A leishmaniose visceral (LV) é um problema de saúde pública, que tem incidência elevada em crianças. No ano de 2009 a cidade de Araguaína - Tocantins foi a cidade com maior número de casos de LV. Este estudo tem como objetivo identificar a expansão geográfica da LV no município de Araguaína, identificar o perfil epidemiológico dos casos de LV atendidos no Hospital de Doenças Tropicais (HDT) de Araguaína, principalmente de crianças e pessoas maiores de 60 anos, que representam população de risco para a gravidade da doença. A partir do número de casos notificados de 2004 a 2009, foram elaborados mapas sobre a evolução da distribuição geográfica da LV nos bairros de Araguaína, também foi realizado estudo epidemiológico, laboratorial e evolutivo dos casos de LV em crianças e pessoas acima de 60 anos atendidas no HDT. Dentre as crianças, nas menores de um ano, também foi avaliado o quadro clínico. Foram utilizados os dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) dos casos notificados no HDT, nos anos de 2004 a 2009. Foram registrados 983 casos, sendo 391 de crianças (39,8%) de zero a cinco anos e destas 71 notificações de menores de um ano (18%). Neste mesmo período foram notificados 22 casos de LV em maiores de 60 anos (2,2%). A maioria das notificações foi da cidade de Araguaína (62,5%). Os casos de LV ocorreram na maioria dos bairros de Araguaína, iniciaram nos bairros centrais e depois se expandiram para a periferia, onde fizeram o maior número de casos. Com relação ao sexo dos pacientes, houve uma discreta incidência no sexo masculino, principalmente na faixa etária dos maiores de 60 anos. O diagnóstico de LV teve confirmação laboratorial na maioria dos casos, porém o exame utilizado foi na maioria das vezes o exame sorológico, que não é o melhor método diagnóstico. O tratamento inicial da maioria dos pacientes foi com o antimoniato pentavalente. A maioria dos pacientes evoluiu para a cura. Este trabalho demonstra a expansão geográfica da LV no município de Araguaína, atingindo principalmente crianças. / Visceral leishmaniasis is a public health problem, have enlarged incidence in children. In 2009 Araguaína city Tocantins was the city with the biggest cases VL. This study aimed to identify the geographical expansion of the VL in Araguaína, identify the epidemiological profile of cases of VL treated at the Hospital for Tropical Diseases (HDT) in Araguaína, especially in children and people over 60 years old, which represent a risk population for disease severity. From the number of reported cases from 2004 to 2009, maps were drawn about the evolution of geographical distribution of VL in the neighborhoods of Araguaína, was also carried out epidemiological study, laboratory and rolling of VL cases in children and people over 60 years attended in the HDT. Among children, with less than a year,was also evaluated the clinical date. The study used data from the Brazilian Information System for Notifiable Diseases (SINAN) cases reported in HDT, in the years 2004 to 2009. 983cases were notified, of which 391 children (39,8%) from zero to five years and of these 71 reports of children under one years (18%). In the same period were reported 22 cases of VL in adults over 60 years (2.2%). Most reports were from the Araguaína city (62,5%). VL cases occurred in most neighborhoods in Araguaína, started in central districts and then expanded into the suburbs, where they made the largest number of cases. With regard to sex of patients, the was a low incidence in males, mainly aged over 60 years. The diagnosis of VL was confirmed by laboratory tests in the most cases, but was obtained the serological diagnosis, that isnt the best diagnostic method. Initial treatment of most patients was with pentavalent antimoniate. Most of patients progressed to healing. This study demonstrates the geographical spread of VL in Araguaína, affecting mainly children.

Nenhuma / O controle epidemiológico da leishmaniose visceral (LV) no Brasil envolve a eliminação de cães infectados, portanto, métodos diagnósticos confiáveis são essenciais para evitar a transmissão da doença ou o sacrifício desnecessário de animais. O programa de controle da LV no Brasil é baseado em inquéritos sorológicos. Os métodos sorológicos, no entanto, apresentam problemas de sensibilidade e especificidade. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) demonstrou ser uma técnica rápida e sensível para a detecção de Leishmania, no entanto amostras não invasivas representam um instrumento essencial, neste contexto, uma vez que elas são mais simples, indolores e mais facilmente aceitas pelos proprietários de cães. Um método útil é o swab conjuntival (SC) que utiliza um swab estéril para a realização de um esfregaço das conjuntivas do cão. O SC mostrou-se altamente sensível para o diagnostico da LV por PCR. O objetivo deste estudo foi avaliar através do SC a prevalência de animais infectados em dois grupos de cães: assintomáticos e vacinados contra a LV. O primeiro grupo foi composto por 30 animais assintomáticos, positivos nos diagnósticos sorológico e parasitológico. Os resultados do SC foram comparados com os obtidos através de duas amostras pouco invasivas, sangue (S) e biopsia de pele (BP). As amostras foram analisadas por dois métodos diferentes de PCR: kDNA PCR-hibridização e ITS-1 nPCR. O volume de amostra de DNA utilizada para o kDNA PCR-hibridização foi de 1,0 &#61549;L e para o ITS-1 nPCR o volume foi de 10,0 L. Utilizando-se o SC o método kDNA PCR- hybridização detectou DNA de Leishmania em 24/30 cães (80%) através da conjuntiva direita (CD) e 23/30 cães (76,6%) utlizando-se a conjuntiva esquerda (CE), 17/30 cães (56,7%) por meio de BP e 4/30 cães (13.3%) com S. A positividade do SC obtida combinando-se ambas as conjuntivas foi de 90% (27/30 cães). A análise das amostras de SC pelo método ITS-1 nPCR revelou que 25/30 cães (83,3%) foram positivos utilizando-se a CD e 20/30 cães (66,6%) foram positivos via a CE. Pelo mesmo método 15/30 cães (50,0%) foram positivos através de BP e 17/30 cães (56,7%) com S. A positividade obtida combinando-se ambas as oculares foi de 83,3%. Para o método kDNA PCR- hybridização as positividades do SC para a CD e CE foram significantemente superiores (p<0.05) as obtidas com BP e S. Diferença estatística em relação a BP e S foi verificada pelo método ITS-1 nPCR apenas para CD. Os métodos kDNA PCR-hibridação e ITS-1 nPCR apresentaram sensibilidade semelhante para SC e amostras BP. Por outro lado, a positividade do ITS-1 nPCR para amostras de S, foi significativamente maior que a obtida pelo kDNA PCR-hibridização, indicando que a sensibilidade dos métodos de PCR pode variar de