Le sujet de cette thèse est la question du nombre minimal d’orbites de Reeb distinctes sur une variété de contact qui est le bord d’une variété symplectique compacte. L’homologie symplectique S1-équivariante positive est un des outils principaux de cette thèse; elle est construite à partir d’orbites périodiques de champs de vecteurs hamiltoniens sur une variété symplectique dont le bord est la variété de contact considérée.Nous analysons la relation entre les différentes variantes d’homologie symplectique d’une variété symplectique exacte compacte (domaine de Liouville) et les orbites de Reeb de son bord. Nous démontrons certaines propriétés de ces homologies. Pour un domaine de Liouville plongé dans un autre, nous construisons un morphisme entre leurs homologies.Nous étudions ensuite l’invariance de ces homologies par rapport au choix de la forme de contact sur le bord. Nous utilisons l’homologie symplectique S1-équivariante positive pour donner une nouvelle preuve d’un théorème de Ekeland et Lasry sur le nombre minimal d’orbites de Reeb distinctes sur certaines hypersurfaces dans R2n. Nous indiquons comment étendre au cas de certaines hypersurfaces dans certains fibrés en droites complexes négatifs.Nous donnons une caractérisation et une nouvelle fa ç on de calculer l’indice de Conley-Zehnder généralisé, défini par Robbin et Salamon pour tout chemin de matrices symplectiques. Ceci nous a mené à développer de nouvelles formes normales de matrices symplectiques. / This thesis deals with the question of the minimal number of distinct periodic Reeb orbits on a contact manifold which is the boundary of a compact symplectic manifold.The positive S1-equivariant symplectic homology is one of the main tools considered in this thesis. It is built from periodic orbits of Hamiltonian vector fields in a symplectic manifold whose boundary is the given contact manifold.Our first result describes the relation between the symplectic homologies of an exact compact symplectic manifold with contact type boundary (also called Liouville domain), and the periodic Reeb orbits on the boundary. We then prove some properties of these homologies. For a Liouville domain embedded into another one, we construct a morphism between their homologies. We study the invariance of the homologies with respect to the choice of the contact form on the boundary.We use the positive S1-equivariant symplectic homology to give a new proof of a Theorem by Ekeland and Lasry about the minimal number of distinct periodic Reeb orbits on some hypersurfaces in R2n. We indicate how it extends to some hypersurfaces in some negative line bundles. We also give a characterisation and a new way to compute the generalized Conley-Zehnder index defined by Robbin and Salamon for any path of symplectic matrices. A tool for this is a new analysis of normal forms for symplectic matrices.

Le domaine TIR (Toll/interleukin (IL)-1 receptor) est une composante essentielle du système immunitaire inné, celui-ci est présent dans les récepteurs TLR (Toll-like receptor) et les protéines adaptatrices associées comme MyD88 et TIRAP. La détection de pathogènes déclenche l'interaction entre les domaines TIR permettant ainsi l'initiation et la propagation de la signalisation par les TLRs. Aussi, de nombreux pathogènes produisent des effecteurs contenant un domaine TIR tels que BtpA et BtpB chez Brucella abortus, TirS chez Staphylococcus aureus ou TcpC chez l'uropathogènique Escherichia coli. Tous ces effecteurs bloquent la signalisation des TLRs et sont capables de perturber les voies de signalisation de l'immunité innée pendant l'infection. Cependant les mécanismes moléculaires impliqués restent la plupart du temps non caractérisés et dans certains cas controversés. Dans le but de mieux comprendre le fonctionnement de ce type d'effecteurs bactériens, j'ai caractérisé chez Pseudomonas aeruginosa PA7 un nouvel effecteur contenant un domaine TIR que nous avons renommé PumA pour Pseudomonas UBAP1 Modulator A. En parallele, j'ai aussi participé à des projets de caractérisation de deux autres effecteurs avec un TIR domain : BtpB et TirS. Ainsi, PumA est un facteur essentiel pour la virulence de P. aeruginosa PA7 et son domaine TIR est essentiel pour interaction avec deux protéines adaptatrice, TIRAP et MyD88. Durant l'infection de cellules épithéliales pulmonaires par P. aeruginosa PA7, PumA est responsable du contrôle de la translocation du facteur de transcription NF-κB dans le noyau. De plus, la production de PumA dans une souche de P. aeruginosa non-TIR confère à cette bactérie de nouvelles propriétés d'immuno-modulation. PumA cible aussi UBAP1, une protéine du complexe de tri endosomal requis pour le transport, ESCRT-I (endosomal sorting complex require for transport I) qui a été récemment montré pour moduler l'activation