La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Plusieurs réarrangements chromosomiques ont été associés à cette maladie, dont la translocation t(12;21), qui est observée dans 25% des cas de LAL de type pré-B. Cette translocation engendre l’expression de la protéine de fusion ETV6-AML1. Toutefois, celle-ci n’est pas suffisante pour initier seule une leucémie, ce qui suggère que des mutations additionnelles sont nécessaires à la transformation oncogénique. Or, on observe que l’allèle non-réarrangé d’ETV6 est perdu dans 75% des cas de t(12;21). Cette délétion entraîne l’inactivation complète du facteur de transcription ETV6 et l’abolition de sa fonction biologique. Puisqu’ETV6 semble jouer un rôle de suppresseur de tumeurs, nous croyons que son inactivation favoriserait le développement de la leucémie via la dérégulation de ses gènes cibles. Ce projet visait donc à identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, afin d’élucider son implication dans la leucémie. Une expérience de RNA-Seq a permis d’identifier plus de 200 gènes dont l’expression est corrélée avec celle d’ETV6 dans des cellules souches hématopoïétiques CD34+. Parmi ceux-ci, plusieurs gènes sont impliqués dans la réponse immunitaire et inflammatoire, la migration cellulaire, l’homéostasie ionique et la signalisation intracellulaire. Nous avons également mis en place une approche d’immunoprécipitation de la chromatine afin d’identifier les régions auxquelles le facteur de transcription ETV6 peut se lier. À l’aide de cette méthode, nous avons démontré une interaction entre ETV6 et SLCO2B1, un gène dont l’expression est également co-régulée avec ETV6. Finalement, notre étude suggère qu’ETV6 contribuerait à la leucémogenèse en dérégulant l’expression de certains gènes ayant des propriétés oncogéniques. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common childhood cancer. Many chromosomal rearrangements have been identified in leukemia, including the translocation t(12;21), which is observed in approximately 25% of children diagnosed with pre-B ALL. This translocation results in the expression of the ETV6-AML1 chimera. However, the fusion protein ETV6-AML1 is not sufficient to initiate leukemia by itself, suggesting that additional mutations are required to promote oncogenic transformation. Accordingly, the expression of the non-rearranged ETV6 allele is lost in 75% of the t(12;21) cases. This deletion leads to the complete inactivation of ETV6 transcription factor and the abolition of its biological function. Because ETV6 seems to be a tumor suppressor, we believe that its inactivation could promote the development of leukemia through the deregulation of its downstream target genes. This project aimed to identify new transcriptional targets of ETV6, in order to elucidate its role in leukemogenesis. A RNA-Seq experiment has led to the identification of more than 200 genes whose expression is correlated with ETV6 mRNA levels in CD34 + hematopoietic stem cells. Among these, several genes are involved in immune and inflammatory responses, cell migration, ion homeostasis and intracellular signaling. We also implemented a chromatin immunoprecipitation approach to identify the binding sites of ETV6. This approach confirmed an interaction between ETV6 and SLCO2B1 gene, whose expression is also co-regulated with ETV6. This study suggests that ETV6 may contribute to leukemogenesis by deregulating the expression levels of several oncogenes.

4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqué dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protéine adaptatrice qui est recrutée par 4-1BB et autres TNFRs et est caractérisée par une expression très restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules épithéliales. TRAF1 est nécessaire pour l’expansion et la survie des cellules T mémoire en présence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk impliquée dans la régulation de la molécule pro-apoptotique Bim. Suite à l’activation du récepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqués dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. L’activation et la régulation de TRAF1 et Bim ont un rôle important dans la survie des cellules T CD8 mémoires. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratégie, nous avons identifié que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recruté dans le complexe de signalisation 4-1BB de manière TRAF1 dépendante. Une caractérisation plus poussée de l’interaction entre TRAF1 et LSP1 a montré que LSP1 lie la région unique N-terminal de TRAF1 de façon indépendante de la région conservée C-terminal. À l’instar des cellules T déficientes en TRAF1, les cellules T déficientes en LSP1 ne sont pas capables d’activer ERK en aval de 4-1BB et par conséquent ne peuvent pas réguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB dans le but d’activer ERK et réguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littérature, le récepteur 4-1BB n’est pas exprimé à la surface des cellules B murines, mais le récepteur 4-1BB favorise la prolifération et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'étudier l'expression du récepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modèle murin et de prédire la réponse clinique à la manipulation de 4-1BB. En utilisant différentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifié que le récepteur 4-1BB est exprimé à la surface des cellules B de souris suite à une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractérisation plus poussée a montré que le récepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manière dépendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a démontré que la stimulation avec le LPS induit l’expression du récepteur 4-1BB à la surface des cellules B murines, menant ainsi à l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manière similaire aux cellules T. Les cellules B déficientes en TRAF1 et les cellules B déficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau d’expression du récepteur significativement diminué comparé aux cellules B d’une souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont nécessaires pour une expression maximale du récepteur 4-1BB à la surface cellulaire de cellules B murines et coopèrent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines. / 4-1BB (CD137) is a member of the TNFR superfamily, which is involved in the transmission of survival signals in lymphocytes. TRAF1 is an adapter protein that is recruited by 4-1BB and other TNFRs and is characterized by a very restricted expression in