acordo com o tecido examinado. A melhor sensibilidade neste estudo (90%) foi obtido através de amostras SC (combinando-se as duas conjuntivas) associada ao kDNA PCR-hibridização. Este nível de sensibilidade foi semelhante ao obtido em outros estudos utilizando SC para o diagnóstico da LV em cães sintomáticos. O segundo grupo foi de 42 cães militares, todos vacinados contra a LV. Neste grupo os resultados do SC foram comparados aos obtidos por testes sorológicos. Os testes sorológicos foram realizados de forma independente por três laboratórios. Os laboratórios 1 e 2 (Lab1 e Lab2) foram laboratórios comerciais. O laboratório 3 (Lab3) foi o Laboratório de Referência Nacional. A primeira triagem sorológica realizada pelo Lab1 mostrou 15 cães reativos e 4 cães foram classificados como indeterminados. Devido à alta positividade encontrada neste ensaio, animais com sorologia reativa e indeterminada, diagnosticados pelo Lab1, foram submetidos a novos testes sorológicos pelos Lab2 e Lab3. O Lab2 confirmou apenas 3 cães reativos e 2 animais foram indeterminados. O Lab3 confirmou 7 cães reativos e 3 cães foram classificados como indeterminados. Os cães que foram confirmados como reativos no diagnóstico sorológico do Lab3 foram submetidos à eutanásia. O diagnóstico molecular por PCR, utilizando o SC em todos os 42 animais foi capaz de detectar o DNA de Leishmania em 17 cães. Comparando os resultados da PCR com os obtidos através do teste sorológico do Lab1, a PCR foi positiva para 10 casos reativos e um caso indeterminado, mas foi negativo para 5 reativos e 3 casos indeterminados. Além disso, a PCR foi positiva em 5 casos não reativos. Os casos reativos e indeterminados, de acordo com o Lab1 que foram PCR negativos, apresentaram resultados negativos nos testes sorológicos dos Lab2 e Lab3. Para o Lab2, a PCR confirmou os 3 casos reativos e foi positiva para os 2 casos indeterminados. Em relação ao Lab3, a PCR confirmou todos os 7 casos reativos e foi positiva para os 3 casos indeterminados. O ensaio de PCR confirmou todos os casos, simultaneamente reativos nos testes sorológicos de dois laboratórios. Nossos resultados mostraram que o SC é um método sensível e prático para coleta de amostra permitindo diagnósticos confiáveis por PCR, além de apresentar sensibilidade superior a outras amostras pouco invasivas. Concluímos que o uso do SC deve ser considerado para os inquéritos caninos rotineiros para a LV / The epidemiological control of visceral Leishmaniasis (VL) in Brazil involves the elimination of infected dogs. Therefore, reliable diagnostic tests are essential to prevent the transmission of the disease or unnecessary culling of dogs. The VL control in Brazil is based on serological surveys, nevertheless serologic assays present problems related to sensitivity and specificity. Polymerase chain reaction (PCR) proved to be a rapid and sensitive technique for detection of Leishmania. However, non-invasive samples are an essential tool in this context, since they are simpler, painless and more easily accepted by dog owners. A useful method is the conjunctival swab (CS) that uses a sterile swab to sample the dog conjunctiva. The SC was highly sensitive for the VL diagnosis by PCR. The objective of this study was to evaluate by CS the prevalence of infected animals in two groups of dogs: asymptomatic and vaccinated against VL. The first group had 30 asymptomatic dogs with positive serological and parasitological tests. The SC samples were compared with two non-invasive samples: blood (B) and skin biopsy (SB). The samples were analyzed by two different PCR methods: kDNA PCR-hybridization and ITS-1 nPCR. The volume of DNA sample used for kDNA PCR-hybridization was 1.0 &#61549; L and ITS-1 nPCR volume was 10.0 L. The DNA sample volume used was of 1.0 L and 10.0 L respectively. Using CS samples the kDNA PCR- hybridization was able to detected parasite DNA in 24/30 dogs (80%) using the right conjunctiva (RC) and 23/30 dogs (76.6%) with the left conjunctiva (LC), 17/30 dogs (56.7%) by means of SB and 4/30 dogs (13.3%) with B. The CS positivity obtained combining RC and LC results was of 90% (27/30 dogs). The assay of CS samples by ITS-1 nPCR revealed that 25/30 dogs (83.3%) were positive when using RC and 20/30 dogs (66.6%) were positive when using LC. Via the same method 15/30 dogs (50.0%) were positive by SB and 17/30 dogs (56.7%) with B. The CS positivity obtained by ITS-1 nPCR combining RC and LC was of 83.3%. The CS positivities for RC and LC were significantly higher (p<0.05) than SB and B for kDNA PCR- hybridization method. Statistical difference in relation to SB and B was verified by ITS-1 nPCR only for RC. Methods kDNA PCR-hybridization and ITS-1 nPCR showed similar sensitivities to CS and SB samples. Moreover, the positivity of ITS-1 nPCR 11 for B samples, was significantly higher than that obtained by kDNA PCR-hybridization, indicating that the sensitivity of the PCR may vary with the tissue examined. The best sensitivity in this study (90%) was obtained from CS samples (by combining both conjunctivas) associated with kDNA PCR-hybridization. This level of sensitivity was similar to that obtained in other studies using CS for the VL diagnosis in symptomatic dogs. The second group was of 42 military dogs, all of them vaccinated against VL. In this group CS and compared with the results obtained by serological tests. The serological tests were carried out independently by three laboratories. Laboratories 1 and 2 (Lab1 and Lab2) were private laboratories. Laboratory 3 (Lab3) was the National Reference Laboratory. The first serological screening performed by the Lab 1 showed 15 reactive dogs and 4 dogs were classified as indeterminate. Due to the high positivity found in this test, animals with reactive and indeterminate serology according Lab 1 were subjected to new serological tests by Lab 2 and Lab 3. Lab 2 confirmed only 3 reactive dogs and 2 animals were undetermined. The Lab 3 found 7 reactive dogs and 3 dogs were classified as indeterminate. Dogs that were confirmed as reactive by Lab 3 were euthanized. The molecular diagnosis by PCR, using CS, was performed in all 42 animals and was able to detect Leishmanial DNA in 17 dogs. Comparing the PCR results with those obtained by serological test of Lab 1, PCR was positive for 10 reactive and one indeterminate case, but was negative for 5 reactive and 3 indeterminate cases. In addition, the PCR was positive in 5 non-reactive cases. The reactive and indeterminate cases according to Lab 1 that were PCR negatives, tested negative in the serologic assays of Lab 2 and Lab 3. For the Lab 2, the PCR confirmed the 3 reactive cases and was positive for the 2 indeterminate cases. In relation to Lab 3, the PCR confirmed all 7 reactive cases and test positive for the 3 indeterminate cases. The PCR assay confirmed all cases simultaneously reactive in the serologic tests of two laboratories. Our results showed that the SC is a sensitive and practical method for collecting samples, allowing reliable diagnostic tests by PCR and showed higher sensitivity than other low invasive samples. We conclude that the use of CS for the regular screenings of dogs by PCR should be considered.