Orientador: Angelo Berchieri Junior / Coorientador: Oliveiro Caetano de Freitas / Banca: Ana Maria Iba Kanashiro / Banca: Rafael Antonio Casarin Penha Filho / Resumo: Salmonella Enteritidis (SE) causa o paratifo aviário em aves e frequentemente está relacionada aos surtos de infecção alimentar em seres humanos. A contribuição do flagelo versus motilidade na interação patógenohospedeiro requer estudos mais aprofundados. Para melhor entendimento da contribuição individual desses fatores de virulência em aves, pintinhos de um dia de vida foram desafiados oralmente com estirpe selvagem de SE, uma mutante não-móvel mas flagelada (SE ΔmotB) e outra mutante aflagelada (SE ΔfliC). Excreção fecal e colonização de fígado, baço e conteúdo cecal pelas estirpes de SE foram avaliadas. Além disso, também foi realizada a avaliação das alterações macroscópicas e microscópicas. Nos estágios iniciais da infecção, ambos mutantes mostraram menor capacidade de colonizar o ceco, além de menor recuperação no baço por SE ΔfliC comparando a estirpe selvagem SE. Após 7 dpi não havia diferenças na contagem das três estirpes em conteúdo cecal, fígado e baço. Análises histopatológicas demonstraram que estirpes flageladas (SE ΔmotB e SE) induziram reatividade linfóide em inglúvio, ceco, íleo e fígado. No entanto, nos estágios iniciais da infecção a estirpe SE ΔfliC não estimulou a reatividade linfóide em lâmina própria de ceco e íleo mas induziu discretos focos necróticos em fígado. Portanto, neste estudo a presença de estrutura flagelar e motilidade parece exercer um papel nos estágios iniciais da colonização intestinal e infecção sistêmica por SE nas aves. / Abstract: Salmonella Enteritidis (SE) causes fowl paratyphoid in poultry often related to outbreaks of food-borne diseases in humans. The contribution of flagella and motility in host pathogen interaction require further investigation. To better understand the individual contribution of these virulence factors in poultry, one day old chickens were challenged orally with wildtype strain of SE, a nonmotile but fully flagellated (SE ΔmotB) and aflagellated mutant (SE ΔfliC). Faecal excretion and colonization of liver, spleen and cecal contents by the SE strains were assessed. Additionally, the assessment of gross and microscopic alterations was also performed. At the early stages of infection both mutants showed lower capacity to colonize the ceca, besides the lower recovering in spleen of SE ΔfliC comparing to the wild type of SE. After 7 dpi there were no differences among the counts of the three strains in ceca, liver and spleen. Histopathological analyses demonstrated that flagellated strains (wild type SE and SE ΔmotB) induced lymphoid reactivity in crop, ceca, ileum and liver. On the other hand, in the early stages of infection, SE ΔfliC strain did not stimulate lymphoid reactivity in lamina propria of ceca and ileum but induced discrete necrotic foci in liver. Thus in the present study the flagellar structure and motility seemed to play a role at the early stages of the intestinal colonization and systemic infection by SE in the chicken. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-23Bitstream added on 2014-06-13T20:20:49Z : No. of bitstreams: 1 000735464.pdf: 1949620 bytes, checksum: 606a0ff66a766ef4da41725644d69aa5 (MD5) / Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Gallinarum biovar Gallinarum (S. Gallinarum) é o agente causador do tifo aviário, uma doença septicêmica que afeta principalmente aves adultas. Enquanto que Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Gallinarum biovar Pullorum (S. Pullorum) é o micro-organismo causador da pulorose, uma doença sistêmica de aves jovens que evolui para infecção persistente em algumas das que se recuperam da enfermidade. Essas bactérias são genética e fenotipicamente semelhantes, mas causam doenças distintas nos seus hospedeiros. Ainda não se sabe quais seriam as informações genéticas responsáveis pelas diferenças na patogenia e epidemiologia do tifo aviário e da pulorose. Com o intuito de investigar essas diferenças, realizou-se o presente estudo, o qual teve por objetivo a comparação dos genomas de S. Gallinarum 287/91, S. Pullorum 449/87 e de S. Pullorum RKS5078 para identificação de regiões de diferenças (“regions of difference” – RODs). Foram identificadas e caracterizadas 68 RODs, buscando correlacioná-las com a patogenicidade desses micro-organismos. Além disso, verificou-se a conservação de algumas dessas RODs em 25 estirpes de S. Gallinarum e 17 de S. Pullorum, todas isoladas de aves com tifo aviário ou pulorose. De modo geral, as RODs continham genes relacionados à funções celulares (reparo de DNA e desagregação de proteínas celulares), produção de energia e virulência. No presente estudo foi observado que a maioria das RODs conservadas era gerada por deleções que, putativamente, provocaram perda de sua função em S. Pullorum. Por esse motivo, foi possível sugerir que a diferente epidemiologia de S. Pullorum poderia ser decorrente de perdas gênicas e não de características adquiridas... / Salmonella enterica subspecie enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum (S. Gallinarum) is the causative agent of fowl typhoid, a septicaemic disease that affects mainly adult birds, whereas Salmonella enterica subespécie enterica serovar Gallinarum biovar Pullorum (S. Pullorum) causes pullorum disease, a systemic disease of young birds that can evolve for persistent infection in some of the birds that recovered. These two bacteria are genetic and phenotypically similar but cause distinct diseases. The genetic bases that would be responsible for these differences are still unknown. For this reason the present study was elaborated and aimed at comparing S. Gallinarum 287/91, S. Pullorum 449/87 and S. Pullorum RKS5078 whole genomes in order to identify regions of difference (RODs). In total, 68 RODs were identified and characterized attempting to correlate them with pathogenicity features of S. Gallinarum and S. Pullorum. Furthermore, the conservation status of some RODs was verified in 25 strains of S. Gallinarum and 17 strains of S. Pullorum, all of them isolated from birds with fowl typhoid or pullorum disease. Overall, the RODs have genes involved in cellular functions (as DNA repair and protein disaggregation), energy production and virulence. In the present study, it was noticed the majority of conserved RODs were generated by deletions in genes which, putatively, would lead to loss of their function in S. Pullorum. Consequently, it was feasible to suggest that S. Pullorum epidemiology would be a negative characteristic stemming from gene losses rather than acquired features...

