Foram objetivos do presente estudo avaliar os efeitos do inoculante microbiano Silobac® (L. plantarum, P. pentosaceus), na silagem pré-secada de alfafa, em 22 silos, sendo 11 destes submetidos ao tratamento com inoculante. A alfafa foi cortada quando em estádio do meio do florescimento e os silos confeccionados em fardos de aproximadamente 600 kg revestidos com película de PVC branca. Amostras foram coletadas logo após a abertura de cada silo para análise da composição bromatológica e perfil fermentativo. Avaliou-se também, os efeitos desta inoculação sobre o consumo de matéria seca, digestibilidade aparente, produção e composição do leite de doze vacas da raça Holandesa, multíparas, com 135 ± 16,4 dias de lactação, distribuídas em delineamento em reversão simples com seqüência balanceada (\"cross-over\") com dois períodos sucessivos. Os tratamentos corresponderam a silagem pré-secada de alfafa (50,0% de MS e 16,5% de PB) controle ou inoculada. Cada período experimental teve duração de 21 dias, sendo os 5 últimos dias destinados à coleta de dados. Nos resultados relativos à fermentação, o inoculante diminuiu o teor de MS (inoculada = 44,7 vs. controle = 51,2%), aumentou a concentração de ácido acético (2,35 vs. 0,89% MS) e apresentou tendência em aumentar os teores de carboidratos solúveis (2,97 vs. 2,44% MS), em relação ao grupo controle. O inoculante também tendeu em diminuir o escore de bolor obtido à 10 cm de profundidade, mas não a 30 ou 50 cm. Não foram observados efeitos sobre os teores de PB (15,9 vs. 16,4% MS), NIDA (11,2 vs. 11,6% do N total), FDN (47,1 vs. 46,7% MS), FDA (40,2 vs. 39,8% MS), LDA (10,4 vs. 11,1% MS) e amido (0,82 vs. 0,69% MS), DIVMS (61,6 vs. 62,5% MS), poder tampão (52,9 vs. 51,7 meq./100g MS), as concentrações de etanol (0,018 vs. 0,024% MS) e dos ácidos propiônico (0,00 vs. 0,00% MS), butírico (0,00 vs. 0,00% MS) e lático (5,62 vs. 4,45% MS), bem como sobre o pH (4,96 vs. 5,33), sobre as concentrações de N-NH3 (8,19 vs. 5,21% do N total) ou sobre a estabilidade aeróbia. Quanto a digestibilidade, o inoculante aumentou a digestibilidade aparente da MS (81,7 vs. 74,2%), PB (83,1 vs. 74,6%), EE (90,1 vs. 81,7%), ENN (84,1 vs. 78,7%), FB (74,8 vs. 61,9%), FDN (70,0 vs. 58,0%), FDA (75,2 vs. 63,9%), amido (92,7 vs. 88,9%), EB (82,4 vs. 74,7%) e o NDT (80,5 vs. 73,3%), em relação ao grupo controle. Porém, não houve efeito do inoculante sobre o consumo MS digestível (14,5 vs. 13,3 kg/animal/dia, ou 2,67 vs. 2,46% do PV) ou de NDT (14,3 vs. 13,2 kg/animal/dia ou 2,63 vs. 2,43% do PV). Também não se observou efeito da inoculação sobre o CMS (17,8 vs. 17,8 kg/animal/dia), produção de leite (23,0 vs. 22,4 kg/dia), porcentagem de gordura (3,46 vs. 3,47%), proteína (2,96 vs. 2,93%), lactose (4,64 vs. 4,67%), sólidos totais (11,9 vs. 11,9%) e sólidos desengordurados (8,49 vs. 8,48%), nos resultados obtidos com as análises de leite. / The objective of this study was to evaluate the effects of microbial inoculant Silobac® (L. plantarum, P. pentosaceus) on twenty-two big bales of alfalfa haylage, eleven treated with inoculant. Alfalfa crop was harvested at middle bloom stage and conditioned in bales about 600 kg capacity and covered with white tube plastic film. Silage was sampled to proceed chemical analyses after each silo was opened. Also was evaluated the effects of this inoculant on dry matter intake, apparent digestibility, milk yield and composition in twelve Holstein cows, at 135 ± 16.4 days in milk. A cross-over design with two periods of sampling was used. Treatments were alfalfa haylage (50.0% DM and 16.5% CP) control or inoculated. Each experimental period extended for twenty-one days, the last five used for data collection. On chemical composition results, inoculation decreased DM content (inoculated = 44.7 vs. control = 51.3%), increased acetic acid content (2.35 vs. 0.89% DM) and tended to increase WSC content (2.97 vs. 2.44% DM) compared to control. It also tended to decrease mould on depth 10 cm, but not on depth 30 or 50 cm. Treatments did not influence CP (15.9 vs. 16.4% DM), ADIN (11.2 vs. 11.6% of total N), NDF (47.1 vs. 46.7% DM), ADF (40.2 vs. 39.8% DM), ADL (10.4 vs. 11.1% DM) and starch contents (0.82 vs. 0.69% DM), IVDMD (61.6 vs. 62.5% DM), buffering capacity (52.9 vs. 51.7 meq./100g DM), ethylic alcohol (0.018 vs. 0.024% DM), propionic (0.00 vs. 0.00% DM), butyric (0.00 vs. 0.00% DM) and lactic acids contents (5.62 vs. 4.45% DM), pH (4.96 vs. 5.33), NH3-N content (8.19 vs. 5.21% of total N) or aerobic stability. As for digestibility, the inoculation increased apparent digestibility of DM (81.7 vs. 74.2%), CP (83.1 vs. 74.6%), EE (90.1 vs. 81.7%), NFE (84.1 vs. 78.7%), CF (74.8 vs. 61.9%), NDF (70.0 vs. 58.0%), ADF (75.2 vs. 63.9%), starch (92.7 vs. 88.9%), GE (82.4 vs. 74.7%) and TDN (80.5 vs. 73.3%) compared to control. However, it did not influence digestible DMI (14.5 vs. 13.3 kg/animal/day or 2.67 vs. 2.46% of BW), nor TDN (14.3 vs. 13.2 kg/animal/day or 2.63 vs. 2.43% of BW). The inoculation did not also influence DMI (17.8 vs. 17.8 kg/animal/day), milk yield (23.0 vs. 22.4 kg/day), fat (3.46 vs. 3.47%), protein (2.96 vs. 2.93%), lactose (4.64 vs. 4.67%), total solids (11.9 vs. 11.9%) and fat free solids percentage (8.49 vs. 8.48%), on milk analysis results.

