Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les antigènes mineurs d'histocompatibilité (AgMis) sont des peptides polymorphiques du soi, présentés par les molécules de classe I et II du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), capables d'induire des réponses immunitaires importantes. En effet, dans un contexte de greffe de moelle osseuse chez des patients leucémiques, nous observons deux réactions immunologiques majeures : la réaction du greffon contre l'hôte (RGH) et l'effet du greffon contre la leucémie (GVL). Ces deux réactions sont dues à une activation des lymphocytes T matures du greffon, capables de reconnaître des AgMis présents sur les organes cibles du patient (RGH) ou uniquement sur les cellules leucémiques de celui-ci (GVL). La RGH est liée à une morbidité importante et sa sévérité peut même causer la mort du patient. Tandis que la RGH est à éviter à tout prix, l'effet GVL est recherché car il permet l'élimination des cellules leucémiques résiduelles du patient. L'élaboration d'une stratégie immunothérapeutique pour combattre la leucémie en favorisant l'effet GVL tout en éliminant la RGH serait donc très intéressante. Dans un tel contexte, les AgMis représentent des cibles de choix. En effet, la distribution tissulaire différentielle des AgMis suggère qu'il serait possible de trouver un AgMi uniquement exprimé sur les cellules hématopoïétiques (normales ou leucémiques) mais absent des organes cibles (tissus épithéliaux) du patient. Ceci nous permettrait de réinfuser des lymphocytes T cytotoxiques (LTCs) du greffon préalablement activés ex vivo contre cet AgMi et d'amener ainsi un effet GVL plus efficace. Malheureusement, le choix de l'AgMi idéal pour remplir ce rôle est plus complexe. Les AgMis exprimés à la surface d'une cellule ne sont pas tous capables d'induire des réponses T cytotoxiques importantes. La reconnaissance des AgMis par les LTCs est influencée par le phénomène encore mal compris d'immunodominance.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La leucémie aigüe lymphoblastique de type B (B-LAL) est la principale cause de mortalité par maladie chez les enfants. Bien que la chimiothérapie moderne puisse guérir la majorité des patients, environ 20 % d'entre eux présentent une réponse inadéquate ou vont rechuter. La stratification des patients en sous-types moléculaires distincts grâce à la cytogénétique, à la biologie moléculaire et au profilage transcriptomique est essentielle pour adapter les thérapies en fonction des risques. Le temps nécessaire à l'analyse traditionnelle des échantillons de tumeurs empêche une intervention rapide au début du traitement. Comme alternative aux biopsies tissulaires conventionnelles, nous proposons que les vésicules extracellulaires (VE), particulièrement les exosomes présents dans le sang périphérique, sont des transporteurs potentiels de biomarqueurs tels que l’ARN. Grâce à l'analyse d'une cohorte de patients représentant deux sous-types moléculaires distincts de la B-LAL, des transcrits d'ARN encapsulés dans les exosomes ont été identifiés comme biomarqueurs non invasifs prometteurs. Ces résultats plaident en faveur d'une détection précoce et d'un suivi continu de la B-LAL de l’enfant à l'aide de biopsies liquides basées sur les exosomes. Néanmoins, le processus de purification des exosomes, long et complexe, nécessite une normalisation et une amélioration afin d'établir une crédibilité dans le suivi clinique de la maladie. Nous avons développé une nouvelle approche de capture magnétique sur une puce microfluidique, basée sur l’assemblage de nanoparticules magnétiques (MNP) en suspension pour une séparation magnétique efficace dans les biofluides. Cette technologie innovante a servi d'élément crucial au sein d'un processeur fluidique, automatisant la séparation des VE du sang total basée sur la taille et l'affinité. Au-delà de la simplification du processus, elle améliore considérablement la reproductibilité et la répétabilité de la purification des exosomes. Cette thèse présente une approche multidisciplinaire pour améliorer le pronostic du cancer. Les résultats offrent un premier aperçu du profil transcriptomique des exosomes dans le sang des patients atteints de B-ALL, révélant des biomarqueurs potentiels spécifiques au sous-type. Le dispositif microfluidique répond à un besoin pressant en permettant une purification efficace des VE à partir du sang total, prometteur pour l'application clinique. / B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) stands as the foremost cause of mortality due to disease in children. While modern chemotherapy