Made available in DSpace on 2016-05-19T12:59:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) 2016barbosa-junior-wl.pdf: 2215174 bytes, checksum: ec8edd1a6fc480050cdd6db05c9631f6 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) 2015moraes-rmn.pdf: 2690273 bytes, checksum: ed5beefae2ad836171467014e6c521e1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Os tripanossomatídeos são organismos caracterizados pelo controle póstranscricional da expressão gênica, principalmente em nível de tradução. Na tradução em eucariotos, tem grande destaque o complexo eIF4F, sendo um de seus principais componentes o fator de iniciação da tradução eIF4E. Já foram descritos em tripanossomatídeos seis homólogos para o eIF4E, nomeados EIF4E1 a 6. Em um estudo com Leishmania amazonensis, focado no EIF4E3, percebeu-se que seu perfil de expressão se alterava rapidamente numa curva de crescimento, com este apresentando ao menos duas bandas. As mudanças observadas sugeriam modificações pós-traducionais do tipo fosforilação, algo posteriormente confirmado. Analisando-se a sequência do EIF4E3 de Leishmania, foi possível identificar a presença de possíveis sítios de fosforilação e de ligação a parceiros funcionais como homólogos do eIF4G, outro componente do complexo eIF4F, e da proteína de ligação á cauda poli-A (PABP). No presente estudo foi analisado o perfil de expressão e a capacidade de ligação a parceiros funcionais do EIF4E3 de Leishmania superexpresso em células transfectadas e no qual foram introduzidas mutações em motivos específicos. Os resultados mostraram um perfil de expressão de ao menos três bandas para o EIF4E3 de L. amazonensis e duas para L. infantum, com o sítio S75, presente apenas na primeira, sendo o responsável por esta diferença. Em ensaios de imunoprecipitação, foi identificado um motivo que, quando mutado, aboliu a ligação do EIF4E3 com a PABP3, sugerindo este como o sítio de interação entre os fatores. Com a análise do efeito de mutações no EIF4E3 de L. amazonensis, foi percebido que ao se mutar três motivos implicados na à PABP e o possível sítio de ligação ao EIF4G, sua fosforilação diminuiu drasticamente, sugerindo a necessidade destas interações para que a fosforilação ocorra. Estes resultados indicam um complexo mecanismo de modificações pós-traducionais responsáveis pela regulação do EIF4E3 e contribuem a para a caracterização da sua função em Leishmania

Les kinétoplastidés sont des protozoaires flagellés responsables de maladies tropicales négligées mortelles telles que la leishmaniose viscérale (L. donovani et L. infantum) ou la trypanosomiase humaine africaine (T. brucei), pour lesquelles les traitements disponibles sont très limités. Depuis quelques années, on observe un regain d'intérêt pour le développement de nitrohétérocycles aromatiques anti-infectieux tels que le delamanide et le féxinidazole. De récentes études indiquent que l'activité anti-kinétoplastidés de ces dérivés repose sur leur bioactivation sélective par des nitroréductases parasitaires, conduisant à la formation de métabolites réduits électrophiles, fortement cytotoxiques. Suite à des études préliminaires réalisées dans notre équipe en série 8-nitroquinoléin-2(1H)-one, ces travaux de thèse portent sur la synthèse et l'étude in vitro de l'activité antiparasitaire de 80 dérivés notamment fonctionnalisés en positions 3 et 6 du pharmacophore par divers motifs, notamment via la mise au point de réactions d'halogénation sélective et de couplages pallado-catalysés. Ainsi, 5 nouvelles molécules hits (4 anti-kinétoplastidés et 1 sélective de T. brucei) ont été identifiées (0,01 µM ≤ CI50 ≤ 7 µM et 13 < IS < 1500), trois d'entre-elles étant des substrats sélectifs des nitroréductases parasitaires de type I. Afin de préciser les relations structure-activité, une étude des potentiels de réduction a également été menée. Des études physico-chimiques (solubilité, test de perméabilité PAMPA) et pharmacocinétiques in vitro (stabilité microsomale et fixation à l'albumine humaine) sont venues compléter ce travail. Enfin, des évaluations de la mutagénicité et de la génotoxicité de ces