lymphocytes, dendritic cells and some epithelial cells. TRAF1 is necessary for the expansion and survival of memory T cells in the presence of anti-4-1BB agonist in vivo. Also, TRAF1 is required downstream of 4-1BB to activate (phosphorylate) the MAP kinase ERK involved in the regulation of the proapoptotic molecule Bim. Upon activation of 4-1BB, TRAF1 and ERK are involved in the phosphorylation of Bim and modulation of its expression. The activation and regulation of TRAF1 and Bim have an important role in the survival of CD8 memory T cells. In this study, we used a proteomic approach in order to identify new TRAF1 binding partners. Using this strategy, we have identified that LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) is recruited to the 4-1BB signaling complex in a TRAF1-dependent manner. It has been shown that LSP1 is a target protein for signaling ERK / MAP kinase. Further characterization of the interaction between TRAF1 and LSP1 has shown that LSP1 binds the N-terminal unique region independently of the conserved C-terminal of TRAF1. Like the T cells deficient in TRAF1, T cells deficient in LSP1 are not capable of activating ERK downstream of 4-1BB and therefore cannot regulate Bim levels in T cells. Thus, TRAF1 and LSP1 cooperate downstream of 4-1BB in order to activate ERK and regulate Bim levels in murine CD8 T cells. According to the literature, the 4-1BB receptor is not expressed on the surface of murine CD19+ B cells, but 4-1BB activation promotes the proliferation and survival of human CD19+B cells. However, it is important to study the expression of 4-1BB receptor in murine B cells to have a murine model and predict the clinical response to the manipulation of 4-1BB. Using different stimulation of primary murine CD19+B cells, we have found that the 4-1BB receptor is expressed on the surface of murine B cells in response to LPS (lipopolysaccharide) stimulation. Further characterization showed that the 4-1BB was induced in murine CD19+B cells in a TLR4-dependent manner (Toll like Receptor 4). Collectively, our work has shown that the stimulation with LPS induces the expression of 4-1BB on the surface of murine B cells leading to the induction of TRAF1. Also, TRAF1 and LSP1 cooperate downstream of 4-1BB to activate the signaling of the Map kinase ERK in murine B cells similarly to T cells. Similarly, as for the T cells, TRAF1-/- B cells or LSP1-/- B cells are not able to activate the ERK pathway downstream of 4-1BB. In addition, the B cells deficient in either TRAF1 or LSP1 show a level of expression of the 4-1BB receptor significantly decreased compared to B cells from a WT mouse. Thus, TRAF1 and LSP1 are required for maximal expression of the 4-1BB receptor on the cell surface of murine B cells and cooperate downstream of 4-1BB to activate the ERK cascade in the murine B cells.

L’existance de cellules souches leucémiques (CSL) dans la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) prédit que que seule la destruction des CSL conduirait à une guérison. Une proportion importante de patients atteints de LMC développe une résistance aux drogues, environ ~ 30% des cas, Les mécanismes de résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) dans la leucémie myéloïde chronique (LMC) restent souvent obscures. Les cellules souches leucémiques de la LMC pourraient rester viables et en repos, malgré la présence de facteurs de croissance ou de médicaments qui semblent les protéger de l'apoptose. Nous avons montré dans la première parti de cette étude que certains transporteurs telles ABCG2, hOCT-1 pourraient jouer un rôle avec le micro environnement dans la résistance des lignées LMC en adhésion au stoma médullaire. De plus, dans deuxième parti nous avons montré que le gène TWIST-1 (est un acteur clé de l'embryogenèse) est déréglementé dans les cellules de LMC innée des résistants à l'imatinib, et que la sur-expression de l’oncogène TWIST-1 pourrait représenter un nouveau facteur clé de pronostiques potentiellement utiles pour améliorer la guérison de LMC aux TKI. De plus, nous avons pu également montrer que le gène TP73 est impliqué dans la résistance des CSL de LMC. Ce gène pourrait être un facteur prédictif pour identifier une résistance potentielle des patients de LMC au moment du diagnostic. Nous avons montré également que ce gène est régulé par le micro-environnement. Nous avons montrés une sur-expression des isoformes tronquées dans les lignées LMC avec l’adhésion au stroma. Les résultats suggèrent que les molécules intrinsèques comme TWIST-1, les transporteurs et les isoformes de p73 sont dérégulées dans les CSL par des mécanismes extrinsèques qui interviennent avec le micro environnement leucémique par le mécanisme d’adhésion dans le phénomène de résistance aux traitements. Ce mécanisme spécial de résistance due à la conservation de ces CSL dans l’état immature en adhésion avec son micro environnement. / The existence of Leukemia stem cells (CSL) in chronic myelogenous leukemia (CML) predicts that only the destruction of CSL lead to a cure. A significant proportion of CML patients develop resistance to drugs, ~ 30% cases, mechanisms of resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKI) in chronic myeloid leukemia (CML) often remain obscure. Leukemic stem cells of CML could remain viable and quiet, despite the presence of growth factors or drugs that seem to protect them from apoptosis. We have shown in the first part of this study that some carriers such as ABCG2, hOCT could to be play a role with the microenvironment in the resistance among CML adhesion of stoma Bone marrow. Furthermore, in the second part we showed that the gene TWIST-1 (is a key player of the embryogenesis) is deregulated in cells of CML innately resistant to imatinib, and that overexpression of the oncogene TWIST-1 could represent a new prognostic factor key potentially useful for improving the querison CML to TKI. In addition, we also could show that the TP73 gene is involved in the resistance of CSL CML. This gene could be a predictor to identify potential resistance of CML patients at diagnosis. We have also shown that this gene is regulated by the microenvironment. We have shown an overexpression of truncated isoforms in CML cell lines with the accession to the stroma. The results suggest that intrinsic molecules such as TWIST-1 carriers and p73 isoforms are deregulated in CSL by extrinsic mechanisms involved with the leukemia microenvironment by the mechanism for participation in the phenomenon of drug resistance. This mechanism with its microenvironment.