de récepteur de cytokine. Nos résultats montrent que UBAP1 peut s'associer avec TIRAP et MyD88, provoquant le mouvement de MyD88 à la membrane cytoplasmique, suggérant une nouvelle voie cellulaire commune entre UBAP1 et les TLRs, et révélant UBAP1 comme nouvelle cible pour des effecteurs bactériens dans le cadre du contrôle des réponses immunitaires de l'hôte / In higher eukaryotes, the innate immune system provides the first line of defense against invading pathogens. The Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain is an essential component of the innate immune system. This domain is present in Toll-like receptors (TLRs) and associated adaptor proteins such as MyD88 and TIRAP. Pathogen detection requires interaction between the TIR domains, which initiates and triggers propagation of TLR signaling. However, many pathogens produce a TIR domain-containing protein such as BtpA and BtpB in Brucella abortus, TirS in Staphylococcus aureus or TcpC in the uropathogenic strain Escherichia coli. These effectors block TLR signaling and are able to disrupt innate immune response during infection. However, the molecular mechanisms involved remain mostly uncharacterized and in some cases controversial. The objective of this thesis was to study bacterial effectors containing a TIR domain particularly at the molecular level. For this, we focused on Pseudomonas aeruginosa PA7, an atypical multi-drug resistant strain that contains an effector with a TIR domain that we named PumA, for Pseudomonas UBAP1 Modulator A. In addition, during these four years of thesis work I also participated in the characterization of two other effectors with a TIR domain: BtpB in B. abortus and TirS in S. aureus.We found that PumA is essential for virulence of P. aeruginosa PA7 and its TIR domain is the key element for interaction with two adaptor proteins MyD88 and TIRAP. During infection of lung epithelial cells by P. aeruginosa PA7, PumA is responsible for controlling the translocation of NF-?B into the nucleus indicative of activation of this transcription factor. In addition, production of PumA by a TIR-deficient strain of P. aeruginosa confers to this bacterium a new immuno-modulation property. Furthermore, PumA targets ubiquitin-associated protein 1 (UBAP1), a protein of the endosomal sorting complex required for transport I (ESCRT-I) which has recently been shown to modulate cytokine receptor activation. Our results also show that UBAP1 can associated with TIRAP and MyD88, causing movement of MyD88 to the cytoplasmic membrane and suggesting a new cellular pathway between UBAP1 and TLRs. In summary, our data reveal UBAP1 as a novel target for bacterial effectors implicated in control of host immune responses

Il a été observé que l’altération des fonctions des granules de stress, entités cytoplasmiques non-membranaires composées d’ARN et de protéines liant l’ARN (RBPs), peut conduire au développement de maladies telles que la sclérose latérale amyotrophique, la démence fronto-temporale, la myopathie à inclusions et la maladie de Paget des os. Ces pathologies sont caractérisées par un dépôt cytoplasmique d’inclusions solides enrichies en RBPs et comprenant des fibrilles. Une connexion génétique a été suggérée entre la persistance des granules de stress et l’accumulation de ces inclusions pathologiques dans le cytoplasme des patients. Dans mon manuscrit de thèse, il est mis en évidence le fait que la protéine hnRNPA1, dont les mutations entrainent les maladies mentionnées plus haut, subit une séparation de phases entre deux liquides connue également sous l’appellation « Séparation de Phases Liquide-Liquide » (LLPS) dans des gouttelettes enrichies en protéines. Bien que le domaine composé d’une séquence à faible complexité (Low Complexity sequence Domains ou LCD) soit suffisant pour obtenir cette séparation de phases, les domaines de liaison à l’ARN y contribuent également en présence d’ARN. Cela a permis d’envisager l’existence de plusieurs mécanismes intervenant dans la régulation de l’assemblage de ces granules. Un autre résultat a mis en exergue le fait que la formation de fibrilles n’est pas une obligation pour permettre la séparation de phases mais que les gouttelettes, enrichies en protéines, entrainent, par ailleurs, une augmentation de la formation de ces fibrilles. La séparation de phases liquide-liquide induite par le domaine composé d’une séquence à faible complexité semble contribuer à l’assemblage des granules de stress et à leurs propriétés liquides. Finalement, cette étude propose d’établir une réelle corrélation entre la formation des granules de stress qui deviennent persistants et l’accumulation d’inclusions pathologiques dans le cytoplasme des patients. / Stress granules are membrane-less organelles composed of RNA-binding proteins (RBPs) and