hits sur des cellules procaryotes et humaines ont été conduites, dans le but de statuer sur leur potentiel pharmaceutique antiparasitaire humain et vétérinaire. / Kinetoplastids are flagellated protozoan parasites responsible for lethal neglected tropical diseases, such as visceral leishmaniasis (L. donovani and L. infantum) or sleeping sickness (T. brucei brucei), for which very few drugs are available. Nowadays, nitroheterocyclic compounds present a renewed interest as anti-infective agents, as illustrated by the development of fexinidazole and delamanid. Some recent studies demonstrated that the antikinetoplastid activity of these derivatives involves their selective bioactivation by parasitic nitroreductases, leading to the formation of electrophilic reduced metabolites, highly cytotoxic. Based on preliminary studies conducted in our team in 8-nitroquinolin-2(1H)-one series, this PhD work is about the synthesis and in vitro antiparasitic study of 80 derivatives mainly functionalized at positions 3 and 6 of the pharmacophore by various substituents, especially via the optimization of selective halogenation and pallado-catalyzed cross coupling reactions. Thereby, 5 new hit compounds (4 antikinetoplastid and 1 selective of T. brucei) were identified (0.01 µM ≤ IC50 ≤ 7 µM and 13 < SI < 1500), three of them being selective substrates of type I parasitic nitroreductases. In order to refine the structure-activity relationship studies, an analysis of reduction potentials was also conducted. In vitro physicochemical (solubility, PAMPA permeability assay) and pharmacokinetic (microsomal stability and human albumin binding) experiments completed this work. Finally, the mutagenicity and genotoxicity evaluations of these new hit compounds toward prokaryotic and human cells were realized, in order to assess their human and veterinary antiparasitic pharmaceutical potential.

Die vorliegende epidemiologische Studie umfaßte 153 Hunde aus der Nähe von Athen, Griechenland. Um die Prävalenz arthropogener Infektionen abschätzen zu können, wurden Serumproben auf Antikörper gegen Leishmania infantum, Ehrlichia canis und Borrelia burgdorferi sowie auf Antigene von Dirofilaria immitis überprüft. Blutausstriche wurden auf das Vorkommen von Babesia canis und Hepatozoon canis untersucht. Außerdem wurden von den Hunden abgesammelte Zecken bestimmt. Bei 126 Hunden erfolgte eine klinische Allgemeinuntersuchung. Des weiteren wurden die serologischen Testverfahren ELISA und IFAT für den Nachweis von Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi miteinander verglichen. Insgesamt waren 94 (61,4 %) der 153 untersuchten Hunde infiziert, 63 (41,2 %) Hunde wiesen Antikörper gegen Ehrlichia canis auf. Infektionen mit Borrelia burgdorferi wurden im ELISA insgesamt bei 43 (28,1 %), im IFAT bei 35 (22,9 %) Tieren nachgewiesen. Außerdem konnte bei 28 (18,3 %) Tieren eine Infektion mit Leishmania infantum und bei 20 (13,1 %) mit Dirofilaria immitis gefunden werden. Ein Nachweis von Babesia canis im Blutausstrich gelang bei vier (2,6 %) Hunden, von Hepatozoon canis nur bei einem (0,7 %) Hund. Für keinen der untersuchten Infektionserreger konnten signifikante Alters-, Geschlechts- oder Rasseprädispositionen festgestellt werden. Die Infektionsraten mit Leishmanien, Babesien, Dirofilarien und Borrelien waren bei den im Tierheim lebenden Hunden geringer als bei den Streunern. Vierundvierzig (28,8 %) der 153 getesteten Hunde waren gleichzeitig mit zwei, drei oder vier durch Arthropoden übertragene Erregerarten infiziert. Zweifachinfektionen kamen bei 29 (19,0 %), Dreifachinfektionen bei sieben (4,6 %) und Vierfachinfektionen bei acht (5,2 %) Tieren vor. In der Regel war das Risiko für Hunde, einen Erreger zu beherbergen, höher, wenn bereits eine Infektion mit einem anderen Erreger vorhanden war. Insgesamt waren 28 (18,3 %) Streuner und 15 (9,8 %) Tierheimhunde von Mehrfachinfektionen betroffen. Von den 94 mit mindestens einem der berücksichtigten Erreger infizierten Hunden wurden 75 (79,8 %) einer klinischen Untersuchung unterzogen. Dreiunddreißig (44,0 %) dieser Tiere zeigten Krankheitserscheinungen. Bei 