Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética que possui uma cápsula polissacarídica robusta e é um dos agentes etiológicos da criptococose. A linhagem R265 de C. gattii foi responsável pelo surto de criptococose na Ilha de Vancouver e há vários estudos indicando sua dispersão e ocupação de novos nichos ecológicos. Fatores de virulência bem caracterizados deste patógeno incluem: a capacidade de sintetizar o pigmento antioxidante melanina, a produção de uma cápsula polissacarídica antifagocíticas e a capacidade de sobreviver e proliferar a 37°C. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi identificar proteínas envolvidas na resposta da linhagem R265 de C. gattii à variação de temperatura experimentada quando o fungo deixa o ambiente para sobreviver no hospedeiro, usando análise in vitro e proteômica comparativa. Nossos dados demonstram que as proteínas com expressão aumentada a 25°C atuam principalmente em processos metabólicos de proteínas, carboidratos, lípidios, ácidos orgânicos e aminoácidos e que as proteínas com expressão aumentada a 37°C, em sua maior parte, participam de processos que incluem fosforilação, metilação, processos catabólicos de corpos cetônicos, GTP e ATP e processos metabólicos de nucleosidios. A diferença mais notável entre as condições testadas é a predominância, no desenvolvimento de C. gattii a 25°C, de proteínas envolvidas em processos de oxirredução e a presença de um número considerável de proteínas envolvidas na resposta ao stress e em processos catabólicos no desenvolvimento a 37°C. Em suma, o presente estudo é a primeira análise proteômica a fornecer informação sobre proteínas reguladas pela variação de temperatura e a primeira descrição da resposta da linhagem hipervirulenta R265 de C. gattii à esta condição. As proteínas identificadas podem ser alvos para novos estudos na identificação de proteínas-chave para o desenvolvimento do fungo a 37°C e para a pesquisa de biomarcadores que podem contribuir para o tratamento e prevenção da criptococose causada por este patógeno. / Cryptococcus gattii is a basidiomycetous yeast which has a robust polysaccharide capsule and is one of the etiological agents of cryptococcosis. The R265 strain of C. gattii was responsible for the Vancouver Island outbreak and there are various studies including their dispersal and occupation of new ecological niches. Well-characterized virulence factors of this pathogen include: the ability to synthesize the antioxidant pigment melanin; the production of an antiphagocytic polysaccharide capsule; and the ability to survive and proliferate at 37°C. In this sense, the objective of this study was identified proteins involved in the response of C. gattii strain R265 to the temperature variation experimented when the fungi leaves the environment to survive in the host, using in vitro analysis and comparative proteomics. Our data demonstrated that the proteins up-regulated at 25°C act mainly in protein, carbohydrate, lipid, organic acid and amino acid metabolic processes and proteins up-regulated at 37°C participate mostly in processes that include phosphorylation, methylation, ketone body, GTP and ATP catabolic process and nucleoside metabolic process. The most striking difference between the conditions tested is the prevalence of proteins involved in oxidation-reduction in C. gattii growth at 25°C and the presence of a relevant number of proteins involved in stress response and catabolic process in C. gattii growth at 37°C. In brief, this study is the first proteomic analysis to provided information about proteins regulated by the infection temperature and the first description of the response of C. gattii high virulent strain R265 to this condition. The proteins identified could be targets to further studies for the identification of key proteins for the development at 37°C and to the search for biomarkers that can contribute to the treatment and prevention of cryptococcosis caused by this pathogen.

A inoculação de rizóbios em espécies leguminosas já é bastante conhecida e levou o Brasil a um avanço na produção de soja. Para garantir a qualidade desses produtos inoculantes é necessário o desenvolvimento de metodologias específicas. A detecção das estirpes constantes na embalagem no produto comercial e em solo e planta inoculada é uma forma de fiscalizar a qualidade do produto. Para tanto os objetivos deste trabalho foram detectar a presença das estirpes de bradirrizóbios recomendadas para a cultura da soja SEMIA 5079 e 5080 (Bradyrizobium japonicum) e SEMIA 587, 5019 (Bradyrizobium elkanii), que devem estar presentes nas formulações de inoculante comerciais, usando-se a técnica de REP- PCR. Detectar a presença destas estirpes em nódulos de plantas de soja inoculadas e em solo de área cultivada. Foi instalado um experimento com soja em vasos, na casa de vegetação. A soja foi inoculada com as estirpes de Bradyrhizobium e com inoculantes comerciais. Os nódulos foram utilizados para a extração de