Carnobacterium maltaromaticum est une bactérie lactique atypique isolée de fromages à pâte molle. Les caractéristiques majeures de cette bactérie sont i) sa capacité à produire un arôme de type malté ou chocolaté, le 3-méthylbutanal à partir du catabolisme de la leucine ii) sa capacité à produire des bactériocines, peptides à activité antibactérienne vis-à-vis de flores pathogènes et/ou d'altération fréquemment rencontrées en industries alimentaire, telle que Listeria monocytogenes. Une caractérisation phénotypique et génotypique réalisée sur six souches de C. maltaromaticum isolées du même biotope a montré que celles-ci ne sont pas phylogénétiquement identiques. Même si ces souches n'ont pas la capacité à coaguler rapidement le lait, elles sont acidotolérantes. Elles n'influent pas sur la capacité ni la rapidité de coagulation des starters, Lactococcus lactis et Streptococcus thermophilus utilisés en industrie laitière. L'étude de l'impact de C. maltaromaticum sur la flore bactérienne du fromage a révélé que sa présence provoque la diminution de la concentration de Psychrobacter, germe pouvant être responsable d'une accélération du phénomène de vieillissement du fromage. Un plan d'expérience a été réalisé pour mettre en évidence ces inhibitions et les éventuelles interactions entre différents facteurs (concentration cellulaire initiale, concentration en NaCl, pH, durée d'incubation). Deux modèles ont été choisis i) Psychrobacter sp. et ii) L. monocytogenes. La concentration cellulaire de C. maltaromatiucm est le facteur le plus important pour inhiber les bactéries testées. Cette espèce opportuniste pourrait être considérée comme un auxilliaire de fabrication intéressant et pourrait être retenue comme flore bactérienne d'affinage. Toutes les souches de C. maltaromaticum testées sont capables de produire du 3-méthylbutanal pouvant conférer une flaveur maltée au fromage. Les études menées sur la biosynthèse du 3-méthylbutanal ont montré la présence et la fonctionnalité de deux voies métaboliques; la voie directe impliquant l'alpha-cétoacide décarboxylase et la voie indirecte passant par l'alpha-cétoacide déshydrogénase. L'oxygénation du milieu de culture a un impact positif sur la formation du 3-méthylbutanal et du 3-méthylbutanol avec la stimulation des voies directes et indirectes / Carnobacterium maltaromaticum is a lactic acid bacterium isolated from atypical soft cheeses. The major characterstics of this bacterium are i) its ability to produce a malty or chocolate-like flavor 3-methylbutanal from leucine catabolism ii) its ability to produce bacteriocins against pathogenic and spoilage bacteria for instance, Listeria monocytogenes. Phenotypic and genotypic characterization of six strains of C. maltaromaticum isolated from the same habitat showed that they were not phylogenetically identical. Although these strains lacked the ability to coagulate the milk quickly, they were acid tolerant. They did not affect the milk coagulation capacity of startes, Lactococcus lactis and Streptococcus thermophilus used in dairy industry. The study on the impact of C. maltaromaticum on the bacterial flora of cheese showed that its presence resulted in the decrease of the concentration of Psychrobacter, which might be responsible for accelerating the aging phenomenon of cheese. An experimental plan was realized to highlight these inhibitions and possible interactions between factors (cell concentration, NaCl, pH, incubation time) by choosing two models i) Psychrobacter sp. and ii) L. monocytogenes. The cell concentration of C. maltaromatiucm was the factor more significant for the inhibitions of the tested bacteria. Being psychrotrophic, alkalinophilic, malty or chocolate flavor producing and biopreservative agent, this species could play a role as a ripening flora of cheese. All strains of C. maltaromaticum tested were able to produce 3-methylbutanal conferring any malt flavor to cheese. The results on the physiology involved in the biosynthesis of 3-methylbutanal showed the presence and functionality of both metabolic pathways; the direct by alpha-ketoacid dacarboxylase enzyme and indirect comprising alpha-keto acid dehydrogenase enzyme. The oxygenation of culture medium had a positif impact on the formation of 3-methylbutanal and 3-methylbutanol with the stimulation of both direct and indirect metabolic routes

O número das espécies microbianas presentes na forragem no ato da colheita é responsável pelo padrão de fermentação da silagem, sendo que o número de unidades formadoras de colônia (ufc) é alterado ao longo do ciclo da cultura e das condições ambientais, e esse fato, influencia fortemente a eficácia de aditivos utilizados no processo. Neste contexto, três experimentos foram conduzidos a fim de caracterizar a população microbiana em plantas de cana-de-açúcar. No primeiro experimento foi caracterizada a população microbiana em plantas de cana-de-açúcar por meio da técnica de plaqueamento. Os tratamentos impostos foram compostos por duas fontes de adubação (NPK e NPK associado a esteco bovino curtido 120kg de N/ha) da cana-de-açúcar colhidas manualmente com vista à quantificação do número de bactérias ácido láticas, leveduras e mofos, bem como relacionar suas freqüências de ocorrência com efeitos ambientais, fonte de fertilizante e estádio de maturação, com colheitas realizadas aos 10, 12, 14 e 18 meses, correspondendo aos meses de Março, Maio, Julho e Novembro de 2009, respectivamente. No segundo experimento foram avaliadas as variáveis biométricas, morfológicas, dinâmica de acúmulo de MS e dos nutrientes em cana-de-açúcar submetida às fontes de fertilização, descritas