Um importante micro-organismo causador de doenças de origem alimentar, presente em animais e no homem, é a Salmonella spp. Sua presença no intestino, na pele e entre as penas das aves pode levar à contaminação das carcaças no momento do abate. Pode ocorrer também a contaminação do próprio ambiente de abate, dos manipuladores além da contaminação cruzada entre os animais. Apesar de o Brasil ser um grande produtor de aves, pouco se sabe sobre a influência de abates realizados sob preceitos religiosos na qualidade microbiológica das carcaças produzidas. Dentre os abates religiosos está o abate Schechita que se diferencia do abate convencional pela não realização da escalda antes da depenagem das aves, bem como a utilização do melichah - que tem como uma de suas etapas a aplicação a seco de cloreto de sódio nas carcaças, seguida de sua lavagem. O presente estudo tem por objetivo avaliar a influência do melichah sobre a ocorrência de Salmonella e sobre a população de enterobactérias em carcaças de frangos. Para tanto, foram avaliadas 318 carcaças de aves, sendo 159 obtidas antes da etapa de salga e 159 após a dessalga, coletadas em um abatedouro sob fiscalização do Serviço de Inspeção Federal do MAPA. As carcaças foram submetidas ao enxágue com solução salina e o caldo resultante transportado ao laboratório da FCF-USP para análise. Também se determinou o peso das carcaças; aferiu-se a temperatura das mesmas e o teor de cloro livre na água do tanque de dessalga. A detecção da presença de Salmonella spp. foi realizada conforme a metodologia ISO 6579:2002, enquanto que sua enumeração foi realizada segundo a técnica do Número Mais Provável Miniaturizado (ISO/TC 34/SC 9, N 988, 2009). A enumeração de enterobactérias foi realizada empregando-se placas de Petrifilm EB (3M®) incubadas a 37ºC/ 24h, segundo recomendação do fabricante. Salmonella spp. foi encontrada em somente uma (0,6%) amostra de carcaça antes da salga. Nessa amostra a população do patógeno foi de 41 NMP/g e a de enterobactérias foi de 4 log UFC/g. A população média de enterobactérias nas amostras foi de 3,21±0,79 log UFC/g antes da salga e de 3,15±0,63 log UFC/g após a salga, indicando que não houve diferença significativa (p<0,05) entre ambas. Na simulação do melichah em laboratório observou-se que a redução do patógeno foi significativa, mostrando a influência da etapa de salga sobre esse micro-organismo. / Salmonella spp is an important foodborne pathogen for animals and human beings. The microorganism is found in the intestine, skin, and bird\'s feathers and is able to contaminate carcasses during slaughtering process. The environmental contamination, as well the food handlers, and cross contamination with animals are also possible. Although Brazil is a major poultry producer, little is known about the influence of slaughter performed under religious precepts on the microbiological quality of the produced carcasses. Among the religious slaughters, the Schechita is different from the conventional ones due to the performance of the scalding step before poultry defeathering, and also due to the use of melichah, by which sodium chloride is applied on the carcasses, followed by a washing procedure. The present study aims to evaluate the influence of melichah on the occurrence of Salmonella and on the enterobacteria populations in chicken carcasses. A total of 318 poultry carcasses were evaluated -159 were obtained before salting step and 159 after it, all collected from a slaughterhouse monitored by the Federal Inspection Service of MAPA. The carcasses were rinsed with sodium chloride solution and this solution was taken to the laboratory of FCF-USP for analysis. The carcasses were weighed, their temperature was assessed and the amount of free chloride in the desalting tanks water was determined. The detection of Salmonella was done according to the methodology ISO 6579:2002, whereas its enumeration was performed by the use of the Miniaturized Most-Probable-Number technique (ISO/TC 34/SC 9, N 988, 2009). The enumeratin of enterobacteria populations was done by the use of Petrifilm EB (3M®) and incubation at 37ºC/ 24h, according to the manufacturer instructions. Salmonella spp. was found in only one sample (0.6%) of a carcass before salting step. In this sample, the pathogen population was determined as 41 MPN/g, whereas the counts obtained for enterobacteria were 4 log CFU/g. The average enterobacteria populations found in the samples were 3.21±0.79 log CFU/g before salting and 3.15±0.63 log CFUC/g after it, indicating that there was not a statistically significant difference between them (p<0.05). During melichah simulation done in the laboratory, the reduction in the pathogen counts observed was significant, which demonstrates the influence of the salting step on this microorganism.