DNA. Também foi realizada extração de DNA de amostras de solo cultivado com soja e de nódulos de soja coletados do campo e de estirpes puras e produto inoculante. As extrações foram realizadas com os Kits: Wizard DNA Purification® (Promega corp., Madison, USA) e Power Soil. Após foi realizada a amplificação do DNA genômico utilizando-se a técnica de REP - PCR com o primer iniciador BOX A1 e com o primer ERIC 1 e ERIC2. O perfil de bandas da amplificação do DNA genômico da mistura de estirpes pela PCR com os oligonucleotideos iniciadores ERIC e BOX A possibilitou a diferenciação de produtos contendo misturas de estirpes diferentes. Nas condições deste trabalho, a técnica de amplificação pela PCR com BOXA1 ou ERIC do DNA de nódulos de plantas inoculadas não se mostra adequada para a identificação das estirpes de rizóbios que induziram a formação destes nódulos em plantas de soja cultivada em casa de vegetação.Não ocorreu a amplificação do DNA extraído de amostras de solo cultivado com soja pela reação em cadeia da polimerase com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A e ERIC. A amplificação pela PCR com BOXA1 do DNA extraído de nódulos de plantas cultivadas a campo apresenta baixa similaridade com os obtidos das amostras de produtos inoculantes comerciais utilizados e não permite a identificação da mistura de estirpes que foram inoculadas nas plantas. / Inoculation of rhizobia in legume species is very well known and led Brazil to advance in soybean production. To ensure the quality of these inoculant products is necessary to develop specific methodologies. The detection of strains contained in packaging of the commercial product and in soil and plant inoculated is a way to monitor the quality of the product. Therefore the objectives of this study were to detect the presence of “bradirrizóbios” strains recommended for soybean SEMIA 5079 and 5080 (Bradyrizobium japonicum) and SEMIA 587, 5019 (Bradyrizobium elkanii) that must be present in the formulations of commercial inoculant, by using the technique of REP-PCR. To detect the presence of these strains in inoculated nodules of soybean plants into soil and cultivated area, an experiment was set up with soybeans in pots in a greenhouse. Soybeans were inoculated with the strains of Bradyrhizobium and commercial inoculants. The nodules were used for DNA extraction. Additionally it was carried out DNA extraction from soil cultivated with soybeans and soybean nodules collected from the field and pure strains and inoculant product. The extractions were performed with the following kits: Wizard DNA Purification® (Promega corp., Madison, USA) and Power Soil. Afterwards was performed the amplification of the genomic DNA using the technique of REP - PCR primer with the starting primer A1 and with the primer ERIC1 and ERIC2. The profile of the bands’ amplification of the genomic DNA from the mixture of strains by PCR with primer ERIC and BOX A allowed to differentiate products containing mixtures of different strains. In this study conditions, the technique of PCR amplification with the BOXA 1 or ERIC of DNA from nodules of inoculated plants, is inadequate for the identification of strains of rhizobia, which induced the formation of nodules on soybean plants grown in greenhouse. It was not observed amplification of DNA extracted from soil samples cultivated with soybeans by PCR with primer BOX A and ERIC. Amplification by PCR with BOXA 1 of the DNA extracted from plants’ nodules grown in a field has low similarity with the product samples obtained from commercial inoculants used and it does not allow the identification of the mixture of strains that were inoculated in the plants.

A incidência de infecções microbianas relacionadas ao uso de cateteres vem aumentando. Uma característica importante dos microrganismos envolvidos é a capacidade de aderência à superfícies com conseguinte formação de colônia, produção de substâncias extracelulares, e subsequente formação de uma matriz compacta, amorfa, de múltiplas camadas, o biofilme. A atividade de bacteriocinas produzidas por Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sobre microrganismos isolados de dispositivos intravasculares foi avaliada. As bacteriocinas Pep5 e Epidermina inibiram um maior número de isolados clínicos quando avaliadas in vitro por antagonismo direto, apresentando halos de inibição de 20 a 36 mm. A adição de Pep5 e Epidermina durante o crescimento de S. epidermidis e Corynebacterium sp resultou na redução do número de células viáveis. O efeito das bacteriocinas sobre a adesão bacteriana à cateteres de silicone foi avaliado através de três protocolos onde variou-se o momento de adição da bacteriocina: (A) simultaneamente, (B) previamente, e (C) posteriormente ao inóculo microbiano. As bacteriocinas Pep5 e Epidermina reduziram significativamente o número de células de S. epidermidis e Corynebacterium sp. aderidas aos cateteres após 6 h e 12 h de incubação. Não foram observadas diferenças