Introdução: Um dos primeiros sistemas de defesa contra os microrganismos é a via dos receptores Toll-like (TLRs). A ativação destes receptores leva à síntese de citocinas, dando início à resposta imune inata. Em modelos animais, o TLR2, TLR4 e TLR9 parecem estar relacionados com o reconhecimento de antígenos de Leishmania. A relação entre TLRs e leishmânia pode ser um mecanismo chave no desenvolvimento da doença ou no controle da mesma. Até o momento não existem estudos de TLRs na leishmaniose cutânea humana. Objetivo: Determinar o padrão de expressão e as células associadas com o TLR2, TLR4 e TLR9 na leishmaniose cutânea. O objetivo secundário é correlacionar a quantidade de TLRs com a quantidade de citocinas e células inflamatórias na pele. Métodos: Cem biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea causadas por Leishmania (V.) braziliensis foram selecionadas inicialmente. Apenas os casos confirmados (presença de amastigotas no raspado, teste de Montenegro positivo, imunoistoquímica com presença de antígenos de Leishmania e reação em cadeia da polimerase com DNA de Leishmania (V.) braziliensis foram incluídos. Um grupo controle de pele normal foi incluído para comparação (quatro casos). A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 foi determinada por técnica imunoistoquímica, da mesma forma que os fenótipos celulares (células NK, macrófagos, células dendríticas, células CD4 e CD8) e citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alfa, IFN-gama). Dupla-marcação foi realizada para identificar as células que expressaram os TLRs analisados. Análise semi-quantitativa foi utilizada para avaliação da expressão de TLRs na epiderme, enquanto na derme foi realizada análise quantitativa. O nível de significância foi estabelecido com p<0,05. Resultados: Doze casos preencheram os critérios de inclusão. Os pacientes eram todos masculinos, com lesões apenas em membros inferiores e mediana de idade de 23 anos [16-47]. A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 na epiderme da pele normal foi alta. Quando comparados com pele normal, tanto TLR4 quanto TLR2 mostraram menor expressão no epitélio dos pacientes com leishmaniose e não houve expressão de TLR9. A média de células expressando TLR2 na derme foi de 136,36±82,46 células/mm2, ao passo que a média de células expressando TLR4 foi de 3,21±4,11 células/mm2. A contagem de TLR9 foi de 86,15±88,36 células/mm2 predominando em áreas de formação de granulomas. A regressão linear não demonstrou relação entre a contagem de células marcadas ou citocinas com TLR2 ou TLR4. O aumento proporcional da expressão de TLR9 relacionou-se com maior expressão de IL-12 e IL-4 (p < 0,05). A dupla marcação demonstrou que os macrófagos expressaram TLR2. A dupla marcação não mostrou expressão de TLR2 nas células dendríticas e nas células NK. Conclusão: A leishmaniose cutânea localizada associa-se com a presença de TLR2, TLR4 e TLR9. No epitélio a expressão de TLR2 e TLR4 em pacientes com leishmaniose está diminuída em relação aos pacientes controles. A expressão do TLR2 na derme é estatisticamente maior que a de TLR4 e TLR9, a qual é expressa pelos macrófagos. A expressão de TLR9 ocorre principalmente nas áreas de granulomas havendo relação com a expressão de IL-12 e IL-4 / Introduction: One of the first systems of defense against microorganisms is the Toll-like receptors (TLRs) pathway. The activation of these receptors promotes the cytokine synthesis, initiating the innate immune response. In animal models, TLR2, TLR4 and TLR9 appear to be related to the recognition of antigens of Leishmania. The relationship between TLRs and Leishmania can be a key mechanism in the development of the disease or it control. Until now, there are not studies about TLRs in human cutaneous leishmaniasis. Objective: To determine the expression pattern and the cells associated with TLR2, TLR4 and TLR9 in cutaneous leishmaniasis. The secondary objective is to correlate the amount of TLRs with the amount of cytokines and inflammatory cells. Methods: One hundred biopsies from patients with cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (V.) braziliensis were initially selected. Only confirmed cases of cutaneous leishmaniasis were included in the analysis (presence of amastigotes in the scraping, positive Montenegro test, immunohistochemistry with the presence of Leishmania antigens and polymerase chain reaction with DNA from Leishmania (V.) braziliensis. A control group (4 cases) of normal skin was included for comparison. The expression of TLR2, TLR4 and TLR9 was determined by immunohistochemistry, as well as cell phenotypes (NK cells, macrophages, dendritic cells, CD4 and CD8) and cytokines (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alpha, IFN-gamma). Double-staining was used to determine the cells expressing TLRs. Semi-quantitative analysis was used for evaluation of the expression of TLRs in the epidermis. Quantitative analysis was performed to evaluate the expression in the dermis. The level of significance was defined as p <0.05. Results: 12 cases fulfilled inclusion criteria. The patients were all male, with lesions in lower limbs and median age of 23 years [16-47]. The expression of TLR2 and TLR4 in the epidermis of normal skin was high. When compared with normal skin, TLR2 and TLR4 showed lower expression in the epidermis. There was no expression of TLR9 in the epidermis in cases of cutaneous leishmaniasis and normal skin. The mean number of cells expressing TLR2 in the dermis was 136.36±82.46 cells/mm2, while the average of cells expressing TLR4 was 3.21±4.11 cells/mm2. The count of TLR9 was 86.15±88.36 cells/mm2, and it was found mainly in the areas of granuloma formation. Linear regression showed no relationship between the number of labeled cells or cytokines with TLR2 or TLR4. There was an association between TLR9 and two cytokines (IL-12 and IL-4). This correlation suggested that the proportional increase in the expression of TLR9 was related to greater expression of IL-12 and IL-4 (p<0.05). The double staining showed that macrophages and endothelial cells expressed TLR2. The double staining showed no expression of TLR2 in dendritic cells and NK cells. Conclusion: The localized cutaneous leishmaniasis associated with the presence of TLR2, TLR4 and TLR9. The expression of TLR2 in the dermis was statistically greater than that of TLR4 and TLR9, which is expressed by macrophages. The expression of TLR9 occurs primarily in the areas of granulomas was associated with the expression of IL-12 and IL-4

