La brucellose est une zoonose causée par le genre bactérien Brucella (B.) dont l’incidence mondiale est estimée à 500 000 cas humains par an. Le réservoir est animal, touchant principalement les espèces de rente. Les espèces les plus importantes pour l’Homme sont B. melitensis, B. abortus et B. suis qui partagent plus de 90% d’identité de séquence. Bien qu’elles soient très apparentées sur le plan génétique, elles présentent une diversité de caractéristiques phénotypiques, de préférence d’hôte et de pathogénicité. L’homogénéité génétique de ces espèces peut apparaître comme un atout pour le développement d’outils de diagnostic universels robustes. En revanche, il s’agit d’un challenge pour les distinguer, rendant difficile la caractérisation précise des isolats issus d’un même foyer. Dans le cadre de cette thèse, un outil de diagnostic moléculaire de PCR en temps réel ciblant le genre Brucella a été développé et optimisé. L’outil a été évalué sur des prélèvements de lait de ruminants, ces prélèvements peuvent être une source importante de Brucella et peuvent être utiles au dépistage de la maladie à l’échelle du troupeau. Basée sur la détection de l’élément d’insertion IS711, une séquence présente en plusieurs exemplaires dans le génome, cette méthode affiche des valeurs de sensibilité et de spécificité qui la rendent intéressante pour un schéma global de lutte contre la brucellose. D’autre part, en vue d’améliorer la compréhension de la stabilité génétique de B. melitensis, un panel original de souches isolées dans le cadre d’un foyer et impliquant 4 espèces d’hôtes différentes a été comparé. Ainsi à l’aide de différentes approches complémentaires, leurs séquences génomiques, les caractères phénotypiques ainsi que leurs comportements dans un modèle in vitro ont été comparés. Nos résultats n’ont pas mis en évidence marqueurs qui laisserait à penser que des mutations dans le génome soient indispensables pour s’adapter à un nouvel hôte / Brucellosis is a zoonotic disease caused by the bacterial genus Brucella (B.), whose global incidence is estimated at 500,000 human cases per year. The reservoir is animal, affecting mainly livestock. The most important species for humans are B. melitensis, B. abortus and B. suis, which share more than 90% sequence identity. Although highly genetically related, Brucella spp. exhibit a variety of phenotypic characteristics, host preference and pathogenicity. The genetic homogeneity of these species may appear as an asset for the development of robust universal diagnostic tools. On the other hand, it is a challenge to distinguish them, making it difficult to precisely characterize isolates from the same outbreak. As part of this thesis, a real-time PCR molecular diagnostic tool targeting the genus Brucella was developed and optimized. The method has been evaluated on ruminant milk samples; these samples may be an important source of Brucella and may be useful for herd-scale disease screening. Based on the detection of the IS711 insertion element, a sequence present in several copies within the genome, this method displays sensitivity and specificity values that make it interesting for a global scheme to fight against brucellosis. On the other hand, in order to improve the understanding of the genetic stability of B. melitensis, an original panel of strains isolated in an outbreak and involving four different host species was compared. Thus, using different complementary approaches, their genomic sequences, phenotypic characteristics and their behavior in an in vitro model were compared. Our results did not highlight markers that would suggest that mutations in the genome are essential to adapt to a new host

Au cours de leur lactation, les vaches laitières font face à d’importants besoins en calcium du fait de la production laitière. L'augmentation très rapide de ces besoins en début de lactation fait que l’organisme des vaches peut difficilement s’adapter par une hausse de l’ingestion et de l’absorption digestive de calcium. L’organisme doit puiser dans les réserves osseuses, qui seront reconstituées plus tard en fin de lactation. Ces cycles de mobilisation et reconstitution osseuses restent cependant impossibles à quantifier chez la vache laitière sur de larges effectifs et les conséquences d’une mauvaise reconstitution osseuse sur les lactations suivantes restent inconnues. Cette thèse avait pour objectif de développer un indicateur des phénomènes de mobilisation et reconstitution osseuse au cours de la lactation.Plusieurs facteurs de mobilisation osseuse ont pu être identifiés, comme la race, la parité ou l’alimentation. Cependant, les cycles de mobilisation et de reconstitution osseuse n’ont pas pu être reliés à des variations de la composition du lait en Ca et P. Il a cependant pu être montré, que contrairement à ce qui est décrit dans la littérature, un apport insuffisant en Ca en début de lactation n’est pas toujours accompagné d’une augmentation de la mobilisation osseuse, mais peut être compensé par une augmentation des capacités d’absorption digestive. Cette thèse montre aussi la nécessité de quantifier les conséquences d’un apport insuffisant de calcium alimentaire sur les performances de production et la santé des vaches laitières sur l’ensemble de la lactation. / During lactations, dairy cows faces huge calcium requirements due to milk production. Because of the fast increase in those requirements at the beginning of the lactation, the organism of dairy cows can hardly adapt by increasing intake and digestive calcium absorption. The organism must mobilize calcium from its storage pool, bones, which will replenish later in lactation. Those cycles of bone mobilization and reconstitution remain impossible to quantify for important number of dairy cows and the consequences of an incomplete bone reconstitution on following lactation remain unknown. The aim of this PhD was to develop an indicator of the phenomenon of bone mobilization and reconstitution during lactation.Several factors increasing bone mobilization have been identified, such as breed, parity or diet. However, the cycles of bone mobilization and reconstitution could not be related to variation in milk Ca and P content. However, it has been showed that, an insufficient Ca supply in early lactation does not always induce a higher bone mobilization, as it has been described in the literature, but can be compensated by an increase in digestive absorption capacity. The thesis also showed the need to quantify the consequences on insufficient dietary calcium supply on dairy cows’ milk production and health throughout lactation.