can cure a majority of patients, around 20% exhibit inadequate response or are susceptible to relapse. Stratifying patients into distinct molecular subtypes through cytogenetics, molecular biology, and transcriptomic profiling is essential for tailoring risk-oriented therapies. However, the time required for traditional tumor sample analysis hampers swift intervention at the onset of treatment. As an alternative to conventional tissue biopsies, we proposed that extracellular vesicles (EVs), notably exosomes present in peripheral blood, are potential carriers of RNA-based biomarkers of B-ALL. Through analysis of a patient cohort representing two distinct molecular B-ALL subtypes, exosome-encapsulated RNA transcripts emerged as promising non-invasive biomarkers. These findings advocate for the early detection and ongoing monitoring of childhood B-ALL using exosome-based liquid biopsies. Nonetheless, the lengthy and intricate exosome purification process necessitates standardization and enhancement to establish credibility in clinical disease monitoring. We then developed a novel magnetic capture approach on a microfluidic chip, employing suspended magnetic nanoparticle (MNP) assemblies for efficient in-flow magnetic separation in biofluids. This innovative technology served as a crucial element within a fluidic processor, automating the purification of exosomes from whole blood through size- and affinity-based separation. Beyond simplifying the process, it significantly heightens the reproducibility and consistency of exosomes purification. This thesis presents a multifaceted approach to enhance cancer prognosis. The results offer a first insight into the transcriptomic landscape of exosomes in the blood of B-ALL patients, revealing potential subtype-specific biomarkers. The microfluidic device addresses a pressing need by enabling efficient exosome purification from whole blood, holding promise for clinical translation.

La migration des neutrophiles est une étape importante de la réponse de l 'hôte à un pathogène qui requiert l'intervention de différents facteurs chimiotactiques telles les chimiokines. Depuis quelques années, diverses études portant sur la régulation du processus migratoires des leucocytes ont révélé que les protéines anti-microbiennes agissent également en facteurs chimiotactiques. Les protéines SI 00A8 et SI 00A9 sont des protéines anti-microbiennes qui inhibent la liaison des bactéries aux épithéliums et la croissance des pathogènes. Leur présence dans les serums de patients atteints de maladies inflammatoires telles l'arthrite rhumatoïde et la mucoviscidose a suscité l' intérêt de diverses équipes de recherche. L'étude de leurs fonctions pro-inflammatoires par différents modèles murins d'inflammation suggère fortement qu'elles participent au recrutement des neutrophiles au site inflammatoire. Cependant, peu d'études ont porté sur l'importance des protéines S100A8 et SI 00A9 dans le cadre d'une infection. Afin de mieux cerner les rôles des protéines SI 00A8 et SI 00A9, leur importance dans l'infection à S. pneumoniae a été évaluée. L'étude des fonctions des protéines SI 00A8 et SI 00A9 dans les infections à S. pneumoniae a permis de démontrer que les protéines SI 00A8 et SI 00A9 sont également importantes pour le recrutement des neutrophiles et des monocytes en réponse à une infection pulmonaire puisque le pré-traitement des souris infectées avec S. pneumoniae par des anticorps anti-S 1 00A8 et anti-S 1 00A9 neutralisants diminue de 70% et 80% la migration des neutrophiles et des monocytes dans les alvéoles. La présence des protéines SI 00A8 et SI 00A9 a également éte observée dans des maladies non-inflammatoires comme les leucémies myéloïdes chroniques. Pour caractériser plus précisement leurs fonctions, le rôle potentiel des protéines SI 00A8 et SI 00A9 dans l 'hématopoïèse normale et pathologique a été étudié. Les protéines SI 00A8 et SI 00A9 induisent la prolifération des cellules leucémiques mais également des cellules mononuclées normales de la luoelle osseuse. De plus, en combinaison avec d'autres cytokines, elles dirigent également l 'hématopoïèse vers la myélopoïese ce qui suggère que ces protéines sont des facteurs de croissance hématopoïétique. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des rôles joués par les protéines S 100A8 et S 100A9 dans le recrutelnent des neutrophiles et dans le procesus inflamnlatoire et soulignent également une nouvelle fonction des protéines SI 00 dans l 'hématopoïèse. De plus, ils concourent à élucider l'importance des protéines anti-microbiennes dans la réponse innée.