Objectif : Ce travail s’inscrit dans le cadre d’une recherche étiologique sur les leucémies aigues (LA) de l’enfant, pathologies dont les facteurs de risque sont peu connus. Plusieurs hypothèses ont été testées : 1) le rôle protecteur d’une supplémentation maternelle en acide folique avant et pendant la grossesse et l’investigation par une approche gène-candidat du rôle de polymorphismes communs rs1801133 et 1801131 de MTHFR et rs1801394 et rs1532268 de MTRR supposés modifier le métabolisme des folates, 2) l’association entre la profession et des expositions professionnelles maternelles lors de la grossesse, 3) l’existence d’un lien positif avec l’exposition des enfants au trafic routier. Matériel et méthodes : Les données analysées proviennent d’une étude cas-témoins française, ESCALE, basée sur le Registre National des Hémopathies malignes de l’Enfant et réalisée en population générale sur la période 2003-2004. L’échantillon comportait 648 cas de leucémie aiguë lymphoblastique [LAL], 116 cas de leucémie aiguë non lymphoblastique [LANL], et 1681 témoins de moins de 15 ans. L’échantillonnage a été stratifié sur l’âge et le sexe. Les données ont été recueillies auprès des mères à l’aide d’un questionnaire téléphonique standardisé, identique pour les cas et les témoins. Les génotypes ont été obtenus par génotypage à haut débit, pangénomique pour les cas et à façon pour les témoins, et par imputation pour les polymorphismes non génotypés. Le géocodage des adresses et des indicateurs dérivés de données d’émission de trafic ont permis d’estimer l’exposition des enfants au trafic routier. Les odds ratios (OR) ont été estimés à l’aide de modèles de régression logistique non conditionnelle, incluant les facteurs de confusion potentiels. Résultats : Le risque de LA était significativement inversement associé à une supplémentation maternelle en acide folique avant ou pendant la grossesse (OR=0.4 [0.3-0.6]). Aucun des polymorphismes génétiques de MTHFR et de MTRR n’était associé au risque de LA. Cependant, le fait d’être à la fois porteur homozygote des allèles variants de l’un des polymorphismes de MTHFR, et porteur de deux allèles variants des polymorphismes de MTRR était positivement associé au risque de LA (OR=1.6 [0.9-3.1]). Nous n’observions pas d’interaction entre MTHFR, MTRR et une supplémentation maternelle en acide folique. Des associations positives et significatives on été mises en évidence entre le risque de LA et des expositions auto-déclarées professionnelles maternelles pendant la grossesse, aux teintures de cheveux (OR=3.0 [1.7-5.2]), à des peintures ou vernis et/ou colles (OR=1.5 [1.1-2.2]), et à des rayonnements ionisants (OR=2.4 [1.3-4.6]). Cependant, ces associations étaient limitées aux fréquences d’exposition de moins d’1 heure par semaine et peuvent refléter une sur-déclaration chez les cas. L’exposition maternelle professionnelle aux pesticides n’était pas associée aux LA dans notre étude.Les LA étaient significativement associées à des concentrations élevées de NO2 de fond liées au trafic estimées au lieu de résidence (OR=1.2 [1.0-1.5]) et avec la présence de routes à fort trafic dans un rayon de 500 m centré sur ce lieu (OR=2.0 [1.0-3.6]). Nous observions une association significative entre les LA et une densité élevée de routes à fort trafic dans un rayon de 500 m (OR=2.2 [1.1-4.2]), avec une tendance linéaire positive significative de l’association des LAL avec la longueur totale de routes à fort trafic dans un rayon de 500 m.Conclusion : Cette thèse apporte des arguments en faveur du rôle protecteur d’une supplémentation maternelle périconceptionnelle en acide folique. Elle suggère également un rôle des polymorphismes de MTHFR et MTRR dans le risque des LA, sans interaction toutefois avec la supplémentation. Enfin, elle renforce l’hypothèse que vivre près de routes à fort trafic pourrait augmenter le risque de LA. / Objectives: This work investigated three hypotheses related to the etiology of childhood acute leukemia (AL):1) maternal folic acid supplementation before or during pregnancy reduces AL risk, accounting for the SNPs rs1801133 (C677T) and rs1801131 (A1298C) in MTHFR and rs1801394 (A66G) and rs1532268 (C524T) in MTRR, assumed to modify folate metabolism, 2) maternal occupation and occupational exposure during pregnancy may be link to LA 3) traffic is a source of environmental exposures, including benzene, which may be related to childhood leukemia. Methods: The data were obtained from the national registry-based case-control study ESCALE, carried out in France in 2003-2004. The ESCALE study included 764 cases and 1681 controls less than 15 years old and the controls were frequency matched with the cases on age and gender. The data were collected by a standardized