Les bactéries lactiques (BAL) ont été utilisées par l\'humanité depuis des siècles en raison de leurs propriétés technologiques et de leur capacité à améliorer les propriétés organoleptiques des aliments. En outre, la demande des consommateurs pour des produits laitiers sains et dépourvus de conservateurs chimiques est de plus en plus grande.Dans ce contexte, l\'utilisation de bactéries lactiques utilisées depuis des siècles pour la fermentation des produits laitiers semble pertinente pour améliorer la digestibilité et/ou prolonger la durée de vie des produits laitiers fermentés. L\'une des principales propriétés de ces bactéries est la production de substances antimicrobiennes telles que des bactériocines, des peptides ou des composés non protéiques de faible poids moléculaire (acides organiques, H2O2, et ainsi de suite) qui inhibent la croissance des pathogènes alimentaires et des micro-organismes d\'altération. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens ribosomiques produits entre autre par certaines bactéries lactiques et qui possèdent un spectre d\'inhibition étroit ciblant généralement les bactéries à Gram-positif. Les substances inhibitrices produites par BAL peuvent également inhiber les champignons qui sont en grande partie responsables pour la détérioration des aliments. Un autre propriété importante de BAL est de modifier les protéines du lait au cours du processus de fermentation. Ceci est important pour les personnes allergiques, en raison de la modification du potentiel allergénique de protéines du lait, mais également important pour la production de peptides bioactifs. Récentes découvertes ont montré que des peptides dérivés de l\'hydrolyse des protéines du lait peuvent avoir des activités biologiques, tels que des activités antihypertensives, antioxydantes, antimicrobiennes et immunomodulatrices. En résumé, les BAL sont des outils potentiels pour la production d\'aliments de haute qualité, ce qui stimule la recherche de nouvelles souches ayant des propriétés biologiques intéressantes. Ainsi, l\'objectif de cette étude était d\'isoler et de cribler de nouvelles souches de BAL possédant des activités antimicrobienne et / où protéolytique. Des souches de BAL ont ainsi été isolées de lait de vache, de buffle et de chèvre ainsi que des fromages provenant du sud-est du Brésil. À partir de 156 échantillons de lait et de fromages, 815 isolats ont été obtenus sur des géloses sélectives pour les BAL. La majorité d\'entre elles était des coques ou des bacilles à Gram-positif et négatif pour la production de catalase. La présence d\'activités antimicrobiennes a été évaluée sur des cultures pures de ces nouveaux isolats par des tests d\'antagonisme sur géloses (essai spot-on-the-lawn), et leurs activités protéolytiques on été évaluées par culture sur géloses BHI (Brian Heart Infusion) additionnée de lait écrémé. Les isolats les plus protéolytiques ont été testés par culture dans du lait écrémé suivie d\'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Parmi les 815 isolats testés, quatre d\'entre eux, identifiés comme Lactobacillus paraplantarum FT 259 et Streptococcus uberis (FT86, FT126 et FT190) étaient producteurs de bactériocines, tandis que quatre autres, identifiés comme Weissella confusa FT424, Weissella hellenica FT476, Leuconostocs citreum FT671 et Lactobacillus plantarum FT723 ont montré une activité antifongique lors d\'essais préliminaires. Des analyses complémentaires ont montré que la souche la plus antifongique était L. plantarum FT723 qui inhibait Penicillium expansum sur gélose MRS modifiée (de Man, Rogosa, Sharpe, sans acétate) et dans un modèle de lait fermenté. Des activités protéolytiques ont été détectées dans 205 isolats lors des tests sur géloses supplémentées en lait écrémé. Les activités protéolytiques des 123 isolats présentant les activités les plus fortes ont été confirmées en faisant migrer les surnageants de laits fermentés sur SDS-PAGE. Les capacités protéolytiques des trois isolats les plus protéolytiques Enterococcus faecalis (FT132 et FT522) et Lactobacillus paracasei FT700 ont également été testées sur des caséines et sur deux protéines du lactosérum (?-lactoglobuline et d\'?-lactalbumine), les produits de dégradation ont été visualisés par SDS-PAGE. En raison de la grande similitude entre les deux souches d\'Enterococcus, seul E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 ont été sélectionnés pour des études plus poussées sur leurs activités protéolytiques en utilisant des protéines du lait comme substrats lors d\'incubations dans différentes conditions suivies de l\'analyse des produits d\'hydrolyse par SDSPAGE et par chromatographie liquide haute performance (high performance liquid chromatography, HPLC). Tant E. faecalis FT132 que L. paracasei FT700 ont montré des activités protéolytiques à un pH de 6,5, à des températures comprises entre 37 à 42 ºC. Leurs activités protéolytiques étaient dues à des métallo-protéases. Pour évaluer les activités biologiques possibles des peptides dérivés de l\'action d\'E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 sur les protéines du lait, les surnageants des laits fermentés par ces souches ont été purifiés sur colonnes C8 puis lyophilisés. Ces lyophilisats ont ensuite été repris dans du RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) et ajoutés à différentes cultures primaires (monocytes et macrophages) pour évaluer leur cytotoxicité, les mécanismes de la mort celullaire qui y étaient associés, ainsi que leurs propriétés immunomodulatrices (différenciation des monocytes en macrophages et quantification de TNF-?). Les peptides générés par les deux souches testées étaient toxiques (favorisant l\'apoptose des cellules) après 72 h d\'exposition à une concentration de 10 mg/mL. Au-dessous de ces concentrations cytotoxiques, les deux surnageants de laits fermentés produits par E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 ont stimulé la différenciation des monocytes en macrophages, comme observé par l\'expression