Orientador: Ingrid Menz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:49:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cutolo_AndreAntonio_D.pdf: 3489196 bytes, checksum: ba6ee219dca9c92ee1ef9d6f194ee0b4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A incidência das leishmanioses tegumentar (LTA) e visceral americanas (LVA) em hospedeiros caninos e humanos encontra-se em crescente expansão no Brasil. Para a vigilância epidemiológica dessas endemias, é fundamental o conhecimento da distribuição das diferentes espécies vetoras de flebotomíneos e, para a LVA, o conhecimento de parâmetros epidemiológicos como a prevalência, incidência, período de incubação e potencial de transmissibilidade de Leishmania infantum chagasi no cão, seu principal reservatório. Objetivou-se assim esclarecer alguns aspectos epidemiológicos das infecções caninas, incluindo-se levantamento entomológico no município de Monte Mor, situado na região centro-leste do estado de São Paulo, além da obtenção de parâmetros epidemiológicos da LVA por estudo longitudinal de 105 cães em área endêmica para a doença em Campo Grande, Mato Grosso do Sul, por dois anos. Em Monte Mor, 319 amostras de soro canino foram avaliadas por ELISA e RIFI, sendo todas negativas para anticorpos anti-Leishmania, identificou-se sete espécies de flebotomíneos, com predomínio de Nyssomyia neivai (48,84%) considerada a principal transmissora do agente causador da LTA no interior paulista, além do diagnóstico de dois casos caninos de LTA, com sorologia reagente para ELISA FML e infecção por L. (Viannia) braziliensis. No estudo longitudinal dos 105 cães acompanhados por meio de avaliações clínicas, exames sorológicos (ELISA L. major-like, FML e S7) e parasitológicos diretos (esfregaços e PCR de aspirados de medula óssea e linfonodo e imunoistoquímica de pele) obteve-se prevalência sorológica inicial de 30,40% (145/477) no ELISA L. major-like e 26,28% (97/369) no ELISA FML. A prevalência da doença clínica (sintomáticos) foi de 7,13% (62/870), sendo que 24,53% (117/477) foram soropositivos no ELISA L. major-like, mas sem sintomas de leishmaniose visceral canina (LVC), demonstrando quantidade elevada de cães infectados assintomáticos na área. Ao final de 24 meses não se observou associação estatística significativa nas variáveis ambientais avaliadas no início do estudo e a ocorrência de casos de LVC, como a ocorrência prévia de LVA e/ou LVC no entorno ou na casa do proprietário, a existência de outras espécies animais na casa, o hábito intra ou peridomiciliar, o temperamento, a idade e o sexo do cão. A incidência de novas infecções variou de 11,76% (8/68), 11,76% (8/68) e 18,18% (12/66) respectivamente entre o Dia -30 e Zero, Dia Zero e Mês 12 por sorologia e Dia Zero e Mês 12 para os métodos diretos. A mortalidade natural e induzida via eutanásia de animais doentes e/ou infectados foi de 28,57% (30/105). O período de incubação médio foi de 6,46 meses. Alguns animais infectados com resultados positivos em prova diagnóstica de PCR e/ou prova de sorologia no início do estudo não apresentaram novos resultados positivos após 12 meses, indicando possível cura ou não estabelecimento da infecção. Observaram-se alguns animais com provas diretas positivas mostrando infecção assintomática por período de 24 meses. Obteve-se baixa prevalência de amastigotas em pele saudável, presente apenas em animais sintomáticos, enquanto que a ausência de amastigotas observada em cães portadores assintomáticos indica que os mesmos podem não ter papel importante na transmissão de parasitas ao flebotomíneo vetor / Abstract: Cutaneous (ACL) and visceral american leishmaniasis (AVL) incidences in human and canine hosts are increasing and expanding in Brazil. In order to perform an adequate vigilance of these diseases, the knowledge regarding distribution of different sandfly vector species is mandatory, besides of precising epidemiological parameters like prevalence, incidence, incubation period and potential of transmissibility in the dog, the main reservoir for the AVL etiologic agent. This way, the objectives of this study were to clarify some epidemiological aspects of canine leishmaniases, including entomological surveillance in the county of Monte Mor, central east region of São Paulo state and performance of a longitudinal study in an AVL endemic area located in Campo Grande, Mato Grosso do Sul state, including 105 dogs in order to evaluate epidemiological data during two years. In Monte Mor county, 319 sera samples were analysed through in house developed ELISA and IFA methods. No seropositive result was found, seven different sandfly species were identified, prevailing Nyssomyia neivai (48.84%) considered the main vector for the ACL etiologic agent in São Paulo state countryside, and two dogs were diagnosed with ACL symptoms, presenting seropositivity through ELISA FML and positive identification of L. (Viannia) braziliensis infection using PCR. The longitudinal study was performed using clinical examination, serology (ELISA L. major-like, FML and S7) and direct diagnostic techniques (bone marrow and lymph node smears and PCR and immunohistochemistry in skin tissues) on dogs. A seroprevalence of 30.40% (145/477) at ELISA L. major-like and 26.28% (97/369) at ELISA FML was obtained at the pre-initial phase. Clinical disease prevalence was 7.13% (62/870), and 24.53% (117/477) dogs were seropositive at ELISA L. major-like, but asymptomatic, showing the high amount of infected healthy carriers. At the end of the 24 months period no significant association was found between visceral leishmaniasis (VL) canine cases with environmental variables evaluated at Day Zero like previous registration of human or canine VL on the study house or neighborhood, other domestic animal species at the backyard, intra or peridomiciliar, aggressive behavior, age or sex of the study dog. Incidence of infections varied from 11.76% (8/68), 11.76% (8/68) e 18.18% (12/66) respectively between Day -30 and Zero, Day Zero and Month 12 using serology and Day Zero and Month 12 for direct diagnostic methods. Natural and induced mortality through euthanasia of sick/infected dogs was 28.57% (30/105). The mean disease incubation period was 6.46 months. Some of the infected animals with positive diagnosis at the beggining of the study had no other positive results after 12 months, indicating a possible cure or an absence of infection establishment, while others had positive diagnosis at the beginning and at month 12 with asymptomatic condition for more than 24 months. A low Leishmania amastigotes prevalence at healthy skin was obtained and positive results were observed only in symptomatic animals. Absence of parasites in skin of asymptomatic carriers may indicate they have no important role on the transmission of Leishmania to competent vectors / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia

INTRODUÇÃO: A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa endêmica no Brasil, causada por protozoários do gênero Leishmania e possui duas formas clínicas principais, a leishmaniose cutânea (LC) e a leishmaniose mucocutânea (LMC). Os macrófagos têm papel crucial na patogênese da Leishmaniose como hospedeiros do parasita e atuam como células apresentadoras de antígenos, promovendo uma resposta imune de perfil Th1 contra a Leishmania. Os macrófagos polarizados M2, relacionados com resposta anti-inflamatória (Th2), são envolvidos no controle da inflamação e dano tecidual em várias doenças e estão associados à cronicidade nas doenças infecciosas. O objetivo deste trabalho foi verificar a participação dos macrófagos M2 nos sítios de lesão cutânea da LTA MÉTODOS: Sessenta e três biópsias de pele de lesões de LTA, obtidas de 48 doentes com LC e 15 de LMC, foram submetidas ao método imuno-histoquímico com os anticorpos anti-CD163 e anti-CD206, marcadores de macrófagos M2. Dez espécimes foram também submetidos à técnica imuno-histoquímica de dupla marcação com a utilização dos marcadores pSTAT-1 e CD68 para identificação de macrófagos M1 e CMAF e CD163 para identificação de macrófagos M2. RESULTADOS: Os espécimes de pele com reação inflamatória difusa (n = 26) exibiram maior número de células imunomarcadas com CD163, quando comparadas ao grupo com reação granulomatosa bem organizada (n = 37) (p= 0,01). Os macrófagos CD163+ também foram mais numerosos nas lesões de pele com a presença de formas amastigotas de Leishmania (n = 39) ao exame histopatológico (p=0,02), quando comparadas às lesões onde os parasitas não foram observados (n = 24). O mesmo ocorreu quando comparados somente os espécimes do grupo de doentes com LC com a presença de parasitas (n = 31) e ausência dos mesmos (n = 17) (p = 0,04). As lesões de pele de doentes com LMC mostraram maior número de células CD206+ (n = 15) que a de doentes com LC (n = 48) (p=0,008). Houve correlação positiva entre o número de células imunomarcadas com os anticorpos CD163 e CD206 (r de Spearman= 0,369). Os macrófagos +pSTAT1/CD68+ (M1) mostraram-se mais numerosos que os macrófagos CMAF+/CD163+ (M2) nos sítios de lesão cutânea da LTA. CONCLUSÕES: Os resultados obtidos sugerem que os macrófagos M2 têm um papel na resposta imune \"in situ\" da LTA. Essas células devem atuar como células alvo, facilitando a entrada dos parasitas, a progressão da doença e parecem estar envolvidos nos mecanismos de cronicidade e nos processos de remodelamento tecidual dessa doença. As moléculas CD163 e CD206 podem ser consideradas bons marcadores teciduais de macrófagos M2, uma vez que mostraram correlação positiva em sua expressão. A técnica de dupla marcação confirmou a presença dos macrófagos M2 nas lesões cutâneas da LTA. Embora ocorra a presença de macrófagos M2, os macrófagos M1 são a população macrofágica predominante da resposta imune \"in situ\" da LTA / INTRODUCTION: American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an endemic infectious disease in Brazil, caused by Leishmania parasites and it has two main clinical forms, cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL). Macrophages play a key role in leishmaniasis pathogenesis. They are definite parasite host and act as antigen presenting cells, eliciting a Th1 pattern of immune response (M1) against Leishmania. M2 polarized macrophages, related to an anti-inflammatory response (Th2), are involved in controlling inflammation and tissue damage in several diseases and are related to chronicity in infectious diseases. The aim of this study was verifying M2 macrophages \"in situ\" participation in ATL. METHODS: Sixty-three skin biopsies from LTA lesions, obtained from patients with CL (n=48) and MCL (n=15), were subjected to imunohistochemical technique with M2 macrophages markers CD163 and CD206 antibodies. Ten samples were selected for double staining technique with pSTAT1 and CD68 markers for M1 identification, and CMAF and CD163 markers for M2 macrophages identification. RESULTS: Skin samples displaying diffuse inflammatory reaction (n = 26) exhibited higher number of CD163 immune stained macrophages when compared to the well-organized granulomatous reaction group (n = 37) (p=0.01). CD163+ macrophages were higher in samples displaying Leishmania parasites (n = 39) at histopathology exam than the samples without parasites (n = 24) (p=0.02). Same result was observed when comparing the lesions of CL lesions with (n = 31) and without (n = 17) parasites (p = 0.04). MCL skin lesions (n = 15) showed higher number of CD206+ cells (p = 0.008) in comparison with skin lesions taken from CL patients (n = 48). Spearman test demonstrated a positive correlation between the number of CD163+ and CD206+ immune stained cells (Spearman r = 0,369). M1 macrophages (pSTAT1+/CD68+) were present in higher number when compared to M2 macrophages (CMAF+/CD163+) in the samples studied. CONCLUSIONS: The results suggest that M2 macrophages play a role in the in situ immune response of ATL. M2 polarized macrophages may act as host target cells facilitating parasites entry and promoting disease progression, but also seem to be involved with chronicity and tissue remodeling of ATL lesions. CD163 and CD206 molecules may be considered as good markers for M2 macrophages. Double staining technique confirmed the presence of M2 macrophages, although M1 macrophages are the predominant macrophagic component in skin lesions of ATL

A caracterização de sequências codificadoras presentes nas vizinhanças do gene META 1 permitiu a identificação de alguns genes expressos preferencialmente em estágios infectivos de L. (L.) amazonensis. Um dos genes presentes é regulado de forma distinta, observando-se maior abundância do RNA em formas amastigotas. Este gene foi denominado LaLRR17 por codificar uma proteína contendo em sua região central 6 repetições ricas em leucina (LRR). As LRR são motivos presentes em diversas famílias de proteínas e são responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. A região central da proteína LRR17 apresentou similaridade com a porção carboxi-terminal da proteína NOD 3 humana. A proteína LRR17 foi localizada no citosol de macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis. Para caracterizar a função da proteína LRR17 foram obtidas linhagens de L. (L.) amazonensis expressoras do gene LmjLRR17. Essas linhagens mutantes foram mais infectivas em macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. Avaliamos também o papel das proteínas NOD 1 e NOD 2 na infecção por L. (L.) amazonensis e L. (L.) major para estabelecer a possível relação da proteína LRR17 na interação com essas vias de defesa celular do macrófago. / The characterization of coding sequences in the vicinity of the META 1 gene allowed the identification of some genes preferentially expressed in L. (L.) amazonensis infective stages. One of the identified transcripts presents a distinct pattern of expression with higher levels of mRNA in amastigotes. This gene was named LaLRR17 since it encodes a 72 kDa protein with 6 leucine-rich repeats (LRR) in its central region. Leucine-rich repeats (LRR) are present in several families of proteins and are responsible for the formation of a structure capable of establishing protein interactions. The central region of the LRR17 protein showed similarity with the carboxyl-terminal portion of the NOD 3 human protein. The LaLRR17 protein is secreted to the cytoplasm of L. (L.) amazonensis-infected macrophages. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained strains of L. (L.) amazonensis expressing the LmjLRR17 gene. These mutant strains were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strain. We also evaluated the role of NOD 1 and NOD 2 proteins in infections with L. (L.) amazonensis and L. (L.) major to investigate a possible role of the LRR17 protein in the interaction with these defense pathways in macrophages.

