Ces travaux de recherche s’intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d’une transplantation hépatique ou bien encore à l’évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l’essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l’agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d’une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s’est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d’absorbance dans l’ultra-violet et l’autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L’autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l’analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d’investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d’un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d’analyse miniaturisé et simple d’utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d’analyse sur puce microfluidique permettant l’analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d’une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR. / The purpose of our work was the development of new analytical methodologies to measure the benefit of liver transplantation and also the evaluation of new therapeutic approaches under testing on patients with Transtyretin (TTR) familial amyloid polyneuropathy. This rare disease is characterized by a structural destabilization of TTR tetramer leading to it’s aggregation into amyloïd fibrils that accumulate in the tissues of the autonomous nervous system, peripheral nerves and around certain organs, including the heart. As part of a collaboration between university, hospital, analytical chemists, electrochemist, physical chemists and technologists, we are committed to develop separations in capillary electrophoresis coupled with optical detection of native and mutated peptides that are directly associated with a variant of this rare disease. The first challenge of this research is the choice of these biomarkers that ultimately proved relevant with the realization of peptide maps from the serum. Then two approaches have been explored: electrokinetic separation with absorbance spectrometric detection in the ultraviolet and the other requiring the prior labeling peptides with fluorescent molecules and then to a separation on electrophoresis coupled with LIF (Laser induced fluorescence). In both cases the main criterion of separation, resolution, allows quantification and especially analytical validations show actual strength associated methodologies developed. Another encouraging sign for the transposition of these methods to the analysis of samples from patients regarding the quantification limit is lower than commonly measured in serum. Mass spectrometry, using physico-chemical investigation powerful allowed to follow and understand a more fundamental viewpoint the product of organic chemistry reactions bypass peptides by three fluorescent dyes: TAMRA-SE, the NDA and FQ. The ability to provide a miniaturized analysis and easy to use tool for the hospital environment was also studied. A post analysis on microfluidic chip for quantitative and qualitative analysis was installed to allow the realization of the first experimental tests of electrokinetic separations on microfluidic chip. These studies lay the foundation for a new analytical way to separate and quantify the different characteristics biomarkers family TTR amyloid polyneuropathy.

Construction of culprits within criminal policy programs: A critical discourse analysis. The purpose of this study was to make visible discourses within criminal policy before the elections of 2018 through analysis of the established political parties ́ criminal policy programs. Method qualitative content analysis was used to bring out categories, later analysed with Fairclough ́s critical discourse analysis. Constructions of culprits as “foreigner”, “in gang”, “organized”, “young”, “male” and “non-ethical Swedish” emerged. Other groups were crime victims identified as “children”, “juveniles”, “elders”, “females” and “entrepreneurs/business owners”. The crimes observed were honor crimes, terrorism, crimes of violence (especially domestic violence), sexual offences and internet-based crime. The constructions may create a skewed interpretation of criminality and feelings of “us and them”. This may lead to “them” labelled as the criminals and “us” as their potential victims. The discourses in the programs therefore risk sustaining unequal power configurations in society.