Le cancer est l'une des maladies les plus répandues au Canada étant responsable de plus d'un quart de tous les décès. En effet chaque personne sera un jour ou l'autre touchée par cette maladie, soit personnellement ou par la souffrance d'un proche. Il y a de nombreux types de cancer, mais ils sont tous associés par la prolifération anarchique de cellules anormales dans le corps. Le cancer de la prostate et la leucémie sont deux types de cancer très fréquents dans la population. Le cancer de la prostate est un cancer androgéno-sensible, c'est-à-dire son développement et sa croissance sont stimulés par la liaison des androgènes actifs au récepteur. L'utilisation d'un antiandrogène capable de bloquer cette interaction permet de diminuer la taille du cancer. Cependant, il n'existe présentement aucun antiandrogène capable de lier fortement le récepteur afin de traiter le cancer par sa seule utilisation. Pour cela, plusieurs agents thérapeutiques potentiels ont été synthétisés à l'aide de plusieurs réactions dont une métathèse utilisant le catalyseur de Grubbs. Parmi cet éventail de produits, le meilleur antiandrogène était un noyau 5a-androstane-3a,17P-diol avec, en positition 16a, une chaîne de 3 méthylènes avec un chlorure à son extrémité. Ce type de produit a de plus été modélisé afin de déterminer son interaction avec le récepteur. La leucémie est le type de cancer le plus fréquent chez les enfants, mais peut aussi affecter les adultes. La majorité des traitements présentement utilisés induisent de nombreux effets secondaires pouvant parfois être fatals pour les patients. À l'aide de la chimie combinatoire ou de la chimie en solution, plusieurs librairies de dérivés 2P-amino5a-androstane-3a,17(3-diol ont été synthétisées. L'analyse de l'activité biologique de tout ces composés a permis d'en identifier six ayant une activité antiproliférative sur les cellules leucémiques HL-60 avec des IC50 variant de 0.58 à 6.4 uM. La plupart de ces produits affectent le cycle cellulaire en bloquant les cellules leucémiques dans la phase G[ du cycle, tandis que d'autres induisent aussi la différenciation. De plus, quelques candidats ont démontré une sélectivité pour les cellules cancéreuses puisqu'ils n'ont aucun effet sur les cellules humaines normales.