importantes entre os três protocolos A, B, ou C. O efeito de Pep5 sobre Corynebacterium sp. foi verificado por microscopia eletrônica de varredura, podendo ser observadas áreas com resíduos celulares na superfície do cateter. / The in cidence of catheter-related microbial infections has been increasing. One important characteristic of related microorganisms is the adhesion to surfaces with colony formation, production of extracellular substances, and subsequent development of a compact, amorphous, multiple layer matrix, the biofilm. The activity of bacteriocins produced by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis against microorganisms isolated from intravascular catheters was studied. The bacteriocins Pep5 and Epidermin inhibited a higher number of clinical isolates when evaluated by direct antagonism, showing inhibition zones of 20 to 36 mm. The addition of Pep5 and Epidermin during growth of S. epidermidis and Corynebacterium sp. resulted in a decrease of viable cell counts. The effect of bacteriocins on bacterial adhesion to silicon catheter was evaluated through three protocols differing in the time of bacteriocin addition: (A) simultaneously, (B) before, and (C) after the microbial inoculum. The bacteriocins Pep5 and Epidermin caused a significant reduction of the number of adhered cells of S. epidermidis and Corynebacterium sp. after 6 h and 12 h. No important differences among the protocols A, B or C were observed. The effe tions ct of Pep5 on Corynebacterium sp. was studied by scanning electron microscopy. Sec with cellular residues were observed on the catheter surface.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-14T12:14:28Z No. of bitstreams: 1 2013_LoianeMayraJacoSouza.pdf: 949233 bytes, checksum: 3bb2b57e28e62e2465daf45a9bc7a6cf (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-15T11:25:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LoianeMayraJacoSouza.pdf: 949233 bytes, checksum: 3bb2b57e28e62e2465daf45a9bc7a6cf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-15T11:25:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LoianeMayraJacoSouza.pdf: 949233 bytes, checksum: 3bb2b57e28e62e2465daf45a9bc7a6cf (MD5) / O objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicabilidade do sistema Petrifilm™ na enumeração de micro-organismos indicadores da qualidade higiênica e sanitária (aeróbios mesófilos, coliformes totais e bactérias ácido-láticas) e patogênicos (Staphylococcus aureus e Escherichia coli) no leite de origem ovina. As amostras de leite de ovelha (n=30) foram semeadas simultaneamente, de acordo com as TMmetodologias convencionais (ICMSF; AOAC) e em sistema Petrifilm . Os resultados foram comparados utilizando os testes de McNemar e Regressão Linear. Os resultados demosntraram boa correlação entre as metodologias convencionais e o sistema Petrifilm™. Ainda, o Petrifim™ STX para contagem de S. aureus apresentou maior capacidade de recuperação de bactérias quando comparado com a metodologia convencional. Com base nos resultados obtidos e tendo em vista a maior facilidade nos procedimentos e rapidez nos resultados, o sistema Petrifim™ pode ser utilizado para as análises microbiológicas em leite de ovelha. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The objective of this study was to evaluate the applicability of the system Petrifilm™ in the enumeration of microorganisms indicators of quality health and hygiene (mesophilic aerobes, coliforms and lactic acid bacteria) and pathogens (Staphylococcus aureus and Escherichia coli) in milk source sheep. Samples of milk from sheep (n = 30) were sown simultaneously, according to conventional methodologies (ICMSF; AOAC) and PetrifilmTM system. The results were compared using McNemar's test and linear regression. The results demosntrated good correlation between conventional methodologies and Petrifilm™ system. Further, the Petrifim™ STX for counting S. aureus had higher resilience of bacteria compared with the conventional methodology. Based on the results obtained and in view of the ease and rapidity procedures results, Petrifim ™ System may be used for microbiological testing in sheep milk.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-18T14:26:43Z No. of bitstreams: 1 2013_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 2410520 bytes, checksum: 221bc54b5d81ce06a0e95ba2fa2d105d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-18T15:21:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 2410520 bytes, checksum: 221bc54b5d81ce06a0e95ba2fa2d105d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-18T15:21:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 2410520 bytes, checksum: 221bc54b5d81ce06a0e95ba2fa2d105d (MD5) / O domínio Archaea possui características em comum com os domínios Bacteria e Eukarya, e ao mesmo tempo apresenta características próprias. Até o momento, são raros os estudos sobre a filogenia e diversidade de archaeas de ambientes naturais do Brasil e, por esta razão, este