accrue du marqueur CD71. Cette stimulation du système immunitaire n\'était pas inflammatoire en raison de la faible production de TNF-?. Certaines BAL peuvent contribuer à la santé des consommateurs et sont utilisées comme probiotiques. Cependant, les effets biologiques des souches ainsi que leur innocuité doivent être vérifiés avant leur utilisation comme probiotiques. Contrairement aux entérocoques, plusieurs espèces de lactobacilles sont reconnues comme GRAS (Generally Recognized as Safe). Dans cette étude, il a été montré que la souche E. faecalis FT132 hébergeait trois gènes de virulence asa1, as et gelE, et qu\'elle était résistante à l\'érythromycine et à la tétracycline, ce qui signifie que cette souche ne peut pas être ajoutée à des produits alimentaires. Cependant, L. paracasei FT700 pourrait d\'avéré un candidat potentiel pour être utilisée en tant que probiotique, ainsi que L. paraplantarum FT259, la souche bacteriocinogénique décrite précédemment. Afin d\'évaluer leur capacité de survie dans le tractus digestif en vu d\'une éventuelle utilisation comme probiotiques, les souches ont été incubées dans des milieux de culture acidifiés (pH 2,0, 2,5 et 3,5), dans des sels biliaires, dans des conditions simulant les conditions gastriques et leur capacité de survie a été testée ainsi que leur sensibilité à différents antibiotiques. En outre, la bactériocine produite par L. paraplantarum FT259 a été partiellement purifiée sur colonne remplie de résine XAD-16, suivie d\'une extraction en phase solide sur colonne C18, suivie d\'une analyse par SDS-PAGE. Des PCR avec différentes amorces ciblant la plantaricine NC8, la plantaricine S et la plantaricine W ont été effectuées suivie du séquençage des amplicons afin d\'idéntifier des gènes pour la production de bactériocines. Les résultats ont montré que L. paraplantarum FT259 tolérait des expositions à un pH de 3,5, et à une concentration en sels biliaires de 0,3% pendant une durée maximum de 180 minutes. En revanche, il n\'était plus possible de détecter de cellules viables (limite de détection de la méthode : 100 UFC / mL) après une exposition à des pH de 2,0 et de 2,5 pendant 90 minutes. Lors des expériences simulant les conditions gastriques, le nombre de cellules viables de L. paraplantarum FT259 a diminué de 8,6 log UFC/mL à 4,4 log UFC/mL après 180 minutes d\'incubation. Les résultats obtenus pour la souche L. paracasei FT700 ont montré que celle-ci a survécut à presque toutes les conditions. Après 180 minutes dans un pH de 2,0 et dans le jus gastrique simulé, la population bactériennes ont respectivement diminué de 4 et de 3 log UFC/mL. Il a également été démontré que L. paraplantarum FT259 et L. paracasei FT700 étaient sensibles à la majorité des antibiotiques testés. L\'analyse par SDS-PAGE a indiqué que la bactériocine partiellement purifiée présentait une masse moléculaire d\'environ 3900 Da et que le séquençage des amplicons d\'ADN suite aux PCR a montré que la souche possédait le gène de la plantaricine NC8. L\'ensemble de ces résultats indique que les deux souches de lactobacilles isolées lors de cette étude (L. paraplantarum FT259 et L. paracasei FT700) possèdent des caractéristiques pouvant leur conférer un intérêt d\'utilisation en tant queprobiotiques. La production de bactériocines (L. paraplantarum FT259), et l\'activité protéolytique (L. paracasei FT700) pourraient également être des caractéristiques intéressantes pour des applications alimentaires. En conclusion, les BAL obtenues dans cette étude pourraient être utiles dans l\'industrie alimentaire pour la production de nouveaux produits laitiers à durée de conservation prolongée et une digestibilité accrue, ou encore pour la production de peptides bioactifs. / As bactérias láticas (BAL) têm sido utilizadas pela humanidade há séculos devido às suas propriedades tecnológicas e potencial para conferir características sensoriais agradáveis aos alimentos. Além disso, é cada vez maior a demanda por alimentos de qualidade. Neste contexto, BAL tem grande potencial para serem utilizadas na produção de alimentos. Uma das principais características destas bactérias é a produção de substâncias que inibem a multiplicação de agentes patogênicos e micro-organismos deteriorantes em alimentos, tais como ácidos orgânicos, H2O2 e bacteriocinas. Estas últimas são um peptídeos antimicrobianos produzido via ribossomo por algumas bactérias e possuem pequeno espectro inibição. As bacteriocinas podem reduzir a multiplicação de bactérias-alvo, aumentando a segurança alimentar e a vida de prateleira de alimentos. Essas substâncias inibitórias produzidas por BAL podem também inibir fungos, que são em grande parte responsáveis pela deterioração dos alimentos. Outra importante propriedade das BAL é capacidade de modificar as proteínas do leite durante o processo de fermentação. Isto é importante para indivíduos alérgicos devido à alteração de potencial alergênico das proteínas do leite, e também é importante para a produção de peptídeos bioativos. Recentemente, resultados demonstraram que os peptídeos obtidos a partir da hidrólise de proteínas do leite podem ter diferentes atividades biológicas, tais como anti-hipertensiva, antioxidante, antimicrobiana e imunomodulatória. Em resumo, BAL apresentam potencial para a produção de alimentos de alta qualidade, o que estimula a busca de novas linhagens com propriedades tecnológicas de interesse. Assim, no presente estudo, BAL com atividade antimicrobiana e / ou proteolítica foram isoladas de leite e queijo de vaca, búfala e cabra, obtidos na região sudeste do Brasil. A partir de 156 amostras de leite e queijo, foram obtidos 815 isolados em ágar seletivo para BAL. A maioria eram cocos ou bacilos Gram-positivos, e não produziam a enzima catalase. Culturas puras destes novos isolados foram avaliadas quanto a atividade antimicrobiana por testes de antagonismo em ágar (spot-on-the-lawn), e quanto a atividade proteolítica sobre proteínas do leite pelo cultivo em placas de ágar BHI (Brain Heart Infusion