anteriormente. No terceiro experimento foi realizada avaliação química e bromatológica de cana-de-açúcar submetida à fontes de adubação. O experimento composto por blocos inteiramente casualizados sendo 6 blocos subdivididos em 2 parcelas. Os dados gerados foram analisados pelo procedimento Proc Mixed e Proc NLIN, do programa SAS. Não se observou efeito do tratamento sobre nunhuma variável avaliada. A produtividade média de massa verde variou entre 162 e 188 tMV/ha, podendo ser considerada elevada. O número de folhas verdes partiu de 9,5 aos 10 meses e atingiu cerca de 10 aos 18, o que é esperado, uma vez que ao passar do tempo há aumento da biomassa das plantas. O mesmo se observo para folhas secas, partindo de cerca de zero folhas por planta até cerca de 3 folhas. O peso das folhas também foi crescente. O peso e comprimento do colmo aumentaram de Março para Maio, mas apartir de Maio e Julho esse crescimento foi estagnado, não aumentando significativamente devido à seca. Porém, apartir de Julho esse crescimento voltou a ocorrer com o aumento das chuvas. A cana-de-açúcar apresentou 10 oBrix aos 10 meses, 17oBrix aos 12 meses e 20obrix aos 20 meses. O índice de maturidade aumentou, saindo de 33,46 aos 10 meses e atingindo 88,5 aos 18 meses. Aos 12 meses a cana-de-açúcar apresentou teor de matéria seca de 24%, e aos 18 meses 28%. Os teores de FDN e FDA da planta inteira dimunuiu ao longo do tempo, dos 10 meses (61% e 38,4% de FDN e FDA, respectivamente) para os 12 meses e permanecendo constante até os 18 meses (55% e 35,6% de FDN e FDA, respctivamente). Foi observado que existe correlação positiva entre DIVMS e do oBrix,e a equação, DIVMS = 41,35 + oBrix ; com R2=0,73 e P<0,01 se estabelecendo como ferramenta importante para se estimar a DIVMS. Ao longo do tempo, a contagem de bactérias ácido láticas e de leveduras foi crescente. De forma geral, todas as frações da planta apresentaram contagem numericamente semelhante, partindo de cerca de 4log ufc/gMV aos 10 meses e atingindo cerca de 5,5 log ufc/gMV aos 18 meses. Aos 10 meses a planta inteira de cana-de-açúcar apresentou contagem de leveduras de 4 log ufc/g MV permanecendo constante até os 18 meses, quando atingiu 5,7 log ufc/g MV. A fonte de adubação, quer seja química ou orgânica, não interfere na população de microrganismos, que entretanto, varia em função do período experimental e das condições climáticas. / The numbe of microbial species in forages during the ensiling is responsible for the silage fermentation, and the numbeof colony forming units (cfu) changes during the crop cycle and environmental conditions. It suggests that the initial microbial profile strongly influences the effectiveness of additives used in the process. In this context, we propose three trials to characterize the microbial population in plants of sugarcane. The first trial evaluated the microbial population in plants of sugarcane by the technique of pour plating. The treatment consisted of two levels of fertilization (NPK and NPK associated with solid manure - 120kg N / ha) applied immediately after sugarcane was harvested by hand. The objective was quantify the number of lactic acid bacteria, yeasts and molds, as well as relating their frequencies with environmental effects, fertilization and stage of maturation, with samples taken at 10, 12, 14 and 18 months, corresponding to the months of March, May, July and November 2009. The second trial measured the biometric variables, morphological, the accumulation of dry matter and nutrients in sugarcane subjected the sources of fertilization, as mensioned. The third trial performed chemical assessments of sugarcane subjected to the sources of fertilization. The trials consisted of a completely randomized design with six blocks sub-divided into two plots. Data were analyzed by the procedure Proc Mixed and Proc NLIN of SAS program. There was no effect of treatment in any trial. The fresh yield ranged from 162 to 188tGM/ha which can be considered high. The number of green leaves was increased from 9.5 to 10 to 10 to 18, which is expected, since there is an increase of plant biomass across the time. The same was observed for dead leaves, from about 0 leaves per plant up to 3 leaves. The weight of the leaves was also increased. The weight and length of the stem increased from March to May, and became more intensive from July with increasing rainfall. However, during the dry season (May - July) there was a decreased growing rate.The sugarcane oBrix was 10 at 10 months, 17 oBrix at 12 months and 20oBrix to 20 months. The maturity index increased, from 33.46 to 10 months reaching 88.5 at 18 months. At 12 months the sugarcane showed dry matter content of 24% and 28% at 18 month. The NDF and ADF of the whole plant decreased over time from 10 months (61% and 38.4% NDF and ADF, respectively) for 12 months and remained constant until 18 months (55% and 35 6% NDF and ADF, respectively). A is positive correlation between IVDMD and oBrix was observed, and the equation, IVDMD = 41.35 + oBrix, with R2 = 0.73 and P <0.01 is an important tool to estimate IVDMD. Over time, the counts of lactic acid bacteria were increased. In general, all plant fractions showed similar counts, starting from 4 log cfu/gGM to 10 months and reaching about 5.5 log cfu/gGM to 18 months. At 10 months the whole plant sugarcane had yeast count of 4 log cfu/gGM remaining constant until 18 months, when it reached 5.7 log cfu / g MV. The source of fertilizer, whether chemical or organic, does not interfere in the population of microorganisms, however, varies depending on the experimental period and climatic conditions.