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Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des proliférations malignes de progéniteurs bloqués lors de la différenciation myéloïde. Le caryotype des blastes leucémiques identifie 3 groupes pronostiques distincts. Parmi les LAM à risque cytogénétique favorable, figurent les leucémies aiguës promyélocytaires (LAP), et celles avec inv(16) ou t(8;21). Les micro-ARNs sont des acteurs clef de l’hématopoïèse et sont aussi impliqués dans la leucémogénèse des LAM. Ils sont très stables dans le sérum et sont utilisés comme biomarqueurs dans les cancers. Le but de cette thèse était d’évaluer si une caractérisation pangénomique des micro-ARNs sériques permettait de distinguer ces 3 types de LAM entre elles ainsi que les LAM avec caryotype normal (NK-AML); d’identifier des micro-ARNs circulants fortement surexprimés dans les NK-AML par rapport à des sujets sains, pour une utilisation ultérieure comme marqueurs de maladie résiduelle; et de mieux préciser le pronostic des NK-AML. Ainsi, nous avons identifié une signature sérique spécifique des LAP liée à une dérégulation des micro-ARNs localisés dans la région DLK1-DIO3 soumise à l’empreinte, en 14q32. Ces micro-ARNs, dont l’origine était le blaste leucémique, étaient corrélés aux facteurs pronostiques connus des LAP. Par ailleurs, deux micro-ARNs, miR-10a-3p et miR-196b-5p, distinguant les NK-AML des LAM avec inv(16) ou t(8 ;21) ont été montré surexprimés dans les NK-LAM avec une mutation de NPM1 et/ou de FLT3-ITD. Enfin l’expression de ces deux micro-ARNs est corrélée à la dérégulation transcriptionnelle et à la méthylation de l’ADN affectant les gènes HOX et TALE. En conclusion, cette étude des micro-ARNs sériques ouvre un nouveau champ d’exploration à visée pronostique dans les LAM. / Acute myeloid leukaemia (AML) is a malignant proliferation of progenitors blocked during myeloid differentiation. The karyotype of the leukemic blasts identified three distinct prognostic groups. Among the favourable risk cytogenetics AML include acute promyelocytic leukaemia (APL), and those with inv (16) or t (8; 21). Micro-RNAs are key players in hematopoiesis and are also involved in leukemogenesis of AML. They are very stable in serum and used as biomarkers in cancers. The aim of this thesis was to evaluate whether a genome-wide characterization of serum micro-RNAs possible to distinguish these three types of AML them as well as AML with normal karyotype (NK-AML); identify micro-RNAs circulating highly overexpressed in NK-AML compared to healthy subjects, for later use as markers of residual disease; and to better define the prognosis of NK-AML. Thus, we have identified a specific serum signing of LAP related to a deregulation of micro-RNAs located in the DLK1-DIO3 under the imprinting, in 14q32. These micro-RNAs whose origin was the leukemic blasts were correlated with known prognosis factors of APL. In addition, two micro-RNAs, miR-10a-3p and miR-196b-5p, distinguishing the NK-AML with inv (16)-AML or t (8; 21)-AML have been shown overexpressed in NK-AML with mutation NPM1 and / or FLT3-ITD. Finally the expression of these two micro-RNAs correlates withtranscriptional deregulation and DNA methylation affectingTALE and HOX genes. In conclusion, this study of serum microRNAs opens a new field of exploration to assess the prognosis in AML.

Les leucémies myéloïdes aiguës (LMA) consistent en un groupe de cancers agressifs causés par une accumulation de mutations génétiques et épigénétiques survenant dans les cellules souches ou progénitrices de la moelle osseuse. Il s’agit d’un groupe de maladies très hétérogène, caractérisé par un grand nombre de combinaisons d’altérations qui perturbent à la fois les voies de signalisation qui y sont exprimées, leur sensibilité aux différents traitements et le pronostic des patients. Le déploiement des technologies de séquençage de nouvelle génération au courant de la dernière décennie a permis l’exploration à une échelle sans précédent du paysage mutationnel et transcriptomique de différents cancers, incluant les LMA. Dans le cadre de nos travaux, nous avons voulu tester l'hypothèse selon laquelle les LMA se déclinent en plusieurs sous-groupes génétiques caractérisés chacun par des mutations distinctes et une expression génique dérégulée, ainsi qu’une réponse différentielle à des molécules qui pourraient représenter de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons testé cette hypothèse au sein de la cohorte Leucegene, qui comprend un grand nombre de LMA primaires analysées par le séquençage du transcriptome, et nous avons analysé les différences entre les différents sous-groupes en les analysant un à la fois. Cette étude des différents sous-groupes nous a permis de disséquer le profil génomique, transcriptomique et les sensibilités aux petites molécules de sept sous-groupes génétiques, représentant environ la moitié des cas de LMA de l’adulte. Notre approche a permis de découvrir plusieurs nouvelles mutations spécifiques aux différents sous-groupes, dont certaines ont été validées dans des cohortes