telephone interview of the mothers. Various indicators of exposure to traffic and pollution were determined using the geocoded addresses at the time of diagnosis for the cases and of interview for the controls. The genotypes were obtained using high-throughput platforms and imputation for untyped polymorphisms. CITP-68 classification was used to classify maternal occupation during pregnancy. Indicators of the distance from, and density of, main roads and background traffic NO2 concentrations data were used. Odds ratio (OR) were estimated using unconditional regression models adjusted for potential confounders. Results: AL was significantly inversely associated with maternal folic acid supplementation before and during pregnancy (OR=0.4 [0.3–0.6]). MTHFR and MTRR genetic polymorphisms were not associated with AL. However, AL was positively associated with homozygosity for any of the MTHFR polymorphisms and carriership of both MTRR variant alleles (OR=1.6 [0.9–3.1]). No interaction was observed between MTHFR, MTRR, and maternal folate supplementation. Significant positive associations were observed between childhood AL and self-reported maternal occupational exposures during pregnancy to hair dye (OR=3.0 [1.7-5.2]), to paints or polishs and/or glues (OR=1.5 [1.1-2.2]), and to ionising radiations (OR=2.4 [1.3-4.6]). However, these associations were limited to exposure frequencies of less than 1 hour by week. Maternal occupational exposure to pesticides during pregnancy was not related to AL. AL was significantly associated with high estimates of traffic NO2 concentration at the place of residence(OR=1.2 [1.0-1.5]) and with the presence of a heavy-traffic road within 500 meters compared to the absence of a heavy-traffic road in the same area (OR=2.0 [1.0-3.6]). There was a significant association between AL and a high density of heavy-traffic roads within 500 meters in comparison to the reference category with no heavy-traffic road within 500 meters (OR=2.2 [1.1-4.2]), with a significant positive linear trend of the association of AL with the total length of heavy-traffic road within 500m. Conclusion: The study findings support the hypothesis that maternal folic acid supplementation may reduce the risk of childhood AL. The findings also suggest that the homozygous genotype for any of the MTHFR variants and carrying both MTRR variants could be a risk factor for AL. Finally, the results support the hypothesis that living close to heavy-traffic roads may increase the risk of childhood leukemia.

Le but de cette thèse était d’analyser les associations entre plusieurs facteurs environnementaux (consommations maternelles de tabac, d’alcool et de boissons caféinées pendant la grossesse) et médicaux (antécédents d’asthme ou d’eczéma) et les leucémies aiguës de l’enfant, et d’étudier des polymorphismes génétiques susceptibles de modifier ces associations. Les analyses ont été réalisées à partir de l’étude cas-témoins nationale ESCALE réalisée en population générale en 2003 et 2004. Les données sur les antécédents médicaux et les consommations maternelles pendant la grossesse ont été recueillies au cours d’un entretien téléphonique standardisé des mères. Les polymorphismes génétiques d’intérêt ont été sélectionnés suivant une approche candidate sur leur fonctionnalité, dans des gènes impliqués dans le métabolisme du tabac (CYP1A1*2, CYP2E1*5, NQO1*2, EPHX1 et NAT2*5), de l’alcool (CYP2E1*5, ADH1C*2) et de la caféine (NAT2*5), et dans l’allergie (IL4, IL4R, IL10 et IL13). Les données génétiques ont été obtenues à partir de prélèvements de sang chez les cas et de salive chez les témoins, par génotypage de 370 000 SNPs chez les cas et sur puce à façon de 4 500 SNPs chez les témoins, complété par des imputations génotypiques lorsque les polymorphismes candidats n’étaient pas disponibles au génotypage. Au total, les données étaient disponibles pour 493 cas de leucémie aiguë et 442 témoins d’origine européenne.La consommation maternelle de café pendant la grossesse était positivement associée aux leucémies aiguës de l’enfant dans cette étude. Aucune association significative n’était observée avec le tabagisme maternel ou la consommation d’alcool pendant la grossesse. La présence de deux allèles NAT2*5 était associée aux leucémies aiguës lymphoblastiques (Odds Ratio OR=1.9 [1.3-2.7]), mais les analyses ne montraient pas d’association avec les autres polymorphismes des enzymes du métabolisme. Aucune interaction significative n’a été observée entre les polymorphismes candidats et le tabagisme maternel ou les consommations d’alcool ou de boissons caféinées pendant la grossesse. Cependant, les allèles candidats de CYP2E1, NQO1 et EPHX1, trois enzymes impliquées dans le métabolisme du benzène, semblaient