Orientadora: Profa. Dra. Mirela Inês de Sairre / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / As licochalconas estão naturalmente presentes na raiz de Glycyrrhiza inflata (alcaçuz) e apresentam atividades biológicas, como antitumoral, antiparasitária, anti-oxidativa e bactericida. A licochalcona "A" apresentou atividade anti-leishmania, o que despertou o interesse em investigar e testar o uso para tratamento da leishmaniose visceral canina (LVC), uma zoonose grave que atinge os cães domésticos, os quais são sacrificados em virtude da falta de uma terapia eficiente. O objetivo deste trabalho é realizar a síntese total da Licochalcona "A" a partir de um reagente comercial de baixo custo, empregando uma rota sintética de quatro etapas. A síntese inclui uma reação de rearranjo sigmatrópico e a clássica condensação de Claisen-Schmidt, etapas que foram estudadas para encontrar condições reacionais catalíticas apropriadas e de grande viabilidade de execução. Além da licochalcona A, diferentes análogos poderiam ser obtidos. Este trabalho está vinculado à empresa Centagro - Centro Tecnológico Agropecuário Ltda e, portanto, se insere dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico com vínculos estreitos aos interesses da indústria farmacêutica, da medicina veterinária e do setor produtivo. Realizou-se um estudo detalhado das quatro etapas da rota, testando diferentes condições reacionais. A etapa de reação de prenilação foi realizada empregando diversos substratos para, em seguida, desenvolver um estudo sobre condições reacionais em rearranjos sigmatrópicos-[3,3]. Os produtos das reações de prenilação foram obtidos com sucesso e rendimentos moderados (47- 68%). Na etapa de condensação de Claisen-Schmidt, uma chalcona prenilada desejada foi obtida com sucesso, para a síntese de um análogo da Licochalcona A, mas a etapa final de rearranjo não foi conclusiva. / Licochalcones are naturally present in the root of Glycyrrhiza inflata (licorice) and have many biological activities, such as antitumor, antiparasitic, anti-oxidative and bactericidal. Licochalcone "A" showed anti-leishmania activity, which aroused interest in investigating and testing it for the treatment of canine visceral leishmaniasis (LVC), a serious zoonosis that affects domestic dogs, which are sacrificed due to the lack of an effective therapy. This work aimed to perform the total synthesis of Licochalcone "A" from a low cost commercial reagent using a four step synthetic route. The synthesis includes a sigmatropic rearrangement reaction and the classical Claisen-Schmidt condensation, steps that were studied to find suitable catalytic reaction conditions and viable execution. Besides licochalcone A, different analogues could be obtained. This work is linked to the Centagro - Centro Tecnológico Agropecuário Ltda company and, therefore, falls within a perspective of promoting scientific and technological development with close links to the interests of the pharmaceutical industry, veterinary medicine and the productive sector. A detailed study of the four stages of the route was carried out, testing different reaction conditions. The prenylation reaction step was performed employing several substrates to then develop a study on reaction conditions in sigmatropic rearrangements-[3,3]. The products of the prenylation reactions were obtained with success and moderate yields (47-68%). In the condensation step of Claisen-Schmidt, a desired prenylated chalcone was obtained for the synthesis of an analogue of Licochalcone A, but the final step of rearrangement was not conclusive.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In the present study, the sera levels of soluble CD40 ligand (sCD40L) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) were quantified by Luminex assay in Visceral leishmaniasis patients before and during treatment follow-up and after regular antimony treatment and also in individuals exposed to infection, living in endemic areas. Different from the other molecules present in sera from classic VL patients, sCD40L and MMP-9 are fairly increased, and increase over time during the follow-up of VL patients undergoing antimony treatment. sCD40L and MMP-9 sera levels were also high in individuals living in endemic settings at high risk of infection (endemic controls). On the other hand, sCD40L and MMP-9 were not observed in sera from non-endemic controls, which are not exposed of infection. Additionally, negative correlations were found between spleen sizes and MMP-9 before treatment and sCD40L at day 15 of treatment. Negative correlations were also found between parasite load with both sCD40L and MMP-9. These findings indicate that both molecules can be used in monitoring therapeutic efficacy in VL. Furthermore, these data suggest a protective effect of these molecules, since the individuals exposed to infection without the symptoms of disease have high sera levels of sCD40L and MMP-9. These data were published in BMC Infectious diseases journal [1]. To confirm the protective effect of sCD40L present in sera of VL patients and determine if this molecule had biological activity, the ability of sera from patients containing high levels of this molecule sCD40L to control infection in vitro in Leishmania infantum infected macrophages, and the ability to induce cytokines production. Thereby, macrophages from of healthy donor were infected with Leishmnia infantum, and later incubated in presence of sera from individuals exposed to infection in presence of anti-CD40L. The infection was evaluated by counting of the number of infected macrophages/100 and the number of intracellular amastigotes/100 macrophages. The data showed that serum sCD40L decrease the number of infected macrophages and the number of intracellular amastigotes. The blockage of sCD40L activity with specific antibody, increase the infection. Moreover, the analysis of cytokines in supernatant of these macrophage cultures by Luminex assay demonstrated that sCD40L induces the IL-12, IL-23, IL-27, IL-15 e IL-1 production. The levels of these cytokines is inversely correlated with infection rate and the number of intracellular parasites from infected macrophages. A second manuscript with these data were published in PLOS One [2] . These results demonstrated that serum sCD40L from individuals exposed to VL improve the microbicide effect and the inflammatory cytokine production, suggesting its potential use in VL immunotherapy. Nevertheless, there is still a long way to be