RNA. Functional impairment of stress granules has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis, inclusion body myopathy, Paget’s disease of bone and frontotemporal dementia; these diseases are characterized by solid, fibrillar, cytoplasmic inclusions that are rich in RNA binding proteins (RBPs). Genetic evidence suggests a link between persistent stress granules and the accumulation of pathological inclusions. In this thesis manuscript, I demonstrate that the disease-related RBP hnRNPA1 undergoes liquid-liquid phase separation (LLPS) into protein-rich droplets mediated by a low complexity sequence domain (LCD). While the LCD of hnRNPA1 is sufficient to mediate LLPS, the folded RNA recognition motifs contribute to LLPS in the presence of RNA, potentially giving rise to several mechanisms for regulating assembly of stress granules. Importantly, while not required for LLPS, fibrillization is enhanced in protein-rich droplets. I suggest that LCD-mediated LLPS contributes to the assembly of stress granules and their liquid properties, and provides a mechanistic link between persistent stress granules and fibrillar protein pathology in disease.

Parmi les modèles de mécanique statistique classique avec interaction les systèmes intégrables de yang—baxter (yb) jouent un rôle particulier. le modèle central dans la théorie des systèmes intégrables yb est le modèle à six vertex. plusieurs méthodes ont été développées pour étudier le modèle à six vertex. notre but est de comprendre la physique du modèle à dix-neuf vertex d’izergin—korepin (ik), qui peut être vu comme une généralisation du modèle à six vertex. on donne une vue d'ensemble de l’ansatz algébrique de bethe pour le modèle ik basé sur la matrice $r$ à dix-neuf vertex et on propose une nouvelle présentation pour les états propres de la matrice de transfert associée. on adresse aussi la question du calcul des produits scalaires pour le modèle ik. un objet important dans la théorie des produits scalaires est la fonction de partition avec des conditions aux bords de domaine. pour cette fonction de partition, définie pour le modèle ik, on obtient une relation de récurrence pour laquelle on trouve la solution dans un cas particulier. la théorie de la représentation du groupe quantique ($u_q(a_2^{(2)})$) associé au modèle ik nous permet d'obtenir toutes les représentations de dimension plus élevée pertinentes pour ce modèle (les modules de kirillov—reshetikhin (kr)). ceci est réalisé dans la présentation de drinfeld des groupes quantiques. cette présentation a des avantages techniques quand on calcule les matrices $r$ par la formule de khoroshkin—tolstoy (kt). on l'utilise pour calculer la matrice $r$ evaluée sur le produit tensoriel de la représentation fondamentale et d'un module kr de dimension plus élevée. d’un autre côté, la présentation de drinfeld montre la connexion entre les sous-algèbres de borel du groupe quantique $u_q(a_2^{(2)})$ et les algèbres d'oscillateurs $q$-deformés (osc$_q$). ces algèbres sont étroitement liées à la définition (par la théorie de la représentation) d'un certain type de matrices de transfert : les opérateurs $q$; ces opérateurs jouent un rôle central dans la théorie des relations fonctionnelles des modèles intégrables. on utilise les algèbres de type osc$_q$ dans la formule kt pour calculer quelques matrices $l$, qui sont utilisées pour construire les opérateurs $q$. finalement, on considère un cas particulier de l'état fondamental du modèle ik avec paramètre de deformation $q$ égal à une racine de l'unité. dans ce cas, on calcule explicitement les valeurs propres de différentes matrices de transfert, y compris de l'opérateur $q$. on utilise ce dernier résultat pour obtenir l'état fondamental du modèle ik pour des petites tailles. / Among the models of interacting classical statistical mechanics the yang—baxter (yb) integrable systems play a special role. The central model in the theory of yb integrable systems is the six vertex model. many powerful techniques were developed to study the six vertex model. the model under consideration is the izergin—korepin (ik) nineteen vertex model, which can be viewed as a generalization of the six vertex model. our aim is to understand the physics of the ik model using the extensions of the methods which were applied to the six vertex model. We review the algebraic bethe ansatz for the ik model based on the nineteen-vertex $r$-matrix and propose a new presentation for the eigenstate of the relevant transfer matrix. we also address the question of the calculation of the scalar products of the ik model. an important object in the theory of scalar products is the domain wall boundary partition function. for this partition function defined for the ik model we derive a recurrence relation and solve it in a special case. we