A sobrevivência de duas cepas de Lactobacillus paracasei (LBC81 e ELBAL) coencapsulados com frutooligossacarídeos (FOS) em alginato de cálcio revestidos ou não com gelatina foram avaliados em pH 1,5, na presença de 1% e 2% de sais biliares e armazenamento a 4°C. O rendimento da microencapsulação e o tamanho das microcápsulas foram avaliados. O tamanho das microcápsulas não revestidas com gelatina variou entre 1,5 e 1,7 mm e as revestidas apresentaram variação entre 1,8 e 2,0 mm. O rendimento da microencapsulação foi de 59% a 73%. Os probióticos microencapsulados foram resistentes ao baixo pH, à presença de sais biliares e ao armazenamento em baixas temperaturas durante 35 dias, apresentando viabilidade acima de 8,0 Log UFC/mL. As células livres não resistiram nas mesmas condições. Lactobacillus paracasei (LBC81) microencapsulados com 1,5% de FOS revestidos com gelatina foram capazes de fermentar os extratos hidrossolúveis de castanha do Brasil e baru, separadamente. Os extratos hidrossolúveis fermentados apresentaram características desejáveis de pH (5,5) e concentração de ácido lático (1,4%), dentro dos padrões exigidos para esse tipo de bebida durante a fermentação e após 21 dias armazenamento. A população de células durante e após o armazenamento sob refrigeração foi de 9,5 Log UFC/mL, acima do recomendado pela Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO) para causar benefícios à saúde do consumidor. Os extratos podem ser utilizados comercialmente para produção de novas bebidas funcionais. Este é o primeiro estudo em que foram utilizados probióticos microencapsulados para o desenvolvimento de bebidas à base de oleaginosas. / The survival of two strains of Lactobacillus paracasei (LBC81 and ELBAL) coencapsulated with fructooligosaccharides (FOS) in calcium alginate coated with or without gelatin were evaluated at pH 1.5, in the presence of 1% and 2% of bile salts and storage at 4°C. The yield of the microencapsulation and the size of the microcapsules were evaluated. The size of the gelatin uncoated microcapsules varied among 1.5 and 1.7 mm and those coated presented variation among 1.8 and 2.0 mm. The yield of the microencapsulation was 59% to 73%. Microencapsulated probiotics were resistant to low pH, presence of bile salts and to low temperatures storage, presenting cell viability above 8,0 Log CFU/mL for 35 days, and free cells did not resist under the same conditions. Lactobacillus paracasei (LBC81) microencapsulated with 1.5% FOS coated with gelatin were able to ferment water soluble extracts of Brazil nuts and baru, separately. The fermented water soluble extracts presented desirable characteristics of pH (5,5) and lactic acid concentration (1,4%) within the standards required for this type of beverage during fermentation and after 21 days of storage. The cell population during and after the refrigerated storage was 9,5 Log UFC/mL, above that recommended by the United Nations Food and Agriculture Organization (FAO) to cause consumer health benefits. The extracts can be used commercially for the production of new functional beverages. This is the first study in which microencapsulated probiotics have been used for the development of oleaginous based beverages.