INTRODUÇÃO: A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa endêmica no Brasil, causada por protozoários do gênero Leishmania e possui duas formas clínicas principais, a leishmaniose cutânea (LC) e a leishmaniose mucocutânea (LMC). Os macrófagos têm papel crucial na patogênese da Leishmaniose como hospedeiros do parasita e atuam como células apresentadoras de antígenos, promovendo uma resposta imune de perfil Th1 contra a Leishmania. Os macrófagos polarizados M2, relacionados com resposta anti-inflamatória (Th2), são envolvidos no controle da inflamação e dano tecidual em várias doenças e estão associados à cronicidade nas doenças infecciosas. O objetivo deste trabalho foi verificar a participação dos macrófagos M2 nos sítios de lesão cutânea da LTA MÉTODOS: Sessenta e três biópsias de pele de lesões de LTA, obtidas de 48 doentes com LC e 15 de LMC, foram submetidas ao método imuno-histoquímico com os anticorpos anti-CD163 e anti-CD206, marcadores de macrófagos M2. Dez espécimes foram também submetidos à técnica imuno-histoquímica de dupla marcação com a utilização dos marcadores pSTAT-1 e CD68 para identificação de macrófagos M1 e CMAF e CD163 para identificação de macrófagos M2. RESULTADOS: Os espécimes de pele com reação inflamatória difusa (n = 26) exibiram maior número de células imunomarcadas com CD163, quando comparadas ao grupo com reação granulomatosa bem organizada (n = 37) (p= 0,01). Os macrófagos CD163+ também foram mais numerosos nas lesões de pele com a presença de formas amastigotas de Leishmania (n = 39) ao exame histopatológico (p=0,02), quando comparadas às lesões onde os parasitas não foram observados (n = 24). O mesmo ocorreu quando comparados somente os espécimes do grupo de doentes com LC com a presença de parasitas (n = 31) e ausência dos mesmos (n = 17) (p = 0,04). As lesões de pele de doentes com LMC mostraram maior número de células CD206+ (n = 15) que a de doentes com LC (n = 48) (p=0,008). Houve correlação positiva entre o número de células imunomarcadas com os anticorpos CD163 e CD206 (r de Spearman= 0,369). Os macrófagos +pSTAT1/CD68+ (M1) mostraram-se mais numerosos que os macrófagos CMAF+/CD163+ (M2) nos sítios de lesão cutânea da LTA. CONCLUSÕES: Os resultados obtidos sugerem que os macrófagos M2 têm um papel na resposta imune \"in situ\" da LTA. Essas células devem atuar como células alvo, facilitando a entrada dos parasitas, a progressão da doença e parecem estar envolvidos nos mecanismos de cronicidade e nos processos de remodelamento tecidual dessa doença. As moléculas CD163 e CD206 podem ser consideradas bons marcadores teciduais de macrófagos M2, uma vez que mostraram correlação positiva em sua expressão. A técnica de dupla marcação confirmou a presença dos macrófagos M2 nas lesões cutâneas da LTA. Embora ocorra a presença de macrófagos M2, os macrófagos M1 são a população macrofágica predominante da resposta imune \"in situ\" da LTA / INTRODUCTION: American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an endemic infectious disease in Brazil, caused by Leishmania parasites and it has two main clinical forms, cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL). Macrophages play a key role in leishmaniasis pathogenesis. They are definite parasite host and act as antigen presenting cells, eliciting a Th1 pattern of immune response (M1) against Leishmania. M2 polarized macrophages, related to an anti-inflammatory response (Th2), are involved in controlling inflammation and tissue damage in several diseases and are related to chronicity in infectious diseases. The aim of this study was verifying M2 macrophages \"in situ\" participation in ATL. METHODS: Sixty-three skin biopsies from LTA lesions, obtained from patients with CL (n=48) and MCL (n=15), were subjected to imunohistochemical technique with M2 macrophages markers CD163 and CD206 antibodies. Ten samples were selected for double staining technique with pSTAT1 and CD68 markers for M1 identification, and CMAF and CD163 markers for M2 macrophages identification. RESULTS: Skin samples displaying diffuse inflammatory reaction (n = 26) exhibited higher number of CD163 immune stained macrophages when compared to the well-organized granulomatous reaction group (n = 37) (p=0.01). CD163+ macrophages were higher in samples displaying Leishmania parasites (n = 39) at histopathology exam than the samples without parasites (n = 24) (p=0.02). Same result was observed when comparing the lesions of CL lesions with (n = 31) and without (n = 17) parasites (p = 0.04). MCL skin lesions (n = 15) showed higher number of CD206+ cells (p = 0.008) in comparison with skin lesions taken from CL patients (n = 48). Spearman test demonstrated a positive correlation between the number of CD163+ and CD206+ immune stained cells (Spearman r = 0,369). M1 macrophages (pSTAT1+/CD68+) were present in higher number when compared to M2 macrophages (CMAF+/CD163+) in the samples studied. CONCLUSIONS: The results suggest that M2 macrophages play a role in the in situ immune response of ATL. M2 polarized macrophages may act as host target cells facilitating parasites entry and promoting disease progression, but also seem to be involved with chronicity and tissue remodeling of ATL lesions. CD163 and CD206 molecules may be considered as good markers for M2 macrophages. Double staining technique confirmed the presence of M2 macrophages, although M1 macrophages are the predominant macrophagic component in skin lesions of ATL

A caracterização de sequências codificadoras presentes nas vizinhanças do gene META 1 permitiu a identificação de alguns genes expressos preferencialmente em estágios infectivos de L. (L.) amazonensis. Um dos genes presentes é regulado de forma distinta, observando-se maior abundância do RNA em formas amastigotas. Este gene foi denominado LaLRR17 por codificar uma proteína contendo em sua região central 6 repetições ricas em leucina (LRR). As LRR são motivos presentes em diversas famílias de proteínas e são responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. A região central da proteína LRR17 apresentou similaridade com a porção carboxi-terminal da proteína NOD 3 humana. A proteína LRR17 foi localizada no citosol de macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis. Para caracterizar a função da proteína LRR17 foram obtidas linhagens de L. (L.) amazonensis expressoras do gene LmjLRR17. Essas linhagens mutantes foram mais infectivas em macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. Avaliamos também o papel das proteínas NOD 1 e NOD 2 na infecção por L. (L.) amazonensis e L. (L.) major para estabelecer a possível relação da proteína LRR17 na interação com essas vias de defesa celular do macrófago. / The characterization of coding sequences in the vicinity of the META 1 gene allowed the identification of some genes preferentially expressed in L. (L.) amazonensis infective stages. One of the identified transcripts presents a distinct pattern of expression with higher levels of mRNA in amastigotes. This gene was named LaLRR17 since it encodes a 72 kDa protein with 6 leucine-rich repeats (LRR) in its central region. Leucine-rich repeats (LRR) are present in several families of proteins and are responsible for the formation of a structure capable of establishing protein interactions. The central region of the LRR17 protein showed similarity with the carboxyl-terminal portion of the NOD 3 human protein. The LaLRR17 protein is secreted to the cytoplasm of L. (L.) amazonensis-infected macrophages. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained strains of L. (L.) amazonensis expressing the LmjLRR17 gene. These mutant strains were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strain. We also evaluated the role of NOD 1 and NOD 2 proteins in infections with L. (L.) amazonensis and L. (L.) major to investigate a possible role of the LRR17 protein in the interaction with these defense pathways in macrophages.