interagir entre eux.Les allèles variants dans les gènes IL13, IL4, IL10 et IL4R n’étaient pas associés au risque de leucémie de l’enfant. Les antécédents d’asthme ou d’eczéma étaient plus fréquemment retrouvés chez les témoins que chez les cas (OR=0.7 [0.6-0.9]). Cette association inverse était essentiellement retrouvée chez les enfants porteurs d’un haplotype variant régulant l’expression de l’IL10 (p interaction=0.08) et porteurs de deux allèles de référence pour IL13-rs20541 (p interaction=0.06).En conclusion, ces résultats suggèrent un rôle de la consommation de café dans le risque de leucémie, déjà observé dans la précédente étude de l’équipe, qui devra être répliqué et approfondi. En revanche, aucune association n’a été observée avec la consommation maternelle de tabac ou d’alcool, même en tenant compte des polymorphismes génétiques candidats. L’interaction gène-gène des trois enzymes impliquées dans le métabolisme du benzène est intéressante et devra être explorée dans d’autres études. Enfin, l’association inverse entre le risque de leucémie aiguë et les antécédents d’asthme ou d’eczéma semble limitée aux enfants porteurs de certains polymorphismes des interleukines IL10 et IL13, ce qui pourrait refléter des mécanismes biologiques sous-jacents. Ces hypothèses pourront être testées d’autres études, et en particulier dans l’étude ESTELLE, récemment réalisée par l’équipe. / The aim of this thesis was to analyze the associations between several environmental (maternal consumption of tobacco, alcohol or caffeinated drinks during pregnancy) and medical (history of asthma or eczema) factors and childhood acute leukemia, and to study genetic polymorphisms suspected to modify those associations.The analyses were performed using data from the national population-based case-control ESCALE study conducted in 2003 and 2004. Information about medical history and maternal consumptions during pregnancy was obtained through a standardized telephone interview with the mothers. The genetic polymorphisms were selected using a candidate approach based on their functionality, in genes involved in the metabolism of tobacco (CYP1A1*2, CYP2E1*5, NQO1*2, EPHX1 and NAT2*5), alcohol (CYP2E1*5, ADH1C*2) or caffeine (NAT2*5), and in allergy (IL4, IL4R, IL10 and IL13). Biological samples consisting of blood for cases and saliva for controls allowed for the genotyping of 370,000 SNPs in the cases and 4,500 SNPs in the controls. Where the candidate polymorphisms were not available from the genotyping, genotypic imputation was used to infer those. In total, data was available for 493 acute leukemia cases and 442 controls of European origin. Maternal coffee drinking during pregnancy and, to a lesser extent, cola soda drinking, was positively associated with childhood leukemia in the ESCALE study. No significant association was observed with maternal smoking or alcohol consumption during pregnancy. Carrying two NAT2*5 alleles was associated with acute lymphoblastic leukemia (Odds Ratio OR=1.9 [1.3-2.7]), although the analyses showed no association with the other candidate alleles involved in metabolism. There was no significant interaction between the candidate genetic polymorphisms and maternal consumptions of tobacco, alcohol or caffeinated drinks during pregnancy. However, the candidate alleles of CYP2E1, NQO1 and EPHX1, three enzymes involved in benzene metabolism, seemed to interact together.The variant alleles in IL13, IL4, IL10 and IL4R genes were not associated with childhood leukemia. A history of asthma or eczema was more frequently reported in controls than in cases (OR=0.7 [0.6-0.9]). This inverse association was mostly observed in children carrying a variant haplotype regulating the expression of IL10 (p for interaction=0.08), and carrying two reference alleles for IL13-rs20541 (p for interaction=0.06).As a conclusion, these results suggest a role of maternal coffee drinking during pregnancy in childhood leukemia that had already been reported in a previous French study of the same research team, and needing in-depth study and replication. However, no association was observed with maternal smoking or alcohol drinking, even after taking into account the candidate genetic polymorphisms. The gene-gene interaction of the three enzymes involved in benzene metabolism is interesting and needs to be investigated in other studies. Finally, the inverse association between childhood acute leukemia risk and medical history of asthma or eczema seems to be limited to the children with specific polymorphisms of interleukins IL10 and IL13, which could reflect underlying biological mechanisms. Those hypotheses should be further tested in other studies, such as the ESTELLE study, that has been recently conducted by the team.