Salmonella do grupo paratifóide é responsável por toxi-infecção alimentar no homem, veiculada por alimentos contaminados. Este estudo determinou o perfil genotípico de nove amostras de S. Typhimurium, a sua patogenicidade, assim como sua capacidade de colonização e invasão em aves SPF. Verificou-se pela análise dos genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP ou spvC em amostras de Salmonella Typhimurium que todas foram negativas para os genes sopE1 ou spvC. O gene cdtB estava presente em apenas uma amostra (11,11%) e o gene pefA em duas amostras (22,22%). O gene sefC foi encontrado em três amostras (33,33%). Em oito amostras (88,88%) os genes agfA, fimA, lpfC ou sptP estiveram presentes. Os genes avrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC ou slyA ou sopB estiveram presentes em 100% das amostras analisadas. Determinou-se quatro perfis genotípicos. No ensaio de patogenicidade observou-se que as amostras inoculadas por via oral, não causaram mortalidade de pintinhos SPF de um dia de idade, com a exceção da amostra SA 633 e SA 006 que apresentaram 30 e 10%, respectivamente. No entanto, observou-se que a infecção por via subcutânea provocou uma maior mortalidade de pintinhos, sendo que as amostras SA 003, SA 004, SA 005 e a amostra vacinal mostraram somente 10% de mortalidade, a amostra SA 002 30%, as amostras SA 632 e SA 634 70% e a amostra SA 633 100%. A amostra SA 006 não provocou nenhuma mortalidade. A amostra mais patogênica pela via subcutânea foi a SA 633. O ensaio de colonização foi realizado em pintinhos SPF, com as amostras SA 002, SA 003, SA 004, SA 005, SA 006, SA 632, SA 633, SA 634 e amostra vacinal. Verificou-se ausência de invasão no fígado e baço 24 horas pós- infecção, exceto para as amostras SA 632 (30%) e amostra vacinal (20%). Após sete dias da infecção houve invasão em dois pintinhos com a amostra SA 002 e um pintinho com as amostras SA 004 e SA 005. Apenas na amostra SA 632 constatou-se colonização em ceco após 24 horas em 10% das amostras e após 7 dias em 70% pós-infecção. Concluiu-se que entre as amostras de Salmonella Typhimurium analisadas existiam diferentes perfis genotípicos baseando-se na presença ou ausência de genes de virulência, e que a amostra vacinal assemelha-se a amostras de S. Typhimurium estudadas quanto a presença dos genes. Os resultados do teste de patogenicidade das amostras de ST indicaram que a via de inoculação modifica a patogenicidade de uma mesma amostra e que a mortalidade após a inoculação pela via subcutânea é sempre superior que pela via oral. / Parathyphoid Salmonella are major food-borne pathogens spread by contaminated food products. This study determined the genotypic profile of nine samples of S. Typhimurium, pathogenicity, colonization and invasion in SPF chicks. It was found by analysis of genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP or spvC samples of S. Typhimurium all were negative to sopE1 or spvC. The cdtB gene was identified in one sample and pefA gene in two samples (22,22%). Sef C gene was detected in three samples (33,33%). In eight samples (88,88%) agfA, fimA, lpf or sptP were detected. AvrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA and sopB were detected in all samples evaluated. Four genotypic profiles were established. Pathogenicity tests showed that samplesinoculated by oral gavage did not present mortality in one day old SPF chicks, except samples SA 633 and SA006 with 30 and 10%, respectively. However, it was observed that subcutaneous inoculation showed high mortality in SPF chicks than oral inoculation, and samples SA 003, SA004, SA005 and vaccinal strain showed 10% of mortality, 30% for sample SA002, 70% in the samples SA632 and SA 634 and 100% when the sample SA 633 was inoculated. No mortality was observed in sample SA006. Colonization test was performed in SPF chicks using the samples: SA002, SA 003, SA 004, SA005, SA006, SA 632, SA 633, SA 634 and vaccinal strain. The more pathogenic strain subcutaneously was the SA 633. There was not invasion in liver and spleen 24 hours p.i., except for sample SA 632 (30%) and vaccinal strain (20%). Seven days p.i. invasion was detected in two chicks inoculated with samples identified as SA 004 and SA 005. Sample SA 632 showed 10% of cecal colonization 24 hours p.i. and 70% after one week p.i. It was concluded that Salmonella Typhimurium strains including the vaccinal strain, showed different genotypical profiles, based on the presence or absence of genes of virulence genes. The results of the pathogenicity test indicated that inoculation route modify the pathogenicity of the same strain, and the mortality post-inoculation was always higher in chicks inoculated by subcutaneous route when compared to the oral route.