suplementado com leite desnatado). Os isolados com maior atividade proteolítica também foram testados pelo cultivo em leite desnatado seguido de análise do leite fermentado por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Entre os 815 isolados testados, quatro deles foram identificados como produtores de bacteriocinas, Lactobacillus paraplantarum FT259 (uma linhagem) e Streptococcus uberis (três linhagens, FT86, FT126 e FT190), enquanto quatro outros identificados como Weissella confusa FT424, W. hellenica FT476, Leuconostoc citreum FT671 e Lactobacillus plantarum FT723, os quais apresentaram atividade antifúngica em ensaios preliminares. Análises complementares mostraram que a linhagem com maior atividade antifúngica foi L. plantarum FT723, o qual inibiu Penicillium expansum em ágar MRS modificado (De Man, Rogosa, Sharpe, sem acetato) e em iv modelo de leite fermentado. No entanto, nenhuma inibição foi observada contra Yarrowia lipolytica. A atividade proteolítica foi detectada em 205 isolados por testes em ágar, sendo que 123 isolados com intensa atividade proteolítica foram submetidos a confirmação da atividade por SDS-PAGE. As atividades proteolíticas de três isolados identificados como Enterococcus faecalis (FT132 e FT522) e Lactobacillus paracasei FT700 foram confirmadas por SDS-PAGE, como visualizado pela digestão de caseínas e proteínas de soro de leite (?-lactoglobulina e ?- lactalbumina). No entanto, devido à alta semelhança entre as linhagens, apenas E. faecalis FT132 (juntamente com L. paracasei FT700) foram selecionados para os próximos estudos utilizando proteínas do leite como substratos em diferentes condições, seguidas de análises por SDS-PAGE e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high-performance liquid chromatography). Ambos E. faecalis FT132 e L. paracasei FT700 apresentaram atividades proteolíticas em pH 6,5, entre 37 e 42 °C. A atividade proteolítica das linhagens foi devida à presença de metaloproteases. Em seguida, para avaliar as possíveis atividades biológicas dos peptídeos derivados da atividade proteolítica de E. faecalis FT132 e L. paracasei FT700 em proteínas do leite, o sobrenadante de leite fermentado produzido por estas linhagens foi purificado em cartucho C8 e liofilizado. Desse modo, os sobrenadantes de leite fermentado produzidos por estas linhagens foram adicionados às culturas de células (monócitos e macrófagos) para avaliar a sua citotoxicidade, os mecanismos de morte celular, propriedades imunomoduladoras (diferenciação de monócitos em macrófagos) e quantificação de TNF-? (do inglês tumor necrosis factor). Os sobrenadantes apresentaram toxicidade após 72 h de exposição a 10 mg/mL por apoptose. Abaixo das concentrações citotóxicas, ambos os sobrenadantes de leite fermentado estimularam a diferenciação de monócitos em macrófagos, como observado pelo aumento da expressão do marcador CD71. Esta estimulação imune não foi inflamatória visto que houve pouca produção de TNF-?. BAL também podem contribuir para a saúde dos consumidores quando utilizadas como probióticos. No entanto, algumas características das linhagens devem ser verificadas antes de serem utilizadas como probióticos, especialmente com relação aos fatores de virulência. Lactobacilos geralmente possuem um status GRAS (do inglês generally recognized as safe), ao contrário dos enterococos. Neste estudo, foi demonstrado que E. faecalis FT132 possuía três genes de virulência, asa1, ace e gelE, e que era resistente à eritromicina e à tetraciclina, indicando que esta linhagem não pode ser adicionada em alimentos. No entanto, L. paracasei FT700 seria um potencial candidato para ser utilizada como probiótico, bem como a linhagem bacteriocinogênica descrita anteriormente, L. paraplantarum FT259. As linhagens foram testadas quanto à sobrevivência em meio ácido (pH 2,0, 2,5 e 3,5), tolerância in vitro aos sais biliares, viabilidade em suco gástrico sintético e sensibilidade a antibióticos. Além disso, o peptídeo antimicrobiano produzido por L. paraplantarum FT259 foi parcialmente purificado em coluna preenchida com resina XAD-16, seguido de extração em fase sólida com cartucho de C18, e analisados por SDSPAGE. Reações em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction) com primers para os genes estruturais da plantaricina NC8, plantaricina S e plantaricina W, seguidas de sequenciamento de DNA, foram realizados para detectar genes responsáveis pela produção de bacteriocinas. Os resultados mostraram que L. paraplantarum FT259 foi resistente ao pH 3,5 e a 0,3% de sais biliares por até 180 minutos, mas a população bacteriana em pH 2,0 e 2,5 após 90 minutos estava abaixo do limite de detecção do método (2 log UFC/mL). Em testes utilizando suco gástrico sintético, a população de L. paraplantarum FT259 reduziu de 8,6 log UFC/ v mL para 4,4 log UFC/mL após 180 minutos. Por outro lado, L. paracasei FT700 sobreviveu bem em quase todas as condições. Depois de 180 minutos em pH 2,0 e em suco gástrico sintético, a população bacteriana reduziu 4 e 3 log UFC/mL, respectivamente. Também foi demonstrado que L. paraplantarum FT259 e L. paracasei FT700 foram sensíveis à maioria dos antibióticos testados. A análise de SDS-PAGE indicou que a bacteriocina parcialmente purificada apresentava uma massa molecular de aproximadamente 3900 Da, e o sequenciamento de DNA do produto de amplificação obtido por PCR mostrou a presença do gene que codifica a produção da plantaricina NC8. De modo geral, os resultados indicaram que ambas as linhagens possuem potencial probiótico. Além disso, a produção de bacteriocinas (L. paraplantarum FT259) e a atividade proteolítica (L. paracasei FT700) podem ser características interessantes para aplicações em alimentos. As BAL obtidas neste estudo podem ser úteis na indústria de alimentos para a produção de novos produtos lácteos com maior vida de prateleira e aumento da digestibilidade de proteínas do leite, assim como para a produção de peptídeos bioativos comercializados como fórmulas parcialmente purificadas.