A leishmaniose é uma doença negligenciada causada por protozoários parasitos do gênero Leishmania sp. e transmitida por vetores. Esta doença pode apresentar formas clínicas que variam de lesões cutâneas simples que podem desaparecer espontaneamente até a forma visceral, a qual acomete órgãos como baço, fígado, medula óssea e linfonodos, e pode levar a morte se não tratada corretamente. Além disso, de acordo com a Organização Mundial da Saúde as leishmanioses são endêmicas em 98 países. O tratamento ainda é feita principalmente com dois medicamentos, os antimoniais pentavalentes e anfotericina B, os quais causam uma série de efeitos secundários, além disso, relatos de resistência a esses fármacos têm sido publicados. Além disso, medicamentos alternativos aprovados para uso, como a miltefosina e pentamidina, também possuem sérios efeitos colaterais e nem sempre são efetivos para todas as espécies do parasito e/ou formas clínicas. Estes fatos demonstram que é necessário o desenvolvimento de fármacos alternativos para a quimioterapia das leishmanioses. Nesse sentido, o reposicionamento de fármacos se mostra como uma importante estratégia para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para a leishmaniose, pois fármacos já liberados para o uso em humanos podem ser reutilizados, diminuindo o tempo de desenvolvimento e custos empregados para o desenvolvimento de novos fármacos. Leishmania sp. possui como um dos principais lipídios o ergosterol, cuja rota metabólica é complexa e envolve uma série de enzimas, as quais, se corretamente bloqueadas poderão suprimir a produção do ergosterol e, portanto, a viabilidade de parasitos. Considerando estes aspectos, o presente estudo objetivou investigar a ação leishmanicida de fármacos que possuem ação inibitória em enzimas da via de esteróis como o fármaco anti-hiperlipidêmico rosuvastatina (inibidor da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase) e, os antifúngicos voriconazol, tiaconazol, fenticonazol (inibidores da enzima 14 alfa-metilesterol 14-demetilase), naftifina e tolnaftato (inibidores da enzima esqualeno epoxidase), e por fim a nistatina que age diretamente sobre ergosterol. O potencial contra formas promastigotas e amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum e L. (V.) braziliensis foram avaliados, e então foram investigadas possíveis alterações ultraestruturais, fisiológicas em promastigotas de L. (L.) amazonensis (formação de poros de membrana, e alteração do potencial de membrana mitocondrial) ou nas células hospedeiras (produção de óxido nítrico, peróxido de hidrogênio, e mudanças no pH intracelular). O fenticonazol, tioconazol, nistatina e o tolnaftato foram capazes de eliminar as formas promastigotas e amastigotas intracelulares, sendo a nistatina, o tolnaftato e o fenticonazol os mais seletivos para amastigotas das três espécies de parasitos estudados. Por outro lado, rosuvastatina, voriconazol e a naftifina não apresentaram ação contra formas amastigotas intracelulares. Além disso, os fármacos com atividade leishmanicida alteraram morfologicamente e fisiologicamente a mitocôndria do parasito. Apesar de não haver estímulo da produção de H2O2 ou NO por parte dos fármacos analisados, o fenticonazol foi capaz de alcalinizar macrófagos hospedeiros infectados. Considerando que estes fármacos foram capazes de inibir o crescimento de multi-espécies do parasito no interior dos macrófagos, esses resultados sugerem que medicamentos antifúngicos podem ser interessantes alvos para reposicionamento da quimioterapia das leishmanioses tegumentar e visceral / Leishmaniosis is a neglected disease caused by parasitic protozoa belonging to the genus Leishmania sp. and transmitted by vectors. This disease presents different clinical forms ranging from single lesion, that can heal spontaneously, to the visceral form, that affects the spleen, liver, bone marrow and lymph nodes, and may lead to death if not properly treated. Additionally, according to the World Health Organization, leishmaniosis is endemic to 98 countries. The treatment is still carried out with two main drugs, antimonials and amphotericin B that induce side effects; in addition, reports about the emergence of parasite resistance have been published. Besides, alternative drugs such as miltefosine and pentamidine still have serious side effects and are not always effective to treat all Leishmania species and/or clinical form. In this regard, drug repurposing has been considered an important strategy to develop new therapeutic alternatives to leishmaniasis chemotherapy, since drugs already approved to human use may be reused, decreasing time and costs needed for the research of new drugs. Leishmania sp. possesses ergosterol as the main membrane lipid, and the metabolic pathway to produce this lipid is complex and involves different enzymes, which if correctly inhibited may suppress ergosterol production and, therefore, parasite viability. Considering these aspects, the aims of this study is to investigate the leishmanicidal potential of drugs who inhibit enzymes of the ergosterol pathway, such as the anti-hyperlipidemic drug rosuvastatin (inhibitor of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase), the antifungals voriconazole, tioconazole, fenticonazole, (inhibitors of the 14 Alpha-methylsterol 14-demethylase), naftifine and tolnaftate (inhibitors of squalene epoxidase), and nystatin, that acts directly on ergosterol. The anti-promastigote and anti-amastigote potentials of drugs against L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum and L. (V.) braziliensis were evaluated; ultrastructural and physiological alterations of L. (L.) amazonensis promastigotes (membrane pore formation and mitochondrion membrane potential alterations) and host macrophages (nitric oxide and hydrogen peroxide productions and changes to intracellular pH) were investigated. Fenticonazole, tioconazole, nystatin and tolnaftate were capable to eliminate promastigote and amastigotes, being the most selective drugs nystatin, tolnaftate and fenticonazole to all studied species amastigotes. Rosuvastatin, voriconazole and naftifine were unable to eliminate amastigote forms. Furthermore, the drugs that possess leishmanicidal effects affected parasite mitochondrion. Although these drugs did not trigger the production of H2O2 or NO, fenticonazole was able to alkalinize host infected macrophages. Considering these drugs were able to inhibit multiple species of the parasite growth in macrophages, these results suggest that antifungal drugs can be interesting targets to be repurposed in the cutaneous and visceral leishmaniasis