indépendantes. Nous avons également confirmé que les gènes différentiellement exprimés dans les sous-groupes sont plus informatifs que les signatures d'expression non supervisées pour identifier les biomarqueurs de la maladie. Nous avons ainsi identifié dans la majorité des sous-groupes des gènes représentant un biomarqueur d'intérêt, ayant une pertinence fonctionnelle ou pronostique. Ces données ont également mené à des criblages chimiques ciblés qui ont identifié de nouvelles vulnérabilités dépendant du contexte génétique. Au-delà de ces observations, nos travaux pourraient avoir une portée translationnelle tandis que le séquençage de nouvelle génération est de plus en plus utilisé en clinique. La combinaison avec d’autres modalités de séquençage et l’incorporation de technologies émergentes aideront à poursuivre la dissection génomique, transcriptomique et chimique de la LMA et l’approche utilisée pourra même éventuellement s’appliquer à d’autres types de cancers. / Acute myeloid leukemias (AML) are a group of cancers caused by an accumulation of genetic and epigenetic mutations occurring in the stem or progenitor cells of the bone marrow. They represent a very heterogeneous group of diseases, characterized by a large number of combinations of alterations which disrupt to varying degrees key networks in these cells, their sensitivity to treatments and the prognosis of the patients. The deployment of next-generation sequencing technologies over the past decade has enabled exploration on an unprecedented scale of the mutational and transcriptomic landscape of various cancers, including AML. As part of our work, we tested the hypothesis according to which AMLs comprise several genetic subgroups, each characterized by distinct mutations and deregulated gene expression profiles, as well as a differential response to molecules that could represent novel therapies. We tested this hypothesis in the Leucegene cohort, which includes a large number of primary AMLs analyzed by transcriptome sequencing, which we explored one subgroup after the other, dissecting the genomic, transcriptomic or small molecule sensitivities profile of seven AML subgroups representing approximately half of adult AML cases. Our approach has allowed us to discover several new mutations specific to different subgroups, some of which have been validated in independent cohorts. We also confirmed that genes differentially expressed in subgroups are more informative than unsupervised expression signatures, and we identified genes representing potential biomarkers, or having a functional or prognostic relevance in the majority of subgroups. Generated data also led to targeted chemical screens performed on primary AML cells, which identified new context-dependent vulnerabilities. Beyond these observations, our work could have a translational scope while next-generation sequencing is paving its way in the clinic. The combination with other Omics and the incorporation of emerging technologies will help to further the multi-dimensional dissection of these groups and additional ones, as the presented approach could be applied to additional disease subsets and cancer types.

L’analyse des anomalies génomiques récurrentes est importante pour établir le diagnostic, le pronostic et pour orienter la thérapie des leucémies aiguës pédiatriques. L’objectif de notre étude est d’élaborer une stratégie optimale pour détecter les anomalies chromosomiques dans les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) et myéloïdes (LAM) des enfants. Pour ce faire, nous avons caractérisé au caryotype, avec des panels d’hybridation in situ en fluorescence (FISH), par RT-PCR et par l’index d’ADN 253 leucémies de novo reçues au CHU Sainte-Justine entre 2005 et 2011 (186 LAL-B, 27 LAL-T et 40 LAM). Nous avons réussi à optimiser la détection des anomalies chromosomiques dans les trois types de leucémies, avec des fréquences de 93,5% dans les LAL-B (174/186), 66,7% dans les LAL-T (18/27) et 90% dans les LAM (36/40). Nos résultats suggèrent d’utiliser plusieurs tests génétiques concomitants afin d’optimiser la détection des anomalies génomiques dans les LAL et les LAM de novo pédiatriques. / Analysis of recurrent genomic abnormalities is important for the diagnosis, prognosis and therapeutic choices in paediatric acute leukemia. The aim of our study is to establish a strategy optimizing the detection of cytogenetic abnormalities in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML). To do so, we have characterized childhood AML and ALL cases received in cytogenetic laboratory of CHU Sainte-Justine (Montreal, Canada) between 2005 and 2011. Overall, 253 de novo cases have been analyzed (186 B-ALL, 27 T-ALL and 40 AML) by karyotyping, fluorescence in situ hybridization (FISH) panels, RT-PCR and DNA index. Chromosomal abnormalities detection rates achieved 93,5% in B-ALL (174/186), 66,7% in T-ALL (18/27) and 90% in AML (36/40). Our results suggest the analysis of both molecular and cytogenetic tests to optimize the detection of genomic abnormalities in new cases of childhood AML and ALL.