Certaines souches de bifidobactéries entrent dans la composition de laits infantiles. Leurs propriétés (modulation du microbiome, régulation de la translocation bactérienne, maturation de cellules dendritiques) sont liées à la capacité de sécrétion de composés de haut poids moléculaire lors de la fermentation bactérienne. Les objectifs de ce travail sont, dans un premier temps, de caractériser les molécules issues de la fermentation de la souche de référence B.breve C50, et de déterminer si d’autres bifidobactéries peuvent sécréter des molécules de propriétés similaires. Les analyses associant chromatographie gazeuse (GC), spectrométrie de masse (MS), électrophorèse, séquençage protéique montrent que les composés fermentaires de B.breve C50 sont des agrégats (>600kDa) associant des unités lipoprotéiques de la paroi cellulaire contenant un domaine CHAP et des sucres, en majorité du glucose. Ces agrégats sont reconnus par le TLR6, indiquant une structure lipoprotéique di-acylée. Ils sont également ligand de la galectine 1, ce qui suggère que les hexosamines et le galactose détectés par GC sont exposés à l’extérieur des agrégats. L’analyse in silico des homologies avec le gène codant pour la séquence protéique révèle la proximité du gène de B.longum avec B.breve. Par contre, il est peu probable que B.bifidum sécrète des agrégats semblables, la séquence du gène homologue étant dépourvu de lipobox. Les agrégats (>600 kDa), isolés après fermentation de la souche B.longum CBi0703 dans le milieu lacté de référence, montrent une composition similaire (unités lipoprotéique associées à des sucres, en majorité du glucose et du mannose), une reconnaissance par la Galectine 1 mais non par le TLR6. La différence de composition en lipide et l’hydrophobicité de la séquence protéique semble prévenir la reconnaissance de la structure lipoprotéique par le récepteur TLR6. Les agrégats de B.longum ayant montré des propriétés anti-inflammatoires, l’hypothèse d’une phagocytose a été explorée dans un deuxième temps. Les agrégats marqués par des marqueurs fluorescents ne sont pas détectés dans les cellules après contact direct (ex-vivo) ou gavage des animaux (in vivo). Une capture des agrégats par les cellules présentatrices d’antigènes est donc peu probable. La reconnaissance par la galectine 1 des deux types d’agrégats bifides nous fait privilégier la piste d’un mécanisme de régulation de la translocation du microbiome par l’intermédiaire des structures hexosamines et galactose exposées à la surface des agrégats. Dans un troisième temps, l’implication des agrégats bifides dans la prévention du diabète de type 1 a été explorée. En effet, le lait de femme prévient la survenue du diabète chez les souris NOD. La recherche par PCR du gène codant pour la lipoprotéine d’intérêt a permis la détection de B.longum dans 21 échantillons de lait maternel sur 33 (soit 12 mamans parmi 16). A l’inverse, B.breve est rarement isolé (2 mamans parmi 16). Comme l’analyse transcriptomique indique que les lipoprotéines sont synthétisées de façon continue, elles peuvent donc être sécrétées par les bifidobactéries dans le lait de femme. Aussi le choix s’est porté sur les agrégats de B.longum, testés à une dose anti-inflammatoire en prévention anti-diabétique. Si l’administration de lait maternel réduit l’incidence du DT1 chez des souris NOD âgées de plus de 18 semaines (p < 0.001), c’est au contraire une protection précoce mais qui ne persiste pas qui est observée sous agrégats bifides. L’effet protecteur est observé en absence de bifidobactéries intestinales. Les agrégats bifides à la dose anti-inflammatoire ne modulent pas à la même vitesse les bactéries intestinales sensibles au lait de femme, ce qui pourrait expliquer le retard d’apparition des premiers diabètes lors du traitement. / Some bifidobacterial strains are used to ferment infant formulas. Their properties (modulation of microbiome, regulation of bacterial translocation, dendritic cells maturation) are related to their ability to secrete high molecular weight compounds during the bacterial fermentation. The first objective of the study was to characterize the molecules secreted by the strain B.breve C50 used as a reference, and to determine whether other bifidobacteria can secrete molecules with similar properties. Analysis using gas chromatography (GC), mass spectrometry (MS), electrophoresis, protein sequencing showed that the B.breve C50 fermentation compounds are constituted of aggregates (>600kDa) combining units of a cell wall lipoprotein with a CHAP domain and sugars moities, mostly glucose. The aggregates are recognized by TLR6, indicating that the protein was diacetylated. They are also ligand of the galectin 1, suggesting that the hexosamine and galactose moieties detected by GC surrounded the aggregates. In silico analysis showed that a B.longum gene exhibiting a high homology with the B.breve C50 gene, coded for a lipoprotein, which was secreted during fermentation, and formed aggregates with sugars. B.bifidum species likely does not secrete similar aggregates since the sequence of the homologous gene is deprived of lipobox. B.longum CBi0703 and B.breve C50 aggregates shared the same global structure (lipoproteins with CHAP domain bordered by sugars primarily constituted of glucose and mannose). Remarkably, the CBi0703 aggregates were also able to bind Gal-1 but were lacking binding capacities to TLR6. It is likely that the hydrophobicity of the protein sequence, as well as the lipid and sugar compositions prevented the recognition of the lipoprotein structure by the TLR6 receptor. Secondly, a putative phagocytosis of aggregates was investigated. Fluorescent-labeled aggregates are not detected within cells after direct contact (ex-vivo) or oral challenge in animals (in vivo). Capture of the aggregates by antigen presenting cells seemed improbable. The two types of aggregates being recognized by galectin-1, regulation of the intestinal bacterial translocation by the aggregates likely involves the hexosamines and galactose surrounding their surface. In a third step, the possible involvement of the bifidobacterial aggregates in the prevention of type 1 diabetes was investigated. Actually, breast milk was previously shown to prevent diabetes onset in old NOD mice. Detection of bifidobacteria using amplification of the gene encoding the B.longum lipoprotein was positive in 21 human milk samples out of 31 (i.e. 12 mothers out of 16). Conversely, B.breve is rarely isolated (2/16 mothers). Since transcriptomic analysis showed that the lipoproteins were continuously synthesized, we hypothesized that the bifidobacterial aggregates were secreted by the bifidobacteria harbored in human milk. To ensure that B.longum aggregates play a role in the protection induced by human milk, they were assayed at an anti-inflammatory dose. Contrary to breast milk which reduced the incidence of T1D in NOD mice older than 18 weeks (p <0.001), only early but not persistent protection is observed during bifidobacterial aggregates intake. The protective effect was observed in the absence of intestinal bifidobacteria. Variation in intestinal bacterial colonization did not match in groups drinking human milk or bifidobacterial aggregates at an inflammatory dose. The difference in kinetics could support the delay in diabetes onset induced by the bifidobacterial aggregates.