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública no Brasil. Na área urbana o cão é a principal fonte de infecção e o controle da LV no Brasil envolve a eliminação de cães infectados. Testes sorológicos são utilizados para os levantamentos rotineiros, mas estes apresentam problemas de especificidade e sensibilidade. Os métodos moleculares como a PCR são úteis tanto no diagnóstico como na identificação das espécies de Leishmania. São capazes de detectar animais infectados soronegativos e são mais sensíveis e específicos, particularmente no diagnóstico de cães assintomáticos. Um dos maiores obstáculos na implementação de ensaios moleculares é a falta de padronização. Mais de 400 publicações sobre o diagnóstico molecular da leishmaniose foram realizadas desde 1989, porém pouquíssimas compararam a eficiência das diversas técnicas disponíveis. O objetivo deste trabalho foi comparar diferentes métodos de PCR em diferentes amostras clínicas para o diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC) em cães assintomáticos. Amostras clínicas de medula óssea, sangue periférico, swab conjuntival e biópsias de pele foram analisadas pelos métodos kDNA PCR hibridização, kDNA semi nested PCR (kDNA snPCR), Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 nPCR). Foram utilizados 30 cães assintomáticos positivos na sorologia e no exame parasitológico. Seis cães não infectados foram utilizados como controles. A extração de DNA a partir dos swabs foi realizada pelo método do Fenol-Clorofórmio. Para as amostras de sangue, medula e biópsias de pele foram utilizados kits comerciais. As análises pelo método kDNA PCR hibridização detectaram 5/30 (16,7%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 19/30 (63,3%) para medula e 21/30 (70%) para swab conjuntival. Utilizando-se o método kDNA snPCR, foram encontrados 7/30 (23,3%) cães positivos para sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 12/30 (40%) para as amostras de medula e 24/30 (80%) para amostras de swab conjuntival. Através de método LnPCR foram detectados 9/30 (30%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 15/30 (50%) para medula, 13/30 (43,3%) para as amostras de pele e 19/30 (63,3%) para swab conjuntival. As análises pelo método ITS-1 nPCR das amostras de sangue periférico detectaram 19/30 (63,3%) cães positivos, 19/30 (63,33%) para pele, 29/30 (97%) para medula óssea e 29/30 (97%) para swab conjuntival. Quando comparados os métodos com base no somatório das positividades obtidas para todas as amostras clínicas, o método ITS-1 nPCR obteve 96/120 resultados positivos, o kDNA PCR hibridização 62/120, o kDNA snPCR 60/120 e o LnPCR 56/120. Na comparação da amostras com base na positividade obtida para todos os métodos o swab conjuntival apresentou 93/120 resultados positivos, a medula 68/120, a pele 63/120 e o sangue 40/120. Os resultados deste estudo indicam o swab conjuntival associado ao método ITS 1 nPCR como a melhor opção, entre os métodos e amostras testados, para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral canina em animais assintomáticos. Palavras-chave: Leishmaniose Visceral canina; Reação em Cadeia da Polimerase (PCR); Diagnóstico. / Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious public health problem in Brazil. In the urban area the dog is the main source of infection and VL control in Brazil involves the elimination of infected dogs. Serological tests are used for routine surveys, but they present problems of specificity and sensitivity. Molecular methods as the PCR are useful in the diagnosis and identification of Leishmania species. PCR is able to detect seronegative animals and is more sensitive and specific, particularly in the diagnosis in asymptomatic dogs. One obstacle on the implementation of molecular assays is the lack of standardization. More than 400 articles on the diagnosis of leishmaniasis had been pubhished since 1989, however a few studies had compared the efficiency of the diverse available techniques. The aim of this work was compare different methods of PCR in different clinical samples for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) in asymptomatic animals. Bone marrow, peripheral blood, conjunctival swab and skin biopsies had been analyzed by the methods kDNA PCR - Hybridization, kDNA semi nested PCR (kDNA snPCR), Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 nPCR). Thirty positive asymptomatic dogs for serology and parasitology examination had been used. Six not infected dogs had been used as controls. The DNA extration from swabs was performed by Phenol-Chloroform method. Commercial kits had been used for DNA extraction of peripheral blood, bone marrow and skin biopsies. The kDNA PCR - Hybridization detected 5/30 (16.7%) positive dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 19/30 (63.3%) for bone marrow and 21/30 (70%) for conjunctival swab. Using the method kDNA snPCR had been found 7/30 (23.3%) positive dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 12/30 (40%) for bone marrow and 24/30 (80%) samples of conjunctival swab. Through LnPCR method 9/30 (30%) positive dogs for the samples of peripheral blood had been detected, 15/30 (50%) for bone marrow, 13/30 (43.3%) for the samples of skin and 19/30 (63.3%) for conjunctival swab. The ITS-1 nPCR analyse showed 19/30 (63.3%) positive dogs for peripheral blood, 19/30 (63.33%) for skin, 29/30 (97%) for bone marrow and 29/30 (97%) for conjunctival swab. The ITS-1 nPCR was superior to other methods based on the positivities obtained using the summatory of all clinical samples. The ITS-1 nPCR obtained 96/120 positive results, kDNA PCR-hibridization 62/120, kDNA snPCR 60/120 and LnPCR 56/120. The conjunctival swab presented the best result considering the summatory of the positivities obtained by all methods. The conjunctival swab obtained 93/120 positive results, medula 73/120, skin biopsies 68/120 and blood 40/120. The results of this study indicated the conjunctival swab associated to ITS-1 nPCR as the best option for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs, among the methods and samples analysed.