move on to the representation theory of the underlying quantum group ($u_q(a_2^{(2)})$), for which we compute all higher dimensional irreducible representations which are relevant for the ik model (kirillov—reshetikhin (kr) modules). the latter is accomplished in the so-called drinfeld presentation of quantum groups. this presentation has technical advantages for computations of the $r$-matrices by means of the khoroshkin—tolstoy (kt) formula. we use this to compute the $r$-matrix in a tensor product of the fundamental representation and a generic higher dimensional kr module. on the other hand, the drinfeld presentation makes apparent the connection between the borel subalgebras of the quantum group $u_q(a_2^{(2)})$ and the $q$-deformed oscillator algebras (osc$_q$). the latter algebras are closely related to the representation theoretic definition of special transfer matrices: the $q$-operators; these operators are central in the theory of functional relations of integrable models. we use the osc$_q$ type algebras in the kt formula to compute some $l$-matrices which are used to build the $q$-operators. finally, we consider a special case of the ground state of the ik model when the deformation parameter $q$ is equal to a root of unity. in this case we compute explicitly the ground state eigenvalues of various transfer matrices including the $q$-operator. we use the latter result to compute the components of the ground state of the ik model for small systems.

Le contexte scientifique de cette thèse est l'imagerie sismique dont le but est de reconstituer la structure du sous-sol de la Terre. Comme le forage a un coût assez élevé, l'industrie pétrolière s'intéresse à des méthodes capables de reconstituer les images de la structure terrestre interne avant de le faire. La technique d'imagerie sismique la plus utilisée est la technique de sismique-réflexion qui est basée sur le modèle de l'équation d'ondes. L'imagerie sismique est un problème inverse qui requiert de résoudre un grand nombre de problèmes directs. Dans ce contexte, nous nous intéressons dans cette thèse à la résolution du problème direct en régime harmonique, soit à la résolution des équations d'Helmholtz. L'objectif principal est de proposer et de développer un nouveau type de solveur élément fini (EF) caractérisé par un opérateur discret de taille réduite (comparée à la taille des solveurs déjà existants) sans pour autant altérer la précision de la solution numérique. Nous considérons les méthodes de Galerkine discontinues (DG). Comme les méthodes DG classiques sont plus coûteuses que les méthodes EF continues si l'on considère un même problème à cause d'un grand nombre de degrés de liberté couplés, résultat des approximations discontinues, nous développons une nouvelle classe de méthode DG réduisant ce problème : la méthode DG hybride (HDG). Pour valider l'efficacité de la méthode HDG proposée, nous comparons les résultats obtenus avec ceux obtenus avec une méthode DG basée sur des flux décentrés en 2D. Comme l'industrie pétrolière s'intéresse au traitement de données réelles, nous développons ensuite la méthode HDG pour les équations élastiques d'Helmholtz 3D. / The scientific context of this thesis is seismic imaging which aims at recovering the structure of the earth. As the drilling is expensive, the petroleum industry is interested by methods able to reconstruct images of the internal structures of the earth before the drilling. The most used seismic imaging method in petroleum industry is the seismic-reflection technique which uses a wave equation model. Seismic imaging is an inverse problem which requires to solve a large number of forward problems. In this context, we are interested in this thesis in the modeling part, i.e. the resolution of the forward problem, assuming a time-harmonic regime, leading to the so-called Helmholtz equations. The main objective is to propose and develop a new finite element (FE) type solver characterized by a reduced-size discrete operator (as compared to existing such solvers) without hampering the accuracy of the numerical solution. We consider the family of discontinuous Galerkin (DG) methods. However, as classical DG methods are much more expensive than continuous FE methods when considering steady-like problems, because of an increased number of coupled degrees of freedom as a result of the discontinuity of the approximation, we develop a new form of DG method that specifically address this issue: the hybridizable DG (HDG) method. To validate the efficiency of the proposed HDG method, we compare the results that we obtain with those of a classical upwind flux-based DG method in a 2D framework. Then, as petroleum industry is interested in the treatment of real data, we develop the HDG method for the 3D elastic Helmholtz equations.