approached in future experimental and clinical studies. / No presente estudo, os níveis séricos dos marcadores inflamatórios CD40 ligante solúvel (sCD40L) e da metaloproteinase de matrix-9 (MMP-9) foram quantificados por Luminex nos pacientes com leishmaniose visceral antes, durante e após o tratamento com antimonial, e em indivíduos controles expostos à infecção, residindo em áreas endêmicas. Ao contrário das outras moléculas inflamatórias presentes nos soros de pacientes com LV, as moléculas sCD40L e MMP-9 apresentaram elevação moderada, havendo um aumento significativo de ambas no decorrer do tratamento com antimonial. Níveis séricos elevados de sCD40L e MMP-9 também foram encontrados nos indivíduos controles sem doença, provenientes de áreas endêmicas e expostos a infecção. Entretanto, o sCD40L e a MMP-9 não foram detectados nos soros de indivíduos de áreas não endêmicas, os quais não estão expostos a infecção. Adicionalmente, correlações negativas entre o tamanho do baço com a MMP-9 antes do tratamento e com o sCD40L 15 dias após o início do tratamento foram observadas, bem como correlações negativas entre ambas as moléculas com a carga parasitaria dos pacientes. Estes resultados indicam que estas moléculas podem ser utilizadas no monitoramento da eficácia terapêutica na leishmaniose visceral. Além disso, estes dados nos sugerem um efeito protetor dessas moléculas contra a doença, desde que os indivíduos expostos e sem a doença apresentaram concentrações elevadas dessas moléculas. Estes dados foram publicados no BMC Infectious diseases [1]. Para confirmar o efeito protetor do sCD40L e investigar se a molécula presente nos soros dos pacientes com LV tinha atividade biológica, foi avaliado se o sCD40L presente no soro dos indivíduos infectados teria ação na resposta leishmanicida e na produção de citocinas por macrófagos infectados por Leishmania infantum. Dessa forma, macrófagos de doadores normais foram infectados com L. infantum e posteriormente incubados com soro de indivíduos expostos a infecção na presença de anti-CD40L. A avaliação da infecção através da contagem de células infectadas e do número de parasitas intracelulares demonstrou que a presença do sCD40L sérico diminui o número de macrófagos infectados e o número de amastigotas intracelulares. O bloqueio da atividade do sCD40L com anticorpo específico reverteu este efeito, aumentando a infecção. Além disso, a análise de citocinas no sobrenadante das culturas de macrófagos por Luminex mostrou que a adição de sCD40L induziu a produção de IL-12, IL- 23, IL-27, IL-15 e IL-1. As concentrações destas citocinas correlacionaram-se inversamente com as taxas de infecção e com o número de parasitas intracelulares nos macrófagos infectados. Um segundo artigo com estes resultados foi publicado na PLOS One [2]. Estes resultados demonstram que o sCD40L sérico dos indivíduos expostos à LV melhora a capacidade microbicida e a produção de citocinas inflamatórias, sugerindo seu potencial uso na imunoterapia na LV humana, embora este seja um longo caminho a ser abordado em estudos futuros experimentais e clínicos.

Visceral leishmaniasis constitutes a serious public health problem in the world, demanding effective measures for its control and treatment. The current treatments are far from ideal for the need for prolonged treatment, development of drug resistance and significant side effects. Thus the search for new therapeutic options in addition to evaluating the effectiveness of adjuvant therapy is very important. The aim of this study was to evaluate biomarkers sCD40L and clinical outcome in the adjuvant treatment of human visceral leishmaniasis with N-acetylcysteine. From an intervention study, kind clinical trial, blinded, randomized, were investigated 60 patients from the University Hospital with a positive diagnosis for acute visceral leishmaniasis. These patients were divided into two groups of 30: Study Group - which made use of antimony penta valent standard dose supplemented with N-acetyl-L-cysteine and the control group - which only used the standard dose antimony. The serum levels of soluble ligand sCD40L were significantly higher elevation and steeper over time in SbV + NAC group compared to the Sb group. Furthermore, the distribution of values sCD40L significantly increased in both groups after 15 days of treatment, thereafter no significant change over time. Likewise the size of the spleen, and serum cytokine levels (TNF-α, IL-10, IL-12p40) decreased during treatment in both groups while the number of neutrophils, eosinophils and platelets increased. Several published studies indicate the importance of CD40 / sCD40L interaction for an effective immune response and that this interaction occurs via reciprocal signaling through protein kinase-induced phosphorylation of MAPK p38 and ERK1 / 2 mitogen. Other studies show as a strategy of evading the immune response and the establishment of infection, Leishmania inhibits p38 MAPK signaling triggered by CD40. And the glutathione redox system regulates the production of IL-12 induced by LPS through the activation of p38 MPAK, and furthermore, the effect initiation of IFN-γ and IL-12 is in part a consequence of the equilibrium glutathione redox. NAC was able to increase serum sCD40L concentrations throughout treatment. Treatment with NAC improved the patients´ clinical parameters associated with the prognosis of the patients: reduced spleen size increased number of neutrophils / lymphocytes and eosinophils faster. The results suggest that the addition of NAC to conventional therapy improves the immune response of patients, particularly in the reduction of serum IL-10, IL-12p40 and increase in sDC40L that this response occurs as early as two weeks. It is likely that increased levels of sCD40L the NAC occurs through the activation of p38 MAPK pathway glutathione redox system. / A leishmaniose visceral constitui-se um grave problema de saúde pública no mundo, demandando medidas eficazes no seu controle e tratamento. A terapêutica atual está longe de ser a ideal pela necessidade de tratamentos prolongados, desenvolvimento de resistência aos medicamentos e efeitos colaterais significativos. Desse modo a busca de novas opções terapêuticas além de avaliação da eficácia de terapêutica adjuvante é muito importante. O objetivo deste trabalho foi avaliar biomarcadores de evolução clínica e CD40 ligante solúvel (sCD40L) no tratamento adjuvante da leishmaniose visceral humana com N-acetilcisteína. A partir de um estudo de intervenção, tipo