A leishmaniose visceral (LV) é um problema de saúde pública, que tem incidência elevada em crianças. No ano de 2009 a cidade de Araguaína - Tocantins foi a cidade com maior número de casos de LV. Este estudo tem como objetivo identificar a expansão geográfica da LV no município de Araguaína, identificar o perfil epidemiológico dos casos de LV atendidos no Hospital de Doenças Tropicais (HDT) de Araguaína, principalmente de crianças e pessoas maiores de 60 anos, que representam população de risco para a gravidade da doença. A partir do número de casos notificados de 2004 a 2009, foram elaborados mapas sobre a evolução da distribuição geográfica da LV nos bairros de Araguaína, também foi realizado estudo epidemiológico, laboratorial e evolutivo dos casos de LV em crianças e pessoas acima de 60 anos atendidas no HDT. Dentre as crianças, nas menores de um ano, também foi avaliado o quadro clínico. Foram utilizados os dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) dos casos notificados no HDT, nos anos de 2004 a 2009. Foram registrados 983 casos, sendo 391 de crianças (39,8%) de zero a cinco anos e destas 71 notificações de menores de um ano (18%). Neste mesmo período foram notificados 22 casos de LV em maiores de 60 anos (2,2%). A maioria das notificações foi da cidade de Araguaína (62,5%). Os casos de LV ocorreram na maioria dos bairros de Araguaína, iniciaram nos bairros centrais e depois se expandiram para a periferia, onde fizeram o maior número de casos. Com relação ao sexo dos pacientes, houve uma discreta incidência no sexo masculino, principalmente na faixa etária dos maiores de 60 anos. O diagnóstico de LV teve confirmação laboratorial na maioria dos casos, porém o exame utilizado foi na maioria das vezes o exame sorológico, que não é o melhor método diagnóstico. O tratamento inicial da maioria dos pacientes foi com o antimoniato pentavalente. A maioria dos pacientes evoluiu para a cura. Este trabalho demonstra a expansão geográfica da LV no município de Araguaína, atingindo principalmente crianças. / Visceral leishmaniasis is a public health problem, have enlarged incidence in children. In 2009 Araguaína city Tocantins was the city with the biggest cases VL. This study aimed to identify the geographical expansion of the VL in Araguaína, identify the epidemiological profile of cases of VL treated at the Hospital for Tropical Diseases (HDT) in Araguaína, especially in children and people over 60 years old, which represent a risk population for disease severity. From the number of reported cases from 2004 to 2009, maps were drawn about the evolution of geographical distribution of VL in the neighborhoods of Araguaína, was also carried out epidemiological study, laboratory and rolling of VL cases in children and people over 60 years attended in the HDT. Among children, with less than a year,was also evaluated the clinical date. The study used data from the Brazilian Information System for Notifiable Diseases (SINAN) cases reported in HDT, in the years 2004 to 2009. 983cases were notified, of which 391 children (39,8%) from zero to five years and of these 71 reports of children under one years (18%). In the same period were reported 22 cases of VL in adults over 60 years (2.2%). Most reports were from the Araguaína city (62,5%). VL cases occurred in most neighborhoods in Araguaína, started in central districts and then expanded into the suburbs, where they made the largest number of cases. With regard to sex of patients, the was a low incidence in males, mainly aged over 60 years. The diagnosis of VL was confirmed by laboratory tests in the most cases, but was obtained the serological diagnosis, that isnt the best diagnostic method. Initial treatment of most patients was with pentavalent antimoniate. Most of patients progressed to healing. This study demonstrates the geographical spread of VL in Araguaína, affecting mainly children.