trabalho tem como objetivo avaliar a diversidade de Archaea em sedimentos de lagoas do cerrado em diferentes estações, por meio da caracterização de genes de rRNA 16S. Amostras de sedimentos lacustres, coletadas em diferentes lagoas do Parque Nacional das Sempre Vivas, foram submetidas à extração de DNA total e o DNA foi utilizado em experimentos de PCR empregando os pares de iniciadores 340f/1000r ou 21f/958r, específicos para o domínio Archaea. Os fragmentos amplificados foram clonados em um vetor plasmidial e transformados em E. coli. O DNA plasmidial de clones recombinantes foi extraído, quantificado e submetido ao sequenciamento automático. Em uma das amostras, proveniente da Lagoa Rio Preto Alto (LRPA), observamos um grande predomínio de membros do filo Euryarchaeota, especialmente metanogênicos. Nos demais sedimentos, coletados na bacia Baixo Inhancica (RIB4 e RIB5) foi observado um predomínio de sequências do filo Thaumarchaeota sobre os filos Euryarchaeota e Crenarchaeota na estação seca, mas ainda foi possível observar sequências do filo Euryarchaeota. Na estação de transição seca/chuvosa, não foram encontradas sequências do filo Euryarchaeota e houve quase exclusivamente sequências do filo Thaumarchaeota. As estimativas de alfa-diversidade mostraram uma maior riqueza da comunidade de Archaea nos sedimentos coletados na estação seca e as curvas de rarefação indicaram que a amostragem dos ambientes foi adequada. As amostras de estações diferentes apresentaram diferenças significativas pelas técnicas de beta-diversidade ∫-Libshuff e gráfico de Análise de Componentes Principais (PCA). _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Archaea domain has characteristics in common with the Bacteria and Eukarya domains, while presenting unique traits. Currently there are few studies on the phylogeny and diversity of Archaea in Brazilian environments; therefore, this study’s objective is to estimate the diversity of Archaea communities in lake sediments of the Brazilian Savannah, Cerrado, in different seasons by rRNA 16S analysis. Lake sediment samples, obtained from different lakes in the park “Parque Nacional das Sempre Vivas”, were submitted to DNA extraction, which was used in PCR assays using archaea-specific primers 340f/1000r or 21f/958r. The amplified fragments were cloned into E. coli. Plasmid DNA was extracted, quantified and submitted to standard sequencing procedures. In one of the samples, collected in the lake “Lagoa Rio Preto Alto” (LRPA), we were able to observe a high number of sequences affiliated to Euryarchaeota, especially methanogens. In the sediments collected in the Baixo Inhancica bay (RIB4 and RIB5), in the dry season members of the Thaumarchaeota phylum predominated over the other phyla. It was still possible to detect members of the Euryarchaeota phylum though. In the sediments collected in the transition period between the dry and rainy seasons we were not able to detect sequences affiliated to Euryarchaeota and there were almost exclusively sequences of the Thaumarchaeota phylum. The α-diversity estimates showed that the communities of Archaea in sediments collected in the dry season had higher richness and the non-parametric estimates showed that both the environments have been well sampled. There is a significant difference between the sediment samples collected in different seasons, shown by the statistical test ∫-Libshuff and by the Principal Component Analysis graphic (PCA).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-10-03T13:53:10Z No. of bitstreams: 1 2006_Cerise de Castro Campos.pdf: 737239 bytes, checksum: 17cb9b76862def88bcc6652e75dbf048 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-12T00:15:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Cerise de Castro Campos.pdf: 737239 bytes, checksum: 17cb9b76862def88bcc6652e75dbf048 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-12T00:15:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Cerise de Castro Campos.pdf: 737239 bytes, checksum: 17cb9b76862def88bcc6652e75dbf048 (MD5) Previous issue date: 2006 / O objetivo deste estudo foi investigar a colonização e a transmissão vertical de EGM em 16 pares mãe e filho com Síndrome de Down (SD) com idade até 12 anos. Os isolados característicos destes microrganismos foram identificados fenotipicamente e as colônias analisadas através de bacteriocinotipagem. Três pares mãe-filho albergavam EGM com o mesmo perfil de produção de bacteriocinas (Pares 1, 6 e 14). O DNA cromossomal foi digerido com enzima Hae III e analisado (Restriction Fragment Length Polymorphism analysis - RFLP) em gel de agarose pela eletroforese. Os resultados mostraram que nos três pares que compartilhavam o mesmo bacteriocinotipo de Streptococcus mutans, um par tinha os genótipos idênticos (Par 6) e em outro, similares (Par 14). Não foi possível extração de DNA do isolado da criança do Par 1. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this study was to investigate the distribution of mutans streptococci and vertical transmission in some families with a child with Down Syndrome (DS). Isolates of mutans streptococci was performed in 16 mother-infant pairs. After growth, representative colonies were comparated using bacteriocin typing and chromosomal DNA by Restriction Fragment Length Polymorphism analysis (RFLP). The DNA was digested with restriction enzyme Hae III, electrophoresed on agarose gels and the resulting patterns were compared. Analysis showed that in 3 families the mothers shared same bacteriocinotypes with their children; one harbored identical genotypes (Pair 6) and the other, similar genotypes (Pair 14).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-12-07T19:17:51Z No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2009-12-08T02:11:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-08T02:11:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) Previous issue date: 2008 / A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para a expressão de várias proteínas heterólogas sendo que diversos vetores já foram desenvolvidos para este sistema. Os principais vetores de expressão de P. pastoris são baseados no promotor do gene AOX1 que codifica a enzima álcool oxidase 1. Alguns estudos têm sido realizados para o uso de promotores alternativos uma vez que o sistema AOX1 apresenta algumas desvantagens. Em nosso laboratório foi isolado e caracterizado o promotor do gene PGK1 de P. pastoris (PPGK1), um promotor forte e constitutivo, que representa uma alternativa promissora para a construção de novos vetores. O objetivo deste estudo foi determinar a região promotora mínima do PPGK1 por meio de deleções controladas utilizando o gene da α-amilase de Bacillus subtilis como gene repórter. Quatro deleções foram obtidas sendo que a menor (PPGKΔ3), com ~400 pb, ainda manteve atividade promotora. Foi demonstrado que esta seqüência é capaz de dirigir a integração de um vetor no genoma de P. pastoris e 51% dos clones transformantes tiveram mais de uma cópia integrada. O uso deste promotor propiciou a expressão heteróloga de α-amilase em altos níveis (250 U.mL-1). Também foram construídos vetores para expressão intracelular baseados no promotor PGK que, todavia, ainda necessitam ser aprimorados para uso em P. pastoris. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been successfully used for the expression of heterologous proteins and several different expression vectors have been developed for this system. The main expression vectors for P. pastoris are based on the alcohol oxidase 1 gene promoter, AOX1. Some studies have been carried out aiming at the use of alternative promoters once the AOX1 system shows some disadvantages. Our laboratory has isolated and characterized the P. pastoris promoter from the PGK1 gene (PPGK1), a strong and constitutive promoter, which represents a promising alternative for the construction of new vectors. The aim of this study was to determine the minimal promoter sequences from PPGK1 through controlled deletions using the α-amylase gene from Bacillus subtilis as a reporter gene. Four deletions were obtained and the smallest (PPGK Δ3) with ~ 400 bp, still maintained promoter activity. We have demonstrated that this sequence was able to direct vector integration into the P. pastoris genome and 51% of the transformants showed more than one copy integrated. The use of this promoter allowed high level expression of α-amylase (250 UmL-1). Also, vectors for intracellular expression were based on the PGK promoter were also constructed which however still need to be improved for use in P. pastoris.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-02-22T17:48:04Z No. of bitstreams: 1 2010_Tiago BenolielRocha.pdf: 1639084 bytes, checksum: b3f6fa5d5ae64ccc7cc41ae94a8b881b (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-11T01:04:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_Tiago BenolielRocha.pdf: 1639084 bytes, checksum: b3f6fa5d5ae64ccc7cc41ae94a8b881b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-11T01:04:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_Tiago BenolielRocha.pdf: 1639084 bytes, checksum: b3f6fa5d5ae64ccc7cc41ae94a8b881b (MD5) / Fontes hidrotermais possuem grande diversidade de microrganismos termo resistentes, que são importantes para as indústrias de conversão de biomassa vegetal. A lignocelulose é o componente mais abundante da biomassa, mas é subutilizado pela indisponibilidade de enzimas de baixo custo que realizem a degradação com eficiência. Neste trabalho, treze bactérias foram isoladas da água de duas fontes termais do Parque Nacional de Caldas Novas, GO. Uma foi selecionada para ser identificada e caracterizada enzimaticamente por suportar a maior temperatura de crescimento e deter maior atividade em placa contra carboximetilcelulose (CMC), celulose ultracritalina (UCel) e xilana. Após análises das sequências gênicas do RNA ribossomal 16S e da subunidade β da RNA polimerase, a bactéria selecionada foi