Le Sélénium (Se) est un oligo-élément essentiel qui est incorporé dans une famille indispensable de protéines, les sélénoprotéines, sous la forme d’un résidu acide aminé rare, la sélénocystéine. Dans les études épidémiologiques, il apparait clairement que des faibles niveaux de sélénium dans les fluides biologiques sont associés avec (i) une augmentation du risque de cancers (colon, prostate, poumon) et de maladies cardiovasculaires, (ii) une altération de la fonction immunitaire et (iii) finalement une réduction de l’espérance de vie. Dans le génome humain, vingt-cinq gènes de sélénoprotéine ont été identifiés. Ces gènes expriment, de par la complexité de la régulation du génome, de nombreuses isoformes de chacun des 25 gènes pour constituer le sélénoprotéome. Quand la fonction est connue, ces protéines participent à des processus essentiels de défense antioxydante, d’homéostasie redox et de signalisation redox. Ces enzymes sont finement régulées par l’apport en sélénium et d’autres stimuli cellulaires. Pour comprendre la fonction et la régulation du sélénoprotéome humain, qui est exprimé à un niveau trace, il s’avère critique de développer une stratégie innovante basée sur une approche multidisciplinaire de détection et quantification du sélénium par différents outils de spectrométrie de masse élémentaire (ICP MS) et moléculaire (ESI-MS/MS). Tout d’abord, le sélénium possède un profil isotopique bien particulier avec six isotopes stables (74Se, 76Se, 77Se, 78Se, 80Se and 82Se) qui sert de signature dans nos analyses en ICP-MS ou en ESI-MS/MS. En parallèle, l’utilisation de sélénium isotopiquement enrichi permet également des marquages cellulaires en multiplexing. Ainsi, en couplant des méthodes de séparation en phase liquide (HPLC) ou en gel d’électrophorèse (IEF ou SDS-PAGE échantilloné par ablation laser) avec l’ICP MS, nous avons mis au point plusieurs méthodes permettant la détection de plusieurs sélénoprotéines de manière simultanée dans différentes lignées cellulaires. De plus, un médicament sélénié sous forme de triglycéride obtenu via un mélange d’huile de tournesol et de sélénite a été testé comme source de sélénium non toxique pouvant stimuler la production de sélénoprotéines. Plusieurs lignées cellulaires humaines cancéreuses et non-cancéreuses ont été expérimentées avec succès permettant de valider cette nouvelle source de sélénium dans la synthèse des sélénoprotéines. / Selenium (Se) is an essential trace element, which is incorporated as a rare aminoacid, selenocysteine, in twenty five selenoproteins, to constitute the selenoproteome. Selenoprotein family is one of the most important bioactive form of selenium in human health. Initially demonstrated in Kashin Beck and Keshan diseases, selenium deficiency is associated with several pathological conditions, including cancer, neurodegenerative diseases, immune and muscular disorders. Chronic selenium deficiency is hypothesized to decrease antioxidant defenses and redox regulatory pathways through a dysregulation of selenoprotein expression. We are interested in understanding the synthesis and regulation of human selenoproteins, which is critically dependent on the availability of adequate analytical methodology. To understand the function and regulation of human selenoproteome, which is expressed at a trace levels, it appears critical to develop innovative strategies based on a multidisciplinary approach to detect and quantify selenium by various elemental and molecular mass spectrometer tools. First, selenium has a particular isotopic profile with six stable isotope (74Se, 76Se, 77Se, 78Se, 80Se and 82Se) used as a signature in our analysis with ICP-MS or ESI-MS/MS. In parallel, the use of isotopically enriched selenium also allows cellular labelling and tracing of selenoproteins and other seleno-coupounds. By coupling liquid phase separation methods (HPLC) with specific mass spectrometry analytical tools, we have developed several methods for detecting several selenoproteins simultaneously in various human cell lines.

O estudo de processos inflamatórios e infecciosos em Medicina Nuclear apresenta grande relevância para a clínica médica diagnostica. Enquanto em alguns casos o diagnóstico é óbvio, baseado na história clínica e exame físico do paciente, em outros é mais difícil, por serem assintomáticos ou por apresentarem sintomas não específicos. O diagnóstico precoce do processo inflamatório ou infeccioso permite tratamento rápido e também o impedimento de outras complicações. Além disto, a distinção entre inflamação e infecção é de extrema importância, bem como a provável localização. O uso de leucócitos radiomarcados, já estudados e aplicados em várias patologias, é o método de escolha para visualização de focos de infecção e