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral é uma doença que acomete cerca de 500 mil pessoas por ano no mundo e se caracteriza principalmente por um quadro de febre, hepatoesplenomegalia e pancitopenia. Há uma imunossupressão específica frente a Leishmania chagasi. Classicamente esta resposta é modulada pelas células dendríticas, que são as primeiras células que entram em contato com o parasita. Estas células, a partir de vários determinantes, elaboram uma resposta do tipo Th1, com a produção de citocinas capazes de ativar os macrófagos a eliminar o parasita ou uma resposta do tipo Th2, que se caracteriza por uma produção de citocinas que são incapazes de ativar o macrófago parasitado. Com o objetivo de se estudar a resposta imune tecidual, esta investigação avaliou a resposta imune na mucosa duodenal de crianças portadoras da leishmaniose visceral plenamente manifesta. MÉTODOS: Um grupo de 13 crianças com calazar foi submetido à biópsia perioral de duodeno, com cápsula de Watson. Nove crianças assintomáticas foram utilizadas como controles e foram submetidas à biópsia duodenal endoscópica. Ambos os grupos foram submetidos a pesquisa do parasita, a análise morfométrica e a análise semiquantitativa da produção local de TNF-&#945;, &#948;-interferon, IL-4 e IL-10 e fenotípica das seguintes células imunes: CD4, CD8, CD68. RESULTADOS: A análise morfomérica revelou que nos casos havia um infiltrado linfoplasmocitário com discreta atrofia vilositária. Não se verificou a presença de eosinófilos ou neutrófilos. A presença de leishmania foi verificada em todos os casos e esteve ausente nos controles. A análise da produção de citocinas revelou que tanto nos casos como nos controles havia uma média de produção de IL-10 semelhante, com p=0,8968 (teste T de Student); que não se detectou IL-4 nos casos e nos controles; que a freqüência da produção de &#948;-interferon nos controles foi maior que nos casos, com p=0,046 (teste de Fischer); que a freqüência da produção de TNF-&#945; foi semelhante nos casos e controles (teste de Fischer) com p=0,41; havia um infiltrado macrofágico significativamente superior nos casos com p=0,005757 (teste T de Student); a média de contagem de CD4 nos casos foi significativamente maior que nos controles, utilizando-se o teste de Mann-Withney com p=0,040, teste da mediana p=0,019; e que a média da contagem de CD8 foi semelhante nos casos e controles com p=0,396 (teste T de Student). CONCLUSÕES: A mucosa duodenal por ser um ambiente imunotolerante, pela produção natural de IL-10, permitiria a presença e multiplicação da leishmania. Que o infiltrado linfoplasmocitário composto por células CD4, CD8 e CD68 foi incapaz de montar uma resposta imune eficaz contra o parasita, principalmente pela baixa produção local do &#948;-interferon. / INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis is a disease that strikes around 500 thousand people in the world per year and its major characteristics are fever hepatoesplenomegaly and pancytopenia. There is a specific imunnosupression in face of the Leishmania chagasi. Classically this response is modulated by the dendritic cells that are the first cells to get in contact with the parasite. These cells, from various determinants, elaborate a Th1 type response, with the production of cytokines capable of activating the macrophages and eliminate the parasite or a Th2 type response, that is characterized by cytokines production that are incapable of activating the macrophages under the parasite action. With the purpose of studying the tissue immune response this investigation evaluated the immune response on the duodenal mucosa of children carrying fully manifested visceral leishmaniasis. METHODS: A group of 13 children carrying kalazar was submitted to a duodenal perioral biopsy, with Watson\'s capsule. Nine assymptomatic children was used as control group and submitted to an endoscopic duodenal biopsy. Both groups were submitted to the parasite research, the morphometric analysis and the semi quantitative analysis of the local production of TNF-&#945;, &#948;-interferon, IL-4 e IL-10 and phenotypic analysis of the following immune cells: CD4, CD8, CD68. RESULTS: The morphometric analysis revealed that there was a limphoplasmocitary infiltrate with discrete vilositary atrophy in the cases. The presence of eosinophilus and neutrophils were not verified. The presence of leishmania was verified in all cases and was absent in the controls. The cytokine production analysis showed that both in the cases and in the controls there was a similar mean IL-10 production, with p=0.8968 (T Student test); that the IL-4 was not detected in the cases nor in the controls; that the &#948;-interferon production frequency in the controls was higher with p=0.046 (Fischer test); that the TNF-&#945; production frequency was similar in the cases and in the controls with p=0.41 (Fischer test); that there was a macrophagic infiltrate significantly higher in the cases with p=0.005757 (T Student test), that the mean CD4 in the cases was higher than in controls, Mann-Withney test with p=0,040, mediana test, p=0,019, and CD8 infiltrate was similar in the cases and in the controls with p= 0,396 respectively (T Student test). CONCLUSIONS: The duodena mucosa, being a immunetolerant environment due to the natural IL-10 production, would allow the presence and the multiplication of leishmania. That the limphoplasmocitary infiltrate composed of CD4, CD8 and CD68 cells was incapable of providing an effective immune response against the parasite, mostly because of the low &#948;-interferon local production.

Orientador: Mary Marcondes / Banca: Wagner Luis Ferreira / Banca: Marcia Dalastra Laurenti / Resumo: O presente estudo teve por objetivo correlacionar as alterações laboratoriais, histopatológicas e a presença de linfócitos T CD3+ e linfócitos B CD79+, com a presença de Leishmania sp no tecido renal de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. Para tanto foi utilizado um grupo (G1) constituído por 24 animais com formas amastigotas de Leishmania sp. no tecido renal, e outro (G2) composto por 43 cães sem evidências imuno-histoquímicas da presença do parasito nos rins. A prevalência de doença renal na população estudada foi de 100% nos animais de G1 e 56,09% de G2. Todos os cães de G1 e 53,6% dos cães de G2 possuíam relação proteína/creatinina urinária (P/C U) maior que 0,5, evidenciando-se uma correlação positiva entre a ocorrência de proteinúria intensa e a presença de Leishmania sp. no tecido renal (p<0,001). Todos os cães de G1 e 88,4% dos cães de G2 apresentavam alterações glomerulares, sendo que a presença do parasito nos rins esteve correlacionada com uma maior prevalência e intensidade das lesões (p<0,001). Imunomarcações para linfócitos T CD3+ foram observadas em 100% dos cães do grupo 1 e 97,7% do grupo 2, havendo uma correlação entre a presença de formas amastigotas no tecido renal e a intensidade do infiltrado