ensaio clínico, cego, aleatorizado, foram investigados 60 pacientes do Hospital Universitário com diagnóstico positivo para leishmaniose visceral aguda. Esses pacientes foram distribuídos em dois grupos de 30: Grupo Estudo que fez uso do antimônio penta valente dose padrão complementado com o N-acetil-L-cisteína e o Grupo Controle - que fez uso apenas do antimônio dose padrão. Os níveis séricos do sCD40L foram significativamente maiores e com elevação ao longo do tempo mais acentuada no grupo SbV + NAC em relação ao grupo SbV. Além disso, a distribuição dos valores de sCD40L aumentaram significativamente em ambos os grupos a partir de 15 dias de tratamento, a partir de então sem variação significativa ao longo do tempo. Do mesmo modo a dimensão de baço e níveis séricos de citocinas (TNF-α, IL-10, IL-12p40) diminuíram ao longo do tratamento nos dois grupos enquanto o número de neutrófilos, eosinófilos e plaquetas aumentaram.Vários estudos da literatura assinalam a importância da interação CD40/sCD40L para uma efetiva resposta imune e que essa interação ocorre por meio de sinalização recíproca através de fosforilação da proteína quinase mitógeno induzida de MAPK p38 e ERK1/2. Outros estudos mostram como uma estratégia de evasão da resposta imune e o estabelecimento de infecção, a Leishmania inibe a sinalização p38MAPK acionada pelo CD40. E que o sistema redox de glutationa regula produção de IL-12 induzida pela LPS através da ativação da p38 MPAK e, além disso, o efeito de iniciação de IFN-γ e a produção de IL-12 é em parte uma conseqüência do equilíbrio redox da glutationa. O NAC foi capaz de aumentar as concentrações séricas de sCD40L ao longo do tratamento. O tratamento com NAC melhorou os parâmetros clínicos dos pacientes associados com o prognóstico dos pacientes: reduziu tamanho do baço, aumento do número de neutrófilos/linfócitos e eosinófilos mais rapidamente. Os resultados sugerem que a adição do NAC ao tratamento convencional melhora a resposta imunológica dos pacientes, sobretudo na diminuição dos níveis séricos de IL-10, IL-12p40 e na elevação da sDC40L que essa resposta ocorre já a partir de duas semanas. É provável que o aumento dos níveis de sCD40L pelo NAC ocorra através da ativação do MAPK p38 via o sistema redox de glutationa.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious infectious disease and is increasing geographical expansion and urbanization. patterns of transmission of the disease are altered due to human actions. The dog is considered the main reservoir of the parasite. The development of the disease depends in part on the host immune system. Neutrophils are considered the first line of defense against pathogens and important agents in the control of LV. These cells have an additional mechanism to eliminate microorganisms that occur with the release of extracellular networks (Neutrophil Extracellular Traps -NETs). This work has two overall objectives, the first being an epidemiological study of LV in Sergipe and the second evaluation of NETs formation in human neutrophils and dogs with LV stimulated with L. infantum, so this thesis was divided into chapters, for better understanding. Epidemiological evaluation were used SINAN data and serosurveys canines Zoonosis Aracaju-SE. A descriptive analysis of the data and construction of distribution maps of disease was performed. Sergipe Aracaju and from 2008 to 2014 the incidence rate in humans with LV increased and the percentage of infected dogs has doubled in the capital. The percentage of cases positive for human VL by sex, according to the age of the patient group, showed that over 15 years the disease affects more males. The spatial distribution analysis allowed to view areas of the city with the highest concentration of human and canine VL. The neighborhoods located in poor areas or growing areas were those with the highest incidence of the disease in humans and dogs. The results show that presents endemicity for human and canine VL. In order to evaluate the formation of NETs were used human groups: Control; LV treated and positive DTH. The dogs were divided into control; Asymptomatic and symptomatic. Neutrophils were isolated from patients with LV University Hospital / UFS and dogs diagnosed with VT by Zoonoses were incubated with and without stimulation of parasite and NETs measures in the supernatant of the cultures after 90 minutes. The parasitic load determined after 24 and 48 hours of interaction with neutrophils treated by the limiting dilution technique. In the evaluation of NETs induction of human neutrophils and release dogs with LV greater amount of NETs when stimulated with L. infantum. When compared between the groups individuals positive DTH release fewer NETs stimulated or not with the parasite. At 24 and 48 hours LV treated subjects have a higher parasite load and showed positive DTH fewer parasite than the other groups tested. Dogs with LV release signals greater amount of NETs when stimulated with L. infantum and have higher parasitic load after 48 hours. It is observed that the release of NETs and control of parasitic load by neutrophils varies according to the clinical form of the LV, in humans and dogs. / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença infecciosa grave e está em crescente expansão geográfica e urbanização. Os padrões de transmissão da doença são alterados devido às ações antrópicas. O cão é considerado o principal reservatório do parasito. O desenvolvimento da doença depende em parte do sistema imune do hospedeiro. Os neutrófilos são considerados a primeira linha de defesa do organismo contra agentes patogênicos e importantes no controle da LV. Estas células têm um mecanismo adicional para eliminar microorganismos que ocorre com a liberação de redes extracelulares (Neutrophil Extracelular Traps -NETs). Este trabalho teve dois objetivos gerais, sendo o primeiro um estudo epidemiológico da LV em Sergipe e o segundo a avaliação da formação de NETs em neutrófilos de humanos e cães com LV estimulados com L. infantum, assim essa tese foi dividida em capítulos, para melhor compreensão. Na avaliação epidemiológica foram utilizados dados do SINAN e inquéritos sorológicos caninos do Zoonoses de Aracaju-SE. Foi realizada uma análise descritiva dos dados e construção de mapas de distribuição da doença. Em Sergipe e Aracaju de 2008 a 2014 o coeficiente de incidência em humanos com LV aumentou e o percentual de cães infectados dobrou na capital. A porcentagem de casos positivos para LV humana por