inflamação. A cintilografia de leucócitos radiomarcados foi introduzida em 1976 por McAffe e Thakur e desde então é usada para diagnosticar diferentes patologias que envolvem infiltração leucocitária como distúrbios inflamatórios do intestino, infecção óssea ou prótese-vasculares entre outras. A marcação dos leucócitos in vitro pode ser realizada com 111In utilizando-se oxima ou tropolona como ligante ou com 99mTc, tendo a hexametilpropileno amino oxima (HMPAO) como ligante, resultando em um complexo lipofílico. A melhor disponibilidade, menor tempo de realização do exame, melhor propriedade física e menor dose de radiação para o paciente, resultou na preferência pelo agente HMPAO marcado com 99mTc, ao invés do 111In, para a maioria das indicações na maioria dos países. Entretanto, a marcação empregando o agente HMPAO apresenta como desvantagens a curta estabilidade do reagente marcado, as exigências relacionadas ao processo de marcação (tempo pós-eluição do 99mTc), além do custo elevado, pois se trata de produto importado. Este trabalho visou o desenvolvimento do reagente liofilizado de glucoheptonatoestanho para marcação de leucócitos com 99mTc in vitro pelo método de préestanização. A otimização da técnica de marcação foi realizada através da incubação dos leucócitos, isolados de sangue total, com diferentes volumes do reagente de glucoheptonato-estanho por diferentes tempos à 37°C (préestanização), com posterior marcação com 99mTc (185 MBq), incubados à temperatura ambiente por 20 minutos. O rendimento da marcação foi superior a 90% na condição ótima de marcação. O reagente liofilizado mostrou-se estável por mais de 90 dias. As imagens cintilográficas obtidas 1, 2 e 3 horas após a administração dos leucócitos radiomarcados em coelho New Zeland demonstraram a alta eficiência de marcação de processo inflamatório provocado a partir da administração local de terebentina. O método de marcação de leucócitos desenvolvido apresenta aplicação promissora na clínica médica, com proposta de redução de custo do procedimento, apesar de ser um procedimento mais demorado quando comparado ao procedimento que utiliza o quelante lipofílico de HMPAO. / The study and localization of inflammatory and infection process in Nuclear Medicine represents a relevant tool in diagnostic procedures. In same cases, the diagnostic is easy and based on anamnesis and clinical observation; in other cases, the patients are asymptomatic or present non specific symptoms that difficult the diagnostic. The early diagnostic of inflammatory or infectious process allow the early introduction of therapy and prevents complications. Farther, the differentiation between inflammation and infection is of extreme importance as well as the localization of the focus. The use of labeled leucocytes, studied and applied in much pathologies, is the method of choice for the visualization of inflammation and infection. The scintigraphy using labeled leucocytes was introduced at 1976 by McAffe and Thakur and since of this is used in the diagnostic of different pathologies related to leucocyte infiltration like intestinal inflammatory disease, bone or prosthetic-vascular infections. The in vitro labeling of leucocytes with 111In was performed using oxime or tropolone as ligand and with 99mTc using hexamethylpropylene amine oxime (HMPAO) as ligand, resulting in a lipophilic complex. The 99mTc-HMPAG complex was preferably employed in many indications and countries do to the ideal physical properties of 99mTc that results in low dose to the patient. However, the labeling employing the HMPAO complex results in some disadvantages like the low stability of the complex, and some requirements related to the 99mTc elution (like the time pos elution), beyond the high cost of the compound that is imported. The aim of this work was the development of a tin-glucoheptonate lyophilized kit for in vitro leucocytes labeling with 99mTc using the pre-stannization method. The optimization of the labeling technique was developed using leucocytes isolated from total blood and employing different volumes of the tinglucoheptonate reagent and different incubation times at 37 deg C (pre-stannization), and posterior labeling with 99mTc (185 MBq), after 20 minutes reaction at room temperature. The labeling yield was superior to 90% using the optimized labeling conditions. Lyophilized reagent was stable after 90 days. Scintilographic images obtained 1, 2 e 3 hours after the administration of labeled leucocytes in New Zealand rabbit, showed good uptake on inflammatory focus promoted by tupertine injection. The leucocytes labeling method developed can be probably applied in clinical procedures and represents cost effective method in substitution of the lipophilic complex of HMPAO.