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-05-31T19:36:03Z No. of bitstreams: 1 JonathaCarneiro.pdf: 2533122 bytes, checksum: 455a2c52730e69d7742efd80a5016817 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-31T19:36:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JonathaCarneiro.pdf: 2533122 bytes, checksum: 455a2c52730e69d7742efd80a5016817 (MD5) Previous issue date: 2016-08-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Cette étude vise à analyser l'inclusion de l'agriculture paysanne dans la chaîne de production de lait dans la microrégion de Imperatriz, avec l'axe d'analyse de la question de l'autonomie / subordination de la paysannerie au marché. La croissance de la production de lait maranhense est un cas récent a eu lieu depuis le début du XXI e siècle, et concentré dans le microrégion de Imperatriz, qui concentre la plus grande part du bétail de l'Etat et des usines de production de lait et leurs dérivés. L'inclusion de la paysannerie dans cette chaîne de production est également affaire récente, et apporte le débat sur la possibilité de la perte d'autonomie paysanne lorsqu'il est inséré dans une chaîne de production industrielle, avec la perspective de la spécialisation productive. Dans le cas spécifique de la paysannerie de microrégion de Imperatriz, je remarquai que les familles impliquées dans l'utilisation de la production de lait l'utilisation différentes stratégies pour se rapportent aux acteurs responsables du processus de commercialisation (produits laitiers, fromagers, intermédiaires), en maintenant les activités économiques auxiliaires, ils servent comme une défense contre les fluctuations du marché et les changements climatiques. Pour faire face à ce processus, j'ai développé une étude de cas dans le règlement São Jorge, situé dans la municipalité de Cidelândia / MA, où j'ai mené des entrevues et par l'observation directe, accompagné le processus de production et de commercialisation du lait par les unités familiales. / O presente estudo tem por objetivo analisar a inserção da agricultura camponesa na cadeia de produção de leite na microrregião de Imperatriz, tendo por eixo analítico a questão da autonomia/subordinação do campesinato ao mercado. O crescimento da produção maranhense de leite é um processo recente, ocorrido a partir do início do século XXI, e concentrado na microrregião de Imperatriz, que responde pela maior parcela do rebanho bovino estadual e das unidades de fabricação de leite e seus derivados. A inserção do campesinato nessa cadeia produtiva é um processo também recente e, traz consigo o debate sobre a possibilidade da perda da autonomia camponesa quando inserida em uma cadeia produtiva industrial, com a perspectiva da especialização produtiva. No caso específico do campesinato da microrregião de Imperatriz, observei que as famílias envolvidas na produção de leite utilizam diferentes estratégias para se relacionar com os atores responsáveis pelo processo de comercialização (laticínios, queijeiros, intermediários), através da manutenção de atividades econômicas auxiliares, que servem como defesa contra as oscilações do mercado e mudanças climáticas. Para abordar esse processo, desenvolvi um estudo de caso no assentamento São Jorge, localizado no município de Cidelândia/MA, onde realizei entrevistas e, através de observação direta, acompanhei o processo de produção e comercialização de leite por unidades familiares.

Les Kazakhs sont des consommateurs traditionnels de lait d'espèces non-conventionnelles comme la chamelle. Pour autant, les régions d'élevage camelin dans ce pays, bien que basées sur un mode extensif et un accès à des ressources naturelles, n'en sont pas moins fragilisées par les risques de pollution, l'environnement du pays étant affectées par la présence de métaux lourds, pesticides et radionucléides. L'objectif de la thèse a été (a) d'évaluer l'impact de cette pollution sur la qualité du lait de chamelle et du shubat (lait fermenté), et (b) d'évaluer les capacités de détoxification des produits laitiers.Pour aborder la question de l'impact de la pollution, plusieurs niveaux d'analyses ont été mis en œuvre:(i) A l'échelle régionale, des cartes d'indice de pollution ont été établies autour de 13 fermes de zones polluées (Almaty, Sud Kazakhstan, Atyraou et Kyzylorda) afin de comparer le niveau de pollution des différentes matrices (sol, eau, plante) selon la distance aux sources de pollution.(ii) A l'échelle des matrices environnementales (sol, plante, eau), deux métaux lourds majeurs (Pb et Cd) ont été déterminés dans les échantillons de sols (7,76-131,08 ppm et 0,08-0,39 ppm, respectivement), l'eau (Pb entre 5,9-13,6 ppm et Cd 0,05-0,25 ppm), les plantes (0,50-2,30 ppm et >0,05-0,56 ppm, respectivement). Un lien entre indice de pollution et métaux dans les sols a été observé, montrant l'impact de la proximité et de la nature des sources de polluants sur la contamination des sols. On observe également une corrélation étroite entre teneur en Pb et Cd au sein des différentes matrices. Cependant, les teneurs dans le sol sont indépendantes des teneurs dans l'eau ou les plantes. Les teneurs en pesticides dans l'eau sont inférieures à celles des normes internationales. Dans les fourrages, le DDT et ses dérivés ont été plus élevés que dans le sol. Cela signifie que les résidus de pesticides peuvent être également d'origine atmosphérique et donc inhalés par les animaux(iii) Dans le lait et le shubat, la concentration en métaux lourds dans cinq régions (Almaty, Atyraou, Kyzylorda, Taraz et Sud Kazakhstan) a été en moyenne faible en Cu (< 0,05 ppm), normale en Zn (près de 5 ppm) et Cd, mais un peu élevée pour Pb. Nos résultats ont été relativement élevés pour le DDT total dans le lait de toutes les régions sauf Kyzylorda et supérieurs pour le HCH total dans le lait des régions d'Almaty et d'Atyraou.