O presente trabalho objetivou descrever o comportamento da cepa Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) PT4, frente ao tratamento térmico a 60,0º C por três minutos e meio, em ovo integral pasteurizado desidratado reconstituído, interrelacionando a termorresistência com temperatura prévia de incubação e concentração de microrganismos. Foram realizadas 150 análises, das quais 75 foram trabalhadas com cepa previamente incubada à 35ºC e 75 com cepa incubada à 43ºC. Cada um destes grupos foi subdividido em três subgrupos, inoculado-se as concentrações de 10³, 105 e 108 unidades formadoras de colônia (UFC)/mL de caldo BHI. Após inoculação, foi simulada pasteurização do ovo, a 60,0ºC por 3,5 minutos, em banho-maria, e, posteriormente, realizadas contagem em placa (UFC) e Número Mais Provável (NMP), para verificação da concentração de S. Enteritidis sobrevivente. O tempo de redução decimal (valor D) foi de 2,54 e 2,57 minutos para S. Enteritidis previamente incubada à 35ºC e inoculada nas concentrações de 105 e 108 UFC/mL de caldo BHI, respectivamente. Para S. Enteritidis previamente incubada à 43ºC e inoculada nas concentrações de 105 e 108 UFC/mL de caldo BHI, o valor D foi de 2,58 e 2,40 minutos, respectivamente. Não foi possível o cálculo do valor D para a concentração 10³ UFC/mL de caldo BHI, visto que não houve população sobrevivente. Não houve diferença significativa entre os resultados de contagem e NMP, comparando-se as duas temperaturas de incubação, entretanto, os resultados de contagem e NMP das três concentrações inoculadas foram diferentes entre si. Concluiu-se que a cepa pré incubada a 43ºC não apresentou maior resistência ao calor, em relação à cepa incubada a 35ºC; e não houve maior resistência ao calor, comparando-se as diferentes concentrações. / The purpose of this study was to describe the behavior of Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) PT4 undergoing thermal treatment at 60ºC for 3 ½ minutes in reconstituted dried-whole egg, correlating the heat resistance with a previous temperature of incubation and microrganism concentration. 150 analyses were conducted, 75 with S. Enteritidis PT4 previously incubated at 35ºC and 75 with S. Enteritidis PT4 previously incubated at 43ºC. Each of these two groups was subdivided in 3 sub-groups, adding the inoculum at concentrations of 10³, 105, 108 CFU/mL of BHI broth. After the inoculation, pasteurization of the egg was simulated at 60ºC for 3,5 minutes in a water bath. Then colony count and Most Probable Number (MPN) were carried out to check the concentration of surviving S. Enteritidis. The decimal reduction time (D-value) was 2.54 and 2.57 minutes for S. Enteritidis previously incubated at 35ºC and inoculated in the concentration of 105 and 108 CFU/mL of BHI broth, respectively. Concerning the S. Enteritidis previously incubated at 43ºC and inoculated in concentrations of 105 and 108 CFU/mL of BHI broth, the D-value was 2.58 and 2.40 minutes, respectively. It was not possible to calculate the D-Value for the 10³ CFU/mL concentration of BHI broth, because there was no surviving population. There was no significant difference between the results of colony count and MPN, comparing the two incubation temperatures, however the results of colony count and MPN of the three inoculated concentrations were different from each other. It was possible to conclude that the S. Enteritidis PT4 previously incubated at 43ºC hadn´t shown more heat resistance if compared with the S. Enteritidis PT4 incubated at 35ºC; and there wasn’t more heat resistance, comparing the different concentrations.