Evidências apontam para o envolvimento da peroxidação lipídica em diversas patologias. Os hidroperóxidos de lipídios (LOOH) são os produtos primários da peroxidação lipídica e sua decomposição resulta em produtos de maior reatividade e toxicidade, como os radicais peroxila. Esses radicais desempenham papel importante na propagação da peroxidação lipídica e também podem gerar oxigênio molecular singlete (1O2) por meio da combinação de dois radicais peroxila. Neste trabalho investigamos a possibilidade dos LOOH, em particular dos hidroperóxidos de ácido linoléico (LAOOH), de servirem como fonte 1O2 na presença de oxidantes de relevância biológica como metais, peroxinitrito ou ácido hipocloroso. A formação de 1O2 foi claramente demonstrada na reação de LAOOH com esses oxidantes pelas detecções (i) da emissão bimolecular na região espectral do vermelho (λ>570 nm), (ii) da emissão monomolecular no infravermelho-próximo (λ=1270 nm), (iii) do espectro de emissão no infravermelho, e (iv) da intensificação e supressão da luminescência na presença de D2O e azida, respectivamente. Além disso, os mecanismos de reação foram estudados utilizando LAOOH marcados com oxigênio-18 (LA18O18OH) e captadores químicos específicos para 1O2 aliada à tecnica de detecção por HPLC acoplada à espectrometria de massa. Os resultados mostraram a formação de 1O2 marcado [18(1O2) ] na reação de LA18O18OH com os três oxidantes, revelando que os átomos de oxigênio do 1O2 são derivados do hidroperóxido. Em conjunto, as evidências obtidas levam à conclusão de que os LOOH podem servir como fontes potenciais de 1O2 em sistemas biológicos em situações onde haja a coexistência de LOOH e metais, peroxinitrito ou ácido hipocloroso. / Evidences point to the involvement of lipid peroxidation in several diseases. Lipid hydroperoxides (LOOH) are the primary products of lipid peroxidation and their decomposition generates more reactive and toxic compounds, such as peroxyl radicals. These radicals play an important role in the propagation of lipid peroxidation and may also generate singlet molecular oxygen (1O2) by the combination of two peroxyl radicals. In this study we have investigated the possibility of LOOH, in particular linoleic acid hydroperoxide (LAOOH), to be a source of 1O2 in the presence of biologically relevant oxidants such as, metal ions, peroxynitrite or hypochlorous acid. The formation of 1O2 was clearly demonstrated in the reaction of LAOOH with all the three tested oxidants by detecting: (i) the dimol light emission in the red spectral region (λ>570 nm), (ii) the monomol light emission in the near-infrared region (λ=1270 nm), (iii) the infrared light emission spectrum, and (iv) the enhancing effect of deuterium oxide and the quenching effect of azide on light emission. Furthermore, the mechanism was studied using LAOOH labeled with 18-oxygen isotope (LA18O18OH) and specific 1O2 chemical traps in combination with HPLC coupled to mass spectrometry detection. The results have showed the formation of 18-oxygen labeled 1O2 [18(1O2) ] in the reaction of LA18O18OH with the three oxidants, indicating that oxygen atoms in 1O2 are derived from the hydroperoxide. Altogether, the obtained evidences lead to the conclusion that LOOH may serve as a potential source of 1O2 in biological systems, in situations where LOOH can interact with metals, peroxynitrite or hypochlorous acid.