Ce travail de thèse a porté sur l’étiologie des leucémies aigües (LA) de l’enfant, et s’est concentré sur les questions (1) du risque de LA chez les enfants conçus par assistance médicale à la procréation (AMP) ; (2) du rôle protecteur d’une supplémentation maternelle en acide folique ; (3) du rôle protecteur de l’exposition précoce à des facteurs induisant une stimulation du système immunitaire ; (4) d’un effet protecteur des antécédents d’allergie sur le risque de LA de l’enfant. Les données analysées proviennent de l’étude cas-témoins française, ESTELLE, réalisée en 2010-2011. Les cas ont été identifiés par le Registre National des Hémopathies malignes de l’Enfant et les témoins ont été recrutés en population générale par téléphone, avec une stratification sur l’âge et le sexe. L’échantillon comportait 636 cas incidents de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL), 100 cas incidents de leucémie aiguë myéloblastique (LAM), et 1421 témoins de moins de 15 ans. Les données ont été recueillies auprès des mères à l’aide d’un questionnaire téléphonique standardisé, identique pour les cas et les témoins. Les odds ratios (OR) ont été estimés par régression logistique non conditionnelle ajustée sur l’âge, le sexe, le niveau d’éducation maternel, la catégorie socio-professionnelle du foyer, et les facteurs de confusion potentiels. Nous n’avons pas observé d’augmentation du risque de LA chez les enfants dont la conception avait été difficile (OR=0,9[0,7-1,2]), ou avait nécessité la prise d'un traitement d’infertilité (OR=0,8[0,5-1,1]). La supplémentation préconceptionnelle en acide folique était inversement associée au risque de LA (OR=0,7[0,5-1,0]), sans spécificité de sous-type. Le risque de LAL était inversement associé aux infections banales avant l’âge de 1 an (OR=0,8[0,6-1,0]), à la fréquentation d’une crèche avant 1 an (OR=0,7[0,5-1,0]), à l'allaitement maternel (OR=0,8[0,7-1,0]) , et à des contacts réguliers avec les animaux domestiques à un âge précoce (OR=0,8[0,7-1,0]). En revanche, nous n’avons pas observé d’influence du mode d’accouchement sur le risque de LA. Enfin, les LA étaient inversement associées aux antécédents de rhinite allergique, d’eczéma, de dermatite atopique, d’allergie alimentaire; et d’asthme ou bronchite asthmatiforme traité par antihistaminique. Ces résultats ne sont pas en faveur d’un risque de LA associé aux techniques d’aide médicale à la procréation. Ils renforcent l’hypothèse d’un effet protecteur de la supplémentation préconceptionnelle en acide folique pour les LA. Enfin, ils apportent des arguments supplémentaires en faveur du rôle d’une stimulation précoce du système immunitaire dans la survenue des LAL. / The aim of this study was to investigate whether the following factors: 1) conception by assisted medical procreation (AMP), 2) maternal folic acid supplementation, 3) factors related to early stimulation of the immune system, and 4) the history of allergy were related to the risk of childhood acute leukemia (CL). The data were obtained from the national registry-based case-control study, Estelle, carried out in France in 2010-2011. Population controls were recruited by random digit dialing, with quotas on age and sex. The sample included 636 cases of acute lymphoblastic leukemia (ALL), 100 cases of acute myeloblastic leukemia (AML), and 1421 controls less the 15 years old and frequency matched on age and sex. The data were collected by telephone interview of the mothers, using the same standardized questionnaire for cases and controls. Odds ratios (OR) were estimated using unconditional regression models adjusted for age, sex, maternal education, parental socioeconomic status , and potential confounders. We did not observe any increase in CL risk in children who were conceived with difficulty (OR=0,9[0,7-1,2]) or with the use of any fertility treatments (OR=0,8[0,5-1,1]). Preconceptional folic acid supplementation was inversely associated with CL (OR=0,7[0,5-1,0]), without subtype-specificity. Early common infections before 1 year (OR=0,8[0,6-1,0]), attendance to day-care before 1 year (OR=0,7[0,5-1,0]), breastfeeding (OR=0,8[0,7-1,0]) and regular contact with pets in the first year (OR=0,8[0,7-1,0]) were inversely associated with ALL. However, the mode of delivery was not associated with ALL. Finally, reported history of eczema, atopic dermatitis, food allergy, allergic rhinitis, asthma or asthmatic bronchitis treated with anti-histaminic was inversely associated with CL. Our findings do not suggest that fertility treatments are risk factors for CL. They suggest that folic acid supplementation during pregnancy may reduce the risk of CL. They also support the hypothesis that some conditions promoting the maturation of the immune system may decrease the risk of ALL.