sexo, de acordo com a faixa etária do paciente, mostrou que acima de 15 anos a doença acomete mais o sexo masculino. A análise de distribuição espacial permitiu visualizar áreas da cidade com maior concentração de LV humana e canina. Os bairros situados em áreas com situação econômica desfavorável ou em zonas de expansão foram os que apresentaram maior incidência da doença em humanos e cães. Os resultados demonstram que apresenta caráter endêmico para a LV humana e canina. Com a finalidade de avaliar a formação de NETs foram utilizados grupos humanos: Controle; Tratados LV e DTH positivos. Os cães foram divididos em: Controle; Assintomáticos e sintomáticos. Foram isolados neutrófilos de pacientes com LV do Hospital Universitário/UFS e de cães diagnosticados com LV pelo Zoonoses foram incubadas, com e sem estímulo do parasito e NETs medidas no sobrenadante das culturas após 90 minutos. A Carga parasitária determinada após 24 e 48 horas de interação com neutrófilos tratados, através da técnica de diluição limitante. Na avaliação da indução de NETs, os neutrófilos de humanos e cães com LV liberam maior quantidade de NETs quando estimulados com L. infantum. Quando comparado entre os grupos indivíduos DTH positivos liberam menor quantidade de NETs estimulados ou não com o parasito. Em 24 e 48 horas indivíduos tratados com LV apresentam maior carga parasitária e os DTH positivos demonstraram menor quantidade do parasito do que os outros grupos testados. Os cães com sinais de LV liberam maior quantidade de NETs quando estimulados com L. infantum e apresentam maior carga parasitária após 48 horas. Observa-se que a liberação de NETs e o controle da carga parasitária através dos neutrófilos variam de acordo com a forma clínica da LV, em humanos e cães.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Search for new therapeutic alternatives for leishmaniasis is considered essential by the World Health Organization, due to the high toxicity of the drugs currently used, its high cost and the risk of resistance. In Brazil, it is used three drugs to treat leishmaniasis: meglumine antimoniate and two formulations of amphotericin B (deoxycholate and liposomal). This study is a piggy-back evaluation linked to a multicentric clinical trial with the objective to perform a decision analysis between the treatment regimens for visceral leishmaniasis, for both adults and children. For this end, it was performed analysis of the data obtained in the state of Sergipe from 62 patients randomized to treatment with meglumine antimoniate (group A), considered the first line treatment in Brazil, amphotericin B deoxycholate (group B), liposomal amphotericin B (group C) and the combined regimen of meglumine antimoniate with liposomal amphotericin B (group D), in order to conduct a decision analysis from among these therapeutic regimens for both adults and children. To this end, two scenarios were considered: scenario 1 is the currently prevailing in Brazil, where patients are always treated as possible on an outpatient basis with meglumine antimoniate, although with a smaller monitoring on its potentially lethal side effects and a possible lower adherence to treatment. In the scenario 2, patients are hospitalized during the treatment period, with a better monitoring of clinical and laboratory parameters of the patient, although with a higher risk of nosocomial infections and increasing treatment costs. In terms of security, there is an emphasis on amphotericin B deoxycholate as the one that presents a greater amount of serious and potentially lethal adverse reactions, with an average of 2 severe reactions per patient. From the viewpoint of cost-efficacy, for scenario 1 the meglumine antimoniate remains the treatment of choice for both adults and children. However, in scenario 2, the combination of drugs (group D) presented itself as the most costeffective for both adults and children. From this study it became clear, from a safety point of view for the patient, the need to evaluate both therapeutic regimens, particularly amphotericin B deoxycholate, such as the treatment scenarios for visceral leishmaniasis. / A busca por novas alternativas terapêuticas para as leishmanioses é considerada essencial pela Organização Mundial da Saúde, em virtude da elevada toxicidade dos medicamentos atualmente utilizados, seu alto custo e o risco de resistência. No Brasil, utilizam-se três drogas para o tratamento da leishmaniose: o antimoniato de meglumina e as formulações de anfotericina B (desoxicolato e lipossomal). Este estudo é uma análise econômica atrelada a um ensaio clínico multicêntrico, com o objetivo de se realizar uma análise de decisão entre os esquemas terapêuticos para a leishmaniose visceral, tanto para adultos como para crianças. Para tal, foram utilizados os dados obtidos do estado de Sergipe, onde foram acompanhados 62 pacientes, randomizados para tratamento com antimoniato de meglumina (grupo A), considerado o esquema de primeira escolha no Brasil, anfotericina B desoxicolato (grupo B), anfotericina B lipossomal (grupo C) e o esquema terapêutico combinado de antimoniato de meglumina com anfotericina B lipossomal (grupo D). Na análise de decisão, foram considerados dois cenários: o cenário 1, atualmente existente no Brasil, no qual os pacientes são tratados sempre que possível ambulatorialmente com o antimoniato de meglumina, porém com um menor acompanhamento de suas reações adversas potencialmente letais e uma possível menor adesão ao tratamento. Já no cenário 2, os pacientes são internados durante todo o período do tratamento, com um melhor monitoramento dos parâmetros clínicos e laboratoriais do paciente, porém com um risco maior de infecções hospitalares e aumento de custos do tratamento. No quesito segurança, há um destaque para a anfotericina B desoxicolato como sendo a que apresenta uma maior quantidade de reações adversas graves e potencialmente letais, com uma média de 2 reações graves/paciente. Já no ponto de vista de custo-eficácia, para o cenário 1 o antimoniato de meglumina continua sendo o tratamento de primeira escolha, tanto para adultos como para crianças. Porém, no cenário 2, a combinação de medicamentos (grupo D) se apresentou como o mais custo-eficaz tanto para adultos como para crianças. Deste estudo evidenciou-se, do ponto de vista de segurança ao paciente, a necessidade de reavaliação tanto dos esquemas terapêuticos, particularmente a anfotericina B desoxicolato, como dos cenários de tratamento para a leishmaniose visceral.