O oxigênio molecular singlete (1O2) é formado em sistemas biológicos e reage com diferentes biomoléculas. Proteínas representam um dos principais alvos de oxidação, devido as suas altas concentrações em organismos. Em pH fisiológico 1O2 reage com His, Tyr, Met, Cys e Trp. Neste trabalho investigamos a oxidação causada pelo 1O2 e a formação de dimerização em uma proteína modelo, a lisozima. A identificação dos principais produtos de oxidação e dimerização foi realizada por sequenciamento de peptídeos através de nano cromatografia acoplada a espectrometria de massas (nLC-MS/MS). A geração de 1O2 foi realizada por fotossensibilização utilizando luz e rosa bengala como fotossensibilizador, e pela decomposição térmica de endoperóxidos derivado do naftaleno DHPN16O2 e DHPN18O2, uma fonte limpa de 1O2 no meio reacional. Os resultados demonstraram que a reação do oxigênio singlete com lisozima acarreta oxidação dos resíduos de Met, His e Trp. A caracterização da estrutura primária por nLC-MS/MS dos aminoácidos confirmou a adição de átomos de oxigênio marcado (18O). A lisozima é constituída apenas de um resíduo de histidina (His15) e as oxidações identificadas foram adições de massas de +14 Da (descrita como 2-oxo-histidina), +16 e +32 Da. Os resíduos de metionina (Met12 e Met105) foram identificados como sulfóxidos (MetSO - adição de massas de +16 Da). Para os resíduos de triptofano foram identificados a formação de quinurenina (adição de massas de +4 Da), +16 e +32 Da. As oxidações levaram a formação de dimerização na proteína caracterizada por eletroforese em gel e nLC-MS/MS. O objetivo principal do trabalho foi analisar a ligação cruzada entre o resíduo de histidina 2-oxohistidina na lisozima. Entretanto, foram identificadas ligações cruzadas entre 2- oxo-histidina e resíduos de lisina, além de ligações cruzadas com resíduos de triptofano oxidado. Em consequência dos resultados obtidos com a proteína modelo, avaliamos as oxidações e formação de dímeros em proteínas extraídas do cristalino do olho bovino. Diferentes tipos de modificações foram observados, além da formação de dímeros entre resíduos de histidina (2-oxoHis-His) caracterizados por nLC-MS/MS e bioinformática. Os dados obtidos neste trabalho, fornecem evidências da ocorrência simultânea de formação de ligações cruzadas entre diferentes proteicas após exposição a 1O2. O trabalho resultou na identificação e sequenciamento através de nLC-MS/MS de peptídeos oxidados por 1O2 a partir de uma proteína modelo. Esses resultados reiteram o importante papel do 1O2 em reações com proteínas além do seu envolvimento no desenvolvimento de condições patológicas. A dimerização formada na ligação cruzada em 2-oxo-His-His representa um possível novo biomarcador para o 1O2 em sistemas biológicos / Singlet molecular oxygen (1O2) can be generated in biological systems, reacting with different biomolecules. Proteins are major target for oxidants due to higher concentration in organisms. At physiological pH, 1O2 may react with the following aminoacids: His, Tyr, Met, Cys and Trp. Here, we investigated oxidation and dimerization reactions of proteins exposed to 1O2 using lysozyme as a model. Modifications of lysozyme by 1O2 were investigated using mass spectrometry approaches. Identification of the main oxidation and dimerization products were performed by peptide sequencing by nano-chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-MS/MS). Singlet oxygen was generated using visible light and rose Bengal as photosensitizer, and from the decomposition of thermolabile endoperoxides DHPN16O2 e DHPN18O2, clean sources of 1O2. Experimental findings showed oxidation of Met, His, and Trp residuesin lysozyme. Structural characterization by nLC-MS/MS of the oxidative modifications in lysozyme tryptic peptides showed the addition of [18O]-labeled atoms in different amino acid residues. Lysozyme has in its structure a single histidine residue (His15). We identified shifts of +14 Da (described as oxohistidine), +16 and +32 Da in this residue. Methionine residues (Met12 and Met105) were oxidized to sulfoxides (MetSO mass shift of +16 Da). Modifications in tryptophan residues were identified as kynurenine (shift mass of +4 Da), +16 and + 32 Da. Oxidized lysozyme subjected to SDS-Page showed dimmers formation. The main aim was to analyze cross-linking formation between 2-oxo-histidine residues in lysozyme. However, cross-links between 2- oxo-histidine and lysine residues, and cross-links between oxidized tryptophan residues have been identified. Following results obtained with the protein model, we evaluated oxidation and the dimers formation in proteins extracted from the lens of the bovine eye. Analysis performed in nLC-MS/MS and bioinformatics identified different types of modifications, including formation of dimers with histidine residues (2-oxo-His-His). The data provided evidence for simultaneous occurrence of protein cross-linking on exposure 1O2. These results demonstrated the important role of 1O2 in protein reactions beyond its involvement in developing of pathological conditions. In conclusion, dimerization of proteins through 2-oxo-His residues may be a possible new biomarker for 1O2 in biological systems.