La contamination fongique des produits laitiers est à l’origine de pertes économiques conséquentes et de gaspillage alimentaire. Dans un contexte de demande pour plus de « naturalité », les cultures de bioprotection et leurs métabolites représentent une alternative d’intérêt aux conservateurs chimiques pour lutter contre ces contaminants.Les objectifs de cette thèse étaient i) de sélectionner des micro-organismes présentant une activité antifongique, pour élaborer des cultures de bioprotection applicables dans des produits laitiers, et ii) d’étudier les composés potentiellement supports de l’activité antifongique observée. Dans un premier temps, l’activité antifongique de 32 souches de bactéries lactiques et propioniques a été étudiée en modèles « fromage » et « yaourt ». L’étude de combinaisons de souches et de leur innocuité a conduit à sélectionner 2 combinaisons binaires de lactobacilles (A1 et A3). Leur efficacité et applicabilité a été évaluée à l’échelle pilote en fabrication de crème fraîche et de fromage.Les challenges tests et tests d’usages ont montré que selon le produit laitier, A1 et A3 ont une activité antifongique similaire ou supérieure que les cultures bioprotectrices commerciales. Selon l’inoculum ajouté, ces cultures n’impactent pas les caractéristiques technologiques et organoleptiques des produits laitiers. Des méthodes chromatographiques des composés antifongiques suivies d’analyses statistiques ont permis de mettre en évidence des « cocktails » de 2 à 17 composés, selon la matrice et la culture considérée, qui sont probablement supports de l’activité antifongique.Ces travaux contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’activité antifongique et devraient conduire au développement de cultures antifongique pour remplacer les conservateurs dans les produits laitiers. / Fungal contamination of dairy products is responsible for economic losses and food waste. In a context of “preservative-free” product demand, bioprotective cultures and their metabolites represe,t an alternative of interest of chemical preservatives to control these spoilers.The objective of this study was i) to select microorganisms exhibiting an antifungal activity, in order to elaborate bioprotectivecultures applicable in dairy products, and ii) to study the compounds potentially supporting the observed activity. Firstly, the antifungal activity of 32 strains of lactic acid and propionic bacteria screened in cheese model and yogurt. Strain combinaison study and safety assessment led to the selection of 2 binary lactobacilli combinations (A1 and A3). Their efficiency and applicability were then evaluated in pilot-scale productions of sour cream and cheese.Challenge and shelf life tests showed that depending on the dairy product, A1 and A3 have a similar or higher antifungal activity than the commercial bioprotective cultures. In addition, depending of inoculum, A1 and A3 did not impact the technological and organoleptic characteristics. Chromatographic methods and statistical analyses allowed identifying cocktails of 2 to 17 compounds, according to the considered dairy product and culture that probably support the antifungal activity.The obtained results contribute to a better understanding of the antifungal activity action mechanisms and should lead to the development of antifungal cultures to replace preservatives in dairy products.

O presente trabalho tem como objetivo estudar o perfil de acidificação e a inter-relação entre Streptococcus thermophilus TAO, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LB340, Lactobacillus acidophilus LAC, Lactobacillus rhamnosus LBA, Bifidobacterium lactis BL04 como culturas associadas em leite fermentado. Cinco leites fermentados foram preparados, sendo a composição das co-culturas a variável estudada. O perfil de acidificação foi monitorado e os parâmetros cinéticos, calculados. Os produtos foram submetidos às análises físico-químicas e microbiológicas durante o armazenamento a 4°C. As associações em cultura mista provocaram a redução do tempo de fermentação do leite. Durante os 21 dias de armazenamento o pH e a firmeza dos leites fermentados variaram. Streptococcus thermophilus TAO, Bifidobacterium lactis BL04 e Lactobacillus rhamnosus LBA forneceram contagens acima de 106 log UFC/mL, porém Lactobacillus acidophilus LAC e Lactobacillus bulgaricus LB340 foram inibidos em cultura mista, demonstrando dificuldades de crescimento quando associados às demais bactérias ácido-láticas. / The present study aimed to evaluate the acidification kinectic and inter-relation between Streptococcus thermophilus TAO, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LB340, Lactobacillus acidophilus LAC, Lactobacillus rhamnosus LBA, Bifidobacterium lactis BL04 like association cultures in fermented milk. Five fermented milks were prepared and studied variable analyzed was the co-cultures composition. Acidification was monitored and the kinectic parameters were calculated. The products were submitted to physical chemistry and microbiological analyses during the storage at 4°C. The associations in mixed cultures promoted the reduction of fermentation time of the milks. During 21 days of storage, pH and firmness of fermented milks varied. Streptococcus thermophilus TAO, Bifidobacterium lactis BL04 and Lactobacillus rhamnosus LBA presented counts above 106 log cfu/mL. However, Lactobacillus acidophilus LAC and Lactobacillus bulgaricus LB340 were inhibited in mixed cultures demonstrating that these strains had difficulty to grow when in associated cultures with lactic acid bacteria.