Il existe de nombreux mécanismes impliqués dans le développement des tissus qui nécessitent que des cellules ou des groupes de cellules s’orientent et se polarisent. Les protéines de la voie de la polarité planaire (PP) s’associent pour former des complexes à la membrane et créer des asymétries proximo-distale. Vangl2 et Scrib1 ont été identifiés comme les deux premiers gènes impliqués dans la PP chez les mammifères. Lors de ma thèse, je me suis intéressé à ces deux protéines et à certains des complexes dans lesquelles elles sont impliquées. Dans un premier temps, nous avons montré l’implication directe de Scribble1 dans le trafic après endocytose des récepteurs NMDA. Scrib1 interagit avec les récepteurs NMDA grâce à ses domaines PDZ. Scribble1 peut interagir avec le complexe AP2 qui intervient dans l’endocytose des récepteurs. Cette étude a permis de définir un nouveau mécanisme dans lequel Scrib1 régule la quantité de récepteurs NMDA à la membrane et donc participe à la plasticité synaptique. Vangl2 est l’une des protéines transmembranaires les plus en amont de la voie de la PP. Nous avons identifié un nouveau partenaire nommé "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). Nous avons montré, par double hybride en levure et pull down, l’interaction de Vangl2 avec les deux isoformes de AIDA et leur colocalisation en COS7 et neurones. Ensemble, ces données présentent AIDA comme un très bon candidat pour le maintien de Vangl2 aux jonctions adhérentes et/ou pour son adressage à la membrane. Ces études nous ont permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliquant les protéines de la polarité planaire. / There are many mechanisms involved in the development of tissues that require cells or groups of cells orient and polarize. The proteins of the planar cell polarity (PCP) combine to form complexes with the membrane and create proximal-distal asymmetries. Vangl2 and Scrib1 have been identified as the first two genes involved in the PCP in mammals. In this study, I am interested in these two proteins and some of the complex in which they are involved. At first, using techniques of biochemistry, cell biology and biophysics, we showed the direct involvement of Scribble1 in traffic after endocytosis of NMDA receptors. Scrib1 interacts with NMDA receptors through its PDZ domains. Due to this binding motif between PDZ1 and PDZ2 of Scrib1, it can interact with the AP2 complex which is involved in receptor endocytosis. This study has identified a new mechanism in which Scrib1 regulates the amount of NMDA receptors on the membrane and is therefore involved in synaptic plasticity. Vangl2 is a transmembrane protein of the most upstream of the PCP pathway. We have identified a new partner named "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). We have shown, by yeast two-hybrid and pull down the interaction of Vangl2 with two isoforms of AIDA and collocation in COS7 and neurons. Together, these data show AIDA as a very good candidate for maintaining Vangl2 to adherens junctions and/or its membrane targeting. These studies have allowed us to improve our understanding of the mechanisms involving the planar polarity proteins.