O oxigênio molecular singlete (1O2) é formado em sistemas biológicos e reage com diferentes biomoléculas. Proteínas representam um dos principais alvos de oxidação, devido as suas altas concentrações em organismos. Em pH fisiológico 1O2 reage com His, Tyr, Met, Cys e Trp. Neste trabalho investigamos a oxidação causada pelo 1O2 e a formação de dimerização em uma proteína modelo, a lisozima. A identificação dos principais produtos de oxidação e dimerização foi realizada por sequenciamento de peptídeos através de nano cromatografia acoplada a espectrometria de massas (nLC-MS/MS). A geração de 1O2 foi realizada por fotossensibilização utilizando luz e rosa bengala como fotossensibilizador, e pela decomposição térmica de endoperóxidos derivado do naftaleno DHPN16O2 e DHPN18O2, uma fonte limpa de 1O2 no meio reacional. Os resultados demonstraram que a reação do oxigênio singlete com lisozima acarreta oxidação dos resíduos de Met, His e Trp. A caracterização da estrutura primária por nLC-MS/MS dos aminoácidos confirmou a adição de átomos de oxigênio marcado (18O). A lisozima é constituída apenas de um resíduo de histidina (His15) e as oxidações identificadas foram adições de massas de +14 Da (descrita como 2-oxo-histidina), +16 e +32 Da. Os resíduos de metionina (Met12 e Met105) foram identificados como sulfóxidos (MetSO - adição de massas de +16 Da). Para os resíduos de triptofano foram identificados a formação de quinurenina (adição de massas de +4 Da), +16 e +32 Da. As oxidações levaram a formação de dimerização na proteína caracterizada por eletroforese em gel e nLC-MS/MS. O objetivo principal do trabalho foi analisar a ligação cruzada entre o resíduo de histidina 2-oxohistidina na lisozima. Entretanto, foram identificadas ligações cruzadas entre 2- oxo-histidina e resíduos de lisina, além de ligações cruzadas com resíduos de triptofano oxidado. Em consequência dos resultados obtidos com a proteína modelo, avaliamos as oxidações e formação de dímeros em proteínas extraídas do cristalino do olho bovino. Diferentes tipos de modificações foram observados, além da formação de dímeros entre resíduos de histidina (2-oxoHis-His) caracterizados por nLC-MS/MS e bioinformática. Os dados obtidos neste trabalho, fornecem evidências da ocorrência simultânea de formação de ligações cruzadas entre diferentes proteicas após exposição a 1O2. O trabalho resultou na identificação e sequenciamento através de nLC-MS/MS de peptídeos oxidados por 1O2 a partir de uma proteína modelo. Esses resultados reiteram o importante papel do 1O2 em reações com proteínas além do seu envolvimento no desenvolvimento de condições patológicas. A dimerização formada na ligação cruzada em 2-oxo-His-His representa um possível novo biomarcador para o 1O2 em sistemas biológicos / Singlet molecular oxygen (1O2) can be generated in biological systems, reacting with different biomolecules. Proteins are major target for oxidants due to higher concentration in organisms. At physiological pH, 1O2 may react with the following aminoacids: His, Tyr, Met, Cys and Trp. Here, we investigated oxidation and dimerization reactions of proteins exposed to 1O2 using lysozyme as a model. Modifications of lysozyme by 1O2 were investigated using mass spectrometry approaches. Identification of the main oxidation and dimerization products were performed by peptide sequencing by nano-chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-MS/MS). Singlet oxygen was generated using visible light and rose Bengal as photosensitizer, and from the decomposition of thermolabile endoperoxides DHPN16O2 e DHPN18O2, clean sources of 1O2. Experimental findings showed oxidation of Met, His, and Trp residuesin lysozyme. Structural characterization by nLC-MS/MS of the oxidative modifications in lysozyme tryptic peptides showed the addition of [18O]-labeled atoms in different amino acid residues. Lysozyme has in its structure a single histidine residue (His15). We identified shifts of +14 Da (described as oxohistidine), +16 and +32 Da in this residue. Methionine residues (Met12 and Met105) were oxidized to sulfoxides (MetSO mass shift of +16 Da). Modifications in tryptophan residues were identified as kynurenine (shift mass of +4 Da), +16 and + 32 Da. Oxidized lysozyme subjected to SDS-Page showed dimmers formation. The main aim was to analyze cross-linking formation between 2-oxo-histidine residues in lysozyme. However, cross-links between 2- oxo-histidine and lysine residues, and cross-links between oxidized tryptophan residues have been identified. Following results obtained with the protein model, we evaluated oxidation and the dimers formation in proteins extracted from the lens of the bovine eye. Analysis performed in nLC-MS/MS and bioinformatics identified different types of modifications, including formation of dimers with histidine residues (2-oxo-His-His). The data provided evidence for simultaneous occurrence of protein cross-linking on exposure 1O2. These results demonstrated the important role of 1O2 in protein reactions beyond its involvement in developing of pathological conditions. In conclusion, dimerization of proteins through 2-oxo-His residues may be a possible new biomarker for 1O2 in biological systems.