Em todas as formas clínicas da leishmaniose tegumentar americana os macrófagos são as células efetoras mais importantes na destruição do parasita intracelular. As células dendríticas são células apresentadoras de antígeno localizadas nos sítios de inoculação, como pele e mucosa. Os dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos são células derivadas de linhagem mielomonocítica e consideradas complementares às células de Langerhans no processo de apresentação de antígenos e indução da resposta imune. As células dendríticas plasmocitoides representam um subgrupo de células dendríticas precursoras presentes no sangue periférico e órgãos linfoides. Estas células são identificadas pela alta expressão de receptor da cadeia alfa da interleucina-3 (CD123) e são fortes produtoras de interferon tipo I. Elas são raramente observadas na pele humana normal, e foram demonstradas em dermatoses inflamatórias e virais. O óxido nítrico e seus derivados atuam como moléculas efetoras da citotoxicidade macrofágica contra parasitas. A expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e a geração de óxido nítrico é importante no controle da infecção por diferentes espécies de Leishmania. Cinqüenta e dois espécimes de biópsias cutâneas de pacientes diagnosticados com leishmaniose tegumentar americana foram classificados histologicamente de acordo com o padrão de resposta tecidual, se granulomatoso ou inflamatório difuso não específico. O objetivo deste estudo foi demonstrar e quantificar a presença de células dendríticas plasmocitoides em 36 das biópsias, através de estudo imuno-histoquímico com anticorpo anti-CD123, comparando os achados entre os diferentes tipos de resposta tecidual; verificar a expressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos e comparar com a expressão de iNOS por macrófagos nas lesões cutâneas, através de estudo imuno-histoquímico com dupla marcação pelos anticorpos antiCD68 e antiiNOS em 43 biópsias cutâneas, e pelos anticorpos anti-Fator XIIIa e antiiNOS em 34 amostras, comparando os achados entre os diferentes padrões de resposta tecidual. Foram evidenciadas células dendríticas CD123+ em todos espécimes de lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana estudados. Em 22/36 amostras, as células dendríticas plasmocitoides estavam dispostas isoladamente entre outras células inflamatórias; em 14/36 amostras estavam agrupadas, pelo menos focalmente, principalmente no grupo granulomatoso (13 amostras) e em um caso do grupo não específico; dez amostras exibiram células na junção dermoepidérmica, sendo oito no grupo granulomatoso e duas no grupo não específico. Entretanto, não houve diferença no número de células CD123+/mm2 entre os dois grupos estudados. Esses resultados sugerem que as células dendríticas plasmocitoides participam da resposta imune nas lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana. A expressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos foi evidenciada em todos os espécimes estudados, sendo que a maioria dos macrófagos expressou iNOS. Não houve diferença estatisticamente significativa entre o número de células CD68+/mm2 e CD68+iNOS+/mm2 nos diferentes padrões de resposta tecidual, tampouco no número de células Fator XIIIa+/mm2, mas o número de células FatorXIIIa+iNOS+/mm2 foi maior no grupo granulomatoso. Quando comparadas 34 amostras, todas elas submetidas a estudos com anticorpos anti-Fator XIIIa, anti-CD68, anti- FatorXIIIa/iNOS e anti-CD68/iNOS, foi maior o número total de macrófagos que dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos, expressando ou não iNOS, e a porcentagem de macrófagos coexpressando iNOS foi maior que a coexpressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos, mas esta diferença não foi estatisticamente significativa quando comparados os grupos histológicos separadamente. Os resultados demonstram que os dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos expressam iNOS, menos que os macrófagos, mas proeminentemente no grupo granulomatoso, sugerindo a sua participação na patogênese de lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana, como células com capacidade leishmanicida e/ou apresentadoras de antígeno / In all forms of American tegumentary leishmaniasis lesions, macrophages are the most important effector cells involved in intracellular parasite destruction. Dendritic cells are antigen-presenting cells that are localized at the entry sites, such as skin and mucosa. Factor XIIIa+ dermal dendrocytes are bone marrow-monocytic lineagederived cells and considered complementary cells to Langerhans cells in the process of antigen presentation and inducing immune response. Plasmacytoid dendritic cells constitute a subset of dendritic cells precursors in peripheral blood and organized lymphoid tissue. These cells are identified by their high levels of interleukin-3 receptor alpha chain (CD123) and are vigorous type I interferon producing cells. They are rarely present in normal human skin, and have been demonstrated in inflammatory and viral dermatoses. Nitric oxide radical and derivatives act as effector molecules of macrophage cytotoxicity against invading parasites. Expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and generation of nitric oxide is important in control of infection in different Leishmania species. Fifty-two samples of skin biopsies obtained from American tegumentary leishmaniasis patients were histologically classified as granulomatous reaction or non specific diffuse inflammatory reaction. The aim of the study was to demonstrate and quantify the presence of plasmacytoid dendritic cells in thirty-six skin biopsies, by immunohistochemistry with anti-CD123, comparing findings in both patterns of tissue response; to verify the expression of iNOS by Factor XIIIa+ dermal dendrocytes and compare to the expression of iNOS by macrophages in cutaneous lesions, by doublestaining technique with antiCD68 and antiiNOS antibodies in forty-three skin biopsies and anti-factor XIIIa and antiiNOS antibodies in thirty-four biopsies, comparing findings between different tissue response patterns. Dendritic CD123+ cells were demonstrated in all specimens of American tegumentary leishmaniasis lesions. The number of CD123+ cells/mm2 in the two groups did not differ. In 22/36 samples, plasmacytoid dendritic cells were intermingled with other inflammatory cells, and were grouped, at least focally, in 14/36 samples. Thirteen cases from the granulomatous group and one non specific case showed clusters of cells in the dermal inflammatory infiltrate. Ten biopsies displayed plasmacytoid dendritic cells at the dermoepidermal junction, two in the non specific group and eight in the granulomatous group. The findings suggest that plasmacytoid dendritic cells participate in the immune response of American tegumentary leishmaniasis skin lesions. Expression of iNOS by Factor XIIIa+ dermal dendrocytes was shown in all specimens, and most of the macrophages expressed iNOS. The total number of CD68+ cells/mm2 and CD68+iNOS+ cells/mm2 in the two groups did not differ, nor the total number of FactorXIIIa+ cells/mm2, but the number of FactorXIIIa+iNOS+ cells/mm2 was higher in the granulomatous group. When comparing thirty-four samples that were all tested to anti-Factor XIIIa, anti-CD68, anti-FactorXIIIa/anti-iNOS and anti-CD68/anti-iNOS, it was higher the total number of macrophages, either non-expressing or expressing iNOS than iNOS-expressing Factor XIIIa+ dermal dendrocytes, and the total percentage of iNOS-expressing macrophages was higher than iNOSexpressing Factor XIIIa+ dermal dendrocytes, but this percentage was not significant when granulomatous and non specific groups were separately analyzed. The results demonstrate that FactorXIIIa+ dermal dendrocytes express iNOS, less than macrophages, but prominently in the granulomatous group, suggesting they play a role in the pathogenesis of American tegumentary leishmaniasis skin lesions as immune effectors and/or antigenpresenting cells