O Brasil é líder mundial em exportação de carne bovina. A qualidade e a segurança dos produtos cárneos são essenciais para permanecer como exportador no competitivo mercado internacional. Atualmente, critérios microbiológicos são usados para avaliar produtos cárneos, e Salmonella tem sido usada como um importante indicador da segurança dos alimentos por diversos países. No presente estudo, um total de 120 carcaças foram analisadas em três diferentes pontos do processo de abate em um abatedouro-frigorífico exportador localizado no sul do Brasil. Os resultados demonstraram que quatro carcaças (3,3%) foram positivas para Salmonella. Todas as amostras positivas foram coletadas do couro depois da sangria (Primeiro ponto de coleta – P1), e Salmonella não foi encontrada nas amostras coletadas após a retirada do couro (Segundo ponto de coleta – P2) e antes do último toalete (Terceiro ponto de coleta – P3). Seis isolados foram obtidos e classificados em três sorovares diferentes; S. Newport (n=3), S. Saintpaul (n=2) e S. Anatum (n=1). As cepas de Salmonella também foram analisadas quanto à susceptibilidade antimicrobiana, usando 15 antimicrobianos recomendados pelo CLSI. Nenhuma cepa apresentou resistência a qualquer um dos antimicrobianos testados. Além da investigação de Salmonella, a contagem de Escherichia coli foi realizada em todos os três pontos do processo. O ponto mais contaminado foi o primeiro (couro) que apresentou contagens variando de 0,31 a 5,07 log UFC/100 cm². O segundo e o terceiro ponto apresentaram contagens variando de N. D (não detectado) a 2,42 log UFC/100 cm² e N. D a 2,10 log UFC/100 cm², respectivamente. Uma redução significativa da contagem de E. coli foi observada entre o primeiro e os outros demais pontos. Os resultados indicaram que o risco de contaminação das carcaças ainda existe principalmente do couro. A implementação de Boas Práticas de Fabricação e dos princípios do APPCC são importantes ferramentas para prevenir a contaminação microbiana em carcaças. / Brazil is the leading exporter of beef worldwide. The quality and safety of the meat products are essential to remain as an exporter in the very competitive international market. Currently, microbiological criteria are used to evaluate meat products, and Salmonella has been used as an important food safety indicator in many countries. In the present study, a total of 120 carcasses were analyzed in three different steps of the slaughter process in an exporter slaughterhouse located in southern Brazil. The results demonstrated that four carcasses (3.3%) were positive for Salmonella. All the positive samples were collected on the hides after the bleeding (First collection step – P1), and Salmonella was not found in the samples collected after the removal of the hides (Second collection step – P2) and before the last toilet (Third collection step – P3). Six isolates were obtained and were classified in three different serovars, i. e. S. Newport (n=3), S. Saintpaul (n=2) and S. Anatum (n=1). The Salmonella strains were also examined for antimicrobial susceptibility using 15 drugs recommended for CLSI. None strains exhibited resistance to any of the antimicrobials tested. In addition to the Salmonella investigation, Escherichia coli counts were carried out in the three processing points. The most contaminated point was the first (hide) that showed counts ranged from 0.31 to 5.07 log CFU/100 cm². The second and the third points demonstrated counts ranged from N.D (not detected) to 2.42 log CFU/100 cm² and N.D to 2.10 log CFU/100 cm², respectively. A significant reduction of the E. coli counts was observed among the first and the other points. Results indicated that the risk of contamination of the carcasses still exists, mainly from the hides. The implementation of Good Manufacturing Practices and HACCP principles are important to avoid microbial contamination.

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T01:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pivetta_LucianeBeneditaDuarte_M.pdf: 4595229 bytes, checksum: 95f48747caf7eb8ddce4f6ccacc9d5d4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Sorovariedades patogênicas de Salmonella enterica constituem um problema de saúde global, que abrange desde gastroenterites até doenças sistêmicas, sendo que ambas podem ser letais. Linhagens atenuadas de S. enterica são promissoras como vacinas vivas, pois são facilmente administradas via oral e capazes de induzir o sistema imune sistêmico e de mucosas do hospedeiro. Além disso, apresentam o potencial de atuar como vacinas multifatoriais, expressando antígenos de outros agentes infecciosos. Neste trabalho, linhagens recombinantes de Salmonella enterica foram construídas e a atenuação da virulência e a estimulação do sistema imune foram avaliadas no modelo murino da salmonelose. As linhagens recombinantes foram desenvolvidas a partir do sistema de recombinação homóloga ?Red, com a deleção de um ou mais genes com efeitos pleiotrópicos na virulência de Salmonella. Após a confirmação da deleção do gene alvo por PCR, as linhagens foram transduzidas com o bacteriófago P22, visando eliminar possíveis problemas com a integridade de lipopolissacarídeos. Posteriormente, caracterizações fenotípicas foram realizadas, por meio de curvas de crescimento in vitro, verificação da capacidade de invasão e sobrevivência no interior de macrófagos e resistência a espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. A atenuação da virulência das linhagens foi avaliada in vivo por meio de inoculações orais e intraperitoneais em camundongos BALB/c/AnUnib e a dose letal média também foi estabelecida. Variados níveis de atenuação foram atingidos e dentre as linhagens desenvolvidas, a duplo mutante para os genes hupA e hupB foi a que apresentou os resultados mais promissores. Nos ensaios de proteção e desafio, 100% dos animais vacinados com duas doses da linhagem 'delta'hupA'delta'hupB sobreviveram ao desafio com doses letais da linhagem selvagem. Para a linhagem duplo mutante também foi verificada a capacidade de colonização bacteriana no sangue, placas de