Made available in DSpace on 2016-04-25T19:20:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Heloisa Constantino.pdf: 4600659 bytes, checksum: 3eb2ec24b8da27b3dd6558e88733f181 (MD5) Previous issue date: 2015-12-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / According to the media, Muslims tend to violence behavior, are not open to dialogue and oppress their women. This view comes from the representations made in the middle aged Europe and does not reflect the behavior of Islam s faithful people living in our country, but it also represents the imaginary of Brazilian people and interferes directly in the relations among the members of this religious group and the rest of the population. Considering that the Federal Constitution states that every citizen is free for practice the chosen religion, this work intends to analyze the attitude of the media that acts like an instrument of labelling, to demonstrate social mechanisms that cause this behavior of the media and to verify the consequences in the people that lives in Mogi das Cruzes Muslim Community / Segundo os veículos de imprensa, os muçulmanos têm tendências a comportamentos violentos, não têm pré-disposição ao diálogo e oprimem suas mulheres. Esta imagem tem sua origem nas representações elaboradas na Europa medieval e não reflete o comportamento das pessoas fiéis ao Islã que vivem em nosso país, mas está cristalizada no imaginário do povo brasileiro e interfere diretamente nas relações convivência entre os membros deste grupo religioso e o restante da população. Tendo em vista que a Constituição Federal garante a todo cidadão seu direito à liberdade religiosa, este trabalho pretende analisar a postura da mídia que age como instrumento de rotulação, demonstrar os mecanismos sociais que causam esta postura, e verificar quais as consequências desta na vida das pessoas que fazem parte da comunidade muçulmana sediada na cidade de Mogi das Cruzes/SP

Em sistemas de plantio direto, o material vegetal incorporado libera fósforo solúvel no solo, porém, sua absorção por plantas subseqüentes ainda é pouco conhecida. Parte do fósforo nos tecidos vegetais está na forma de compostos insolúveis, que precisam ser mineralizados para serem absorvidos pelas plantas. Os objetivos deste trabalho foram estabelecer a melhor época de aplicação de 32P para marcação de plantas de adubo verde; determinar as formas de P nas plantas; determinar as principais formas de fósforo no solo após a incorporação de diferentes espécies de adubo verde; estimar a eficiência dos adubos verdes no fornecimento de P para plantas de arroz, e determinar a relação entre as formas de P nas plantas de adubo verde e sua mineralização no solo. Os experimentos foram conduzidos em duas etapas. Na Etapa 1 foram marcadas com 32P plantas de aveia-preta, milheto e nabo forrageiro na semeadura e aos 14, 28 e 42 dias. Estas plantas foram incubadas e utilizadas como adubo verde no cultivo de arroz. As plantas de arroz apresentaram eficiência de utilização de P semelhantes para adubos verdes marcados até 28 dias, podendo ser utilizada uma atividade 75% menor para marcação dessas espécies. Na etapa 2 foram cultivadas plantas de aveia-preta, crotalária e nabo forrageiro marcadas com 32P aos 14 dias. Foi verificado que a maioria do P nas plantas está na forma solúvel, correspondendo em média 67% do 32Pt. Essas plantas foram incubadas por 20, 40 e 60 dias e cultivadas plantas de arroz. A eficiência de utilização do P proveniente de adubo verde foi maior para incubação por 20 e 60 dias, diminuindo consideravelmente para incubação por 40 dias. Foram determinadas as frações de P no solo incubado com adubo verde nos diferentes períodos de incubação, utilizando o método de Hedley. A fração Pi-resina e P-NaHCO3, que correspondem ao P-lábil, apresentaram as maiores atividades específicas, demonstrando que a maior parte do P solúvel do adubo verde são encontrados nessas frações. A fração Po-NaOH apresentou as maiores concentrações de P, enquanto