L’hématopoïèse est un processus finement régulé pour permettre sa pérennité et son adaptation aux contraintes physiologiques et pathologiques. Ce potentiel repose en grande partie sur les capacités de quiescence, auto-renouvellement, division asymétrique et multipotence des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Les CSH et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) sont principalement régulés de façon extrinsèque au sein des niches hématopoïétiques médullaires et cette régulation fait intervenir, des contacts intercellulaires et des facteurs diffusibles. Le phénotype « side-population » (SP), secondaire à l’efflux actif d’un colorant fluorescent (Hoechst 33342) par des pompes de type multidrugresistance, est une caractéristique des cellules souches de la plupart des tissus. Au sein de l’hématopoïèse, le phénotype SP est un excellent moyen pour identifier les CSH murines et est associé à leur quiescence et à leur adhésion à la niche endostéale, mais sa valeur comme marqueur des CSH est plus discutée chez l’homme. Les cellules SP, de par leur nature, sont également étudiées en oncologie, et sont associées aux cellules tumorales les plus résistantes et les plus tumorogènes. La compréhension des mécanismes régulant la fonctionnalité SP devrait permettre d’ouvrir des pistes en physiologie quand à la compréhension de la régulation des CSPH par les niches mésenchymateuses et en pathologie pour cibler les mécanismes de chimiorésistance.Dans ce travail nous montrons pour la première fois chez l’homme que l’acquisition du phénotype SP est un phénomène dynamique et versatile sous le contrôle du stroma médullaire. Le stroma médullaire est en effet capable de maintenir le phénotype SP de CSPH médullaires et d’induire le phénotype SP de CSPH circulants. L’acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes nécessite à la fois un « nichage » au sein du stroma et des facteurs diffusibles. Les cellules circulantes capables d’acquérir le phénotype SP contiennent des CSPH au regard de (i) leur expression du CD34, (ii) leur richesse en cellules quiescentes, (iii) leur capacité clonogénique et proliférative en cultures secondaires, (iv) leur expression des gènes de « nichage » et de « souchitude », (v) leur capacité de migration en réponse à un gradient de CXCL12, (vi) leur activité LT-SRC in vivo. De plus nous avons mis en évidence, au sein de ces CSPH SP+CD34+ révélés par le stroma médullaire, une sous-population CD44-/faible qui pourrait contenir les cellules plus immatures en raison de sa quiescence et de l’intensité de son efflux du Hoechst 33342. Les études mécanistiques montrent que l’acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes est sous la dépendance de l’intégrine VLA-4 et du CD44. La transduction du signal implique des protéines G et la famille des Src-kinases. Nous montrons également que le stroma médullaire peut induire/maintenir/amplifier la fonctionnalité SP de blastes circulants de leucémie aigüe myéloblastique de façon ß1-intégrine dépendante et que cette fonctionnalité est associée à une capacité d’efflux de Mitoxantrone. Ce mécanisme de modulation de l’activité d’ABC-transporteurs par l’adhésion au stroma correspond à un mécanisme encore jamais décrit de CAM-DR. / Hematopoiesis is a finely tuned process to allow its long-term efficiency and its adaptation to various physiological and pathological stresses. Hematopoietic stem cell (HSC) is the keystone of hematopoiesis through its multipotency, quiescence, asymmetrical division and self-renewing properties. HSC bone marrow (BM) niches mainly regulate hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) through intercellular contacts and diffusible factors. Side-population (SP) cells are characterized by their capability to actively efflux Hoechst 33342 dye through multidrug resistance-like pumps. SP phenotype is a characteristic of stem cells in many tissues and especially, it is a stringent criterion to purify murine HSCs. In mice, this phenotype has been demonstrated to be related to quiescence and resistance to drugs/environmental stresses and to be controlled by endosteal niche adhesion. SP cells are also studied in oncology and are associated to chemo-resistance and tumor initiating capacity. At steady state, SP cells are mainly present in the BM and are mostly absent from the circulation except in stress conditions, raising the hypothesis of the versatility of the SP functionality. Therefore, studying SP phenotype regulation is of importance to understand how BM niches regulate HSPC and how to interfere with cancer cells chemo-resistance.In this work, we demonstrate for the first time and in human that SP phenotype acquisition is a dynamic phenomenon under control of stromal BM cells. Stromal cells from healthy donors maintain SP phenotype of BM HSPC and promote SP phenotype acquisition in circulating ones. SP phenotype promotion depends of stroma nesting and of diffusible factors secretion. This stroma-induced circulating SP cell fraction contains HSPC, as ascertained by (i) CD34 expression, (ii) proportion of cells in G0, (iii) clonogenic and proliferative potential, (iv) nesting and “stemness” gene expression, (v) CXCL12-related migration capability and (vi) LT-SRC activity. Moreover, we describe an SP+CD34+CD44-/low sub-population that could contain most immature HSPCs with regards to their quiescence and Hoechst efflux intensity. Mechanistic studies show that the stoma-mediated SP promoting effect is VLA-4/4ß1-integrin and CD44 dependent, and implicate G-protein and Src-kinase pathways. We also demonstrate that BM stroma from healthy donors can induce/maintain/amplify in a ß1-integrin dependent manner an SP sub-population with mitoxantrone efflux capability in blast cells from acute myeloid leukemia. The existence of a similar mechanism in circulating leukemic blasts suggests the possibility to interfere with the chemo-resistant phenotype of blast cells through integrin/CD44 axis blockade.