A formação de biofilmes é um fator preocupante para indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização de superfícies de contato e aumentar o risco de contaminação por patógeno em alimentos processados. L. monocytogenes é uma bactéria de ampla distribuição no ambiente e com capacidade de formar biofilmes e sobreviver por longos períodos em condições adversas. Esta bactéria pode causar doenças em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas manifestando-se por infecções do sistema nervoso central, abortos e nascimentos prematuros. Vários estudos têm demonstrado que algumas bactérias podem sofrer transição para o estado viável mas não cultivável em resposta ao estresse. Considerando-se a importância da garantia da segurança e qualidade dos alimentos, há necessidade de desenvolvimento e de padronização de técnicas rápidas para a quantificação de células viáveis de L. monocytogenes em alimentos e biofilmes. Neste estudo foi avaliada a formação de biofilmes e viabilidade celular de Listeria monocytogenes em condições de estresse. Foram utilizadas técnicas de semeadura em placa e quantificação direta por microscopia de fluorescência com os corantes cloreto de 5-ciano-2,3-di-(p-tolil) tetrazólio (CTC) e 4,6-diamino-2- fenilindol (DAPI). Foram também realizados ensaios preliminares para padronização da Reação da Polimerase em Cadeia em tempo real (PCR em tempo real) com amostras previamente tratadas com brometo de etídio monoazídico (EMA). Os resultados obtidos demonstraram que o método de semeadura em placa foi adequado somente para a enumeração de células viáveis de L. monocytogenes em biofilmes enquanto que o método de enumeração por microscopia de fluorescência com CTC-DAPI permitiu quantificar bactérias no estado viável e viável mas não cultivável. Também foi observado que a presença de bacteriocinas de L. sakei 1 e L. mensenteroides 11 causou a diminuição na viabilidade e formação de biofilmes por L. monocytogenes. Os resultados preliminares utilizando culturas puras de L. monocytogenes demonstraram que o tratamento com brometo de etídio monoazídico (EMA) antes da análise por PCR em tempo real reduziu a amplificação do DNA de células mortas em 1 log de UFC por mL. No entanto dependendo da concentração utilizada, pode ocorrer também a inibição da amplificação de células viáveis de L. monocytogenes. Os resultados do presente trabalho indicaram que a microscopia de fluorescência é comparável à placa para análise de células de L. monocytogenes não estressadas. Entretanto, para a quantificação de L. monocytogenes submetida a estresse, é desejável a utilização de corantes de viabilidade celular. O método de PCR em tempo real com pré-tratamento com EMA é promissor mas, ainda necessita de maior padronização para avaliação de sua aplicabilidade na determinação seletiva de células viáveis de L. monocytogenes. / Biofilm formation is of great concern for food industry because it may compromise sanitization of surfaces and increase contamination risk of processed foods by bacterial pathogens. L. monocytogenes is an ubiquitous bacterium which is able to form biofilms and to survive for long periods under adverse conditions. L. monocytogenes may cause disease in immunocomprommised people and pregnant women, manifesting as central nervous system infections, abortion and premature birth. Some bacteria can undergo transition to viable but non-cultivable state in response to stress and it is important to study techniques for rapid quantification of viable cells of L. monocytogenes in foods. In this study biofilm formation and cell viability of Listeria monocytogenes were studied in stress conditions by plate counting, direct quantification by fluorescence microscopy with double staining dyes 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)/4\'-6 diamino-2 phenylindole (DAPI). Preliminary experiments with real time polymerase chain reaction and treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) were also performed. The results showed that plate count method was suitable for enumeration only of viable cells of L. monocytogenes in biofilms since, fluorescence microscopy with CTC-DAPI yielded higher counts, probably due to the presence of viable but nonculturable cells. It was also observed that the presence of bacteriocins of L. sakei 1 and L. mensenteroides 11 decreased viability and formation of biofilm by L. monocytogenes. Results obtained with pure cultures of L. monocytogenes showed that the treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) before real time PCR detection, reduced DNA amplification of dead cells in 1 log CFU per mL, but depending on the concentration used, EMA also inhibited amplification of viable cells of L. monocytogenes. The results indicated that plate counting and fluorescence microscopy are equivalent for enumeration of non-stressed L. monocytogenes cells. However, the use of double staining with fluorescence microscopy is a more suitable method if stressed cells are present. The EMA-real time PCR is a promissing tool for rapid evaluation of viable L. monocytogenes, but it needs further standartization.

Orientador: Ismael Antonio Bonassi / Banca: Maura Seiko T. Esperancini / Banca: Regina de Oliveira Moraes Arruda / Resumo: No presente trabalho estudou-se o comportamento das hortaliças couve-flor e feijão-vagem, submetidas ao processo de fermentação lática controlada sob temperatura de 20 C (variação de 0,5 C). O experimento constituiu-se de três ensaios de fermentação para cada uma das hortaliças: Tratamento Controle (Testemunha), Tratamento com Adição de Inóculo Comercial e Tratamento com Adição de Inóculo Comercial + Adição de Acido Lático. O monitoramento das fermentações foi realizado por meio de análises químicas, físicas, físico-químicas e microbiológicas, no decorrer e no final do processo fermentativo. Para a avaliação sensorial foram elaborados picles em vinagre de vinho branco condimentado, utilizando-se dos produtos fermentados e a matéria-prima "in natura'. A pesquisa foi complementada com o estudo do gasto de energia elétrica e do custo de elaboração dos produtos fermentados, considerando-se o processamento em laboratório; e foi determinado o consumo de energia e sua racionalização, comparando-se com o armazenamento refrigerado (processamento mínimo) das diferentes hortaliças em estudo. Os resultados obtidos através das análises químicas, físico-químicas e microbiológicas, permitiram verificar que as fermentações transcorreram normalmente, obtendo-se produtos com características desejáveis, ou seja, de alimento fermentado e produzidos com as condições tecnológicas para se apresentaram seguros, em relação aos aspectos de conservação e de saúde pública. Para ambas as hortaliças estudadas (couve-flor e feijão-vagem), os tratamentos em que houve Adição de Inóculo Comercial, resultaram em produtos com níveis mais elevados de acidez. Para couve-flor a maior acidez foi desenvolvida no tratamento com Adição de Inóculo Comercial;...