classificada no grupo do Bacillus cereus, mas não foi possível a diferenciação entre o B. cereus e o B. thuringinensis, sendo denominada como Bacillus sp. linhagem FT9. Após a classificação, o Bacillus sp. FT9 foi cultivado em CMC, UCel, xilana oat spelts (XOS), xilana birchwood (XBW) e glicose. Para os substratos complexos, a maior taxa de crescimento específico e os mais elevados rendimentos de indução foram encontrados nas culturas induzidas com XOS, sendo observada atividade de xilanase no sobrenadante dessa cultura igual a 0,537 UI/mL a 50 °C e pH 6,0. No sobrenadante da cultura induzida em CMC, foi encontrada atividade de CMCase e FTPase igual a 0,231 UI/mL e 0,111 UI/mL a 70 °C e pH 7,0, respectivamente. Esse é o primeiro relato de atividade xilanolítica e o segundo de atividade celulolítica para linhagens relacionadas filogeneticamente com o grupo do B. cereus. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Microorganisms from hot springs play an important role at the biomass conversion industries. Lignocellulose is the major component of vegetal biomass, however, it is underused because of the unavailability of cost-effective enzymes that perform efficiently its degradation. In this work, thirteen bacteria were isolated from two hot springs located at Caldas Novas National Park, Brazil. One of them was selected for identification and enzymatic description due to the highest grown temperature and the greatest cellulase and xylanase activity that it shown at preliminary assays. When its rDNA 16S and RNA polymerase’s β subunit sequences were analyzed, the chosen strain presented close phylogeny to Bacillus cereus group, although species classification has not been possible through these techniques, it was named Bacillus sp. strain FT9. Then, it was grown on carboxymetylcellulose (CMC), ultracrystalline cellulose (UCel), xylan oat spelts, xylan birchwood and glucose. Considering the complex substrates, the highest rates of specific grown and yields were found at fermentation on XOS, which had 0,537 UI/mL of xylanase activity at 50 °C and pH 6,0. On CMC grown cultures, 0,231 UI/mL of CMCase activity and 0,111 UI/mL of FTPase were detected, both at 70 °C and pH 7,0. That is the first work describing xylanase activity and the second one to describe cellulase activity at Bacillus cereus close related species.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T22:05:09Z No. of bitstreams: 1 2009_CamilaMirandaCosta.pdf: 4198124 bytes, checksum: d3b4eb30602d04ae4793e2f9c4245f48 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T22:06:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CamilaMirandaCosta.pdf: 4198124 bytes, checksum: d3b4eb30602d04ae4793e2f9c4245f48 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T22:06:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CamilaMirandaCosta.pdf: 4198124 bytes, checksum: d3b4eb30602d04ae4793e2f9c4245f48 (MD5) / Triatomíneos vetores da doença de Chagas são organismos hematófagos durante todas as fases de seu desenvolvimento. O sucesso de seu repasto se deve, em grande parte, ao conteúdo de suas glândulas salivares. Especialmente o conjunto de proteínas secretadas lhes proporciona ter acesso ao seu alimento contrapondo mecanismos hemostáticos do organismo alvo, como a agregação plaquetária, coagulação sanguínea e vasoconstrição, como também processos inflamatórios. Tendo em vista a relevância desses componentes no controle da transmissão do Trypanosoma cruzi, as salivas de espécies de triatomíneos importantes na epidemiologia dessa enfermidade no Brasil, Panstrongylus megistus no Cerrado e Mata Atlântica, e Rhodnius brethesi e Rhodnius robustus na Amazônia, foram coletadas e submetidas a estudos de caracterização proteômica. Inicialmente foram otimizadas as condições experimentais de separação por eletroforese bidimensional (2DE) em faixas amplas de pH. O número de spots nas salivas analisadas variou entre 129 e 320. As análises comparativas dos mapas bidimensionais de cada saliva revelam perfis de expressão diferentes entre gêneros. A identificação de spots proteicos obtidos a partir desses mapas foi feita por peptide mass fingerprinting, fragmentação de peptídeos e sequenciamento de novo utilizando espectrômetros de massas do tipo MALDI-TOF/TOF. Perfis predominantemente anti-hemostáticos foram observados nas salivas do gênero Rhodnius, mostrando principalmente proteínas com potencial anti-agregação plaquetária como as lipocalinas. A análise proteômica da saliva de Panstrongylus megistus está em andamento, e os primeiros resultados sugerem a presença de proteínas potencialmente anti-agregadoras plaquetária. Os proteomas salivares desses vetores triatomíneos mostraram-se ricos em inibidores da agregação plaquetária que promovem o repasto sanguíneo desses insetos. Análises posteriores destes e novos spots poderão proporcionar melhor compreensão da interação vetor-hospedeiro, além de possibilitar a descoberta de novas moléculas de importância farmacológica para uso terapêutico contra hemopatias. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Triatomine bugs acting as vectors of Chagas‟ disease are haematophagous organisms in all of its evolvement phases. Their feeding success is greatly related to their salivary glands content. The presence of a pool of specific proteins allows this insect to access its food by counteracting host haemostatic mechanisms, such as platelet aggregation, clotting and vasoconstriction, as well as host inflammatory reactions. Since these components are relevant in controlling the Trypanosoma cruzi transmission process, the salivas of epidemiologically significant triatomine bugs in Brazil, Panstrongylus megistus at Cerrado and Atlantic Rainforest Biomas, and Rhodnius brethesi and Rhodnius robustus at Amazon region, were harvested and submitted to proteomic research. Initially, the experimental conditions for wide-pH-ranged separation by two-dimensional electrophoresis (2DE) separation at wide pH range were optimized. The average number of spots of each salivary profile varied from 129 to 320. Comparative analysis of all two-dimensional maps revealed divergence among genera. The identification of the obtained protein spots from such maps was made by peptide mass fingerprinting, peptide fragmentation and de novo sequencing using MALDI-TOF/TOF mass spectrometers. The data revealed largely anti-haemostatic profiles for Rhodnius salivas, which presented mainly lipocalins, potential anti-platelet aggregation proteins. Proteomic analysis of Panstrongylus megistus saliva is still in progress and the first results imply the presence of potentially anti-platelet aggregation proteins too. Salivary proteomes of these triatominae vectors appear to be rich in platelet aggregation inhibitors which promote the blood feeding of these insects. Future analysis of these and other salivary spots will permit better understanding of vector-host interaction and lead to the possibility of new findings on pharmacologically active molecules useful for haemopathy treatments.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-27T13:27:34Z No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-04-29T14:53:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-29T14:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / O silenciamento gênico, ou RNA de interferência (RNAi), atua como um mecanismo de defesa contra infecções virais em organismos eucarióticos. Ao longo da evolução, os vírus adquiriram proteínas específicas com a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em diferentes pontos do processo. Como por exemplo, as proteínas AC2 de begomovírus, NS1 do vírus da gripe (Influenza A) e NSs de um tospovírus (Tomato spotted wilt virus - TSWV). Neste estudo, pretendeu-se induzir mecanismos de supressão de silenciamento gênico através da expressão heteróloga de AC2, NS1 e NSs por baculovírus AcMNPV – Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, a fim de analisar o efeito na replicação viral em diferentes células de inseto. Assim, no primeiro capítulo, foi feita uma revisão sobre o silenciamento gênico, a ação de proteínas virais supressoras de RNAi e o uso potencial de baculovírus recombinantes como agentes bioinseticidas melhorados. O segundo capítulo descreve a clonagem dos genes AC2, NS1 e NSs, a construção dos baculovírus recombinantes (vAcAC2, vAcNS1 e vAcNSs) e os ensaios preliminares de infecção em célula e em larvas de inseto. Nesses ensaios, o vAcNSs (contendo o gene NSs) foi o recombinante com maior influência na replicação do baculovírus selvagem AcMNPV. Por sua vez, o terceiro capítulo relata a ação da proteína supressora de silenciamento NSs de TSWV, expressa pelo baculovírus vAcNSs, em três linhagens hospedeiras: uma permissiva, derivada de Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4); outra semipermissiva, derivada de Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286); e, uma linhagem não-permissiva, derivada de Bombyx mori (BM-5). Os resultados mostraram que vAcNSs, em células semipermissivas, obteve maior eficiência na replicação quando comparado ao selvagem, pois produziu mais vírus extracelulares; em uma linhagem celular não-permissiva, causou efeito citopático, enquanto a infecção com o tipo selvagem AcMNPV não provocou nenhuma alteração morfológica; aumentou a produção de poliedros do baculovírus tipo selvagem em todas as linhagens de células testadas; aumentou fortemente a expressão da proteína fluorescente verde (EGFP) nas células semipermissivas e em hemócitos de A. gemmatalis quando co-infectado com um AcMNPV recombinante contendo o gene egfp. A análise de microscopia confocal revelou que a NSs acumulou em abundância no citoplasma de células permissivas e semipermissivas. Em contraste, a NSs foi detectada no núcleo da célula não-permissiva. A ausência de moléculas curtas de RNA (siRNA) de transcritos de egfp em linhagens semipermissivas e permissivas indica atividade de supressão do silenciamento gênico. Por