21 (67,7 %) der 31 klinisch untersuchten und mit mehreren Erregern gleichzeitig infizierten Hunde konnten Krankheitssymptome diagnostiziert werden. Von 44 klinisch untersuchten Tieren, die nur mit einem Erreger infiziert waren, zeigten 12 (27,3 %) klinische Symptome. Die diagnostizierten Symptome waren bei allen untersuchten Erregern von einer starken Variabilität geprägt. Die Übereinstimmung der Testsysteme IFAT und ELISA für den Nachweis von Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi lag bei 92,2 %. Die Testverfahren sind damit als nahezu gleichwertig anzusehen, wobei der ELISA etwas sensitiver zu sein scheint. Eine Infektionsgefahr besteht demnach in Griechenland vor allem für Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi und Leishmania infantum, aber auch für Infektionen mit Dirofilaria immitis besteht ein Risiko. Infektionen mit Babesia canis kommen in dieser Region seltener vor, es muss jedoch insbesondere bei geschwächten oder in Deutschland geborenen und somit hochempfänglichen Tieren mit Erkrankungen gerechnet werden. Hepatozoon canis ist nach den vorliegenden Ergebnissen in der Umgebung von Athen von geringer Verbreitung. Ein Rückschluß vom klinischen Bild auf das Vorliegen einer Infektion mit einem bestimmten Erreger kann aufgrund der Variabilität der Symptome in Verbindung mit häufig auftretenden Mehrfachinfektionen nicht gezogen werden. Die Möglichkeit von gleichzeitig vorliegenden Infektionen sollte in der Diagnostik und Therapie unbedingt berücksichtigt werden. Gute Haltungsbedingungen und eine tierärztliche Überwachung und Prophylaxe reduzieren offensichtlich die Inzidenz von Infektionen mit arthropodenübertragenen Erregern. Die überwiegende Anzahl (449 von 457 Exemplaren) der bestimmten Zecken gehörte der Art Rhipicephalus sanguineus an. Es wurden sechs Nymphen und 443 adulte Tiere gefunden. Die adulten Tiere verteilten sich auf 243 männliche und 200 weibliche Zecken. Bei acht Zecken handelte es sich um weibliche Ixodes ricinus. Bei aus Griechenland stammenden Hunden wie auch bei Tieren, die sich reisebegleitend dort aufgehalten haben, muss mit einer starken Infestation mit Rhipicephalus sanguineus gerechnet werden. Da Rhipicephalus sanguineus der Vektor für Ehrlichia canis, Babesia canis vogeli und Hepatozoon canis ist, sollten Prophylaxemaßnahmen eine geeignete Zeckenbekämpfung einbeziehen. / 153 dogs from the environs of Athens, Greece, were surveyed for tick infestation and arthropod borne infections. Serology was performed for Leishmania infantum, Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis and Borrelia burgdorferi and bloodfilms were microscopically examined for Babesia canis and Hepatozoon canis. Ticks collected from the dogs were differentiated. 126 dogs underwent clinical examination. Suitability of an indirect immunofluorescent antibody assay (IFAT) and an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the diagnosis of antibodies to Borrelia burgdorferi was compared. Altogether 94 (61.4 %) dogs were infected with an arthropod borne pathogen, 63 (41.2 %) produced antibodies to Ehrlicha canis. ELISA detected Borrelia burgdorferi infection in 43 (28.1 %) dogs while IFAT was positive in 35 (22.9 %). 28 (18.3 %) dogs were infected with Leishmania infantum and 20 (13.1 %) with Dirofilaria immitis. Babesia canis was found in blood smears of four (2.6 %) dogs, Hepatozoon canis was detected only in one case (0,7 %). No association was found between the breed, age or sex of the dogs and any of the tested pathogens. The rate of infection with Leishmania, Babesia, Dirofilaria or Borrelia was lower in dogs living in the animal shelter than in those living as strays. 44 (28.8 %) of the 153 dogs examined were infected concurrently with two (n = 29, 19,0 %), three (n = 7, 4,6 %) or four (n = 8, 5,2 %) arthropod borne pathogens. In general the risk of infection was higher in dogs that were already infected with another pathogen. Altogether 28 (18.3 %) of the strays and 15 (9.8 %) of the dogs living in the animal shelter had a multiple infection. 75 of the 94 dogs infected with at least one of the tested pathogens were examined clinically. 