Située dans une perspective d’anglais de spécialité et adoptant des outils d’analyse de discours, cette thèse vise à contribuer à la caractérisation du discours environnemental entendu comme un discours spécialisé. Résultat d’une conception changée de notre environnement, les mouvements de pensée, les pratiques et les discours qui se développent dans le but de sa protection, préservation ou régénération font partie du domaine spécialisé environnemental. Ce domaine émergent, ainsi que ses composants principaux, sont définis dans cette thèse.La première partie de notre thèse présente une vision globale du domaine et de son discours. Les concepts centraux de mouvement environnemental, d’environnementalisme, d’écologie et d’écologisme y sont analysés. Nous offrons ensuite une définition du concept de discours environnemental en partant du contenu des travaux faits par différents auteurs sur cet objet et en aboutissant à la prise en compte de ses spécificités grâce aux outils élaborés dans le cadre des études d’anglais de spécialité. La deuxième partie s’attache plus particulièrement aux discours et aux pratiques des organisations au Royaume-Uni. Dans ce contexte culturel particulier, nous présentons les principales organisations qui ont un rôle à jouer dans le domaine environnemental et décrivons leurs principaux discours de communication dans le domaine en nous interrogeant notamment sur les nouveaux genres de discours, les termes spécialisés et les pratiques discursives récurrentes. L’organisation interne du domaine est également considérée avec la présentation d’une typologie des organisations et des relations entretenues entre elles ainsi que du rôle et de la spécificité des experts dans le domaine. Cette étude est complétée dans une troisième partie par une analyse descriptive d’un genre de discours jouant un rôle prééminent dans le domaine : les rapports sur la responsabilité sociale des organisations. Après avoir présenté son contexte d’apparition et sa fonction principale, nous nous interrogeons sur la représentation des acteurs du domaine offerte par l’étude de ce genre puis sur les phénomènes de normalisation générique de ces rapports d’un point de vue diachronique. / With an English for Specific Purposes perspective and adopting the methodological tools of discourse analysis, this thesis explores the characteristics of environmental discourse considered as a specialized type of discourse. As a result of a change of conception of our environment, the trends of thinking, the practices and discourses that are developing, with the aim of contributing to the protection, preservation, or regeneration of the environment have become part of the specialized domain referred to as environmental. This emerging domain and its main components are defined in this thesis.The first part of the thesis presents a global vision of the domain and of its discourse. The central concepts of the environmental movement, environmentalism, ecology and ecologism are analyzed. A definition of the concept of environmental discourse is then offered, starting with the presentation of the content of various authors' work on the object and concluding with the identification of its specificities thanks to tools elaborated in the French school of English for Specific Purposes. The second part of the thesis is devoted to the discourses and practices of organisations in the UK. We present, within this specific cultural context, the main organisations that have a role to play in the environmental domain and describe their principal environmental communication discourses with a particular focus on new genres, specialized terms and recurrent discursive practices. The internal organisation of the domain is also considered with the presentation of a typology of organisations, of the relations they maintain as well as of the role and specificities of environmental experts.The study is completed in a third part by a descriptive analysis of a genre that plays a decisive role in the domain: reports on corporate social responsibility. After having presented the context in which this type of report emerged and its main function, we question the way these reports represent the main actors of the domain and the existence and influence of generic norms in a diachronic perspective.