outro lado, vAcNSs não suprimiu o RNAi na linhagem celular nãopermissiva. Por fim, o quarto capítulo investiga a ação bioinseticida do baculovírus vAcNSs em larvas de Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis - um hospedeiro permissivo e outro semi-permissivo, respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a DL50 do vAcNSs para S. frugiperda e A. gemmatalis, quando comparada à DL50 observada para o tipo selvagem AcMNPV. Entretanto, o TL50 foi significativamente diferente, com valores menores para vAcNSs em S. frugiperda [5,62 dias com 1 p.f.u. e 4,82 dias com 105 p.f.u.] e em A. gemmatalis [7,46 dias com 1 p.f.u. e 3,2 dias com 105 p.f.u.] quando em comparação com o TL50 do AcMNPV em S. frugiperda [8,5 dias com 1 p.f.u. e 7,52 dias com 105 p.f.u.] e em A. gemmatalis [20,11 dias com 1 p.f.u. e 7,34 dias com 105 p.f.u.]. Estes resultados corroboram os dados observados in vitro, indicando que a proteína NSs de TSWV aumenta a replicação do baculovírus e pode contribuir para gerar bioinseticidas mais eficientes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Gene silencing, or RNA interference (RNAi), works as a eukaryotic defense mechanism against viral infections. During evolutionary time viruses acquired specific proteins, which are able to halt the silencing process in different steps of its biochemical pathway e.g. the AC2 protein from Begomovirus, the NS1 protein from influenza (Influenza A) and the NSs protein from Tomato spotted wilt virus (TSWV). In this study we sought generation and evaluation of the gene-silencing suppression effect of three different genes, AC2 from begomovirus, NS1 from Influenza A and NSs from TSWV, via heterologous expression by recombinant Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV, genus Alphabaculovirus, family Baculoviridae) in different insect cell lines. In the first chapter, a review concerning gene silencing, suppression of gene silencing by viral proteins and the potential use of recombinant baculovirus as bio-insecticidal agents suitable for biological control is presented. The second chapter describes the cloning strategies designed for the construction of recombinant baculoviruses carrying the AC2, NS1 and NSs genes (vAcAC2, vAcNS1 and vAcNSs, respectively) as well as the results of preliminary insect cell infection assays. In these preliminary assays, vAcNSs had more influence on wild type AcMNPV replication than vAcAC2 and vAcNS1. The third chapter shows the effect of the protein NSs from TSWV on virus replication in different host insect cell lines: one permissive, Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4); other semi-permissive, Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286); and a non-permissive cell line, Bombyx mori (BM-5). Results showed that infection of the semi-permissive cell line by vAcNSs was more efficient than infection by wild type AcMNPV, since production of budded virus was higher. In the non-permissive cell line, vAcNSs was able to produce cytopathic effects whereas no morphological alteration was found when wild type AcMNPV was inoculated. When vAcNSs and wild type AcMNPV were co-inoculated, production of polyhedra was enhanced despite the insect cell line used. Co-infection of vAcNSs and a recombinant AcMNPV carrying the egfp gene was also evaluated. In the semi-permissive cell line and in A. gemmatalis hemocytes (permissive cell line) co-infection greatly increased enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression. Northern blotting assays showed absence of small interfering RNA (siRNA) molecules associated to egfp transcripts in the permissive and semi-permissive cell lines, which indicates suppression of gene silencing activity by the NSs protein. On the other hand, vAcNSs was not able to suppress the siRNA production in the non-permissive cell line. Confocal microscopy analysis showed that the NSs protein accumulated abundantly in the cytoplasm of permissive and semipermissive infected cells. In contrast, high amounts of NSs were detected in the nuclei of nonpermissive cells. Finally, chapter four presents the study of the bio-insecticidal activity of vAcNSs on Spodoptera frugiperda and Anticarsia gemmatalis larvae, a permissive and semipermissive host, respectively. The vAcNSs LD50 for S. frugiperda and A. gemmatalis was not statistically different from wild-type AcMNPV. However, the LT50 values were significantly smaller for vAcNSs in S. frugiperda [5.62 days with 1 p.f.u. and 4.82 days with 105 p.f.u.] and A. gemmatalis [7.46 days with 1 p.f.u. and 3.20 days with 105 p.f.u.) when compared to the LT50 for AcMNPV in S. frugiperda [8.5 days with 1 p.f.u. and 7.52 days with 105 p.f.u.] and A. gemmatalis [20.11 days with 1 p.f.u. and 7.34 days with 105 p.f.u.]. These in vivo results are in accordance with the data observed in vitro indicating that the protein NSs from TSWV could efficiently improve baculovirus replication and be used to generate more effective bioinsecticides.