(iv) Les relations entre environnement et lait ont été testées montrant l'absence de lien entre contamination de l'environnement en métaux lourds et celle du lait et shubat. Aucune relation non plus n'a été observée pour les pesticides, à l'exception du lindane et 4,4-DDD.Pour tester l'effet détoxifiant, il a été procédé en deux étapes. D'abord l'isolement et l'identification des souches de bactéries lactiques (BAL) du shubat afin de tester leur capacité à fixer Pb et Cd. Au total, 138 souches ont été isolées à partir de 25 échantillons laitiers. Une étude qualitative pour détecter la capacité des BAL à fixer les métaux lourds a été réalisée. Parmi 118 souches testées, seules 5,1% d'entre elles n'ont poussé ni sur Pb ni sur Cd, 36 % ayant eu la capacité de fixer Pb ou Cd, et 9% les deux. Les 52 souches montrant les meilleurs résultats ont été retenues pour identification par des méthodes moléculaires (rRNA16S). Selon les résultats de séquençage, la plupart de souches étaient de genre Enterococcus et Lactobacillus, secondairement Lactococcus et Leuconostoc.Dans un second temps, un test physiologique (in vivo) a été réalisé sur 80 cobayes divisés en 8 groupes traités par le Pb et des souches de BAL. La quantité de Pb dans les fèces des groupes traités par le lait fermenté ayant contenu ou pas du Pb était relativement élevé par rapport aux groupes témoin et celui recevant de l'eau enrichie de Pb (groupe EauPb). La distribution du Pb dans les organismes de cobayes du groupe EauPb s'est révélée dans l'ordre croissant: rate / The Kazakh people are traditional consumers of milk from non-conventional species like camel. However, the camel-rearing areas in this country, although based on an extensive mode and an access to natural resources, are affected by the risks of pollution, the environment of the country being affected by the presence of heavy metals, pesticides and radionuclides. The objective of the thesis was (a) to evaluate the impact of this pollution on the quality of the camel milk and shubat (fermented milk), and (b) to evaluate the abilitiy of detoxification by the dairy products. To answer to the question of the impact of pollution, several levels of analyses were implemented:(i) At the regional level, maps of pollution index were established around 13 farms from polluted zones (Almaty, Southern Kazakhstan, Atyraou and Kyzylorda) in order to compare the level of pollution of the various matrices (soil, water, plant) according to the distance to the polluting sources.(ii) On environmental matrix level (soil, plant, water), two major heavy metals (Pb and Cd) were determined in the soil (7,76-131,08 ppm and 0,08-0,39 ppm, respectively), water (Pb 5,9-13,6 ppm and Cd 0,05-0,25 ppm), the plants (0,50-2,30 ppm and >0,05-0,56 ppm, respectively) samples. A correlation between pollution index and metals in soils was observed, showing the impact of the proximity and the nature of the polluting sources on the contamination of the soils. A close correlation between Pb and Cd content within the various matrices was also observed. However, the contents in the soil were independent of the contents in water or plants. The contents of pesticides in water were lower than those of the international standards. In fodder, the DDT and its derivatives were higher than in the soil. That means that the pesticides residues can be also of atmospheric origin and thus inhaled by the animals(iii) In milk and shubat, the heavy metal concentration in five areas (Almaty, Atyraou, Kyzylorda, Taraz and Sud Kazakhstan) was on average low in Cu (< 0,05 ppm), normal for Zn (nearly 5 ppm) and Cd, but a little high for Pb. Our results were relatively high for the total DDT in the milk of all the areas except Kyzylorda and superiors for the total HCH in the milk of Almaty and Atyraou areas.(iv) The relations between environment and milk were tested showing the absence of link between environmental contamination of the heavy metals and that of milk and shubat. No relation either was observed for the pesticides, except for lindane and 4,4-DDD.To test the detoxification effect, it was proceeded in two stages: initially the isolation and identification of the strains of lactic bacteria (LAB) of the shubat in order to test their capacity to fix Pb and Cd. On the whole, 138 strains were isolated starting from 25 dairy samples. A qualitative study to detect the capacity of the LAB to fix heavy metals was carried out. Among 118 tested strains, only 5.1% of them pushed neither on Pb nor on Cd, 36% having had the capacity to fix Pb or Cd, and 9% both. The 52 strains showing the best results were retained for identification by molecular methods (rRNA16S). According to results' of sequencing, the majority of strains were of genus Enterococcus and Lactobacillus, secondarily Lactococcus and Leuconostoc. In the second time, a physiological test (in vivo) was carried out on 80 guinea-pigs divided into 8 groups treated by strains of LAB containing or not some Pb. The quantity of Pb in feces of the groups treated by fermented milk having contained or not Pb was relatively high compared to the reference groups and that receiving from the water enriched by Pb (WaterPb group). The distribution of Pb in the organes of guinea-pigs of the WaterPb group appeared in the ascending order: spleen> blood> heart> lungs> liver> kidneys. There was no significant correlation between organs.The results obtained on the identification of the isolated strains, gave the possibilities of studying

Une grande diversité des types d'élevage bovin laitier existe au Maroc. Afin d'en clarifier les performances zootechniques et d'en saisir les performances économiques, une série de suivis d'élevage a été mise en œuvre, dans le cadre de l'application d'une démarche de type systémique dans différentes zones agro -écologiques du pays : la zone suburbaine de Rabat - Salé et le périmètre irrigué du Gharb. L'élaboration d'une typologie de fonctionnement des étables a ainsi montré la grande similarité des classes d'élevage par région : la présence de fermes de type allaitant, suivie de nombreuses fermes déficitaires en raison de gaspillages des ressources alimentaires, des concentrés notamment, de fermes produisant du lait avec peu de concentrés se regroupant sous l'appellation « élevage extensif » et de très rares étables qui peuvent être considérées comme spécialisées en lait. Paradoxalement, il a même été démontré que l'élevage laitier semblait plus intensif en zone suburbaine qu'en irrigué, dû aux facilités financières des éleveurs citadins pour l'achat d'aliments concentrés. Le détail des pratiques d'élevage et de leurs incidences a révélé le caractère singulier de la production laitière dans des étables étatiques où le pic d'intensification atteint est entièrement tributaire d'un milieu d'élevage entièrement artificiel : concentrés et traitements vétérinaires. Dans la région d'agriculture totalement pluviale de Ben Slimane, cette logique d'intensification bute sur l'aléa climatique et rend les résultats économiques très vulnérables, car pour maintenir un niveau de rendement laitier élevé, il ne peut y avoir d'autre voie que le recours aux concentrés. Enfin, en région suburbaine, les données structurelles des étables font qu'elles pratiquent dans leur majorité un élevage « hors - sol », lui aussi très dépendant des apports en concentrés. Les conséquences sur la qualité du lait sont néfastes, puisque le taux butyreux est inférieur à la norme minimale acceptable par les usines laitières au Maroc, de 35 g/kg dans 2 des 5 fermes étudiées. La qualité hygiénique du lait est mauvaise pour tous les échantillons considérés, sans aucune exception. L'ensemble de ces considérations imposent de penser à des stratégies d'appui technique prenant en compte cette diversité d'étables et de logiques d'élevage, même en proposant des rations riches en concentrés, pour améliorer la productivité laitière et la rentabilité du cheptel bovin