Le maintien de l’homéostasie passe notamment par la sécrétion d’hormones provenant des cellules neuro-endocrines ou endocrines telles que les cellules chromaffines ou les cellules b pancréatiques. Par exemple, la régulation de la glycémie nécessite l’exocytose de l’insuline depuis les cellules b pancréatiques des îlots de Langerhans. Une famille de protéines membranaires est au cœur de la machinerie de fusion d’une vésicule avec la membrane plasmique. Ce groupe appelé, la famille des protéines SNARE est composé de trois protéines. VAMP2 est localisée à la membrane vésiculaire alors que syntaxine 1A et SNAP25 sont localisées à la membrane plasmique. Syntaxine 1A et VAMP2 ont un domaine transmembranaire alors que SNAP25 est reliée à la membrane par prénylation de résidus cystéine. Cette famille forme le complexe cytosolique SNARE décrit comme essentiel à l’exocytose. La structure et la fonction du complexe cytosolique ont été étudiées en profondeur et ont mené au modèle du « zipper ». Celui-ci décrit un enroulement progressif des domaines cytosoliques SNARE permettant l’apposition des membranes puis la fusion. Le rôle des domaines transmembranaires reste encore peu décrit. Pourtant, leur étude est nécessaire afin d’établir un modèle complet de la fusion membranaire par les protéines SNARE. Nous avons donc mené une étude alliant une analyse structurale dynamique à une analyse biologique pour déterminer l’importance du domaine transmembranaire de VAMP2 dans la sécrétion. L’analyse biologique représente donc le centre de ma thèse. Le système biologique utilisé est basé sur l’extinction de l’expression de la protéine VAMP2 endogène et l’expression concomitante d’une protéine VAMP2 mutée dans son domaine transmembranaire. Deux lignées cellulaires considérées comme des modèles dans l’étude de la sécrétion hormonale et du trafic vésiculaire ont servi de support à notre étude. Par des approches de microscopies (confocal, TIRF) et d’analyses biochimiques, nous avons observé les conséquences fonctionnelles des mutations ponctuelles, établis par mutagénèse dirigée, sur le trafic vésiculaire et sur la capacité des cellules à sécréter.Les mutations induites présentent différents effets cellulaires. Certaines bloquent la sortie de VAMP2 du réseau golgien alors que d’autres ont un effet important sur la sécrétion hormonale et plus précisément sur l’exocytose. Les études structurales ont permis de corréler ces effets avec une diminution de la flexibilité structurale dans le cas de la diminution de l’exocytose, ou avec une restriction à la conformation hélice alpha dans le cas du sorting. Ce projet pluridisciplinaire a pu mettre en avant le rôle biologique du domaine transmembranaire de VAMP2 au cours de l’exocytose probablement soutenue par la dynamique conformationelle unique observée par le versant structural du projet. / The hormonal secretion plays a key role in the maintenance of homeostasis. For example, the maintenance of normoglycaemia requires insulin exocytosis from the pancreatic beta cells. The SNARE membrane family protein has been described as the core machinery of fusion between the vesicle containing hormones and the plasma membrane. This family consists of 3 different membrane proteins that are essential during exocytosis. VAMP2 is localized on the vesicle and Syntaxin 1A - on the plasma membrane. They both are transmembrane protein whereas SNAP25 is linked to the plasma membrane by palmitoylation. The SNAREs appear to be essential as they form the cytosolic SNARE complex to dock the vesicle to the plasma membrane. Even though the role of this cytosolic domain has been studied in depth, much less is known on the role of their transmembrane domain during the fusion. Their study remains necessary to establish a complete model of membrane fusion mediated by the SNARE proteins.Here, we have studied the behavior and the role of the SNARE transmembrane domain during exocytosis. In a multidisciplinary project, we have combined a structural approach with a biological study to evaluate the role of this domain. Using mutagenesis in the transmembrane domain of VAMP2 and a cellular system with a clean background, we have assessed the effect of mutations on the secretion and exocytosis in two different cell lines (INS1E and PC12). The biological system is based on the silencing of endogenous VAMP2 and reconstitution of the expression of VAMP2 wt or mutated in the transmembrane domain. Using biochemistry assay and TIRF microscopy we have shown that mutations in this domain can lead to a missorting of the Golgi apparatus or a reduction of the stimulated secretion and exocytosis. This effect can be correlated to a modification of the structural dynamics of this domain.The obtained results clearly demonstrate the role of the transmembrane domain of VAMP2 during exocytosis probably sustained by its unique structural dynamics observed by physico-chemistry.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2SS / The type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2SS