33 (44.0 %) showed clinical symptoms. In 21 (67,7 %) of the 31 clinically examined dogs with multiple infection symptoms of disease were diagnosed. Twelve (27.3 %) of the 44 clinically examined dogs that were only infected with one pathogen had symptoms of some kind. Clinical symptoms varied considerably irrespective of the causative agent. The concordance of the IFAT and the ELISA for the diagnosis of Borrelia burgdorferi was 92.2 %. The serologic diagnosis of Borrelia burgdorferi with IFAT or ELISA can be regarded similarly suitable although ELISA seems to be somewhat more sensitive. In conclusion the risk of infection in Greece is particularly high for Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi and Leishmania infantum and Dirofilaria immitis as well. Babesia canis is obviously transmitted less. However dogs in poor condition or born in non endemic areas may acquire babesiosis in Greece. According to the results of this study Hepatozoon canis seems to be of negligible relevance in Greece. Due to the variability of the clinical symptoms and the frequent occurrence of multiple infections diagnosis based on the clinical picture only is not possible. Multiple infections should also be considered with respect to treatment. Infections with arthropod borne pathogens seem to occur less often in prophylactically treated dogs living under good conditions. Most of the examined ticks were identified as Rhipicephalus sanguineus (449 out of 457 specimens). Six nymphs and 419 adults were found. Of the adult Rhipicephalus sanguineus ticks 243 were males and 200 were females. Eight of the ticks were female Ixodes ricinus. In dogs originating from Greece as well as in dogs having accompanied tourists into Greece infestation with Rhipicephalus sanguineus is probable. As Rhipicephalus sanguineus is known to transmit Ehrlicha canis, Babesia canis vogeli and Hepatozoon canis prophylactic measures should include a suitable tick-control.

Orientador: Wilma Aparecida Starcke Buzetti / Resumo: Tripanosomatídeos são protozoários parasitas flagelados que em ruminantes no Brasil incluem os pertencentes à família Trypanosomatidae, com os gêneros Trypanosoma e Leishmania. Com relação aos búfalos domésticos (Bubalus bubalis), pouco ou nada se conhece sobre estes parasitas. Este estudo teve como objetivo avaliar por meio de métodos parasitológicos (exame direto do parasita no microscópio), sorológicos (RIFI – reação de imunofluorescência indireta) e moleculares (PCR – reação em cadeia pela polimerase e sequenciamento) a presença de tripanosomatídeos em búfalos. Amostras de sangue e suabe conjuntival foram coletadas de 100 búfalos da Fazenda São Francisco, Andradina, SP e de 10 búfalos de Selvíria, MS. Dos 110 búfalos, 60,9% (67/110) apresentaram hemoflagelares tripanossomatídeos nos esfregaços sanguíneos e 90% (99/110) deles apresentaram anticorpos anti-Leishmania pela RIFI. O DNA destes parasitas foi detectado em 29,09% (32/110) dos búfalos pela técnica de PCR, sendo, 26,36% (29/110) na PCR do sangue e 3,6% (4/110) na PCR do suabe conjuntival. Das amostras positivas para PCR, sete foram enviadas para o sequenciamento gênico, e uma delas foi identificada como Leishmania infantum e três como Trypanosoma theileri, ambas as amostras apresentaram 100% de similaridade com as respectivas espécies após comparação pelo GenBank. Este estudo relata o primeiro registro de infecção por L. infantum em B. bubalis na região de Andradina, SP, e a presença de búfalos infectados por espéci... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Trypanosomatides are flagellate protozoan parasites that in ruminants include those belonging to the family Trypanosomatidae, with the genera Trypanosoma and Leishmania, but with little or nothing information about these parasite infections in domestic water buffalo (Bubalus bubalis). Tthis study was assessed through the parasitological (direct examination of the parasite under microscope), serological (IFAT – immunofluorescence antibody test), and molecular tests (PCR from blood and conjunctival swab and genic sequencing) to detect possible trypanosomatides in buffalo herds from Andradina, SP and Selvíria, MS. Thus, 60.9% (67/110) buffaloes presented trypanosomatid parasites in the blood smears, 90% (99/110) had anti-Leishmania antibodies by IFAT. The DNA of these parasites was detected in 29.09% (32/110) of buffaloes by the PCR technique; 26.36% (29/110) in blood and 3.6% (4/110) in conjunctival swab. Positive PCR samples from seven animals were sent for DNA sequencing, and one of them was identified as Leishmania infantum and three as Trypanosoma theileri, both samples showed 100% of similarity with the respective species after comparison by BenBank. This study reports for the first time the presence of parasite L. infantum in B. bubalis from Andradina, SP, and highlights the presence of buffaloes infected with T. theileri, and indicates the need for more studies on trypanosomatid parasites in buffaloes. / Mestre

A dinâmica da leishmaniose visceral humana na Amazônia brasileira é pouco conhecida e nos últimos anos tem aumentado a incidência da doença principalmente no Estado do Pará. Os objetivos do estudo foram: I) identificar indivíduos com infecção sintomática e/ou assintomática por Leishmania (L.) infantum chagasi, II) estudar os dois tipos de infecção, tanto clínica quanto imunologicamente, e III) estudar a taxa de prevalência da infecção. O estudo foi de corte transversal com 946 indivíduos de ambos os sexos, com idade a partir de 1 ano, vivendo em área endêmica de leishmaniose visceral americana (LVA), município de Barcarena, Pará, Brasil. Para o diagnóstico da infecção, foram usadas a reação dérmica de hipersensibilidade retardada (Reação Intradérmica de Montenegro) - RIM e a Reação de Imunofluorêscencia Indireta (RIFI). Foram diagnosticados 120 casos de infecção com taxa de prevalência de 12.6%; 8 casos mostraram alta soro-reatividade (1.280 a 120.240) IgG utilizando-se o teste da RIFI e nenhuma reação na RIM; 4 casos foram típicos de LVA e outros 4 casos de infecção subclínica oligossintomática. Os dois métodos imunológicos usados simultaneamente com o exame clínico permitiram a identificação de 5 perfis clínico-imunológicos: Infecção Assintomática (IA) 73,4%; Infecção Subclínica Resistente(ISR) 15%; Infecção Subclínica Oligossintomática (ISO) 3%; Infecção Sintomática (IS=LVA) 3% e, Infecção Inicial Indeterminada (III) 5% / The dynamic of the human visceral leishmaniasis in the Amazon region is not well known and the incidence of the diseases in the last years have increase mainly in the Para state. The objectives the study were I) to identify individuals with symptomatic and/or asymptomatic infection due to Leishmania (L.) i. chagasi, II) to study the two types of infection, both clinically and immunologically, and III) to study the prevalence rate of infection. This was a cross-sectional study with a cohort of 946 individuals, of both sexes, with age from one year old onward, living in an endemic area of American Visceral Leishmaniasis (AVL), municipality of Barcarena, Pará State, Brazil. For the diagnosis of infection, the delayed hypersensitivity skin reaction (LST) and the indirect fluorescent antibody test (IFAT) were used. One hundred twenty cases of infection were diagnosed, with a prevalence rate of 12.6%; 8 cases showed high seroreactivity (1.280 to 10.240, IgG) in IFAT and no reaction in the LST; 4 cases being of typical AVL and other 4 cases of subclinical oligosymptomatic infection. The two immunological methods used simultaneously, with the clinical examination enabled to identify 5 clinical-immunological profiles: Asymptomatic Infection (AI) 73.4%; Subclinical Resistant Infection (SRI) 15%; Subclinical Oligosymptomatic Infection (SOI) 3%; Symptomatic Infection (SI=AVL) 3% and, Indeterminate Initial Infection (III) 5%