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the present work it was studied the behavior of the vegetables cauliflower and snap-bean, submitted to the process of controlled lactic acid fermentation under temperature of 20 °C (variation of l 0,5 °C). The experiment was constituted for three trials of fermentation process for each one of the vegetables: Control Treatment (test) with Addition of Starter (Lactobacillus plantarum) and with Addition of Starter (L. plantarum) + Lactic Acid. The monitoring of the fermentations was accomplished through chemical, physical, physical-chemical and microbiological analyses, during and at the end of the fermentation process. Using the fermented products and raw vegetable, pickles were elaborated in spiced white vinegar for the purpose of sensorial evaluation. Parallelly, the research was complemented with the study of the expense of electric energy and the elaboration cost of the fermented products, being considered the processing in laboratory; and also, it was verified of the consumption of energy and its rationalization, being compared with the refrigerated storage (minimum processing) of the different vegetables in study. The obtained results through the chemical, physical-chemical and microbiological analyses, allowed to verify that the fermentations usually elapsed, being obtained products with desirable characteristics, that is to say, of fermented food and produced with the technological conditions for they came safe, in relation to the conservation aspects and of public health. For both studied vegetables (cauliflower and snap-bean), the treatments in that there were Addition of Starter, they resulted in products with a higher acidity levels. For cauliflower the greatest acidity was developed in the treatment with Addition of Starter;...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

L’utilisation de bactéries lactiques (BL), telle que Lactococcus lactis (LL), comme vecteur de transfert d’ADN, constitue une stratégie prometteuse dans la mesure où elles sont considérées sans risque pour la santé. Des souches sauvages (wt) ou recombinantes de LL ont été décrites comme capables de transférer un plasmide dans des cellules épithéliales in vitro et in vivo. Cependant, les mécanismes d'action grâce auxquels certaines souches de LL ont la capacité de transférer de l’ADN plasmidique sont toujours inconnus. C’est pourquoi, nous avons décidé de construire une nouvelle souche recombinante de LL exprimant l’internaline mutée (mlnlA,) à partir de la souche pathogène Listeria monocytogenes, de manière à comprendre par quel procédé l’ADN est transféré à des cellules eucaryotes. Nous avons détecté l’expression de mInIA par FACS et montré que la souche LLmInIA était plus invasive que la souche sauvage wt après co-incubation avec des cellules épithéliales intestinales (IECs) non confluentes ou polarisées. La microscopie confocale confirme ces propriétés d’invasivité de la souche LL-mLnLA capable de transférer plus efficacement le vecteur d’expression eucaryote codant pour l’allergène de la β-lactoglobuline, pValac :BLG, in vitro dans des IECs et dans des cellules dendritiques (DCs). La souche LL-mInIA a aussi la capacité de transférer le vecteur pValac:BLG à des DCs à travers une monocouche de IECs différenciées. Des essais in vivo montrent que des bactéries invasives du genre Lactococcus ont tendance à augmenter l’expression de BLG chez la souris. De plus, il est montré qu’une souche non invasive de LL, ou la souche invasive LL-mInIA, stimulent la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-12 dans des DCs, et que, in vivo, après des essais d’immunisation oraux ou intra nasaux, la souche LL non invasive oriente la réponse immunitaire plutôt vers le type 1, alors que la souche LL invasive génère une réponse de type 2 chez des animaux immunisés. Tous ces résultats apportent un nouvel éclairage sur le mécanisme d’assimilation des lactocoques en tant que vecteurs de transfert de molécules actives. / The use of Lactic Acid Bacteria (LAB), such as Lactococcus lactis (LL), as DNA delivery vehicles represents an interesting strategy as they are regarded as safe. Wild type (wt) LL or recombinant invasive LL, were able to trigger DNA expression by epithelial cells both in vitro and in vivo. However, important information about how LL can transfer DNA plasmids is still missing. Therefore, we decided to construct a new recombinant invasive LL strain expressing mutated Internalin A (mInlA) from the pathogen Listeria monocytogenes to understand the manner by which the DNA is transferred to mammalian cells. mInlA expression was detected by FACS analysis and LL-mInlA strain showed to be more invasive than the wt strain after co-incubation assays with non-confluent or polarized intestinal epithelial cells (IECs). Confocal microscopy confirmed the invasive status of LL-mInlA which demonstrated to deliver more efficiently the eukaryotic expression vector coding the allergen β-lactoglobulin, pValac:BLG, in vitro to IECs and to dendritic cells (DCs). LL-mInlA was also capable to transfer pValac:BLG to DCs across a monolayer of differentiated IECs. In vivo, invasive lactococci tended to increase the number of mice expressing BLG. Moreover, noninvasive or invasive LL-mInlA stimulated the secretion of the pro-inflammatory cytokine IL-12 in DCs and, in vivo, after oral or intranasal immunization trials, non-invasive LL polarized the immune response more in the type 1 direction while invasive LL generated a Th2-type response in immunized animals. All these data gives new insights on the mechanism of lactococci uptake for delivery of therapeutics.