Peyer e baço, assim como a produção de anticorpos IgG e IgA. A obtenção de uma linhagem atenuada, porém capaz de induzir com eficácia o sistema imune do hospedeiro é idealmente almejada no desenvolvimento de uma vacina viva. No entanto, atingir esse balanço é um desafio, já que a deleção de genes de virulência de Salmonella acarreta em diferentes níveis de atenuação, mesmo quando os genes são intimamente relacionados. Uma perspectiva futura é o refinamento das linhagens atenuadas por meio da introdução de antígenos heterólogos e de um sistema de expressão regulado, com o estabelecimento de vacinas multifatoriais / Abstract: Pathogenic Salmonella enterica serovars are the cause of a global health problem that ranges gastroenteritis to lethal systemic disease. Attenuated strains of Salmonella enterica are promising as live vaccines because they are orally administrated and capable of inducing a mucosal and systemic immune response in the host. Besides, they can act as multifactorial vaccines delivering antigens from other diseases. In this work, attenuated strains of Salmonella enterica were produced and the attenuation of the virulence and the induction of an immunologic response were evaluated in the murine model of salmonellosis. The recombinant strains were constructed using the ?Red system of homologous recombination deleting one or more genes with pleiotropic effects on Salmonella virulence. After that, a PCR to confirm the deletion of the target gene was made and the strains were transduced with bacteriophage P22 to avoid problems with lipopolysaccharide's integrity. Phenotypic characterization as the in vitro growth curve of the strains, the resistance to ROI and RNI species and the ability of survival inside J774 macrophages cultures were performed. The attenuation of the strains was evaluated in vivo trough oral and intraperitoneal inoculations of the strains into BALB/c/AnUnib mice and the median lethal dose was also established. Many levels of attenuation were reached and among the developed strains, the double mutant strain for the genes hupA and hupB was the one with the best results. In the protection and challenge assays, 100% of the animal vaccinated with two doses of the 'delta'hupA'delta'hupB strain survived to the challenge with lethal doses of the wild type strain. For this strain it was also verified the capacity of colonization into blood, peyer's patches and spleen as well as the production of IgG and IgA antibodies. In the developmente of a live vaccine it is ideal to have a strain that is attenuated but still capable of inducing an immune response in the host. Reaching this balance is a challenge and the deletion of virulence genes in Salmonella entails different levels of attenuation although they are closely related. A future prospect is the improvement of these attenuated strains with the insertion of controlled expression systems and heterologous antigens, creating a multifactorial vaccine / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ronaldo Stefanutti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo / Made available in DSpace on 2018-08-15T08:25:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franca_JosueTadeuLeite_M.pdf: 8680034 bytes, checksum: 1ab8ef0109f94daf34a018122905eed9 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudou-se o sistema de remoção de lodo de lagoa de estabilização, o desaguamento e acondicionamento do lodo pelo uso de BAG, bem como a redução da viabilidade de ovos de helmintos, coliformes, Salmonellas e teor de sólidos em função do tempo de acondicionamento. Entre várias opções para a retirada, adensamento e desaguamento do lodo de lagoa, a utilização de centrifuga no processo de deságue foi considerada inviável devido a necessidade de pré-condicionamento do lodo, em virtude da presença de materiais estranhos como pedrinhas, pedaços de pau, de metais, plásticos, e outros materiais, que danificam os elementos do equipamento. Optou-se por avaliar a remoção do lodo com a combinação de dragagem seguida da aplicação de polímero e deságüe em BAG de polipropileno de alta resistência. Definiu-se por esta combinação para remoção do lodo da lagoa de estabilização de Coronel Macedo-SP, Sabesp, devido às dificuldades operacionais e em virtude de longas distâncias para disposição do resíduo em aterros licenciados, o que representa elevados custos, uma vez que os aterros da região não são autorizados para receberem este tipo de resíduo.Como opção para redução de custos no desaguamento, transporte e disposição do lodo e com um importante viés ambiental, propôs-se nesta pesquisa estudar um modelo para desaguamento, acondicionamento e redução da carga patogênica, procurando adequar o lodo aos padrões para aplicação em solo agrícola. Seis meses após a operação de desaguamento do lodo acondicionado em BAG, constatou-se ausência de ovos de helmintos viáveis, salmonellas, protozoários e coliformes termotolerantes <103 NMP.g-1.MS. Estes resultados indicaram que o processo removeu a patogenicidade do lodo adequando-o para a disposição no solo, quanto aos parâmetros avaliados. O acúmulo de lodo foi de 2,2 cm.ano-1 e a contribuição média per capta foi de 0,042 m3 de lodo.hab-1.ano-1. A eficiência da ETE com relação a remoção da DBO, aumentou de 63% para em torno de 82%, após a limpeza. O lodo no BAG atingiu teor de sólidos totais de 34,10% após 374 dias e foi classificado como Classe II A - Não perigoso e não inerte. O custo da remoção de 2000 m3 lodo com teor médio de sólidos totais 12%, por meio do sistema de dragagem e acondicionamento em BAG foi de USD 4,67.hab-1.ano-1 / Abstract: This study was about a removal system of stabilization pond sludge, its dewatering and conditioning using BAG. Another point of this work was study the viability reduction of helminthes eggs, coliforms, salmonellas and quantities of solids by the time of conditioning. Among a many options for the removal, concentration and dewatering of the sludge pond, the centrifuge use was considerate unfeasible because the need of preconditioning of the sludge due the presence of foreign material