Introdução: O diagnóstico etiológico da leishmaniose tegumentar baseia-se na detecção do parasito em amostras de lesão colhida por método invasivo. A detecção de DNA do parasito, através da PCR, poderia ser uma alternativa mais sensível, porém não está disponível na rotina diagnóstica e foi padronizada em amostras clínicas colhidas por métodos invasivos, tais como raspado, aspirado ou biópsia da lesão. Uma proposta para o diagnóstico de leishmaniose tegumentar seria a obtenção de material de lesão (mucosa ou cutânea) através de métodos de coleta menos invasivos e que fosse possível detectar DNA do parasito a partir de pequenas quantidades de amostra clínica. Neste trabalho avaliamos a eficácia da PCR, em amostras colhidas por método não invasivo (swab de lesão) como ferramenta para ser utilizada no diagnóstico de leishmaniose (mucosa e cutânea localizada), bem como para detecção precoce de Leishmania em mucosa de pacientes com lesão cutânea ativa e como ferramenta de avaliação de resposta terapêutica na leishmaniose mucosa. Metodologia: Entre os meses de agosto de 2013 a julho de 2015 foram selecionados 57 pacientes no ambulatório de Leishmanioses do Instituto de Infectologia Emilio Ribas, dos quais foram coletadas amostras de lesão cutânea ou mucosa através de swab e de biópsia das lesões. Em paralelo, foi realizada rotina laboratorial para diagnóstico de leishmaniose nos pacientes que apresentavam lesão ativa (anatomopatológico, pesquisa e cultura de Leishmania, sorologia e teste de Montenegro). As amostras colhidas por biópsia ou swab foram avaliadas através da reação em cadeia da polimerase tendo como alvos o minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania para PCR convencional e o gene da proteína de choque térmico 70Kda (Hsp70) para PCR convencional e PCR em tempo real. Resultados: A detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab de lesões ativas foi semelhante as das amostras colhidas por biópsia das mesmas lesões. Quando comparado aos métodos comumente empregados no diagnóstico da leishmaniose tegumentar, a PCR em material colhido por swab apresentou desempenho superior. Foi demostrado que utilizando os iniciadores para o alvo kDNA obtivemos maior eficácia quando comparado com o alvo Hsp70, seja pela PCR convencional como pela PCR em tempo real (sensibilidade de 94.1%, 42.4% e 39.4%, respectivamente). Ao analisarmos amostras de pacientes já tratados para leishmaniose mucosa observamos positividade de 86% para kDNA e de 22% para Hsp70. Nas amostras de mucosa nasal íntegra e com leishmaniose cutânea ativa, coletadas com swab para detecção precoce da doença, obteve-se 92.9% de positividade com kDNA e 28.6% com Hsp70. Conclusões: Os resultados obtidos sugerem que o método de coleta de amostra biológica através do swab para o diagnóstico molecular da leishmaniose tegumentar apresenta eficácia comparada com o método de coleta por biópsia. A detecção de DNA em amostras colhidas por swab permite analisar a presença de DNA do parasito em tecido sem lesão, podendo detectar a presença de Leishmania mesmo antes de alterações clínicas estarem presentes. A monitorização da resposta terapêutica da leishmaniose mucosa pode ser feita através da detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab / Introduction: Etiologic diagnosis of tegumentary leishmaniasis is based on the detection of the parasite in injury samples collected by invasive method. DNA detection of the parasite by PCR, could be a more sensible alternative, but is not available in routine practice and it was standardized in clinical samples by invasive methods such as scrapes, aspirate or biopsy of the lesion. A proposal for the diagnosis of tegumentary leishmaniasis lesions would obtaining material (cutaneous or mucosal) through less invasive collection methods, and it was possible to detect parasite DNA from small quantities of clinical specimen. In this study we evaluate the effectiveness of the PCR in samples collected by non-invasive method (swab injury) as a tool to be used in the diagnosis of leishmaniasis (mucosal and localized cutaneous), as well as for early detection of Leishmania in mucosa from patients with cutaneous lesions active and as an evaluation tool of therapeutic response in mucosal leishmaniasis. Methodology: Between August 2013 to July 2015 were selected 57 patients from the Leishmaniasis out clinic from the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, which samples of cutaneous lesion or mucosa were collected by swab and biopsy of the lesions. In parallel, routine laboratory was carried out for the diagnosis of leishmaniasis in patients with active lesions (histopathology, search and Leishmania culture, serology and Montenegro skin test antigen). The samples taken by biopsy or swab were assessed by polymerase chain reaction having as targets the minicircle kinetoplast DNA (kDNA) of Leishmania for conventional PCR and gene heat shock protein 70kDa (Hsp70) for conventional PCR and real-time PCR. Results: Leishmania DNA detection in samples taken by swab of active lesions was similar to the samples taken by biopsy from the same lesion. When compared to the methods commonly used in the diagnosis of tegumentary leishmaniasis, PCR material collected by swab showed superior performance. It was shown that using the primers for the target kDNA obtained more effectively compared with the target Hsp70, or by conventional PCR and by real-time PCR (sensitivity 94.1%, 42.4% and 39.4%, respectively). When analyzing samples from patients already treated for mucosal leishmaniasis observed positivity of 86% to kDNA and 22% for Hsp70. Samples of nasal mucosa and active cutaneous leishmaniasis, collected by swab for early detection of disease, it obtained 92.9% positivity with kDNA and 28.6% with Hsp70. Conclusions: Our results suggest that the biological sample collection method using the swab for the molecular diagnosis of tegumentary leishmaniasis had compared efficacy with biopsy collection method. The DNA detection collected by swab samples allows to analyze the presence of DNA of the parasite in tissue without damage and can detect the presence of Leishmania even before clinical changes are present. The monitoring of therapeutic response mucosal leishmaniasis can be made by Leishmania DNA detection in samples per swab