Bacteriocins are peptides produced by various species of bacteria, especially lactic acid bacteria (LABs), which exhibit a large spectrum of action against spoilage bacteria and foodborne pathogens. However, when this bacteriocin has not been completely characterized regarding its amino acid and the nucleotide sequences of the corresponding gene, the qualified term bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) is recommended. In order to increase the antimicrobial activity of bacteriocins, the ability of probiotics LABs, such as Pediococcus pentosaceus, to ferment different carbon and nitrogen sources has been studied. For the development of an improved culture medium, carbon and nitrogen sources must be considered as nutrients responsible for cell growth and bacteriocin production. The best condition, after 48 h of cultivation, for growth (3.420 g/L) and for BLIS production by Pediococcus pentosaceus ATCC 43200 was in Man, Rogosa and Sharp (MRS) culture medium supplemented with 1.5% peptone, initial pH 6.0 and under the following culture conditions: anaerobiosis, 30oC and agitation of 200 rpm. Compared with control (MRS without supplement), the growth of Pediococcus was significantly lower (1.995 g/L) as well as it reduced significantly its generation time from 2.05 h (control) to 1.28 h (MRS supplemented), a reduction of approximately 62.5%. Moreover, addiction of peptone to MRS medium promoted reduction of 4 h to the Pediococcus exponential phase onset. Regarding BLIS antimicrobial activity, addition of nitrogen source to MRS medium was also quite significant. Through the agar diffusion method, BLIS showed inhibition halos between 12.50 and 19.50 mm against LABs strains (Lactobacillus sakei ATCC 15521, Lactobacillus plantarum CECT 221 and Carnobacterium piscicola CECT 4020). Against Listeria strains (Listeria innocua NCTC 111288 and Listeria seeligeri NCTC 11289), their antimicrobial activity was better detected in liquid medium assay, evaluating the minimal inhibitory concentration of 50%. BLIS was able to inhibit 60 and 100% of L. seeligeri and L. innocua, respectively, as well as, diluted 1x (v/v) in water was able to inhibit 100% growth of both Listeria. BLIS 17 showed also good results as food preservative when applied in ready-to-eat pork ham artificially contaminated with L. seeligeri in vacuum-package at 4oC during shelf life of 10 days. BLIS was able to maintain low Listeria multiplication, lower samples weight loss, low lipid peroxidation and good color parameters during samples storage. Results demonstrated the importance of optimizing the culture medium to increase microbial mass, to produce and to improve the activity of this antimicrobial molecule. Moreover, results also suggest the possible application of BLIS as a natural food preservative. / Bacteriocinas são peptídeos produzidos por várias espécies de bactérias, especialmente bactérias ácido-láticas (BALs) e apresentam um amplo espectro de ação contra bactérias deteriorantes e patógenos de origem alimentar. Entretanto, quando estas bacteriocinas não foram completamente caracterizadas quanto a sequência de seus nucleotídeos e do seu gene correspondente, é recomendada a denominação de substância semelhante a bacteriocina (BLIS). Para aumentar a atividade antimicrobiana de bacteriocinas, a habilidade de BALs probióticas, como Pediococcus pentosaceus, em fermentar diferentes fontes de carbono e nitrogênio tem sido estudado. Para o desenvolvimento de um meio de cultura melhorado, fontes de carbono e nitrogênio devem ser consideradas como nutrientes responsáveis pelo crescimento celular e pela produção de bacteriocina. A melhor condição, após 48 h de cultivo, para o crescimento (3,420 g/L) e para a produção de BLIS por P. pentosaceus ATCC 43200 foi em meio de cultivo Man, Rogosa e Sharp (MRS) suplementado com 1,5% de peptona, pH inicial 6,0 e sob as seguintes condições de cultivo: anaerobiose, 30oC e agitação de 200 rpm. Comparado ao controle (MRS sem suplementação), o crescimento de Pediococcus foi significativamente menor (1,995 g/L) assim, como também, reduziu significativamente o tempo de geração de 2,05 h (controle) para 1,28 h (MRS suplementado), uma redução de aproximadamente 62,5%. Além disso, a adição de peptona ao meio MRS promoveu redução de 4 h para o início da fase exponencial de Pediococcus. Quanto a atividade antimicrobiana de BLIS, a adição de fonte de nitrogênio ao meio MRS também foi bastante significativa. Através do método ágar difusão, BLIS apresentou halos de inibição entre 12,50 a 19,50 mm contra cepas de BALs (Lactobacillus sakei ATCC 15521, Lactobacillus plantarum CECT 221 e Carnobacterium piscicola CECT 4020). Contra cepas de Listeria (Listeria innocua NCTC 11288 e Listeria seeligeri NCTC 11289), a sua atividade inibitória foi melhor detectada em meio líquido, através da determinação da concentração mínima inibitória de 50%. BLIS sem diluição foi capaz de inibir 60 e 100% de L. seeligeri e L. innocua, 15 respectivamente, assim como, diluído 1x (v/v) em água foi capaz de inibir 100% o crescimento de ambas Listeria. BLIS também apresentou bons resultados como conservante de alimento quando aplicado em presunto contaminado artificialmente com L. seeligeri e armazenado a 4oC a vácuo por 10 dias. BLIS foi capaz de manter baixa a multiplicação de Listeria, menor perda de peso das amostras, baixa peroxidação lipídica e bons parâmetros de cor durante o armazenamento das amostras. Os resultados demonstraram a importância de se otimizar meio de cultivo tanto para o aumento da massa microbiana como para a produção e melhoramento da atividade desta molécula antimicrobiana. Além disso, os resultados também sugerem a possível aplicação de BLIS como conservante natural de alimentos.