L’importance des modificateurs de la chromatine dans la régulation de l’hématopoïèse et des hémopathies malignes est illustrée par l’histone méthyltransférase Mixed-Lineage Leukemia (MLL) qui est essentielle au maintien des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et dont le gène correspondant, MLL, est réarrangé dans plus de 70% des leucémies du nourrisson. Les histones déméthylases (HDM), récemment découvertes, sont aussi impliquées dans le destin des CSH et des hémopathies malignes. Le but de ce projet est d’étudier l’expression des HDM dans les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques afin d’identifier de potentiels régulateurs de leur destin. Nous avons réalisé un profil d'expression génique des HDM par qRT-PCR et par séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans des cellules de sang de cordon (cellules CD34+ enrichies en CSH et cellules différenciées) et des cellules de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec réarrangement MLL. Les deux techniques montrent une expression différentielle des HDM entre les populations cellulaires. KDM5B et KDM1A sont surexprimés dans les cellules CD34+ par rapport aux cellules différenciées. De plus, KDM4A et PADI2 sont surexprimés dans les cellules leucémiques par rapport aux cellules normales. Des études fonctionnelles permettront de déterminer si la modulation de ces candidats peut être utilisée dans des stratégies d’expansion des CSH, ou comme cible thérapeutique anti-leucémique. Nous avons aussi développé et validé un nouveau test diagnostique pour détecter les mutations de GATA2 qui code pour un facteur de transcription clé de l’hématopoïèse impliqué dans les LAM. Ces travaux soulignent l’importance des facteurs nucléaires dans la régulation de l’hématopoïèse normale et leucémique. / The importance of chromatin modifiers in regulation of hematopoiesis and hematologic malignancies is illustrated by the Mixed-Lineage Leukemia (MLL) histone methyltransferase, which is essential to maintain hematopoietic stem cells (HSC) and whose corresponding gene, MLL, is rearranged in over 70% of infant leukemia. The recently discovered histone demethylases (HDM) are also involved in HSC fate and in hematologic malignancies. The purpose of this project is to study the expression of HDM in normal and leukemic hematopoietic cells to identify potential regulators of their fate. We performed a comprehensive gene expression profile of HDM by qRTPCR and transcriptome sequencing (RNA-seq) in cord blood cells (CD34+ cells enriched in HSC and differentiated cells) and in acute myeloid leukemia (AML) cells with MLL rearrangement. Both techniques revealed differential expression of HDM between these cell populations. KDM5B and KDM1A are overexpressed in CD34+ cells compared to differentiated cells. Moreover, KDM4A and PADI2 are overexpressed in leukemic cells compared to normal cells. Functional studies will determine whether modulation of these candidates can be used in HSC expansion strategies or as anti-leukemic drug target. We have also developed and validated a new diagnostic test to detect mutations of GATA2, a gene encoding a key transcription factor involved in hematopoiesis and in AML. This work highlights the importance of nuclear factors in the regulation of normal and leukemic hematopoiesis.