inflamatório (p<0,0005). Imunomarcações para linfócitos B CD79+ foram observadas em todos os cães do grupo 1 e em 55,8% do grupo 2 (p < 0,0001). Nos cães com parasitos no tecido renal observou-se uma maior intensidade do infiltrado de linfócitos B (p<0,0001). A presença de Leishmania sp, linfócitos T CD3+ e de linfócitos B CD79+ nos rins de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral confirmam a participação do parasita, da imunidade celular e da imunidade humoral na patogênese da lesão renal / Abstract: The aim of this study was to correlate the laboratory and histopathological changes and the presence of CD3+T and CD79+ B cells with the presence of Leishmania sp in the renal tissue of dogs naturally affected by visceral leishmaniasis. For this purpose two groups were used: G1 with 24 dogs with amastigotes of Leishmania sp. in the renal tissue, and G2 consisting of 43 dogs with no immunohistochemical evidence of the presence of the parasite in the kidneys. The prevalence of renal disease in the population studied was 100% in G1 and 56.1% in G2. All dogs from G1 and 53.6% of the dogs from G2 had urine protein/creatinine ratio (U/PC) > 0.5, demonstrating a positive correlation between the occurrence of severe proteinuria and the presence of Leishmania sp. in renal tissue (p <0.001). All dogs from G1 and 88.4% of the dogs from G2 had glomerular lesions, and the presence of the parasite in the kidney was correlated with a higher prevalence and intensity of the lesions (p <0.001). Immunostaining for CD3+ T cells were observed in 100% of the dogs from G1 and in 97.7% of G2. There was a correlation between the presence of amastigotes in renal tissue and the intensity of the inflammatory infiltrate (p <0.0005). Immunostaining for CD79+ B cells were observed in all dogs from G1 and in 55.8% of the dogs from G2 (p <0.0001). Dogs with parasites in the renal tissue presented a greater intensity of B cells infiltrate (p <0.0001). The presence of Leishmania sp, CD3+ T cells and CD79+ B cells in the kidney of dogs naturally affected by visceral leishmaniasis confirmed the participation of the parasite, cellular immunity and humoral immunity in the pathogenesis of renal injury / Mestre

Orientador: Mirela Tinucci Costa / Banca: Aleksandro Schafer da Silva / Banca: Leucio Câmara Alves / Banca: Aureo Evangelista Santana / Banca: Annelise Carla Camplesi / Resumo: O tratamento de cães com leishmaniose visceral no Brasil tem gerado polêmicas discussões entre os diversos segmentos de profissionais da saúde. De um lado os Médicos Veterinários pressionados pelos proprietários dos cães que querem ter o direito de decidir por um tratamento ou pela eutanásia de seus animais; de outro os Ministérios da Saúde e da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) que se mostram contrários a qualquer tratamento, motivados pelo risco de se criar cepas do parasita resistentes aos fármacos, os quais também podem ser empregados em pacientes humanos. Argumentos científicos que possam embasar essa polêmica devem ser explorados. Uma das possibilidades de se avaliar o desenvolvimento de resistência a fármacos pode ser conseguida por meio da pesquisa da expressão da glicoproteína-P (gp-P) e proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP1), que atuam como bombas de efluxo expulsando xenobióticos de células, responsáveis pelo fenótipo MDR (resistência a múltiplas drogas). Avaliamos, pela técnica de imuno-histoquímica, a reatividade da gp-P e MRP1, clone C494 e ABCC1, respectivamente, na pele de 11 cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum chagasi antes e após serem submetidos a dois protocolos de tratamento: Alopurinol e vacina inativada (n=4) e Alopurinol, vacina inativada e domperidona (n=7) e quantificamos formas amastigotas na pele pela mesma técnica. Todos os animais após 3 e 6 meses de tratamento tiveram melhora clínica evidente e tiveram contagem negativa de formas amastigotas do parasita. Pele de cães com LV expressaram gp-P e MRP1, antes e após o tratamento, no entanto, este experimento permitiu concluir que a gp-P e MRP1 não foram bons marcadores para avaliar a eficácia terapêutica da LVC e para prever possíveis estados de resistência a fármacos. Todavia, o entendimento sobre a participação de marcadores de resistência a múltiplas drogas na pele de ... / Abstract: The treatment of dogs with visceral leishmaniasis in Brazil has generated controversial debate among various segments of health professionals. On one side, veterinarians pressured by dog owners want to have the right to decide between treatment and euthanasia of their animals. On the other hand, the Ministry of Health and the Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply (MAPA) are opposed to treatment because of the risk of creating strains of the parasite resistant to drugs that are also used for human patients. Scientific arguments that can support this controversy should be explored. One possibility for assessing the development of drug resistance can be achieved through research of the expression of Pglycoprotein (P-gp) and multidrug resistance-associated protein (MRP1). These proteins, which are responsible for the MDR phenotype (multiple drug resistance), act as efflux pumps which expel xenobiotics from cells. Using immunohistochemistry, the reactivity of P-gp (clone C494) and MRP1 (clone ABCC1) in the skin of 11 dogs naturally infected by Leishmania (L.) infantum chagasi was analyzed before and after undergoing two treatment protocols: Allopurinol and inactivated vaccine (n=4) and Allopurinol, inactivated vaccine, and domperidone (n=7). Quantification of Leishmania amastigotes in the skin was also achieved via immunohistochemistry. All of the animals after 3 and 6 months of treatment had clinical improvement and tested negative for amastigote forms of the parasite. Yet, the skin of dogs positive for CVL (canine visceral leishmaniasis) expressed P-gp and MRP1 before and after treatment, illustrating that P-gp and MRP1 were neither good markers for evaluating the therapeutic efficacy of CVL nor for predicting the possible states of drug resistance. However, an understanding of the participation of markers for multiple drug resistance in the skin of dogs under treatment for CVL can be of great importance for the development of an ... / Doutor

Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Coorientador: Pamela Rodrigues Reina Moreira / Coorientador: Daniela Berdanete Rozza / Banca: Claudia Momo / Banca: Daniela Gomes da Silva / Resumo: A onicogrifose é um dos principais achados clínicos em cães com Leishmaniose Visceral (LV), porém são escassas as pesquisas com enfoque na região ungueal de cães infectados. O objetivo do presente estudo foi avaliar a região ungueal de cães com LV que apresentaram ou não onicogrifose, por meio das análises histopatológica e imuno-histoquímica. O terceiro dígito dos membros torácico e pélvico foi colhido de 16 cães naturalmente infectados com Leishmania infantum, sem predileção por sexo, raça ou idade. Os animais foram divididos em dois grupos, cães com onicogrifose (GO; n=7) e sem onicogrifose (GSO; n=9). Os dígitos foram avaliados em quatro regiões (epiderme/derme dorsal, epiderme/derme ventral, matriz ungueal dorsal e matriz ungueal ventral). Todas as lesões observadas (infiltrado inflamatório mononuclear, degeneração vacuolar dos queratinócitos basais, separação dermo-epidérmica e incontinência pigmentar) estavam presentes em ambos os grupos, porém em maior intensidade nos dígitos de cães com onicrogrifose. A imunomarcação das formas amastigotas de Leishmania infantum foi observada nas diferentes áreas do dígito. Observou-se diferença estatística entre as áreas de epiderme/derme dorsal com a matriz dorsal e com a matriz ventral nos dígitos do membro pélvico e, entre a epiderme/derme dorsal com a matriz dorsal no membro torácico do grupo GO. Conclui-se que a principal alteração histopatológica da região ungueal de cães com LV é o infiltrado inflamatório mononuclear independ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Onychogryphosis is among the main clinical findings in dogs with Visceral Leishmaniasis (VL). However, there are few researches focusing on the claw region of infected dogs. This aim of this study was to evaluate claw region of dogs with symptomatic CanL with and without onychogryphosis, through histopathological and immunohistochemical analyzes. The third digit of the right thoracic and pelvic limbs was collected from 16 dogs with CanL, without for sex, breed or age predilection. The dogs were divided into two groups, dogs with (GO; n = 7) and without onychogryphosis (GSO; n = 9). The digits were evaluated in four regions (dorsal epidermis / dermis, dorsal matrix / dermis, ventral matrix / dermis, ventral epidermis / dermis). All the lesions observed (mononuclear inflammatory infiltrate, basal keratinocyte vacuolation, dermoepidermal clefting and pigmentary incontinence) were presente in both groups, but more strongly in the digits of dogs with onychogryphosis. Immunohistochemistry revealed numerous amastigotes in the different areas of the digit. Statistical difference was observed between dorsal epidermis / dermis areas with dorsal matrix / dermis and ventral matrix / dermis in the digits of the pelvic limb, and between dorsal epidermis / dermis áreas with dorsal matrix / dermis of the thoracic limb in dogs with onychogryphosis. In conclusion, main histopathological alteration of the claw region of dogs with CanL was mononuclear inflammatory infiltrate in the dorsal epider... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Newton Goulart Madeira / Resumo: Leishmania infantum (syn. L. chagasi) é o agente causador da Leishmaniose Visceral (LV) no Novo Mundo, com áreas endêmicas que se estendem do Sul dos EUA ao norte da Argentina. As leishmanioses assumem grande importância em saúde pública por sua natureza zoonótica e, atualmente, vêm apresentando crescente disseminação nas diferentes regiões do Brasil, em especial no Estado de São Paulo. No Brasil, a Leishmaniose Tegumentar (LT) tem sido assinalada em praticamente todos os Estados e vem crescendo progressivamente nos últimos 20 anos, ocorrendo surtos em todas as regiões do país. Apesar dos registros de ocorrências de infecções esporádicas de leishmaniose felina (LF), são necessários mais estudos para se considerar os felinos como reservatórios importantes nas leishmanioses. Estes animais quase não apresentam sinais clínicos, mesmo estando infectados, constituindo-se em importantes fontes de infecção para outros animais domésticos, o homem ou vice-versa. Coletaram-se amostras de sangue de 50 gatos procedentes do Bosque Municipal de Marília, área de grande concentração de transeuntes e já detectado flebotomíneos no local. Armadilhas do tipo CDC luminosas foram instaladas em dez diferentes pontos do bosque, nos meses de julho a dezembro/2012, tendo-se capturado um total de quatro espécies de Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) sendo dois machos e duas fêmeas e quatro espécies fêmeas do gênero Brumptomyia spp. A análise parasitológica do conteúdo intestinal das duas fêmeas da espécie Lu. longipalpis foi negativa. Realizou-se a prova de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum, tendo-se quatro (8%) animais reagentes. Todos os animais foram não reagentes à prova de RIFI para Leishmania(Viannia) braziliensis. Em relação ao teste de ELISA indireto para Leishmania infantum, 42% dos animais (21/50) foram reagentes. Para L. braziliensis, 18% dos animais (9/50) foram reagentes ... / Abstract: Leishmania infantum (syn. L. chagasi) is the causative agent of visceral leishmaniasis (VL) in the New World, with endemic areas that spreads from the south of United States until the north of Argentina. Leishmaniasis represents a great importance in public health due to the zoonotic nature, and currently have been presented a great dissemination in different regions of Brazil, specially in Sao Paulo State. In Brazil, cutaneous leishmaniasis has been occurred in almost all States, and have been growing up progressively in the last twenty years, occurring outbreaks in all regions of the country. Even though the sporadic reports of feline leishmaniasis, more studies are necessary to consider cats as the great importance as reservoirs in the feline leishmaniasis. These animals almost do not represent any clinical symptoms, even infected, representing important source of infection to another domestic animals, humans and vice-versa. Blood samples were collected from fifty cats habiting the Municipal Grove from Marília-SP, an area with high number of visitors and already detected sandflies. Traps CDC were installed in ten different points of the Municipal Grove from Marília-SP, since July to December/2012. Four specimens of Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) were captured (two males and two females) and four females specimens of the Brumptomyia genre. The parasitological analysis of gut contents of two females of Lu. longipalpis was negative. The Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) for Leishmania infantum was performed, resulting in four (8%) reagent animals. All cats were non-reagent to Leishmania braziliensis by IFAT. Regarding to Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) test for Leishmania infantum, 42% of the animals (21/50) were reagent. For L. braziliensis, 18% of the animals (9/50) were reagent to ELISA test. The Polimerase Chain Reaction (PCR) for Leishmania infantum and for Leishmania braziliensis from ... / Mestre

Hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi são considerados um dos melhores modelos para estudo de fatores relacionados à imunossupressão que ocorre durante a leishmaniose visceral ativa, pois apresenta manifestações clínicas similares ao que ocorre no homem e não conseguem controlar a infecção. Neste estudo, hamsteres infectados intraperitonealmente com 2x107 parasitos foram utilizados para avaliação de possíveis fatores envolvidos na dinâmica da imunossupressão. Os parâmetros avaliados foram a produção de citocinas de padrão Th1 e Th2, produção de óxido nítrico por células esplênicas e detecção de apoptose em linfócitos esplênicos em tempos precoces (6, 20, 48 e 72 horas), intermediários (7 e 15 dias) e tardios (30 e 60 dias) de infecção. Inicialmente avaliamos a carga parasitária no baço e observamos aumento progressivo dependente do tempo de infecção, ratificando que hamster infectado é um bom modelo para desenvolvimento de doença. A resposta celular frente a mitógeno e antígeno de Leishmania foi o parâmetro utilizado para avaliação de imunossupressão. Observamos resposta preservada à concanavalina A em todos os tempos de infecção e resposta preservada ao antígeno de Leishmania nos tempos precoces, porém com ausência de resposta antígeno específica a partir do tempo de 7 dias de infecção. A quantificação de óxido nítrico foi determinada em sobrenadante de células esplênicas de cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania, pelo método de Griess. Observamos inicialmente baixo nível de produção de óxido nítrico em todos os tempos de infecção, no entanto quando as células foram estimuladas com antígeno de Leishmania observamos níveis ainda menores nos tempos de 48 e 72 horas de infecção. O perfil de citocinas produzido foi determinado pela reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa, sendo detectado RNA mensageiro tanto de citocinas Th1, quanto Th2 em todos os tempos de infecção (precoce, intermediária e tardia), em células ex-vivo e estimuladas; e também em animais controles não infectados; não havendo um padrão de dicotomização de produção de citocinas neste modelo experimental. Detecção de apoptose em células esplênicas não aderentes (prováveis linfócitos T) ex-vivo e em cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania foi avaliada pelos seguintes métodos: Anexina V, caspase 3 clivada e TUNEL por citometria de fluxo. Houve marcação da exposição de fosfatidil serina pelo método da anexina V, nos tempos de 6 horas de infecção, quando as células foram estimuladas com mitogeno ou antígeno de Leishmania; e com 48 horas e 60 dias de infecção somente quando estimuladas com antígeno de Leishmania. Em células esplênicas em cultura estimuladas com concanavalina não houve marcação de caspase 3 clivada, porém em células esplênicas ex-vivo nos tempos 20, 48 e 72 horas de infecção houve detecção de apoptose, definida por marcação de caspase 3 clivada. A marcação de células esplênicas não aderentes para quebra de DNA foi baixa em todos os tempos analisados, porém observamos aumento de marcação em células esplênicas não aderentes, estimuladas com antígeno nos tempos de 20 horas e posteriormente de 7 dias até 60 dias de infecção. Nossos resultados sugerem que a imunossupressão na leishmaniose visceral no modelo de hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi é antígeno dependente e instala-se nos tempos intermediários de infecção, a partir de 7 dias. Esta imunossupressão parece estar relacionada com aumento de apoptose em linfócitos já nos tempos precoces de infecção, que pode favorecer a progressão da infecção, por ocorrer principalmente em células esplênicas antígenos reativas. Nossos dados sugerem ainda, que a imunossupressão não é decorrente da dicotomização da produção de citocinas Th1 e Th2 / Hamsters infected by Leishmania (L.) chagasi are considered one of the most remarkable models to study several characteristics related to immunosuppression, raised during active visceral leishmaniasis especially because hamsters show similar clinical manifestations as it is found in humans without surmounting the infection. In this study, hamsters infected intraperitoneally with 2x107 parasites were used to evaluate the possible factors involved in the dynamic of immunosuppression that occurs during the disease development. The evaluated parameters were the production of Th1 and Th2 cytokines profile, nitric oxide production of splenic cells and detection of apoptosis in splenic lymphocytes at early (6,20, 48 e 72 hours), intermediate (7 e 15 days) and late times (30 e 60 days) of infection. Initially, we evaluate the parasite load in the spleen and observed a progressive increase dependent on the time of infection, ratifying that infected hamsters are good models to set up the disease development. Cellular response upon mitogen or Leishmania antigen was the parameter used to evaluate the immunosuppression showing a preserved response to concanavalin A at all period of infection and a preserved response to the Leishmania antigen at all early phases however with no specific antigen response from 7 day of infection until the late phase of infection. Nitric oxide quantification was determined in the splenic cells supernatant in culture stimulated upon concanavalin A and Leishmania antigen and we observed initially low level of nitric oxide production, measured by the Griess method. Nonetheless, when the cells were stimulated upon Leishmania antigen we observed a lower level nitric oxide production at 48 and 72 hours of infection. mRNA of Th1 e Th2 cytokines profile was determined by RT-PCR at all period of infection studied in infected or non infected hamsters showing no difference at the cytokine profile in this experimental model. Detection of apoptosis in the non adherent splenic cells (probably T lymphocytes) ex-vivo and in the stimulated culture with concanavalin A and Leishmania antigen was evaluated by the following methods: annexin V-FITC, cleaved caspase 3 and TUNEL by flow cytometry analysis. There was phosphatidilserine staining by annexin method, at 6 hour of infection when cells were stimulated by mitogen or Leishmania antigen at 48 hours and 60 days of infection only when stimulated by Leishmania antigen. Splenic cells in culture stimulated by concanavalin A showed no cleaved caspase 3 staining in all period of infection studied. Otherwise, apoptosis was detected in the ex-vivo splenic cells at 20, 48 and 72 hours of infection by cleaved caspase 3 staining. We observed a low DNA break staining of non adherent splenic cells in all period analyzed, although this staining was increased in non adherent cells stimulated upon Leishmania antigen at 20 hours from 7 day of infection until 60 day of infection. Our results suggest that a visceral leishmaniasis immunosuppression in the hamsters model infected by Leishmania (L.) chagasi is antigen dependent and sets up in the intermediate phases of infection from 7 days on. This immunosuppression seems to be related to the apoptosis increase in lymphocytes already in the early period of infection probably favoring its progression especially because of its occurrence in reactive splenic antigen. Our data also suggest that the immunosuppression is not provided by dichotomization in the Th1 and Th2 cytokines profile