as small stones , wood, metals, plastics and other materials which can damage the equipment system. Hence we decided to assess the removal of sludge with a combination of dredging followed by the application of polymer and drainage bag in the high resistance polypropylene. Was defined for this combination to remove the stabilization pond sludge of Coronel Macedo -SP, Sabesp, due the operational difficulties and due the long distances for disposal of waste in landfills, which is costly, since the landfills in the region are not authorized to receive this type of waste. As an option for cost reduction in drainage, transportation and disposal of sludge and an important environmental bias, it was proposed in this research study a model for dewatering, conditioning and reduction of the pathogen, adapting the standards for sludge application on agricultural land . Six months after the operation of sludge dewatering packed in bag, it was detected an absence of viable helminth eggs, salmonella, protozoa and coliforms. These results indicated that the process removed the pathogenicity of the sludge tailoring it to the wastewater disposal, as to the parameters evaluated. The accumulation of sludge was 2.2 cm.year-1 and the average contribution per capita was 0.042 m3 of sludge inhab-1 year-1. The effectiveness of treatment station for BOD removal increased from 63% to 82% after cleaning of the stabilization pond. The sludge in the bag reached total solids of 34.10% after 374 days and was classified as Class II A - Not dangerous, not inert. The cost of the removal of 2000 m3 sludge with an average of 12% solids, by means of the dredging and placing in bag was US$ 4.67 inha-1 year-1 / Mestrado / Saneamento e Ambiente / Mestre em Engenharia Civil

O objetivo deste estudo foi o de verificar a ocorrência de quatro genes de virulência em Salmonella Enteritidis de acordo com o fagotipo e ribotipo, assim como a virulência “in vivo”. Os genes estudados foram invA, spvC, sefC e pefA em 120 amostras isoladas de várias fontes, pertencentes a diferentes fagotipos e ribotipos provenientes de sete estados brasileiros. Para a verificação da presença dos genes, as amostras foram examinadas pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) individualmente e em multiplex. A ocorrência para o gene invA foi de 100% nas amostras (120/120), spvC em 94% (113/120), sefC em 97,5% (117/120) e pefA em 97% (116/120) das amostras. Foi possível caracterizar as amostras em cinco diferentes perfis. O primeiro, P1, foi positivo para os genes invA, spvC, sefC e pefA, P2 para invA, spvC e pefA, P3 para invA, sefC e pefA, P4 para invA e sefC e o último P5 para os genes invA e spvC. Para as amostras PT4RT1 obteve-se o perfil P1 em 94% (64/68), P2 em 1,5% (1/68), P3 em 3% (2/68) e P4 em 1,5% das amostras (1/68). Para as amostras PT4RT2, 86% (18/21) pertenceram ao perfil P1, 5% (1/21) ao P3 e 9% (2/21) das amostras ao perfil P4. Nas amostras PT4RT3 80% (4/5) pertenceram ao perfil P1 e 20% (1/5) ao P2. Nas amostras PT4TR9, 91% (10/11) pertenceram ao perfil P1 e 9% (1/11) ao P3. Todas as amostras PT4RT5, PT7RT1 e PT4RT10 pertenceram ao perfil P1 e apenas a amostra PT1 apresemtou o perfil P5. A virulência foi avaliada desafiando as aves via oral e subcutânea, através da colonização do ceco e invasão do fígado e baço. O gene spvC está relacionado com a sobrevivência e aumento da média de crescimento da bactéria no fígado e baço, mas neste estudo não demonstrou diferença na porcentagem de aves com reisolamento positivo para a bactéria nestes orgãos. Os genes sefC e pefA foram importantes para promover a colonização cecal, pois somente quando estes dois genes simultaneamente estiveram presentes no perfil, obteve-se o reisolamento cecal quando as aves foram desafiadas oralmente sendo esta via a principal rota de infecção deste patógeno. / This study has the intention of verify the four virulence genes event in Salmonella Enteritidis according with phage type and ribotype and the virulence “in vivo”. The genes studied were invA, spvC, sefC and pefA in 120 Salmonella Enteritidis isolates from different origins, belongs at different ribotypes and phage types of seven Brazilian states. To verify the genes presence the strains were examined by Polimerase Chain Reaction (PCR) technique, singly and multiplex. The event of invA gene was in 100% (120/120) of strains, the spvC gene was in 94% (113/120) of strains, the sefC gene was in 97.5% (117/120) of strains and the pefA gene was in 97% (116/120) of strains. There were discovered five different profiles. The pattern one, P1, was positive for invA, spvC, sefC e pefA. The P2 was positive for invA, spvC and pefA. The P3 was positive for invA, sefC e pefA. The P4 was positive for invA and sefC and the last one, P5, was positive for invA and spvC. For the PT4RT1 strains, the P1 profile was present in 94% (64/68) of strains; P2 profile was in 1.5% (1/68); P3 in 3% (2/68); and P4 in 1.5% (1/68) of strains. For the PT4RT2 strains, the P1 profile was present in 86% (18/21) of strains; P3 profile was in 5% (1/21); and P4 in 9% (2/21) of strains. For the PT4RT3 strains, the P1 profile was present in 80% (4/5) of strains, and P2 in 20% (1/5) of strains. For the PT4RT9 strains, the P1 profile was present in 91% (10/11) of strains, and P3 in 9% (1/11) of strains. The strains: PT4RT5, PT7RT1 e PT4RT10 belongs at the P1 profile, and only the PT1 strain belongs at the P5’s profile. The virulence was evaluated challenging the birds orally and subcutaneous, through the colonization of the caecum, liver and spleen invasion. The gene spvC was related with the survivance and the increase of the average grow of the bacteria in the liver and spleen, but this study doesn’t demonstrate the difference in the percentage of positive birds for the bacteria in their organs. The sefC and pefA genes were important to promote the caecum colonization, because only when both genes were present simultaneously in the profile, obtain the caecum isolation when the birds were been by orally challenged this way the main route of the infection of this pathogen.