Leishmaniasis is a worldwide neglected disease with high impact among the underprivileged population, especially in developing countries. The therapeutic arsenal is limited, outdated and causes serious side effects and can even cause death. In addition, studies show that there is great resistance of the parasite to treatment. In this regard, 18 (4a - 4o) new dialkylphosphorylhydrazones compounds were synthesized and evaluated against the parasites Leishmania species. Initially, we evaluated the effect of these compounds against L. amazonensis and L. braziliensis promastigotes in vitro. It was observed that all of compounds showed activity against these parasite, except 4a, 4c and 4e. In order to assess a potential toxicity against mammalian cells, MTT assay were performed in J774 macrophages treated with compounds. All The compounds showed low cytotoxicity with LC50 values >100 mM, except for 4o, which was toxic to approximately 20% of the treated cells. Using the EC50, Emax and cytotoxicity parameters, 4m and 4n compounds were chosen for the subsequent tests. These compounds were tested antiamastigote assay in vitro. In this test, the average of the number of parasites per macrophage, the percentage of infected macrophages and infection index of L. amazonensis-infected macrophages were reduced dose dependently by both compounds, similar to standard drug miltefosine. Since these compounds showed anti-leishmania activity in vitro, later it was tested 4m and 4n anti-leishmania effect in mouse model of cutaneous leishmaniasis, that mimics human disease. In this assay, the oral treatment with both compounds caused a complete healing of nodules and ulcers in L. amazonensis-infected mice ears, but the control of parasite burden at the inoculation site was reduced only in the case of treatment with 4n. On the other hand, none of two compounds interfered in systemic parasite burden, once they did not reduce parasite levels in draining lymph nodes. Thereafter, we also evaluate 4m and 4n effect in L. chagasi-induced visceral leishmaniasis in hamsters (Mesocricetus auratus). Firstly, in vitro assays against promastigotes and amastigotes form of L. chagasi were performed. Similar to observed previously, 4m and 4n were active against both L. chagasi forms. In addition, by scanning electron microscopy, it was observed that promastigotes treated with 4m compound presented multiple flagellae, aberrant shapes and multi-septation; while 4n treatment caused cell body shrinkage and multi-septation. In in vivo test, 15 days after oral treatment with 4m and 4n, it was evaluated the visceral organs weight (spleen and liver). Despite this treatment did not reduce organs weight, it reduced the parasite burden in spleen, which indicate oral effect of 4m and 4n against visceral leishmaniasis in mice. Also, it was observed that 4m and 4n treatment did not induce hepatotoxicity and nephrotoxicity, since they did not increase the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), urea and creatinine. Taken together, these data indicate that dialkylphosphorylhydrazones compounds are active against Leishmania species, mainly 4m and 4n compunds, which are orally active against cutaneous and visceral leishmanisis. This indicate that 4m and 4n could be new lead compounds therapeutically useful against leishmaniasis. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose é uma doença negligenciada mundialmente com alto impacto dentre a população menos favorecida, principalmente em países em desenvolvimento. O arsenal terapêutico é restrito, ultrapassado e provoca efeitos adversos graves, podendo causar até a morte. Além disso, estudos mostram que há grande resistência do parasita ao tratamento. Nesse sentido, foram racionalmente planejados e sintetizados 18 novos derivados dialquifosforilhidrazonas (4a - 4o) e avaliados contra espécies de Leishmania. Inicialmente, foi avaliado o efeito desses compostos contra formas promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis in vitro. Observou-se que todos os compostos apresentaram atividade contra esses parasitos, exceto os compostos 4a, 4c e 4e. Para avaliar a toxicidade destes compostos contra células de mamíferos, foi realizado o ensaio de MTT em macrófagos J774. Nesse ensaio nenhum derivado apresentou citotoxicidade na concentração avaliada (100 mM), exceto 4o, que foi tóxico para aproximadamente 20% das células tratadas. Em seguida, utilizando os parâmetros de CI50, Emax e citotoxicidade, foram escolhidos os compostos 4m e 4n para os testes subsequentes. Esses compostos foram avaliados in vitro no ensaio de amastigota. Nesse teste, a média do número de parasitas por macrófago, a porcentagem de macrófagos infectados e o índice de infecção dos macrófagos por L. amazonensis foram reduzidos de forma dependente de dose por ambos os compostos, semelhante ao fármaco padrão Miltefosina. Uma vez que estas moléculas apresentaram atividade leishmanicida in vitro, foi avaliado o efeito de 4m e 4n no modelo de leishmaniose cutânea em camundongos, que mimetiza a doença em humanos. O tratamento oral com ambos os compostos promoveu a cicatrização total de nódulos e úlceras nas orelhas de camundongos infectados com L. amazonensis, porém apenas o tratamento com 4n reduziu a carga parasitária no local do inóculo. Além disso, nenhum dos compostos interferiu na carga parasitária sistêmica, uma vez que eles não reduziram os níveis dos parasitas nos linfonodos drenantes. O efeito de 4m e 4n foi também avaliado contra L. chagasi, causadora da forma visceral da doença. Inicialmente, foram realizados ensaios in vitro contra as formas promastigotas e amastigotas de L. chagasi. Semelhante ao que foi observado anteriormente, 4m e 4n foram ativos contra ambas as formas de L. chagasi. Além disso, por meio de microscopia eletrônica de varredura, observou-se que as formas promastigotas tratadas com 4m apresentaram múltiplos flagelos, formas anômalas e múltiplos septos, enquanto o tratamento com 4n induziu uma redução do corpo celular das promastigotas e a formação de múltiplos septos. No modelo de leishmaniose visceral em hamsters (Mesocricetus auratus), 15 dias após os tratamentos, o peso dos órgãos viscerais (fígado e baço) foi avaliado. Embora esse tratamento não tenha reduzido o peso dos órgãos, reduziu a carga parasitária no baço, o que indica um efeito oral leishmanicida dos compostos 4m e 4n contra a forma visceral. Adicionalmente, foi observado que o tratamento com 4m e 4n não induziu hepatotoxicidade nem nefrotoxicidade, uma vez que os níveis de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), ureia e creatinina não estavam elevados após o tratamento. Em conjunto, esses dados indicam que os compostos dialquilfosforilhidrazonas são ativos contra espécies de Leishmania, principalmente os compostos 4m e 4n, que são foram ativos por via oral contra leishmaniose cutânea e visceral. Indicando que estes podem ser considerados novos protótipos para o tratamento da leishmaniose.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-04-22T19:57:28Z No. of bitstreams: 2 Tese - Mauro Roberto Biá da Silva - 2014.pdf: 1034991 bytes, checksum: 33b9d1a7520d55b9ed3fc8220c32caae (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-04-22T19:58:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Mauro Roberto Biá da Silva - 2014.pdf: 1034991 bytes, checksum: 33b9d1a7520d55b9ed3fc8220c32caae (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-22T19:58:56Z (GMT). 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The LV diagnosis is dificult, mainly for patients co infected with HIV, because LV paients present atipical clinic forms and the sorology is not trustfull Objectives: The aim of this thesis is to evaluate the accuracy of Immunochromatographic rK39 tests in the diagnosis of Visceral Leishmaniasis in serum and saliva of HIV-co-infected patients Methods: VL suspected patients were treated at the Institute of Tropical Diseases Natan Portela - IDTNP, Teresina, Piauí, Brazil, from March 2011 to October 2012. In addition to the clinical examination, it was performed the IC rK39 test in saliva and blood and also the bone marrow aspiration for parasitological and the PCR-RFLP tests. As routine in the institution, VL suggestive patients were also investigated for HIV. Bone marrow samples were collected for Leishmania research in smear, culture and PCR. For the research of Leishmania spp. in bone marrow aspirate, the Panoptic stain was used (RANYLAB Pharmaceutical Chemistry). The analyses of the stained slides were done in an optical microscope with immersion objective, magnification of 1000x. To perform the bone marrow aspirate culture, the aspirate was cultivated in 3 mL of NNN medium (McNeal, Novy & Nicolle) and 500 μL Schneider medium at 26°C. The search for promastigotes. was performed every seven days in blade - cover slip in an optical microscope. 5 mL were collected from peripheral blood in Vaccutainer® tubes without any anticoagulant in order to obtain the serum. Sera were then aliquoted in cryoassay tubes and kept in a freezer at -70°C. Saliva was collected in 50 mL polypropylene tubes and, in order to increase the amount of saliva, the patients received a piece of Parafilm® for chewing. Saliva was aliquoted in cryoessay tubes and kept in a freezer at -70°C. Results: VL patients who possessed the IC rK39 test with positive serum showed 58.6% of positivity (n = 17) in saliva (SalPos), while all of the healthy donors (CT) (n = 20) were negative in serum and saliva. The amount of total and specific IgG in the serum of patients with VL was significantly higher than that in the CT group. The specific IgG of the SalPos group was greater than in VL patients with negative saliva (SalNeg), but it was not statistically xv significant. The amount of total or specific IgA was similar in all groups. The amount of specific IgG for Leishmania found in saliva of both the SalPos and SalNeg groups was higher than in the control group, but the group with SalPos saliva presented more specific IgG to Leishmania than the SalNeg group. Among the 86 VL patients, 33 had positive serology for HIV and five tested negative serology, however, they were carriers of the virus and were being treated, totalizing 37 infected individuals. The sensitivity of VL in PCR was of 100%, since this test was considered gold standard in this study. The other tests had sensitivity of 57.14% (n = 49) (bone marrow aspiration culture), 48.71% (n = 78) (marrow aspirate smear analysis), 55.81% (n = 86) and 56 25% (n = 85) for the IC rK39 tests in Orangelife or Kalazar Detect serum, respectively. In the case of using the parasitological test as the gold standard, the sensitivity of serological tests was greater than 82%. It is not clear if HIV infection is able to interfere in the serological tests yet. Conclusions: The rK39 IC tests, with the utilization of serum, have a low sensitivity when applied to patients co-infected with HIV and VL, and the use of saliva for VL diagnosis is limited. / Introdução: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma antropozoonose causada por protozoários do gênero Leishmania, especialmente Leishmania (Leishmania) infantum ou Leishmania (Leishmania) donovani. Está presente em regiões tropicais e subtropicais e é considerada uma doença negligenciada. O diagnóstico preciso da LV é geralmente difícil, principalmente em pacientes coinfectados pelo HIV, porque a LV apresenta formas clínicas atípicas e porque o diagnóstico sorológico se torna pouco confiável. Objetivo: Avaliar a acurácia de Testes Imunocromatográficos rK39 no diagnóstico da LV em soro e saliva de pacientes coinfectados com HIV. Métodos: Pacientes suspeitos de LV foram atendidos no Instituto de Doenças Tropicais Natan Portela - IDTNP, Teresina, Piauí, Brasil, no período de março de 2011 a outubro de 2012. Além do exame clínico, foi realizado o teste IC rK39 em saliva e sangue, aspiração de medula óssea para exames parasitológicos e PCR- RFLP. Como rotina na instituição, pacientes sugestivos de LV também foram investigados para HIV. Foram coletadas amostras de medula óssea para pesquisa de Leishmania em esfregaço, cultura e PCR. Para pesquisa de Leishmania spp. em aspirado de medula óssea, utilizou-se a coloração pelo Panótico (RANYLAB Química Farmacêutica). A leitura das lâminas coradas foi realizada em microscópio óptico com objetiva de imersão, aumento de 1000x. Para realização da cultura de aspirado de medula óssea, o aspirado foi cultivado em 3 mL de meio NNN (McNeal, Novy & Nicolle) e 500 μL de meio Schneider a 26ºC. A pesquisa de formas promastigotas de Leishmania spp. foi realizada a cada sete dias em lâmina – lamínula em microscópio óptico. Foram coletados 5 mL de sangue periférico em tubos Vaccutainer® sem anticoagulante para obtenção do soro. Em seguida, os soros foram aliquotados em tubos de crioensaio e mantidos em freezer a -70ºC. A saliva foi recolhida em tubos de polipropileno de 50 mL e para aumentar a quantidade de saliva, os pacientes receberam um pedaço de Parafilm® para mastigar. A saliva foi aliquotada em tubos de crioensaio e mantidas em freezer a -70ºC. Resultados: Pacientes com LV que possuiam o teste IC rK39 positivo no soro, apresentaram uma positividade de 58,6% (n = 17) na saliva (SalPos), enquanto todos os doadores saudáveis (CT) (n = 20) foram negativos no soro e na saliva. A quantidade de IgG total e específica no soro do paciente com LV foi significativamente mais elevada do que no grupo CT. A IgG xiii específica do grupo SalPos foi maior do que no grupo de pacientes com LV com saliva negativa (SalNeg), mas não foi estatisticamente significativa. A quantidade de IgA total ou específica foi semelhante em todos os grupos. A quantidade de IgG específica para Leishmania observada na saliva de ambos os grupos SalPos e SalNeg foi maior do que no grupo controle, mas o grupo com saliva SalPos apresentou mais IgG específico para Leishmania do que o grupo SalNeg. Dos 86 pacientes com LV, 33 possuíam sorologia positiva para HIV, cinco apresentaram sorologia negativa, porém, eram portadores do vírus e estavam em tratamento, totalizando 37 indivíduos infectados. A sensibilidade para LV na PCR foi de 100%, já que este foi o teste considerado ouro neste estudo. Os demais testes tiveram sensibilidade de 57,14% (n= 49) (cultura de aspirado medular), 48,71% (n = 78) (análise de esfregaço de aspirado medular), 55,81% (n = 86) e 56,25% (n = 85) para os testes IC rK39 no soro Orangelife ou Kalazar Detect respectivamente. No caso do uso do teste parasitológico como padrão ouro, a sensibilidade dos testes sorológicos foi superior a 82%. Ainda não está bem esclarecido se a infecção pelo HIV é capaz de interferir nos testes sorológicos. Conclusões: Os testes IC rK39, com utilização de soro, tem uma baixa sensibilidade quando aplicados a pacientes coinfectados com LV-HIV, e o uso da saliva para o diagnóstico da LV é limitado.

Os flebotomíneos são dípteros hematófagos pertencentes à família Psychodidae e subfamília Phlebotominae. Considerando o processo migratório da doença no Estado de São Paulo e a complexidade da relação parasito/vetor/hospedeiros da Leishmaniose é necessário realizar estudo sobre os aspectos ecológicos e epidemiológicos desta doença. A expansão da Leishmaniose no interior paulista está associada aos processos antrópicos e ao desequilíbrio ambiental. O município de Bom Jesus dos Perdões passa por um crescente processo de urbanização onde não é conhecida a fauna de flebotomíneos, bem como a pesquisa de parasitas do gênero Leishmania nestes vetores. O presente projeto teve por objetivo principal, a Identificação da fauna de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) e detecção molecular de parasitas do gênero Leishmania no Município de Bom Jesus dos perdões, Estado de São Paulo. Os flebotomíneos foram coletados com armadilha do tipo CDC e armadilha de Shannon, em 12 pontos em três diferentes ambientes, sendo áreas de mata, área Periurbana e áreas urbanas. A taxonomia alfa foi baseada na chave dicotômica descrita por Galati (2003) e o nome das espécies foram abreviado segundo Marcondes (2007). Para a pesquisa de parasitas do gênero Leishmania foram utilizados marcadores baseados nos genes SSU rDNA, citocromo e quitinase. No município de Bom Jesus dos Perdões foi registrada uma riqueza de 12 espécies de flebotomíneos distribuídos em duas Subtribos: Subtribo Lutzomyiina com Migonemyia migonei, Pintomyia fischeri, Pintomyia monticola, Pintomyia misionensis, Evandromyia edwardsi e a Subtribo Psychodopygina com Psathyromyia lanei, Psathyromyia sp (série forattiniella), Martinsmyia alphabetica, Psychodopygus arthuri, Psychodopygus lloydi, Psychodopygus ayrozai e Nyssomyia whitmani. A análise molecular baseado no gene de quitinase identificou a espécie Leishmania (L.) infantum chagasi em Pi. fischeri, Mg. migonei e Ma. alphabetica e espécies de Leishmania sp. causadoras da doença na forma tegumentar em Migonemyia migonei, Pintomyia fischeri, Evandromyia edwardsi, Martinsmyia alphabetica, Psychodopygus lloydi, Psychodopygus ayrozai e Nyssomyia whitmani. Os resultados obtidos alertam para o aumento do risco de transmissão das Leishmanioses e aponta para uma maior importância das medidas de vigilância entomológica, da fiscalização do uso e ocupação do solo e de estudos mais detalhados sobre as espécies desses vetores e de sua relação com os reservatórios silvestres ou urbanos e a população vulnerável no município e região / Sand flies are bloodsucking Diptera belonging to the Psychodidae family and subfamily Phlebotominae. Considering the migration process of the disease in the state of São Paulo and the complexity of the relation parasite / vector / Leishmaniasis of hosts is necessary to conduct study on the ecological and epidemiological aspects of this disease. The expansion of Leishmaniasis in the interior is associated with anthropogenic processes and environmental imbalance. The municipality of Bom Jesus of Pardons goes through a growing process of urbanization which is not known to sandfly fauna as well as the search for parasites of the genus Leishmania in these vectors. This project has as main objective the identification of the sand fly fauna (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) and molecular detection of Leishmania species in the Municipality of Bom Jesus of Pardons, State of Sao Paulo. The sandflies were collected with CDC trap type and trap Shannon on 12 points in three different environments, and forested areas, peri-urban area and urban areas. Alpha taxonomy was based on the dichotomous key described by Galati (2003) and the name of the species were abbreviated according to Marcondes (2007). For the research of the genus Leishmania parasites were used based markers in genes SSU rDNA, cytochrome and chitinase. In the city of Bom Jesus of Pardons has recorded a wealth of 12 species of sand flies distributed into two sub-tribes: Subtribe Lutzomyiina with Migonemyia migonei, Pintomyia fischeri, Pintomyia monticola, misionensis Pintomyia, Evandromyia edwardsi and Subtribe Psychodopygina with Psathyromyia lanei, Psathyromyia sp (series forattiniella) alphabetica Martinsmyia, Psychodopygus arthuri, Psychodopygus lloydi, Psychodopygus ayrozai and Nyssomyia whitmani. Molecular analysis based on the chitinase gene identified Leishmania (L.) infantum chagasi Pi. fischeri, Mg. migonei and Ma. alphabetica and species of Leishmania. causing disease in cutaneous leishmaniasis in Migonemyia migonei, Pintomyia fischeri, Evandromyia edwardsi, alphabetica Martinsmyia, Psychodopygus lloydi, Psychodopygus ayrozai and Nyssomyia whitmani. The results warn of the increased risk of transmission of Leishmaniasis and points to greater importance of entomological surveillance measures, surveillance of land use and occupation and more detailed studies of the species of these vectors and their relationship to the reservoirs wild or urban and the vulnerable population in the municipality and region