Les canaux potassiques (Kv) dépendants du voltage sont des protéines transmembranaires qui permettent le flux passif d’ions potassium à travers une membrane plasmique lorsque celle-ci est dépolarisée. Ils sont constitués de quatre domaines périphériques sensibles au voltage et un domaine central, un pore, qui délimite un chemin hydrophile pour le passage d’ions. Les domaines sensibles à la tension (VSD) et le pore sont couplés, ce qui signifie que l’activation des VSD déclenche l’ouverture du pore, et qu’un pore ouvert favorise l’activation des VSD. Le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) est un lipide mineur du feuillet interne de la membrane plasmique. Ce lipide fortement chargé négativement module le fonctionnement de plusieurs canaux ioniques, y compris les membres de la famille Kv. En particulier, l’application de ce lipide à Kv1.2 et Kv7.1, deux canaux homologues, augmente leur courant ionique. Cependant, alors que Kv1.2 est capable de s’ouvrir en l’absence de PIP2, dans le cas de Kv7.1, ce lipide est absolument nécessaire pour l’ouverture du canal. En outre, dans Kv1.2, PIP2 induit une perte de fonction, qui est manifesté par un mouvement retardé des VSD. Jusqu’à présent, les mécanismes sous-jacents à de telles modulations des canaux Kv par PIP2 restent inconnus. Dans ce travail, nous tentons de faire la lumière sur ces mécanismes en utilisant des simulations de dynamique moléculaire (DM) combinées avec une approche expérimentale, entreprise par nos collaborateurs. En utilisant des simulations de DM sans contrainte, nous avons identifié les sites potentiels de liaison du PIP2 au Kv1.2. Dans l’un de ces sites, PIP2 interagit avec le canal de sorte à former des ponts salins dépendants de l’état du canal, soit avec le VSD soit avec le pore. Sur la base de ces résultats, nous proposons un modèle pour rationaliser les données expérimentales connues. En outre, nous avons cherché à évaluer quantitativement la perte de fonction induite par la présence de PIP2 au voisinage du VSD du Kv1.2. En particulier, nous avons calculé l’énergie libre des deux premières transitions le long de l’activation du VSD en présence et en l’absence de ce lipide. Nous avons constaté que PIP2 affecte à la fois la stabilité relative des états du VSD et les barrières d’énergie libre qui les séparent. Enfin, nous avons étudié les interactions entre PIP2 et un autre membre de la famille Kv, le canal Kv7.1 cardiaque. Dans le site de liaison de PIP2 que nous avons identifié pour ce canal, l’interaction entre les résidus positifs de Kv7.1 et le lipide sont dépendants de l’état du VSD, comme dans le cas de Kv1.2. On montre que cette interaction est importante pour le couplage entre les VSD et le pore, couplage qui est par ailleurs affaibli à cause de la répulsion électrostatique entre quelques résidus positifs. Ces résultats et prédictions ont été vérifiés par les données expérimentales obtenues par nos collaborateurs / Voltage-gated potassium (Kv) channels are transmembrane proteins that enable the passive flow of potassium ions across a plasma membrane when the latter is depolarized. They consist of four peripheral voltage sensor domains, responding to the applied voltage, and a central pore domain that encompasses a hydrophilic path for passing ions. The voltage sensors and the pore are coupled, meaning that the activation of the voltage sensors triggers the pore opening, and the open pore promotes the activation of the voltage sensors. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) is a minor lipid of the inner plasma membrane leaflet. This highly negatively charged lipid was shown to modulate the functioning of several ion channels including members of the Kv family. In particular, application of this lipid to Kv1.2 and Kv7.1, two homologous channels, enhances their ionic current. However, while Kv1.2 is able to open without PIP2, in the case of Kv7.1, this lipid is absolutely required for opening. Additionally, in Kv1.2, PIP2 induces a loss of functioning, which is manifested by delayed motions of the voltage sensors. So far, the mechanism underlying the Kv channels modulation by PIP2 remains unknown. In the present manuscript, we attempt to shed light on this mechanism using molecular dynamics (MD) simulations combined with experiments, which was undertaken by our collaborators. Using unconstrained MD simulations, we have identified potential PIP2 binding sites in Kv1.2. In one of these sites, PIP2 interacts with the channel in a state-dependent manner forming salt bridges either with the voltage sensor or with the pore. Based on these findings, we propose a model rationalizing the known experimental data. Further, we aimed to estimate the loss of functioning effect induced by PIP2 on the Kv1.2 voltage sensors. In particular, we have calculated the free energy of the first two transitions along the activation path in the presence and absence of this lipid. We found that PIP2 affects both the relative stability of the voltage sensor states and the free energy barriers separating them. Finally, we studied the interactions between PIP2 and another member of the Kv family, the cardiac channel Kv7.1. In the PIP2 binding site that we have identified for this channel, the interaction between positive residues of Kv7.1 and the lipid was state-dependent, as in the case of Kv1.2. This state-dependent interaction, however, is prominent for coupling between the voltage sensors and the pore, which is otherwise weakened due to electrostatic repulsion of some positive residues. These findings are in a good agreement with the experimental data obtained by our collaborators