Dros triggers the inflammatory response by means of the interaction of its lectin domain with sugars in the macrophage membrane. The present data suggest that Dros could be used as tools in biochemical and pharmacological studies.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas sÃo proteÃnas de origem nÃo imune que possuem pelo menos um domÃnio de ligaÃÃo especÃfica e reversÃvel a carboidratos, sem aÃÃo enzimÃtica. Estas proteÃnas sÃo amplamente distribuÃdas na natureza. As lectinas isoladas de sementes de leguminosas estÃo entre as mais estudadas e possuem homologia, sendo importantes marcadores moleculares da evoluÃÃo dentro desta famÃlia vegetal. Existem poucas informaÃÃes sobre as lectinas das tribos da base da subfamÃlia Papilionoideae e novas informaÃÃes sÃo importantes para solidificar os conhecimentos sobre as lectinas dessas tribos. Este trabalho teve como objetivo purificar uma nova lectina de sementes de Swartzia laevicarpa, caracteriza-la fÃsicoquimicamente e por espectrometria de massas e testa-la quanto a sua capacidade de causar inflamaÃÃo e dor e quanto a sua toxidade contra nÃuplios de Artemia sp. A lectina foi purificada por fracionamento por sulfato de amÃnio seguido de cromatografia de troca iÃnica e exclusÃo molecular. Denominada de SLA, a lectina apresenta o perfil eletroforÃtico de uma cadeia de 30 kDa e, diferente de SLL, apresenta subunidades por volta de 13 e 17 kDa. Possui afinidade por GalNAc e derivados de galactose, e apresenta caracterÃsticas termodinÃmicas de ligaÃÃo diferente para Gal e GalNAc. A lectina em estudo causou inflamaÃÃo em modelo de edema de pata de camundongos e hipernocicepÃÃo ligada a inflamaÃÃo. SLA tambÃm apresentou toxicidade contra nÃuplios de fase II de Artemia sp. A lectina isolada e caracterizada nesse trabalho demonstra ser uma ferramenta taxonÃmica interessante para corroborar o posicionamento de Swartzeae alÃm de demonstrar tambÃm um potencial biotecnolÃgico no estudo de modelos de inflamaÃÃo e dor. AtravÃs da espectrometria de massas foi possÃvel verificar que SLA apresenta pelo menos duas isoformas e apresenta glicoformas. Possui aproximadamente 250 resÃduos de aminoÃcidos e nesse trabalho foram determinados 179 deles. SLA apresentou similaridade com lectinas de outras tribos basais como VML e SJA, corroborando com a classificaÃÃo de Swartzieae como tribo de Papilionoideae e demonstrando a utilizaÃÃo de lectinas como ferramenta taxonÃmica. / Lectins are proteins of non-immune origin that have at least one specific and reversible carbohydrate binding domain without enzymatic action. These proteins are widely distributed in nature. Lectins isolated from legume seeds are among the most studied, have homology and are important markers of evolution within this plant family. There is little information about the lectins of the basal tribes of the subfamily Papilionoideae and new information is important to solidify your knowledge of the lectins of these tribes. This study aimed to purify a new lectin from Swartzia laevicarpa, to characterize its physical-chemical and mass spectrometry proprieties and test as its ability to cause inflammation and pain and their toxicity against Artemia sp. The lectin was purified by ammonium sulfate fractionation followed by ion exchange chromatography and molecular exclusion. Named SLA, the lectin shows the electrophoretic profile of a chain of 30 kDa and, unlike SLL presents subunits around 13 and 17 kDa. Has affinity for GalNAc and Gal derivatives, and presents thermodynamic binds characteristics of different for Gal and GalNAc. SLA caused inflammation in a model of paw edema of mice and hypernociception linked to inflammation. SLA also showed toxicity against stage II nauplii of Artemia sp. The lectin isolated and characterized in this work proves to be an interesting tool and corroborate the taxonomic placement of Swartzeae. SLA also demonstrate the biotechnological potential in the study of models from inflammation and pain. By mass spectrometry we found that SLA has at least two isoforms and provides glycoforms. It has approximately 250 amino acid residues and in this work were determined 179 of them. SLA showed similarity with lectins from other basal tribes as VML and SJA, corroborating the classification as Swartzieae Papilionoideae tribe and demonstrating the use of lectins as a taxonomic tool.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A frutalina, lectina &#945;-D-galactose ligante, foi expressa e processada num sistema heterÃlogo para expressÃo de proteÃnas utilizando a levedura metilotrÃfica Pichia pastoris. Para atingir os objetivos esperados foram desenvolvidas trÃs estratÃgias: identificar o gene que codifica para a frutalina a partir do DNA genÃmico obtido de folhas de A. incisa; sintetizar, por uma empresa especializada, o gene que codifica para as cadeias polipeptÃdicas da frutalina, otimizando-o para a expressÃo em P. pastoris e isolar o gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA presente em sementes maduras e frescas, para obtenÃÃo do cDNA utilizando a tÃcnica da RT-PCR. Enquanto na primeira estratÃgia, foi obtido apenas o gen da cadeia beta, nas duas outras estratÃgias o gen completo foi obtido. No entretanto, a estratÃgia que mostrou melhor expressÃo da frutalina recombinante em P. pastoris foi a da obtenÃÃo do gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA. A expresÃo foi tempertura dependente e a frutalina recombinante apresentou uma massa molecular aparente de 17 kDa, sugerindo a presenÃa do peptÃdeo de ligaÃÃo e da cauda de histidina. / Frutalin, the Artocarpus incise alfa-D-galactose binding seed lectin was expressed and processed in a heterologous system for protein expression, using the metilotrophic yeast Pichia pastoris. In order to obtain the proposed objectives, three strategies were followed: identify the frutalin gene from the genomic DNA, obtained from the leaves; obtain, from the GenScript Corporation, the synthetic frutalin polypeptide chains gene, optimized for expression in Pichia system; and isolate frutalin gene, from mRNA present in fresh seeds in order to obtain the cDNA, using the RT-PCR technique. The obtained genes were inserted in the Pichia genome, in order to evaluate the lectin expression. While in the first strategy only the beta chain gene was obtained, in the other two the complete frutalin gene was obtained. The best results were obtained from the third strategy. The expression process was temperature dependent, with the optimum at 18 &#959;C and the recombinant frutalin showed an apparent molecular mass of 17 kDa, which suggest the presence of both the linker peptide and the histidine tag.