A dinâmica da leishmaniose visceral humana na Amazônia brasileira é pouco conhecida e nos últimos anos tem aumentado a incidência da doença principalmente no Estado do Pará. Os objetivos do estudo foram: I) identificar indivíduos com infecção sintomática e/ou assintomática por Leishmania (L.) infantum chagasi, II) estudar os dois tipos de infecção, tanto clínica quanto imunologicamente, e III) estudar a taxa de prevalência da infecção. O estudo foi de corte transversal com 946 indivíduos de ambos os sexos, com idade a partir de 1 ano, vivendo em área endêmica de leishmaniose visceral americana (LVA), município de Barcarena, Pará, Brasil. Para o diagnóstico da infecção, foram usadas a reação dérmica de hipersensibilidade retardada (Reação Intradérmica de Montenegro) - RIM e a Reação de Imunofluorêscencia Indireta (RIFI). Foram diagnosticados 120 casos de infecção com taxa de prevalência de 12.6%; 8 casos mostraram alta soro-reatividade (1.280 a 120.240) IgG utilizando-se o teste da RIFI e nenhuma reação na RIM; 4 casos foram típicos de LVA e outros 4 casos de infecção subclínica oligossintomática. Os dois métodos imunológicos usados simultaneamente com o exame clínico permitiram a identificação de 5 perfis clínico-imunológicos: Infecção Assintomática (IA) 73,4%; Infecção Subclínica Resistente(ISR) 15%; Infecção Subclínica Oligossintomática (ISO) 3%; Infecção Sintomática (IS=LVA) 3% e, Infecção Inicial Indeterminada (III) 5% / The dynamic of the human visceral leishmaniasis in the Amazon region is not well known and the incidence of the diseases in the last years have increase mainly in the Para state. The objectives the study were I) to identify individuals with symptomatic and/or asymptomatic infection due to Leishmania (L.) i. chagasi, II) to study the two types of infection, both clinically and immunologically, and III) to study the prevalence rate of infection. This was a cross-sectional study with a cohort of 946 individuals, of both sexes, with age from one year old onward, living in an endemic area of American Visceral Leishmaniasis (AVL), municipality of Barcarena, Pará State, Brazil. For the diagnosis of infection, the delayed hypersensitivity skin reaction (LST) and the indirect fluorescent antibody test (IFAT) were used. One hundred twenty cases of infection were diagnosed, with a prevalence rate of 12.6%; 8 cases showed high seroreactivity (1.280 to 10.240, IgG) in IFAT and no reaction in the LST; 4 cases being of typical AVL and other 4 cases of subclinical oligosymptomatic infection. The two immunological methods used simultaneously, with the clinical examination enabled to identify 5 clinical-immunological profiles: Asymptomatic Infection (AI) 73.4%; Subclinical Resistant Infection (SRI) 15%; Subclinical Oligosymptomatic Infection (SOI) 3%; Symptomatic Infection (SI=AVL) 3% and, Indeterminate Initial Infection (III) 5%

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-11T12:57:27Z No. of bitstreams: 1 amanda_r_lobo_ioc_bp_0013_2008.pdf: 4777016 bytes, checksum: a9e75760e9cb6f61af23579591306cb1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-11T12:57:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_r_lobo_ioc_bp_0013_2008.pdf: 4777016 bytes, checksum: a9e75760e9cb6f61af23579591306cb1 (MD5) Previous issue date: 2008 / Cnpq - PDTIS/FIOCRUZ / Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Laboratório de Farmacologia Bioquímica e Celular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose visceral é uma doença de alta mortalidade quando não tratada. Aproximadamente 500.000 novos casos ocorrem todo ano, freqüentemente em países pobres e em desenvolvimento. No Brasil, a leishmaniose visceral é causada pela Leishmania chagasi, que é transmitida principalmente pelo inseto vetor Lutzomyia longipalpis. Após 72 h de alimentação sanguínea num hospedeiro infectado, parasitas procíclicos são vistos aderidos ao intestino do inseto via flagelo. Esta adesão é vital para a evolução do ciclo de transmissão do parasita. Em vetores espécie–específicos foi proposto um papel para um lipofosfogligano (LPG) de superfície de Leishmania na adesão, porém, em vetores permissíveis, tem-se sugerido que esta adesão seja independente de LPG. Com o interesse de identificar e caracterizar moléculas que possam ter uma participação na interação parasito-vetor, nós iniciamos o estudo de duas moléculas de L. chagasi denominadas Flag e Sup, pertencentes à família de proteínas pequenas