as menores foram encontradas na fração P-HCl / In no-tillage systems, plant materials incorporated into soil release soluble phosphorus, but its absorption by subsequent plants is not completely clarified. A fraction of phosphorus in vegetal tissues is in the form of insoluble species, which require mineralization to be absorbed by plants. The aims of this work were to establish the best period for 32P application for green manure labeling; to determine the forms of P in plants and in soil after incorporation of different green manures; to estimate the efficiency of green manures for supplying phosphorus to rice plants and to determine the relationship between the P species in green manure and their mineralization in soil. The experiments were carried out in two steps. In the first, plants of black oat, millet and turnip were labeled with 32P at sowing and after 14, 28 and 42 days. These plants were incubated and used as green manure for rice plants. The rice plants showed similar utilization efficiencies of P form green manure plants labeled up to 28 days, making possible the use of a 75% lower activity to label these plants. In step two, black oat, sunnyhemp and turnip plants labeled with 32P after 14 days from sowing were grown. It was verified that the more significant fraction of P in plants is in the soluble form, corresponding in average 67% of 32Pt. These plants were incubated for 20, 40 and 60 days before culturing rice plants. The utilization efficiency of P from green manure sources was higher when the material was incubated for 20 and 60 days, being considerably reduced for 40 days incubation. The P-fractions in the soil incubated with green manure in different periods were determined by the Hedley method. The Pi-resin and P-NaHCO3 fractions, which correspond to labile P, showed the highest specific activities, because the most significant part of the soluble P was found in these fractions. The Po-NaOH fraction showed the highest concentrations of P, while the lowest amounts were in the P-HCl fraction

Le marquage protéique par fluorescence est une méthode de choix permettant d’étudier l’évolution des protéines depuis leur synthèse cellulaire jusqu’à leur dégradation, en plus de rendre possible leur localisation ainsi que la visualisation des interactions entre protéines. De cet intérêt certain ont découlé différentes techniques de marquage, dont celle présentement développée dans le groupe Keillor. Le principe de celle-ci repose sur la réaction entre deux maléimides portés par un fluorogène et une séquence peptidique cible, laquelle contient deux résidus cystéines séparés par une distance appropriée. Suite à cette double addition de thiols du peptide sur les maléimides du fluorogène, la fluorescence latente de ce dernier est régénérée, menant au marquage covalent de la protéine d’intérêt. Afin d’optimiser la spécificité et la sensibilité de cette méthode de marquage, la synthèse de nouveaux fluorogènes et l’étude de l’efficacité de quench de la fluorescence par les maléimides est présentement en cours dans les laboratoires du groupe Keillor. / The fluorescent labelling of proteins is a powerful approach for following the dynamic process of their cellular synthesis and degradation, in addition to determining their localization and protein-protein interactions. We have developed a ‘small molecule’-based labelling technique that is complementary to existing methods. Our fluorogenic approach relies on the use of dimaleimide fluorogens that react with a target peptide sequence that presents appropriately spaced, solvent-exposed Cys residues. The thiol addition reaction between target sequence and dimaleimide fluorogen restores the latent fluorescence of the latter and results in the covalent fluorescent labelling of the protein of interest. Synthesis of new fluorogens and quench efficiency studies are presently taking place in the Keillor group laboratory in order to optimize the specificity and sensitivity of the labelling method.