La population de N'Djamena, capitale du Tchad, croît de 6 % par an, ce qui entraîne une augmentation rapide de la demande en lait et en produits laitiers. De nombreuses capitales africaines importent l'essentiel de leur approvisionnement en produits laitiers sous forme de poudre de lait. Au contraire, on constate plutôt au Tchad, un regain d'intérêt pour les produits laitiers locaux. Cette spécificité tchadienne traduit-elle une meilleure capacité d'adaptation des systèmes d'élevage aux mutations marchandes ? Pour comprendre la place qu'occupent les systèmes d'élevage locaux dans l'approvisionnement de la ville, et les liens entre la croissance du marché et l'évolution des systèmes d'élevage, une étude a été menée en périphérie de N'Djamena par la méthode de l'analyse de filière : production, commercialisation et consommation du lait et de produits laitiers. Des enquêtes ont concerné 372 consommateurs, 254 commerçants, 51 transformateurs, et 161 éleveurs. La consommation des produits laitiers locaux et importés par les ménages dépend fortement des habitudes alimentaires et du niveau de revenu du foyer. Celle des produits laitiers hors domicile est en plein essor avec le succès du rayeb, un lait fermenté entier local, distribué principalement par les bars laitiers de la ville. L'analyse du marché montre le dynamisme et la complémentarité des filières qui approvisionnent la ville en produits laitiers locaux : lait frais, lait caillé, lait de chamelle. Parmi elles, la filière « lait frais » de vache, composée de micro-entreprises de collecte, est la plus dynamique en alimentant les entreprises de transformation laitière qui valorisent ce lait local. Ainsi, les micro-entreprises laitières apparaissent comme le « moteur » principal des changements intervenus dans la filière et dans le bassin de production. L'essor de la filière lait de chamelle est lié à la spécificité du produit qui n'entre pas en concurrence avec le lait de vache ; ce lait est consommé par les populations originaires des zones pastorales du nord du pays. Le rôle des systèmes d'élevages pastoraux et agropastoraux dans l'approvisionnement de la ville en lait local est ainsi mis en évidence ainsi que ses mutations profondes sous l'effet de l'intégration au marché. Loin des clichés sur « l'élevage contemplatif », l'étude montre que le pastoralisme sahélien s'adapte aux mutations de son environnement et que ces mutations dépendent fortement du dynamisme des entreprises en aval et des évolutions des modes de consommation. Les résultats obtenus par l'approche filière permettent de formuler des recommandations aux politiques et aux projets d'appui à l'élevage cohérentes avec les caractéristiques du marché visé. Pour sécuriser l'approvisionnement en lait et en produits laitiers des villes africaines, il convient en particulier de prendre en compte les difficultés liées à la sécurisation des débouchés, à la fourniture d'intrants alimentaires et de services, et aux contraintes foncières. Les recherches futures devront mieux cerner la dynamique organisationnelle (groupements, fédérations, coopératives, contrats), et l'organisation des services (approvisionnement en intrants vétérinaires et alimentaires, micro-crédit) pour résoudre ces contraintes.

La commercialisation du lait peut jouer un rôle central dans les changements au sein des unités de production : 1) sur les techniques de la production laitière et 2) sur la gestion de la recette du lait. La recherche repose sur des enjeux de développement et des enjeux scientifiques. L'objectif global de la thèse est d'évaluer l'impact de la commercialisation du lait sur les pratiques et les stratégies des éleveurs et d'apprécier son rôle dans les processus de changements socio-techniques dans les systèmes de production laitière en zone péri-urbaine de Sikasso au Mali. L'objectif de recherche est de contribuer aux recherches en zootechniesystème sur le développement de l'élevage en général et de l'élevage péri-urbain en particulier. Pour cela, nombre de connaissances a été mobilisé et des méthodes développées pour analyser dans le temps long les changements et évaluer dans le temps rond les performances des unités de production. Une méthodologie spécifique a été élaboré, elle articule trois groupes de méthodes : (i) des enquêtes pour un diagnostic systémique de la production laitière, (ii) des enquêtes rétrospectives pour l'analyse des changements sur le temps long et incluant l'échelle territoriale, (iii) des suivis technico-économiques sur un an. Cinq stratégies de production laitières ont été distinguées : 1) Faible prélèvement de lait, 2) Intérêt sur le lait avec gestion du pâturage, 3) Intérêt sur le lait avec achat de compléments, 4) Forte production de lait avec des vaches croisées et distribution de concentrés et 5) Forte production laitière avec stabulation permanente de vaches croisées. Un modèle de fonctionnement technico-économique a également été construit. Les éleveurs ont fait évoluer leurs pratiques et développer des stratégies pour produire et commercialiser plus de lait et profiter de l'opportunité offerte par le marché de consommateurs urbains.

Les allergies alimentaires à l'arachide et au lait posent un problème majeur de santé publique, en particulier chez les enfants. Nous avons développé un modèle cellulaire de dégranulation, afin d'analyser si la liaison d'un allergène à ses IgE spécifiques, mesurée in vitro, a bien la capacité de déclencher la phase effectrice de la réaction allergique. Ce modèle repose sur l'utilisation de la lignée cellulaire RBL SX-38 développée par JP Kinet, mastocytes de rat immortalisés et modifiés pour exprimer le récepteur de haute affinité aux IgE humaines. Le développement de ce modèle pour son utilisation en microplaques de 96 puits a consisté notamment en l'optimisation de différents paramètres critiques pour la réalisation des 2 phases du test : la phase de sensibilisation des cellules par les IgE de patients allergiques et la phase de déclenchement par les allergènes auxquels le patient est sensibilisé. Ce modèle a permis de montrer l'importance des caséines et des albumines 2S (Ara h 2 et Ara h 6) dans cette étape clé de la réaction allergique au lait et à l'arachide, confirmant les observations sérologiques et cliniques disponibles. L'effet de traitements thermiques sur l'allergénicité d'un allergène majeur de l'arachide (Ara h 1), a été évalué dans le cadre du programme européen EuroPrevall. Les résultats obtenus montrent la diminution de la réactivité d'Ara h 1 après chauffage de la protéine isolée en solution. Par contre, la même protéine préparée et purifiée à partir d'arachide grillée présente une forte réactivité. Ces résultats suggèrent qu'un traitement à température élevée de la graine entraine une augmentation de l'allergénicité de Ara h 1 du fait de ses interactions avec les autres constituants de la graine. Le modèle cellulaire de dégranulation développé apparaît être un outil pertinent pour l'étude de la fonctionnalité biologique de l'interaction allergène-IgE, permettant une meilleure compréhension de la relation entre la structure d'une protéine alimentaire et son allergénicité, voire une évaluation du risque allergique des aliments ne nécessitant pas d'essais cliniques systématiques.