miristiladas (SMP’s), que anteriormente haviam sido implicadas em adesão ao tubo digestivo de flebotomíneos. Amplificamos e seqüenciamos o gene Flag de L. chagasi e observamos por alinhamento múltiplo o alto grau de conservação deste gene entre as espécies de Leishmania. Proteínas Flag e Sup recombinantes foram produzidas e utilizadas para produção de anticorpos policlonais em coelhos. Vimos por Western Blot de extrato protéico de várias espécies de Leishmania, que os anticorpos monoclonal e policlonal anti-Flag/MBP e o anticorpo policlonal anti-Sup, reconhecem as proteínas em todas as espécies, evidenciando a conservação destas. A imunolocalização destas proteínas mostrou que a proteína Flag está preferencialmente localizada na forma promastigota na bolsa flagelar e no flagelo, e, em amastigota, na bolsa flagelar e no flagelo interno curto, enquanto que a proteína Sup mostrou localização em toda a superfície do corpo em ambas as formas. Experimentos de RT-PCR mostraram que há transcrição diferencial de Flag e Sup quando comparamos entre as formas evolutivas amastigotas e promastigotas. Flag tem uma expressão parecida nas duas formas evolutivas enquanto Sup é mais expresso em amastigotas. Ensaios de inibição ex-vivo incubando previamente L. chagasi com anticorpo monoclonal anti-Flag ou policlonal anti-Sup, mostrou redução significativa de parasitas aderidos ao intestino de L. longipalpis Na tentativa de identificar um potencial receptor para o parasita no intestino de L. longipalpis, observamos a marcação de uma proteína de 27 kDa no extrato protéico do vetor utilizando parasita biotinilado em experimentos de “ligand blot”. / Visceral leishmaniasis is an illness of high mortality if not treated. Approximately 500,000 new cases occur per year, frequently in poor countries. In Brazil, visceral leishmaniasis is caused by Leishmania chagasi, transmitted by the insect vector Lutzomyia longipalpis. After 72h of blood feeding in an infected host, procyclic parasites are seen adhered to insect gut by the flagellum. This adhesion is vital for the completion of the parasite cycle of transmission. In species-specific vectors a role for a surface lipophosphoglycan (LPG) of Leishmania in the adhesion has been considered, while in the permissible vectors, this adhesion may be independent of LPG. Aiming to identify and characterize molecules that may be involved in the parasite- vector interaction, we initiated a study of two molecules of L. chagasi, Flag and Sup, which belong to the small myristylated protein family (SMP's), that have previously been implicated in adhesion to the sandfly midgut. We amplifyed and sequenced the Flag gene of L. chagasi and, using multiple alignments, observed a high degree of conservation of this gene among Leishmania species. Recombinant protein Flag and Sup were produced and used for polyclonal antibodies production in rabbits. By Western Blot of total protein extract of some species of Leishmania, we observed that the anti-Flag monoclonal and polyclonal antibodies and the anti-Sup polyclonal antibody, recognized proteins in all the analyzed species, evidencing their conservation. Immunolocalization of these proteins showed that Flag is preferentially located in the flagellar pocket and flagellum in the promastigote form and in the flagellar pocket and internalized short flagellum in the amastigote, while Sup showed localization on the cell surface in both forms. Experiments of RT-PCR showed that there is a differential transcription of Flag and Sup between amastigotes and promastigotes. Flag has similar levels of expression in both evolutive forms while Sup is more expressed in amastigotes. Assays of ex-vivo inhibition with L. chagasi previously incubated with monoclonal antibodies anti-Flag or anti-Sup showed a significant reduction of the number of adhered parasites to the L. longipalpis midgut. In an attempt to identify a potential receptor for the parasite in the intestine of L. longipalpis, we observed the labelling of a protein of 27 kDa in the protein extract of the vector using biotinylated parasites in experiments of "ligand blot".

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:13:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 18.pdf: 1870075 bytes, checksum: d5ea98b7af7284f04b5ff0aa3d2c7c71 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / A leishmaniose visceral canina (LVC) e uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, principalmente por Leishmania infantum. A epidemiologia da doença varia de região para região e o entendimento dos fatores associados à infecção em cães pode ajudar na elaboração de medidas de controle mais específicas. O diagnóstico sorológico da infecção sofreu mudanças importantes nos últimos anos com a introdução do TR-DPP® e do estabelecimento de novos critérios de diagnóstico (TR-DPP® + EIE-LVC) pelo Ministério da Saúde. Dentro desse contexto, no presente estudo objetivou-se estudar a epidemiologia da LVC no município de Goiana, estado de Pernambuco, nordeste do Brasil. Para tal, realizaram-se testes sorológicos (TR-DPP® e EIE-LVC) e análise clínico-epidemiológica em 360 cães semi e domiciliados, de ambos os sexos, raças e idades variadas, nos distritos de Atapuz, Tejucupapo e Pontas de Pedra no referido município. No TR-DPP®47 (13,1 por cento) animais foram reagentes, onde se observou associação significativa dos resultados com os seguintes sinais clínicos: alopecia, lesões na pele paresia e linfonodomegalia. Já no EIE-LVC 21 (5,8 por cento) animais foram reagentes, havendo associação significativa entre a classificação clínica dos animais, condição corporal, alopecia, lesões na pele, secreção ocular, paresia e linfonodomegalia. Já de acordo com o critério do Ministério da Saúde do Brasil, apenas 15 (4,2 por cento) animais foram classificados como positivos. De fato, verificou-se uma fraca concordância (Kappa = 0,39) entre os dois testes sorológicos. Conclui-se que a LVC encontra-se estabelecida em Goiana e que o uso do TR-DPP® como teste de triagem e do EIE-LVC como teste confirmatório pode levar a perda de cães infectados, uma vez que cães positivos do TR-DPP® são negativos no EIE-LVC e vice-versa

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 173.pdf: 1047808 bytes, checksum: 48de5cc0086090a92e066047b4e59660 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Os tripanossomatídeos possuem uma combinação não usual de mecanismos moleculares, e seus processos de regulação de expressão gênica ocorreram a nível pós-transcricional. Acredita-se que essa regulação envolva tanto o controle da estabilidade dos mRNAs, como sua tradução em proteínas, eventos em que atua a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP - Poly-A Binding Protein), uma das principais proteínas de ligação a RNAs em eucariotos. Um grande número destas proteínas está presente nos tripanosomatídeos, se caracterizando por possuírem domínios típicos de ligação a RNA, como o domínio RRM (RNA Recognition Motif). Dentre estas se destacam as proteínas de ligação a sequências ricas em uridina (UBPs), que se mostraram capazes de interagir com homólogos de PABP. Outras proteínas hipotéticas contendo domínios de ligação a RNA foram identificadas em ensaios que buscavam parceiros diferenciais para os três homólogos de PABP de Leishmania. Este trabalho se propôs a contribuir na caracterização funcional das proteínas UBPs e das proteínas hipotéticas, através da otimização de sua expressão de forma heteróloga em L. infantum, fusionadas ao epítopo HA. Para isto, os genes codificantes dos três homólogos de UBPs, e de cinco outras proteínas de ligação a RNA que parecem interagir com PABPs, foram amplificados e clonados em vetor de expressão de Leishmania. As construções geradas foram transfectadas em L. infantum e a expressão de seis destas proteínas avaliada. Os resultados obtidos mostram uma variação no reconhecimento das proteínas geradas com anticorpos comerciais anti-HA, que parecem depender da sequência de aminoácidos da sua extremidade C-terminal. Diferenças significativas nos seus níveis de expressão também foram observadas. Entre os três homólogos de UBP, dois destes se mostraram mais abundantes enquanto que os três são representados por mais de uma banda, indicando possíveis modificações pós-traducionais