Introdução: O diagnóstico etiológico da leishmaniose tegumentar baseia-se na detecção do parasito em amostras de lesão colhida por método invasivo. A detecção de DNA do parasito, através da PCR, poderia ser uma alternativa mais sensível, porém não está disponível na rotina diagnóstica e foi padronizada em amostras clínicas colhidas por métodos invasivos, tais como raspado, aspirado ou biópsia da lesão. Uma proposta para o diagnóstico de leishmaniose tegumentar seria a obtenção de material de lesão (mucosa ou cutânea) através de métodos de coleta menos invasivos e que fosse possível detectar DNA do parasito a partir de pequenas quantidades de amostra clínica. Neste trabalho avaliamos a eficácia da PCR, em amostras colhidas por método não invasivo (swab de lesão) como ferramenta para ser utilizada no diagnóstico de leishmaniose (mucosa e cutânea localizada), bem como para detecção precoce de Leishmania em mucosa de pacientes com lesão cutânea ativa e como ferramenta de avaliação de resposta terapêutica na leishmaniose mucosa. Metodologia: Entre os meses de agosto de 2013 a julho de 2015 foram selecionados 57 pacientes no ambulatório de Leishmanioses do Instituto de Infectologia Emilio Ribas, dos quais foram coletadas amostras de lesão cutânea ou mucosa através de swab e de biópsia das lesões. Em paralelo, foi realizada rotina laboratorial para diagnóstico de leishmaniose nos pacientes que apresentavam lesão ativa (anatomopatológico, pesquisa e cultura de Leishmania, sorologia e teste de Montenegro). As amostras colhidas por biópsia ou swab foram avaliadas através da reação em cadeia da polimerase tendo como alvos o minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania para PCR convencional e o gene da proteína de choque térmico 70Kda (Hsp70) para PCR convencional e PCR em tempo real. Resultados: A detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab de lesões ativas foi semelhante as das amostras colhidas por biópsia das mesmas lesões. Quando comparado aos métodos comumente empregados no diagnóstico da leishmaniose tegumentar, a PCR em material colhido por swab apresentou desempenho superior. Foi demostrado que utilizando os iniciadores para o alvo kDNA obtivemos maior eficácia quando comparado com o alvo Hsp70, seja pela PCR convencional como pela PCR em tempo real (sensibilidade de 94.1%, 42.4% e 39.4%, respectivamente). Ao analisarmos amostras de pacientes já tratados para leishmaniose mucosa observamos positividade de 86% para kDNA e de 22% para Hsp70. Nas amostras de mucosa nasal íntegra e com leishmaniose cutânea ativa, coletadas com swab para detecção precoce da doença, obteve-se 92.9% de positividade com kDNA e 28.6% com Hsp70. Conclusões: Os resultados obtidos sugerem que o método de coleta de amostra biológica através do swab para o diagnóstico molecular da leishmaniose tegumentar apresenta eficácia comparada com o método de coleta por biópsia. A detecção de DNA em amostras colhidas por swab permite analisar a presença de DNA do parasito em tecido sem lesão, podendo detectar a presença de Leishmania mesmo antes de alterações clínicas estarem presentes. A monitorização da resposta terapêutica da leishmaniose mucosa pode ser feita através da detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab / Introduction: Etiologic diagnosis of tegumentary leishmaniasis is based on the detection of the parasite in injury samples collected by invasive method. DNA detection of the parasite by PCR, could be a more sensible alternative, but is not available in routine practice and it was standardized in clinical samples by invasive methods such as scrapes, aspirate or biopsy of the lesion. A proposal for the diagnosis of tegumentary leishmaniasis lesions would obtaining material (cutaneous or mucosal) through less invasive collection methods, and it was possible to detect parasite DNA from small quantities of clinical specimen. In this study we evaluate the effectiveness of the PCR in samples collected by non-invasive method (swab injury) as a tool to be used in the diagnosis of leishmaniasis (mucosal and localized cutaneous), as well as for early detection of Leishmania in mucosa from patients with cutaneous lesions active and as an evaluation tool of therapeutic response in mucosal leishmaniasis. Methodology: Between August 2013 to July 2015 were selected 57 patients from the Leishmaniasis out clinic from the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, which samples of cutaneous lesion or mucosa were collected by swab and biopsy of the lesions. In parallel, routine laboratory was carried out for the diagnosis of leishmaniasis in patients with active lesions (histopathology, search and Leishmania culture, serology and Montenegro skin test antigen). The samples taken by biopsy or swab were assessed by polymerase chain reaction having as targets the minicircle kinetoplast DNA (kDNA) of Leishmania for conventional PCR and gene heat shock protein 70kDa (Hsp70) for conventional PCR and real-time PCR. Results: Leishmania DNA detection in samples taken by swab of active lesions was similar to the samples taken by biopsy from the same lesion. When compared to the methods commonly used in the diagnosis of tegumentary leishmaniasis, PCR material collected by swab showed superior performance. It was shown that using the primers for the target kDNA obtained more effectively compared with the target Hsp70, or by conventional PCR and by real-time PCR (sensitivity 94.1%, 42.4% and 39.4%, respectively). When analyzing samples from patients already treated for mucosal leishmaniasis observed positivity of 86% to kDNA and 22% for Hsp70. Samples of nasal mucosa and active cutaneous leishmaniasis, collected by swab for early detection of disease, it obtained 92.9% positivity with kDNA and 28.6% with Hsp70. Conclusions: Our results suggest that the biological sample collection method using the swab for the molecular diagnosis of tegumentary leishmaniasis had compared efficacy with biopsy collection method. The DNA detection collected by swab samples allows to analyze the presence of DNA of the parasite in tissue without damage and can detect the presence of Leishmania even before clinical changes are present. The monitoring of therapeutic response mucosal leishmaniasis can be made by Leishmania DNA detection in samples per swab