Lorsqu’il est surexprimé ou activé constitutivement par mutation, le récepteur tyrosine kinase KIT est impliqué dans le développement de pathologies prolifératives comme les mastocytoses, les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) et certaines leucémies. La voie de signalisation KIT représente donc une cible thérapeutique majeure en oncologie. Le développement d’une nouvelle classe de molécules pharmacologiques appelées inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) est en plein essor. Un exemple majeur d’ITK est l’imatinib qui cible, entre autre, KIT et est efficace dans la plupart des GIST. Cependant, le traitement aux ITK est souvent confronté au phénomène de résistance primaire ou acquise par mutation secondaire. C’est pourquoi nous cherchons à développer de nouveaux composés ciblant KIT ou les voies de transductions activées par ses formes oncogéniques, et ce par 3 approches.Nous avons récemment montré que les mutants oncogéniques de KIT ont une localisation intracellulaire alors que KIT sauvage est exprimé à la membrane. L’inhibition de l’activité kinase des mutants restaure une localisation normale. A partir de cette observation, nous avons créé et validé un test de criblage par cytométrie mesurant la relocalisation de KIT muté à la surface cellulaire. Le criblage d’une chimiothèque nous a permis de sélectionner de nouveaux inhibiteurs de la signalisation KIT actifs sur des lignées cellulaires mutées pour KIT.Nous avons utilisé la technique du phage display pour sélectionner des anticorps au format scFv et VHH spécifiques de la partie intracellulaire de KIT mutant. Lors de leur expression dans le cytosol (on parle alors d’intrabodies), leur fixation au niveau de KIT inhibe soit directement l’activité kinase, soit le recrutement de partenaires de signalisation. Nous avons obtenu des intrabodies de différentes spécificités vis-à-vis des formes de KIT dont la caractérisation fonctionnelle est en cours Les intrabodies inhibiteurs seront utilisés pour cribler des chimiothèques par ELISA. Les molécules chimiques recherchées empêcheront la fixation des intrabodies sur la région intracellulaire de KIT. On sélectionnera donc des molécules inhibant potentiellement l’oncogénicité de KIT.Nous avons développé des anticorps au format scFv-Fc par phage display qui reconnaissent le domaine extracellulaire de KIT. Deux des anticorps sélectionnés inhibent donc la signalisation induite par le SCF. Dans des lignées de leucémie exprimant KIT WT, nous avons montré que l’utilisation de ces anticorps entraîne une diminution de la viabilité cellulaire. De plus, ils diminuent également la prolifération de lignées de leucémie à mastocytes sensibles et résistantes à l’imatinib (HMC11 et HMC12, respectivement). Ils représentent donc des outils thérapeutiques potentiels pour le traitement des pathologies impliquant KIT ainsi que pour contourner la résistance aux ITK de certains mutants. / When overexpressed or constitutively active by mutation, the tyrosine kinase receptor KIT is involved in some proliferative diseases such as gastro-intestinal stromal tumors (GIST), mastocytosis and some leukemia. Therefore, KIT signaling represents a major target in oncology. Development of a new therapeutic class called tyrosine kinase inhibitors is in full expansion. A major example of TKI is imatinib which targets KIT and is efficient in the majority of GIST cases. However, TKI treatment is often unpaired by primary or acquired resistance due to secondary mutations. That is why we aim to develop new compounds to target KIT or associated signaling pathways by three strategies.We have recently shown that oncogenic KIT mutants are intracellularely localized whereas WT KIT is expressed at the cell surface. Kinase activity inhibition leads to membrane mutants’ relocalization. Based on this finding, we developed and validated a screening assay measuring mutants’ relocalization by cytometry. Chemicals library screening allows us to select new KIT signaling inhibitors active on KIT mutant cell lines.We used phage display to generate scFv and VHH antibodies which are specific to KIT intracellular domain. When expressed in cytoplasm (they are called intrabodies), their binding on KIT inhibits kinase activity directly or signaling partners’ recruitment. Selected intrabodies are specific to various KIT isoforms and their functional characterization is ongoing. KIT inhibitory intrabodies will be used to screen chemical libraries by ELISA for drugs that block intrabodies binding on KIT intracellular domain. We will then select molecules that potentially inhibit KIT oncogenicity.We developed scFv-Fc antibodies by phage display that recognize KIT extracellular domain. Two selected antibodies inhibit SCF induced signaling. In WT KIT expressing leukemic cell lines, we showed that antibody treatment reduces cell viability. Moreover, they also diminish cell proliferation of 2 imatinib sensitive and resistant mast cell leukemia cell lines (HMC1.1 and HMC1.2, respectively). They represent potential therapeutic tools for treatment of KIT involved diseases and for bypass TKI resistance of some mutants.

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