Orientadores: José Luiz Pereira, Maristela Nascimento / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-18T16:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_IvoneFranciscada_M.pdf: 1262965 bytes, checksum: 1fe0878a62acfd4e2e373d7b14691653 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os microrganismos são extremamente importantes no processamento do cacau, sob dois aspectos. O primeiro é o aspecto tecnológico, porque desempenham um papel fundamental no desenvolvimento do sabor do chocolate. O segundo é o aspecto de saúde pública, porque podem transmitir doenças de origem alimentar. O chocolate já foi incriminado em vários surtos de salmonelose e, em alguns deles, a contaminação por Salmonella originou-se dos ingredientes de cacau. O objetivo do presente estudo foi verificar a ocorrência de enterobactérias, incluindo Salmonella em cada etapa do processamento do cacau até a obtenção do chocolate além de determinar características fisico-químicas como pH e atividade de água. Foram analisadas 364 amostras, obtidas de produtores e processadores de cacau da Bahia e comerciantes de chocolate do Estado de São Paulo, sendo 119 amostras de cacau durante o pré-processamento nas fazendas produtoras; 150 amostras de derivados processados de cacau e 65 amostras comerciais de chocolate. As polpas de cacau apresentaram resultados microbiológicos e físico-químicos de acordo com a legislação vigente. As sementes que chegam do campo, antes de entrarem na fermentação, não apresentaram contaminação por E. coli, o que indica que a matéria prima é uma fonte menos provável de entrada de enteropatógenos, dentre eles Salmonella, no pré-processamento do cacau. Na etapa de fermentação não houve o isolamento de Salmonella, nem foi observada correlação entre a presença ou contagem de E. coli e o tempo de fermentação. Todas as fazendas produtoras apresentaram contaminação por E. coli. Durante a etapa de secagem das amêndoas não foi detectada presença de Salmonella, já a porcentagem de amostras contaminadas por E. coli aumentou em todas as fazendas (40% de amostras contaminadas) com relação a etapa anterior. Nas amêndoas fermentadas e secas foi detectada a presença de Salmonellaem uma amostra, além de ter sido verificado um aumento na porcentagem de amostras contaminadas por E. coli em relação a etapa anterior. Quanto cacau processado, nas amostras de Nibs analisadas houve o isolamento de bactérias do grupo enterobactérias e coliformes totais em 17 e 20% das amostras, mesmo após terem sido submetidos a um processo de torração com temperaturas acima de 110°C. Para os demais produtos foi verificada contaminação de até 7% das amostras analisadas. Em relação ao chocolate as amostras analisadas apresentaram resultados microbiológicos dentro dos padrões estabelecidos pela legislação. Os resultados obtidos nos levam a concluir que: o pré-processamento do cacau é uma etapa onde ocorre a introdução e multiplicação de microrganismos indicadores e patogênicos como a Salmonella, sendo que as etapas de secagem e armazenamento se mostraram as mais críticas; a etapa de processamento também oferece risco de introdução e/ou sobrevivência de microrganismos patogênicos como Salmonella / Abstract: Microorganisms are extremely important in the processing of cocoa for many reasons. First of all is the technological aspect because some microorganims play a key role in the improvement of chocolate flavor. The other aspect is on public health, mainly on the transmission of food-borne diseases. Chocolate has already in several outbreaks of salmonellosis, in some of them Salmonella source was cocoa ingredient. Therefore, the aim of this study was to investigate the occurrence of been Enterobacteriaceae, including Salmonella, throughout cocoa and chocolate chain incremented. Furthermore, physico-chemical properties such as pH and water activity were determined. The amount of 364 samples, obtained from manufacturers of Bahia state and cocoa traders from São Paulo state, were analyzed, including 119 samples of cocoa during the pre-processing on farms, 150 samples of cocoa processed products and 65 samples of commercial chocolate. The results indicated that the microbiological and physical-chemical analyses of the cocoa pulp were according to law. Cocoa sucs before the fermentation process are not. source of Salmonella and E.coli. In the fermentation stage, Salmonella was not isolated, but all farms showed contamination by E. coli, without correlation between the counting of pathogens and fermentation time. In the drying step, Salmonella was not detected as opposed to E. coli counting, that increased 40% in all farms with respect to the previous step. In the storage only one sample showed Salmonella. In Nibs samples were isolated Enterobacteriaceae and total coliforms in respectively 17% and 20% of samples, despite of roasting processing with temperatures above 110ºC. For other products the contamination of 7%. Commercial chocolate samples showed results seconding to the standards established by law.The results lead us to conclude that the pre-processing of cocoa is the stage where there is the introduction and multiplication of indicators microorganisms and Salmonella. The drying and storage were the most critical steps. The processing stages, also offer risk of introduction and survival of pathogens such as Salmonella / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos