Le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) par imatinib est un succès de thérapie ciblée en oncologie. Le principe de cette thérapie est de bloquer les processus biochimiques à l'origine du développement de la maladie, et de permettre à une majorité de patients de réduire leurs risques de progression mais aussi d'éviter des traitements lourds et risqués comme la greffe de cellules souches hématopoïétiques.Cependant, même si l'efficacité de l'imatinib à été prouvée dans un contexte clinique, il n'en demeure pas moins qu'une proportion non négligeable de patients n'obtient par de niveaux de réponse moléculaire jugés optimale. Le but de cette thèse est de tester l'hypothèse d'un lien entre des polymorphismes de gènes impliqués dans l'absorption des médicaments et de leurs métabolisme, et la réponse moléculaire dans la leucémie myéloïde chronique en phase chronique traitée par imatinib.Dans le but d'évaluer la réponse moléculaire des patients, des prélèvements sanguins sont réalisés tout les 3 mois afin de pratiquer le dosage d'un biomarqueur. Ce type particulier de suivi produit des données censurées par intervalles. Comme par ailleurs, les patients demeurent à risque de progression ou sont susceptible d'interrompre leurs traitements pour cause d'intolérance, il est possible que la réponse d'intérêt ne soit plus observable sous le traitement étudié. Les données ainsi produites sont censurées par intervalles dans un contexte de compétition (risques compétitifs).Afin de tenir compte de la nature particulière des données collectées, une méthode basée sur l'imputation multiple est proposée. L'idée est de transformer les données censurées par intervalles en de multiples jeux de données potentiellement censurées à droite et d'utiliser les méthodes disponibles pour l'analyser de ces données. Finalement les résultats sont assemblés en suivant les règles de l'imputation multiple. / Imatinib in the treatment of chronic myeloid leukemia is a success of targeted therapy in oncology. The aim of this therapy is to block the biochemical processes leading to disease development. This strategy results in a reduction of the risk of disease progression and allows patients to avoid extensive and hazardous treatments such as hematologic stem cell transplantation.However, even if imatinib efficacy has been demonstrated in a clinical setting, a significant part of patients do not achieve suitable levels of molecular response. The objective of this thesis, is to test the hypothesis of a correlation between polymorphisms of genes implied in drug absorption an metabolism and the molecular response in chronic myeloid leukemia in chronic phase treated by imatinib.In order to evaluate patients molecular response, blood biomarker assessments are performed every 3 months. This type of follow up produces interval censored data. As patients remain at risk of disease progression, or may interrupt their treatments due to poor tolerance, the response of interest may not be observable in a given setting. This situation produces interval censored competing risks data.To properly handle such data, we propose a multiple imputation based method.The main idea is to convert interval censored data into multiple sets of potentially right censored data that are then analysed using multiple imputation rules.

La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une pathologie clonale de la cellule souche hématopoïétique qui touche principalement les personnes âgées. Le seul traitement curatif de cette maladie est la greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques, souvent difficile à mettre en oeuvre. Les patients qui ne peuvent être greffés et dont la maladie présente des critères de gravité se voient proposer un agent déméthylant de l'ADN. Chez 30 à 40% d'entre eux, ce traitement induit une réponse objective dont le bénéfice en termes de survie n'est pas démontré. Le séquençage de gènes candidats a identifié une trentaine de gènes mutés de façon récurrente. Il s'agit de gènes codant des régulateurs épigénétiques, des facteurs d'épissage, des facteurs de transcription, et des protéines de la signalisation intracellulaire. Cette approche ne donnait qu'une vision partielle des événements génétiques associés à la maladie.Le premier objectif de cette thèse a été de recenser l'ensemble des mutations touchant les régions codantes et non codantes de l'ADN dans les cellules leucémiques des patients.Le séquençage de l'exome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 49 patients. Nos analyses ont montré qu'en moyenne, un patient porte 14 mutations somatiques dans les régions codantes. Nous avons confirmé que les mutations récurrentes les plus fréquentes affectaient les gènes TET2, SRSF2 et ASXL1. Nous avons aussi identifié 8 nouveaux gènes mutés de façon récurrente à une faible fréquence. En moyenne, 3 des 14 mutations affectent des gènes touchés de façon récurrente.Le séquençage du génome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 17 patients. L'analyse réalisée a détecté 475 mutations par patient dans les régions non répétées du génome. Dans l'exome, comme dans le reste du génome, les altérations principales sont des transitions. Deux signatures mutationnelles ont été identifiées et sont observées dans de nombreux cancers, traduisant probablement des altérations de la méthylation des cytosines au cours du vieillissement. Une troisième signature, jamais observée jusqu'alors et de signification indéterminée, a été détectée chez 2 patients.Nous avons alors répété l'analyse de l'exome dans les monocytes triés de 17 patients prélevés de façon séquentielle sur plus de 2 années : 6 n'ont pas été traités et 11 ont été traités par un agent déméthylant, parmi lesquels 6 sont restés stables et 5 ont montré une réponse clinique et biologique objective. L'analyse montre que 1) l'accumulation de mutations est un événement rare ; 2) l'hétérogénéité génétique du clone malade est limitée ; 3) la charge allélique des mutations reste inchangée, même chez les répondeurs ; 4) de nouvelles mutations peuvent apparaître alors que le patient est répondeur.Nous avons alors sélectionné 9 patients, 3 non traités, 3 stables sous traitement sans réponse objective, et 3 répondeurs. Nous avons collecté leurs monocytes avant tout traitement et quelques mois plus tard, alors que 6 d'entre eux étaient traités par un agent déméthylant. Nous avons analysé l'expression des gènes et la méthylation globale de l'ADN à ces deux temps. Chez les patients non traités, nous avons observé une remarquable stabilité de l'expression des gènes et de la méthylation de l'ADN. Chez les patients répondeurs, le traitement induit un changement significatif du niveau d'expression d'environ 500 gènes et la déméthylation d'environ 35,000 régions de l'ADN. Chez les patients stables sous traitement, le traitement induit un changement d'expression d'une soixantaine de gènes et du niveau de méthylation d'une centaine de régions seulement. Ces résultats suggèrent que les agents déméthylants n'affectent l'expression des gènes et la méthylation de l'ADN que chez les répondeurs, fournissant un argument important pour un effet essentiellement épigénétique et très peu cytotoxique de ces médicaments. / Chronic myelomonocytic leukemia is a clonal disorder of the hematopoietic stem cell, affecting mainly the elderly. The only curative therapeutic is allogeneic stem cell transplantation, which is rarely feasible. When transplantation is not an option, patients with a severe disease can be treated with a demethylating agent. Thirty to 40% of these patients show hematological improvement, but it remains unknown if these drugs increase overall survival. Analysis of candidate genes by Sanger sequencing, then by New Generation Sequencing, identified about thirty genes that are frequently mutated. These genes encode epigenetic regulators, splicing factors, transcription factors and cell signalling regulators. However, this approach catched only part of the genetic events that characterize this disease.The first objective of this study was to determine the mutational landscape of CMML cells by analyzing the coding and non coding regions of leukemic cell genome.We first performed whole exome sequencing analysis of leukemic and control cells in 49 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 14 somatic mutations in its coding regions. We confirmed that the most frequent mutations were in TET2, SRSF2 and ASXL1 genes. We identified also recurrent mutations in 8 new genes, these recurrent mutations occurring at a low frequency. In average, 3 out of the 14 mutations identified in each patient affected recurrently mutated genes.Secondly, we performed whole genome sequencing of leukemic and control cells in 17 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 475 somatic mutations in the non repeated regions of the genome. In both the coding and non coding sequences, alterations were observed to be mainly transitions. As a signature of CMML, two mutational processes were identified in all 17 patients and are found in various other cancer types, most likely resulting from the cytosine methylation observed with ageing. A third process, never seen before and without known significance, was also detected in two patients.We collected several samples from 17 patients on a more than two year period: 6 of these patients remained untreated whereas 11 were treated with demethylating agent, among which 6 showed a stable disease and 5 fulfilled criteria of hematological improvement. These sequential analyses showed that 1) the occurence of new mutations is a relatively rare event ; 2) the genetic heterogeneity of the malignant clone is limited ; 3) the mutation allele burden remains unchanged under treatment, whatever the response ; 4) new mutations can appear, even in responding patients.We selected 9 patients, 3 untreated, 3 stable on therapy and 3 responders. We collected monocytes before treatment and a few months later and we analyzed gene expression and DNA methylation in sorted monocytes at these two time points. We did not detect any significant change in gene expression and DNA methylation pattern in untreated patients. In those who responded to treatment, we noticed significant changes in both gene expression, with about 500 deregulated genes, and the DNA methylation pattern, with about 35,000 demethylated regions. In stable patients, the treatment had a limited effect with changes in the expression of about 60 genes, and in the DNA methylation pattern of about 100 regions. These results show that demethylating agents affect gene expression and DNA methylation of responding patients only, suggesting they have mostly an epigenetic effect rather than a cytotoxic one.

Les cellules Natural Killer (NK) représentent une population de cellules innées lymphoïdes aux fonctions anti-infectieuses et antitumorales. Les leucémies aiguës lymphoblastiques pré-B (LAL pré-B) constituent le cancer de l’enfant le plus fréquent et ont été décrites comme résistantes à la cytotoxicité médiée par les NK bien que les bases moléculaires demeurent inconnues.L’objectif de ces travaux a été de caractériser cette résistance. En développant un essai de cytotoxicité par cytométrie en flux et en utilisant des cellules effectrices activées in vitro, nous avons établi la sensibilité retardée des LAL pré-B à la cytotoxicité NK : initialement résistantes après 4h d’incubation, elles sont fortement tuées après 25h.Cette cytotoxicité est contact-dépendante mais ni la voie de l’exocytose des granules cytotoxiques ni celle des récepteurs de mort n’y contribuent. La mort cellulaire des cibles est de profil apoptotique mais indépendante des caspases ; la signalisation mitochondriale l’amplifie partiellement. Interférer avec les dérivés de l’oxygène par un antioxydant diminue la cytotoxicité. Nous montrons que les cellules NK de patients atteints de granulomatose septique chronique liée à l’X présentent un défaut de cette nouvelle cytotoxicité. Nous démontrons l’expression par les NK des composants clefs d’une NADPH oxydase distincte du complexe utilisé par les phagocytes. Nos travaux établissent l’existence d’une voie de cytotoxicité non conventionnelle et en définissent les principaux prérequis moléculaires. / Natural Killer (NK) cells are innate lymphoid cells with anti-infectious and anti-tumoral activities. Among neoplasia, pre-B acute lymphoblastic leukemias (pre-B ALL) represent the most common form of cancer in childhood and were shown to be resistant to NK cell mediated cytotoxicity although the mechanisms explaining this phenomenon are incompletely understood.In the present work, we investigated the relative immune resistance of pediatric pre-B ALL targets to activated NK cells. We developed a flow cytometry based cytotoxicity assay to assess the NK activity and the involvement of long term cytotoxic pathways. Although pre-B ALL blasts were strongly resistant at 4h, we found a considerable delayed NK killing at 25h.Further investigations revealed that cell contact was mandatory for efficient killing but also that neither the granule exocytosis nor the death receptor pathway were involved. Target cell death was caspase independent but mitochondria signaling amplified it. We then showed that NK cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease could not kill efficiently ALL blasts and that NK cells expressed key components of a NADPH oxidase complex that was distinct from the phagocyte type. Our work reveals an uncharacterized effector pathway among cytotoxic lymphocytes and establishes key molecular requirements for this unconventional pathway.

La Nucléophosmine (NPM1) est l’une des protéines les plus fréquemment altérée dans les troubles hématopoïétiques. Sa mutation, au niveau de l’exon 12, est impliquée dans un tiers des leucémies myéloïdes aiguës et constitue l’un des premiers évènements dans la leucémogénèse. Elle est caractérisée par la séquestration aberrante de NPM1 au cytoplasme, on parle alors de NPMc+. NPM1 peut également subir plusieurs translocations menant à la synthèse de protéines de fusion dont NPM-MLF1. Cette dernière est impliquée dans les syndromes myéloprolifératifs et en plus faible proportion dans les leucémies myéloïdes aiguës. Cette translocation reste peu documentée. NPM1 est une protéine multifonctionnelle dont le rôle dans la régulation génique reste à être définie. La littérature fait état de quelques études rapportant que NPM1 influencerait l’expression génique mais aucun mécanisme n’a encore été clairement décrit. Nous proposons donc dans ce projet de doctorat, de définir comment NPM1 régule la transcription et nous déterminerons si la translocation NPM-MLF1 a un effet différent de celui de NPM1. Afin de déterminer de nouveaux partenaires d’interaction, nous avons purifié les complexes protéiques de NPM1 et NPM-MLF1 dans la lignée de cellules hématopoïétique K562. Dans une étude protéomique, nous avons mis en évidence par spectrométrie de masse puis par immunoprécipitation, que NPM1 et NPM-MLF1 interagissent avec les complexes de remodelage de la chromatine NuRD, P/BAF et ISWI. Par Ampli-Sequencing, nous avons identifié des gènes dérégulés par la baisse d’expression de NPM1 et anormalement exprimés chez les patients présentant une leucémie myéloïde aiguë avec mutation NPMc+. Nous avons déterminé par immunoprécipitation de la chromatine que NPM1 et NPM-MLF1 peuvent influencer l’expression de gènes cibles via le recrutement du complexe NuRD au niveau du site d’initiation de la transcription. Le profil des modifications d’histone est également perturbé. Nous montrons ici que NPM1 et NPM-MLF1 sont impliqués à la fois dans la répression et l’activation génique. Dans une seconde partie du projet, nous proposons de déterminer l’importance physiologique de la régulation, par NPM1-NuRD, de l’un des gènes cibles mis en évidence : SPARC. La méthode CRISPR-Cas9 a été utilisée pour générer des clones uniques K562 dont l’expression de SPARC est absente et celle de NPM1 est diminuée. Cette étude démontre que la diminution d’expression de NPM1 synergise avec la perte de SPARC afin d’induire la différenciation érythroïde et réduire l’invasion cellulaire. Nous montrons donc pour la première fois que NPM1 et la translocation NPM-MLF1 peuvent interagir avec des complexes de remodelage de la chromatine et peuvent influencer leur recrutement au niveau de gènes cibles afin de réguler la transcription. Nos résultats suggèrent que NPM1 est un facteur important dans le contrôle de la modification du transcriptome associée à la différenciation des cellules hématopoïétiques. Ce projet apporte donc de nouvel éclairage sur la compréhension des mécanismes associés à la mise en place des leucémies myéloïdes aiguës présentant une mutation NPMc+ ou la translocation NPM-MLF1. / Nucleophosmine (NPM1) is one of the most frequent altered proteins in hematopoietic disorders. NPM1 exon 12 mutation characterizes one third of all acute myeloid leukemia and can be fundamental to leukemogenesis. This mutation is characterized by the aberrant sequestration of NPM1 to the cytoplasm, the mutated protein is then called NPMc+. NPM1 can also undergo several translocations leading to the synthesis of fusion proteins including NPM-MLF1. The latter is involved in myeloproliferative disorders and in a lower proportion in acute myeloid leukemia. Little is known about this translocation. NPM1 is a multifunctional protein reported to influence gene regulation. The function(s) of NPM1 in gene regulation remains to be defined. The aim of this doctoral research project was to define how NPM1 regulates transcription and determine whether the NPM-MLF1 translocation could disrupt gene regulation imposed by NPM1. In order to determine new protein interaction partners, we purified NPM1 and NPM-MLF1 complexes in the K562 hematopoietic cell line. In a proteomic analysis performed by tandem immunoaffinity purifications followed by mass spectrometry and immunoprecipitation, we identified multiple nuclear protein partners of NPM1 and NPM-MLF1. Importantly, we found that NPM1 and NPM-MLF1 can interact with the chromatin remodeling complexes NuRD, P/BAF and ISWI. An analysis made by Ampli-Sequencing, indicated that multiple genes dysregulated by the decrease expression of NPM1 were also reported to be abnormally expressed in acute myeloid leukemia cells characterized by the NPMc + mutation. We demonstrate that not only NPM1 but also NPM-MLF1 can be recruited to NPM1 regulated genes and affect the chromatin recruitment of the NuRD complex. The variation in NuRD recruitment imposed by NPM1 knockdown or NPM-MLF1 expression, is associated to the abnormal transcriptional regulation of the target genes. We show here that NPM1 and NPM-MLF1 are involved in both gene repression and activation. In a second part of the project, we investigated the physiological importance of gene regulation imposed by NPM1-NuRD in these cells. Importance of the genetic link between NPM1 and the target gene SPARC was defined. Using the CRISPR-Cas9 methodology, we generated unique K562 clones whereby SPARC expression is abrogated and NPM1 expression is decreased. The decrease of NPM1 expression synergizes with the loss of SPARC expression to induce erythroid differentiation and reduce cell invasion. The results presented provide the first demonstration that NPM1 and NPM-MLF1 translocation can interact with chromatin remodeling complexes, influence their recruitment to target genes and thereby, influence the expression of specific genes. This project provides new information to understanding mechanisms affected in acute myeloid leukemia characterized by NPMc+ mutation or NPM-MLF1 translocation.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le lymphome avec phase circulante le plus fréquent chez l’adulte dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par une grand hétérogénéité dans son évolution naturelle avec des formes indolentes ne nécessitant jamais de traitement spécifique et des formes agressives requérant une chimiothérapie rapidement après le diagnostic. Dans ce travail de thèse, nous avons posé la question du rôle des anomalies moléculaires et en particulier des gènes des immunoglobulines dans l’histoire naturelle de la maladie, tant au plan mécanistique que pour le pronostic. Nous avons étudié trois remaniements atypiques impliquant un gène des immunoglobulines et un partenaire inconnu dans la LLC/lymphome lymphocytique. Les points de cassure ont pu être identifiés et nous ont permis de mettre en évidence l’implication dans 2 cas d’ARN longs non codants en 17q25 et 8q24. De plus, deux cas ont des points de cassure dans une région chromosomique restreinte (espacés de 200 kb en 17q25). Il pourrait s’agir d’un locus important dans la lymphomagénèse, de même que pour la région 8q24 contenant MYC et de nombreux gènes non codants jusqu’ici peu explorés. Par ailleurs, dans l’ère du séquençage haut débit, de nombreux marqueurs pronostiques moléculaires sont décrits dans la LLC. Nous avons démontré que l’électrophorèse des protéines sériques normale (immunoglobulines polyclonales sans hypogammaglobulinémie) au diagnostic, un marqueur simple et peu couteux, reste dans l’ère du NGS, un marqueur indépendant de bon pronostic dans la LLC. Sa combinaison avec un statut IGHV muté identifie un groupe de patients qui n’auront probablement jamais besoin de traitement spécifique. Ce travail nous a conduit à mettre au point un outil performant de détection des anomalies de nombre de copies par séquençage haut débit. Celui-ci permet la mise en évidence de disomies uniparentales dont la signification pronostique n’est actuellement pas établie dans la LLC. Ces anomalies pourraient être le reflet d’une instabilité chromosomique et il serait intéressant d’étudier leur impact pronostique dans la LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent lymphoma with leukemic phase in the elderly in Western countries. It is characterized by a great heterogeneity in its natural history with indolent forms never requiring any specific treatment and aggressive forms needing chemotherapy rapidly after diagnosis. In this work of thesis, we asked the question of the role of molecular abnormalities, and in particular of the immunoglobulin genes in the natural history of the disease, at mechanistic level and for prognosis. We studied three atypical rearrangements implicating an immunoglobulin gene and an unknown partner in CLL/lymphocytic lymphoma. The breakpoints have been identified and the implication of long non coding RNA was highlighted in two cases in 17q25 and 8q24. Moreover, two cases harboured breakpoints in a restricted chromosomic region (200 kb spaced in 17q25). It could be an important locus in lymphomagenesis, as is 8q24 region containing MYC and numerous other non coding genes poorly characterized by now. Furthermore, in high throughput sequencing (HTS) era, many molecular prognosis markers have been described in CLL. We demonstrated that normal serum protein electrophoresis (polyclonal immunoglobulin without hypogammaglobulinemia) at diagnosis, a simple and unexpensive marker, stays in HTS era an independent good prognosis marker in CLL. Its combination with unmutated IGHV genes status identifies a group of patients who will probably never require any specific treatment. This work led us to develop an efficient tool to detect copy number variations by THS. This tool allows to highlight uniparental disomy whose prognosis signification is not established in CLL. These abnormalities could reflect chromosomal instability and it could be interesting to study their prognosis impact in CLL.

L’expérience d’un cancer à l’enfance peut entraîner différents impacts physiques, neurologiques et émotionnels, autant à court terme qu’à long terme. Les survivants d’une leucémie lymphoblastique aigüe (LLA) sont une population vulnérable à la détresse émotionnelle, qui peut perdurer et même s’aggraver avec le temps. Malheureusement, les outils de repérage de la détresse émotionnelle utilisés en clinique, tel que le Thermomètre de Détresse (TD), génèrent un niveau élevé d’erreurs. L’objectif de cette thèse est d’étudier la détresse émotionnelle des survivants d’une LLA pédiatrique, en étudiant la caractérisation et la détection de cette détresse, ainsi que les facteurs explicatifs de cette détresse. La présente thèse est composée de quatre articles. Le premier article a pour objectif de caractériser un niveau de détresse émotionnelle élevé, mesuré par le Thermomètre de Détresse (TD), au sein de 202 survivants de LLA pédiatrique. Les résultats montrent qu’une cotation élevée au TD est associée à l’affectivité négative chez les enfants et les adultes, et à l’anxiété chez les adultes. Également, un niveau de détresse faible est associé à l’affectivité positive chez les adultes. Après avoir davantage défini les particularités de la détresse émotionnelle des survivants de LLA pédiatrique, nous souhaitions étudier le repérage de cette détresse. Le second article a comme objectif d’identifier une stratégie de repérage de la détresse émotionnelle en deux étapes, en utilisant le TD comme première étape et une question sur les émotions (peur, tristesse, inquiétude, colère, fatigue) comme deuxième étape. L’étude a été effectuée auprès de 255 survivants de LLA pédiatrique. Cette étude montre qu’une stratégie en deux étapes (TD combiné à la question sur la tristesse ou à celle sur l’inquiétude) repère plus efficacement les survivants ne rapportant pas de détresse ainsi que les survivants rapportant une détresse élevée, comparativement à l’utilisation du TD seul au seuil 4, pour le repérage de la détresse anxio-dépressive (dépression et/ou anxiété). Après avoir répondu à l’objectif de détection de la détresse, nous souhaitions étudier les facteurs explicatifs d’une détresse élevée. En nous basant sur les appuis de la littérature, nous souhaitions étudier particulièrement l’association entre les traitements de corticostéroïdes et la détresse émotionnelle. Le troisième article est une revue de littérature qui vise à synthétiser les résultats sur l’association entre la présence d’une détresse émotionnelle élevée rapportée par les patients ou les survivants de LLA pédiatrique, et la dose cumulative de corticostéroïdes reçue durant les traitements. Les résultats de cette étude ne permettent pas d’identifier une association significative entre les différentes dimensions de la détresse émotionnelle (émotions, comportements, neurocognitions, fatigue/sommeil) et la dose cumulative de corticostéroïdes reçue durant les traitements. Toutefois, cette revue de littérature a permis d’identifier des recommandations pour améliorer l’information divulguée dans les études, afin de faciliter la synthèse des résultats de la littérature. Finalement, afin d’étudier de manière empirique les différents facteurs reliés aux traitements de radiothérapie, de chimiothérapie et de corticothérapie, associés à la détresse émotionnelle, nous avons effectué la quatrième étude. Le quatrième article est une étude empirique sur les facteurs explicatifs de la détresse émotionnelle de 212 survivants d’une LLA pédiatrique. Les résultats de cette étude montrent qu’il n’y a pas d’association entre les variables reliées aux traitements de radiothérapie, de chimiothérapie et de corticothérapie, et la détresse anxio-dépressive. La présente thèse a permis d’apporter un éclairage sur la caractérisation et la détection de la détresse émotionnelle des survivants d’une LLA pédiatrique. Les résultats prometteurs de l’efficacité d’une stratégie de repérage de la détresse en deux étapes génèrent des implications cliniques importantes et novatrices pour les cliniques de cancérologie. Des recherches ultérieures sur l’amélioration du repérage de la détresse, ainsi que sur l’identification des facteurs explicatifs de cette détresse, autant chez les patients que chez les survivants des différents types de cancers pédiatriques, sont nécessaires afin de mieux comprendre, prévenir et traiter cette détresse émotionnelle élevée, rapportée par le groupe de survivants les plus vulnérables. / Pediatric cancer is associated with different physical, neurological, and emotional short- and long-term adverse effects. Survivors of childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) are vulnerable to emotional distress, which could persist or increase over time. Unfortunately, the existing routine screening tools of emotional distress, such as the Distress Thermometer (DT) generate high rates of errors. The aim of this thesis is to study emotional distress among childhood ALL survivors. We studied the description and the screening of emotional distress, and the identification of predictive factors of distress. This thesis is composed of four articles. The objective of the first article is to describe the characteristics of a high level of emotional distress measured by the DT, among 202 childhood ALL survivors. The results suggest that a high level of distress on the DT is associated with negative affectivity among children and adults, and with anxiety among adults. Also, a low level of distress is associated with positive affectivity among adults. After defining emotional distress’s characteristics among pediatric ALL survivors, we wanted to study emotional distress’ screening. The objective of the second article is to study the efficacy of a two-step strategy, combining the DT at step one, and one question on emotions (fear, sadness, concerns, anger, fatigue) at step two. The study is conducted among 255 childhood ALL survivors. The results show that a two-step strategy (DT combined with emotional question of sadness or concerns) is more effective than the DT used alone at the cut point 4, to screen mixed anxious-depressive distress (depression and/or anxiety). After responding to the objective of distress’ screening, we wanted to study the predictive factors associated to emotional distress. Based on the literature support, we desired to study the association between corticosteroids ALL treatments and emotional distress. The third article is a literature review. The aim of this review is to synthesize the literature results on the association between presence of elevated emotional distress among childhood ALL patients and survivors, and the cumulative doses of corticosteroids received during ALL treatments. The results do not suggest association between cumulative doses of corticosteroids and any domains of emotional distress (emotions, behaviours, neurocognitions, and fatigue/sleep). However, this review has allowed us to identify recommendations for future studies, to improve the synthesis of research results. Finally, we wanted to empirically study the different treatment related factors (radiotherapy, chemotherapy, corticotherapy) associated to emotional distress. The fourth study is an empirical study on predictive factors of emotional distress among 212 childhood ALL survivors. The results show that there is no association between treatment related variables (radiotherapy, chemotherapy and corticotherapy) and mixed anxious-depressive distress. This thesis has allowed to different contributions on the characterization and the screening of emotional distress among childhood ALL survivors. The results are promising. The efficacy of the screening two-step strategy for emotional distress. These results have significant and innovative clinical implications. Future researches are needed to improve the screening of emotional distress and the identification of predictive factors, both in patients and survivors of the different childhood cancer types. More experimental researches are needed to understand high level of emotional distress among patients and survivors of childhood cancer, and to prevent and treat this distress.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont le cancer le plus fréquent chez l’enfant et dérivent le plus souvent de précurseurs lymphoïdes B. D’importants progrès thérapeutiques ont permis d’améliorer considérablement le pronostic. Néanmoins, 15 à 20 % des enfants rechutent encore. Ces rechutes peuvent survenir de façon isolée ou combinée dans la moelle osseuse, le site primitif des lymphoblastes, et/ou dans des organes extramédullaires tels que le testicule ou le système nerveux central. Notre équipe a montré que la protéine transmembranaire CD9 jouait un rôle majeur dans la migration des blastes dans ces sites et notamment le testicule, par l’activation de la voie RAC1 en réponse à la stimulation des cellules par le CXCL12. Ici, nous avons mis en évidence qu’un faible niveau d’oxygène, caractéristique commune aux niches médullaire et extramédullaires, régulait positivement l’expression de CD9 aux niveaux transcriptionnel et protéique, via la voie majeure de réponse à l’hypoxie, dépendante du facteur de transcription Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a). Nous montrons que HIF1a se fixe directement sur le promoteur de CD9 pour induire sa transcription. Nous montrons aussi que la protéine CD9 est essentielle aux propriétés d’adhérence et de migration des blastes dans des conditions de basse oxygénation, et que son action pourrait s’exercer à travers RAC1 comme en normoxie. Nos résultats dans des expériences de xénogreffe à des souris indiquent que la voie HIF1a favorise la dissémination des blastes, possiblement à travers la régulation qu’elle exerce sur CD9. Ainsi, ce travail contribue à mieux comprendre le rôle de CD9 dans la pathogenèse des LAL de l’enfant. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) are the most frequent cancer in children and derive most often from B-cell precursors. Huge therapeutic improvements have allowed to reach high survival rates near 90% at 10 years from diagnosis. However, 15-20% of children still relapse with a significant risk of death. Relapses can occur in bone marrow and/or extramedullary sites such as testis or central nervous system, usually referred as “sanctuary sites”. Our previous work showed that the transmembrane protein CD9 plays a major role in lymphoblasts migration into these sites, especially in testis, through the activation of RAC1 signaling upon blasts stimulation with C-X-C chemokine ligand 12 (CXCl12). Here, we addressed the question of putative common factors shared by bone marrow and extramedullary niches which could upregulate CD9 expression and function. Consequently, we found that low oxygen levels could actually enhance CD9 expression both at mRNA and protein levels. We further determined that Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a), the master transcription factor involved in hypoxia response, binds directly CD9 promoter to induce its transcription. We also showed that CD9 protein is crucial for leukemic cell adhesion and migration at low oxygen levels, possibly through its action on RAC1 signaling. Mouse xenograft experiments indicate that HIF1a signaling pathway favors ALL cells dissemination, which may involve CD9 as well. The present work increments our understanding of CD9 implication in ALL pathogenesis.

La leucémie myéloïde aigüe (LMA) est la forme de leucémie la plus fréquente chez l’adulte au Canada. Bien que de nombreux réarrangements chromosomiques récurrents aient été identifiés chez les patients LMA, près de la moitié des cas présentent un caryotype normal (LMA-CN). L’étude de la LMA-CN in vitro est rendue difficile par le fait que la survie des cellules primaires de patients est défectueuse sur le long terme et que les lignées cellulaires leucémiques ont un caryotype hautement anormal. En 2009, Munker et son équipe ont établi une nouvelle lignée cellulaire, CG-SH, ayant la particularité d’avoir un caryotype normal. L’objectif principal de ce projet d’étude est de caractériser plus en détail ce nouveau modèle d’étude. Nous avons identifié l’ensemble des variants génétiques présents dans CG-SH grâce au séquençage du génome entier. Les variants susceptibles de participer à la leucémogénèse ont été isolés, tels que des insertions détectées dans EZH2 et GATA2, et de nombreux variants faux-sens détectés dans des gènes pertinents pour la LMA. Nous avons montré que les cellules CG-SH sont sensibles à l’effet prolifératif d’une combinaison de cytokines, qui agissent sur le comportement des cellules en modifiant l’expression des gènes associés à la régulation de la prolifération, de l’apoptose et de la différentiation. De plus, les cytokines diminuent le taux de nécrose des cellules en culture sur le court terme. La présente étude a permis d’approfondir notre connaissance sur les caractéristiques moléculaires de la lignée cellulaire CG-SH, un nouveau modèle d’étude in vitro de la LMA-CN. / Acute myeloid leukemia (AML) is the most frequent form of leukemia in the adult population in Canada. Although many recurrent chromosomal rearrangements have been identified in AML, almost half of all adult patients will present with a normal karyotype (NK-AML). The in vitro study of NK-AML is difficult because the long-term survival of primary patient samples is deficient and AML cell lines have a highly abnormal karyotype. In 2009, Munker and collegues established a new cell line, CG-SH, with the advantage of having a normal karyotype. The main goal of this research project is to further characterize this new model system. We identified all the genetic variants present in the CG-SH cells using whole genome sequencing. We also isolated the variants that are susceptible to participate to leukemogenesis, including the insertions detected in EZH2 and GATA2, and several missense mutations occurring in relevant genes for AML. We found that a combination of cytokines promotes the proliferation of CG-SH cells, and that cytokines act on the cells behavior through expression changes of the genes involved in the regulation of proliferation, apoptosis and differentiation. Moreover, cytokines trigger a decrease of the necrotic rate of CG-SH on the short-term. The current study allowed us to better appreciate molecular characteristics of the CG-SH cell line, a new model to study NK-AML in vitro.

Cette étude s’intéresse au lien entre les dynamiques cérébrales et les capacités cognitives, cette problématique a déjà été explorée auparavant en imagerie cérébrale, notamment à l’aide de tâches effectuées pendant l’imagerie. Cependant la caractérisation de l’activité spontanée a principalement été faite soit avec une faible précision spatiale (capteur EEG/MEG), soit en IRMf qui a une faible résolution temporelle. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’activité spontanée au repos au niveau cortical associée à différents processus cognitifs et leur performance. Le second chapitre cherche à établir les corrélats neuronaux de la performance de la mémoire au repos à l’aide des puissances spectrales localisées au niveau des sources corticales. Le troisième chapitre cherche à répliquer les méthodes utilisées dans l’article 1 avec les mêmes participants, mais dans un autre domaine cognitif afin d’établir les corrélats neuronaux de la fluence verbale ainsi que de discriminer une composante verbale et exécutive. Ces deux composantes ont été mises en évidence en utilisant une factorisation avec un test purement exécutif (Trail making test- condition 4) et un autre purement verbal (richesse du vocabulaire). Dans le quatrième chapitre, nous répliquons encore la méthode de l’article 1 avec les mêmes sujets, mais sur un test d’apprentissage verbal. Lors de l’apprentissage verbal, deux stratégies d’apprentissage (sériel et sémantique) possibles sont utilisées de manière concurrente, nous avons cherché à établir si des différences comportementales se traduisaient par des patrons d’activation différents. Dans le cinquième chapitre, nous avons cherché à établir des différences fonctionnelles entre les survivants de la leucémie et des sujets contrôles, puis à établir un lien entre la neurotoxicité et le déficit cognitif rencontré chez cette population, finalement nous avons établi un modèle intégrant neurotoxicité, performance cognitive et marqueur neurophysiologique fonctionnel cérébral. Cette recherche aura approfondi les connaissances sur l’état de repos et principalement fourni les premiers travaux qui mettent en lien l’activité cérébrale spontanée au repos au niveau des sources corticales avec plusieurs tests neuropsychologiques comportementaux. Les résultats ont amené des patrons d’activation spatio-fréquentielle différents, démontrant des spécificités reliées à certains tests comportementaux ou des traitements de l’information (sériel ou sémantique). Finalement les travaux sur les survivants de la leucémie ont montré que l’état de repos pouvait caractériser le fonctionnement des déficits cognitifs à long terme et être un marqueur de remédiation pour de futurs traitements. / This study is interested in the link between brain dynamics and cognitive abilities. This problem has already been explored before in brain imaging, notably with the help of task performed during imaging. However, the characterization of spontaneous activity has mainly been done either with weak spatial resolution (EEG/MEG sensor) or in fMRI which has a low temporal resolution. The objective of this thesis is to characterize the spontaneous activity at rest at the cortical level associated with different cognitive processes and their performance. The second chapter seeks to establish the neural correlates of resting memory performance using spectral powers localized at cortical sources. The third chapter seeks to replicate the methods used in article 1 with the same participants but in another cognitive domain in order to establish the neural correlates of verbal fluency as well as to discriminate a verbal and an executive component. These two components were highlighted using a factorization with a purely executive test (Trail making test-condition 4) and another purely verbal one (vocabulary richness). In the fourth chapter, we replicate the method of article 1 with the same subjects, but on a verbal learning test. During verbal learning, two possible learning strategies (serial and semantic) are used concurrently, we sought to establish whether behavioural differences translate into different activation patterns. In the fifth chapter, we sought to establish functional differences between leukemia survivors and control subjects, then to search for a link between neurotoxicity and the cognitive deficit encountered in this population; finally we established a model integrating neurotoxicity, cognitive performance and functional neurophysiological brain markers. This research will have deepened the knowledge on the resting state and mainly provided the first works that link the spontaneous brain activity at rest at the level of cortical sources with several behavioural neuropsychological tests. The results led to different spatio-frequential activation patterns, showing specificities related to certain behavioural tests or information processing (serial or semantic). Finally, work on leukemia survivors has shown that resting states could characterize the functioning of long-term cognitive deficits and be a remediation marker for future treatments.

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Elle est la cause principale de mortalité liée au cancer chez les enfants due à un groupe de patient ne répondant pas au traitement. Les patients peuvent aussi souffrir de plusieurs toxicités associées à un traitement intensif de chimiothérapie. Les études en pharmacogénétique de notre groupe ont montré une corrélation tant individuelle que combinée entre les variants génétiques particuliers d’enzymes dépendantes du folate, particulièrement la dihydrofolate réductase (DHFR) ainsi que la thymidylate synthase (TS), principales cibles du méthotrexate (MTX) et le risque élevé de rechute chez les patients atteints de la LAL. En outre, des variations dans le gène ATF5 impliqué dans la régulation de l’asparagine synthetase (ASNS) sont associées à un risque plus élevé de rechute ou à une toxicité ASNase dépendante chez les patients ayant reçu de l’asparaginase d’E.coli (ASNase). Le but principal de mon projet de thèse est de comprendre davantage d’un point de vue fonctionnel, le rôle de variations génétiques dans la réponse thérapeutique chez les patients atteints de la LAL, en se concentrant sur deux composants majeurs du traitement de la LAL soit le MTX ainsi que l’ASNase. Mon objectif spécifique était d’analyser une association trouvée dans des paramètres cliniques par le biais d’essais de prolifération cellulaire de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs, n=93) et d’un modèle murin de xénogreffe de la LAL. Une variation génétique dans le polymorphisme TS (homozygosité de l’allèle de la répétition triple 3R) ainsi que l’haplotype *1b de DHFR (défini par une combinaison particulière d’allèle dérivé de six sites polymorphiques dans le promoteur majeur et mineur de DHFR) et de leurs effets sur la sensibilité au MTX ont été évalués par le biais d’essais de prolifération cellulaire. Des essais in vitro similaires sur la réponse à l’ASNase de E. Coli ont permis d’évaluer l’effet de la variation T1562C de la région 5’UTR de ATF5 ainsi que des haplotypes particuliers du gène ASNS (définis par deux variations génétiques et arbitrairement appelés haplotype *1). Le modèle murin de xénogreffe ont été utilisé pour évaluer l’effet du génotype 3R3R du gène TS. L’analyse de polymorphismes additionnels dans le gène ASNS a révélé une diversification de l’haplotype *1 en 5 sous-types définis par deux polymorphismes (rs10486009 et rs6971012,) et corrélé avec la sensibilité in vitro à l’ASNase et l’un d’eux (rs10486009) semble particulièrement important dans la réduction de la sensibilité in vitro à l’ASNase, pouvant expliquer une sensibilité réduite de l’haplotype *1 dans des paramètres cliniques. Aucune association entre ATF5 T1562C et des essais de prolifération cellulaire en réponse à ASNase de E.Coli n’a été détectée. Nous n’avons pas détecté une association liée au génotype lors d’analyse in vitro de sensibilité au MTX. Par contre, des résultats in vivo issus de modèle murin de xénogreffe ont montré une relation entre le génotype TS 3R/3R et la résistance de manière dose-dépendante au traitement par MTX. Les résultats obtenus ont permis de fournir une explication concernant un haut risque significatif de rechute rencontré chez les patients au génotype TS 3R/3R et suggèrent que ces patients pourraient recevoir une augmentation de leur dose de MTX. À travers ces expériences, nous avons aussi démontré que les modèles murins de xénogreffe peuvent servir comme outil préclinique afin d’explorer l’option d’un traitement individualisé. En conclusion, la connaissance acquise à travers mon projet de thèse a permis de confirmer et/ou d’identifier quelques variants dans la voix d’action du MTX et de l’ASNase qui pourraient faciliter la mise en place de stratégies d’individualisation de la dose, permettant la sélection d’un traitement optimum ou moduler la thérapie basé sur la génétique individuelle. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most frequent malignancy of childhood. It is the principal cause of cancer–related mortality in children due to a persistent group of patients who does not respond to standard anti-cancer treatment. Susceptible patients may also suffer from number of toxicities associated with intensive chemotherapy treatment. Pharmacogenetic studies of our group, showed that particular genetic variants of the folate dependent enzymes, particularly, dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidylate synthase (TS), major targets of methotrexate (MTX), correlate both individually and combined with increased risk of relapse in patients with childhood ALL. Furthermore, variations of ATF5 gene involved in asparagine synthetase (ASNS) regulation and of ASNS gene were associated with higher risk of ALL relapse or with ASNase related toxicity in patients who received E.coli asparaginase (ASNase). The major goal of my doctoral research project was to further understand from the functional point of view the role of genetic variations underlying therapeutic responses of childhood ALL, by focusing on two major components of ALL treatment, MTX and ASNase. My specific goal was to analyze associations found in clinical setting using cellular proliferation assay in lymphoblastoid cell lines (LCLs, n=93) and xenograft mice model of ALL. Genetic variation in TS polymorphism (homozygosity for triple repeat allele, 3R) and of DFHR haplotype *1b (defined by particular allelic combination derived from six polymorphic sites in the major and minor promoter of DHFR), on MTX sensitivity was assessed using cellular proliferation assay. Similar in vitro assay in response to E.coli ASNase was used to access the T1562C variation in the ATF5 5’UTR and particular haplotypes of ASNS gene (defined by two genetic variation and arbitrarily named haplotype *1). Xenograft mouse model was used to access the effect of TS 3R3R genotype. Analysis of additional polymorphisms in ASNS gene revealed diversification of haplotype *1 of ASNS gene in 5 subtypes, two polymorphisms (rs10486009 and rs6971012,) defining particular subtypes correlated with in vitro sensitivity to ASNase and one of them (rs10486009) seems particularly important for reducing sensitivity to ASNase in vitro, possibly providing mechanistic explanation for lower sensitivity of haplotype *1 observed in clinical setting. No association between ATF5 T1562C variation and cellular proliferation assay in response to E.coli ASNase was found. We did not observe genotype-related association when in vitro sensitivity to MTX in LCLs was analyzed. In contrast, in vivo results using xenograft mouse model demonstrated the relationship between the TS 3R/3R genotype and the resistance to MTX treatment in dose-dependent manner. Obtained results provided function explanation for the significantly higher risk of relapse seen in 3R/3R ALL patients and suggest that these patients might benefit from increase dose of MTX. Through these experiments we also showed that xenogeneic mice model can serve as a preclinical tool to explore individualized treatment options. In conclusion, the knowledge acquired through my doctoral work confirmed and/or identified some functional variants in MTX and ASNase action pathway which may facilitate dose individualization strategies, allowing for optimal treatment selection or tailoring childhood ALL therapy based on individual genetics.