Made available in DSpace on 2016-08-16T18:18:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE SOFIA SOUSA SALES.pdf: 1314406 bytes, checksum: cf0a23c2cfdc8d768fd9d2a3edfd3773 (MD5) Previous issue date: 2012-08-11 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The aim of this study was to evaluate the protective effect of the flagellar fraction of Leishmania (L) amazonensis and BCG in dogs from endemic area for canine visceral leishmaniasis (CVL). Initially a study was conducted on an epidemiological survey in order to determine the frequency of antibodies against Leishmania in dogs of both sexes, with aged above six months and their correlation with clinical variables such as : hypertrophy of popliteal lymph nodes, skin lesions , onychogryphosis, cachexia and ocular lesions. A total of 341 dogs were used in this study. The serum of these animals was submitted to ELISA/S7 ® test. The serological results shwoed that 173 (50.73%) were positive and 135 (39.59%) were negative for anti-Leishmania antibodies. Among Seropositive animals was observed that 79 (45.66%) presented lymph node hypertrophy, 25 (14.45%) skin lesions, 23 (13.29%) onychogryphosis, 22 (12.72%) cachexia and 11 (6.36%) with the presence of ocular lesions. To evaluate the protective effect of flagellar fraction and BCG were evaluated 90 seronegative animals divided in three groups of 30animals: Group I - animals immunized with flagellar fraction doses of BCG and Group II - animals immunized with BCG and Group III - control animals inoculated with PBS. After immunization the animals remained in the endemic area and they were followed up during 14 months. For immunohistochemical analysis just 06 dogs of each group were selected randomly. However, all dogs were negative for the presence of anti-Leishmania, the immunohistochemical analysis showed amastigotes of Leishmania in the skin of 2 animals, one belonging to the Group II (5 parasites / field) and another belonging to the Group III (18 parasites / field ). The animals of group I (immunized with BCG and flagellar fraction) did not present parasites in the skin. In conclusion this study reinforce the same results obtained in murine model that immunization with flagellar fraction of L. amazonensis in combination with BCG is able to protect dogs analyzed, and the immunohistochemistry was more efficient in the diagnosis of CVL in this study. / O propósito do presente estudo foi avaliar a capacidade protetora da fração flagelar de Leishmania (L) amazonensis sob imunomodulação do BCG em cães provenientes de área endêmica para leishmaniose visceral canina (LVC) por meio da avaliação sorológica, histológica e imunohistoquímica. A priori foi realizado um estudo do tipo inquérito, sobre a ocorrência de anticorpos anti-Leishmania em cães macho e fêmea, com idade igual ou superior a seis meses e sua correlação com as variáveis clínicas: hipertrofia de linfonodos poplíteos, alterações cutâneas, onicogrifose, caquexia e lesões oculares. Os cães foram analisados sorologicamente, através do teste de ELISA/S7®, utilizando-se amostras de sangue periférico num total de 341 amostras analisadas. Desse total, 173 (50,73%) foram soropositivos e 135 (39,59%) foram soronegativos para anticorpos anti-Leishmania. Dos animais com sorologia positiva observou-se 79 (45,66%) com hipertrofia de linfonodos, 25 (14,45%) com alterações cutâneas, 23 (13,29%) com onicogrifose, 22 (12,72%) com caquexia e 11 (6,36%) com presença de lesões oculares. Para avaliar a capacidade protetora da fração flagelar imunomodulada pelo BCG, foram avaliados 90 animais com sorologia negativa para LVC, divididos em três grupos de 30 animais: Grupo I animais imunizados com doses de fração flagelar e BCG; Grupo II animais imunizados apenas com BCG e o Grupo III animais controles inoculados com PBS. Após a imunização os animais foram deixados em área endêmica e acompanhados por 14 meses. Na etapa seguinte, 06 cães de cada grupo, escolhidos aleatoriamente, tiveram sangue e fragmentos de pele da ponta da orelha coletados para posterior realização de sorologia anti-Leishmania, imunohistoquímica, imprinting e histologia. A avaliação dos resultados mostrou que todas as amostras coletadas foram negativas para a presença de anticorpos anti-Leishmania. Já a análise imunohistoquímica evidenciou formas amastigotas de Leishmania sp na pele de 2 animais, um pertencente ao Grupo II (5 parasitos/campo) e outro pertencente ao Grupo III (18 parasitos/campo). Os animais do grupo I (imunizados com fração flagelar e BCG) não apresentaram positividade em nenhuma das análises. A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que a imunização com fração flagelar de L. amazonensis em associação com BCG foi capaz de proteger os cães analisados e que a técnica de imunohistoquímica mostrou-se mais eficiente no diagnóstico da LVC no presente estudo.

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Joao Freitas de Almeida.pdf: 224070 bytes, checksum: e823447b5af3454f3861d310f6e1d693 (MD5) Previous issue date: 2006-05-19 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The Vila Nova town located in the municipality of Raposa, Maranhão, has been reported as endemic area for visceral leishmaniasis. Knowing the importance of dogs as reservoir household, this study aimed to identify the dogs for leishmaniasis infected through test immunoassay (ELISA). Collections of blood of all dogs resident in the locality were held in the period of February to April 2005, giving a sample of 233 dogs. The results of the ELISA showed that 69 dogs showed positive results, corresponding to a seroprevalence of approximately 29.6% of the dogs of the town. / A localidade Vila Nova situada no município de Raposa, Maranhão, tem sido relatada como área endêmica para a leishmaniose visceral. Sabendo da importância dos cães como reservatório doméstico, este trabalho teve como objetivo identificar os cães infectados para leishmaniose por meio de teste imunoenzimático (ELISA). Coletas de sangue de todos os cães domiciliados na localidade foram realizadas no período de fevereiro a abril de 2005, perfazendo uma amostra de 233 cães. Os resultados do ELISA demonstraram que 69 cães apresentaram resultados positivos, correspondendo a uma soroprevalência de aproximadamente 29,6% dos cães da localidade.