Introdução: O fator de transcrição FOXP3 está aumentado em pacientes com rejeição aguda do transplante renal, mas a sua influência na função e sobrevida do enxerto ainda não é clara. O objetivo deste estudo foi correlacionar a expressão gênica e protéica de FOXP3 com os desfechos do enxerto renal, e avaliar a sua associação com células apresentadoras do antígeno em biópsias do enxerto renal. Métodos: Foram avaliados 91 receptores de transplante renal submetidos à biópsia do enxerto por disfunção aguda ou crônica, classificados pela histologia de Banff. O RNAm de FOXP3 foi analisado por PCR em tempo real, e a proteína de FOXP3 e as células dendríticas CD83+ (CDs) por imuno-histoquímica. Todas as análises foram feitas em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. A magnitude de expressão de FOXP3 foi estabelecida por curva ROC. A função e a sobrevida do enxerto em 5 anos pós-transplante foram avaliados, assim como fatores preditores de perda do enxerto. Resultados: A correlação da expressão intra-enxerto do gene e da proteína de FOXP3 foi positiva e significativa (r=0.541, p<0.001). Tanto o RNAm quanto a proteína de FOXP3 estavam aumentados em pacientes com rejeição aguda (RA), em comparação com aqueles sem rejeição (SR) (p=0,039 e p<0,001, respectivamente) ou fibrose intersticial/atrofia tubular (FI/AT) (p=0,035 e p=0,034, respectivamente). Níveis elevados do RNAm de FOXP3 (≥ 2,36 log10 RNAm) ou da proteína (≥ 2,5 células FOXP3+/mm2) não se correlacionaram com variáveis demográficas ou do transplante, mas pacientes com FOXP3 RNAm elevado tiveram maiores taxas de filtração glomerular estimada (TFGe) e uma tendência de variação positiva da TFG ao final do seguimento. O número de CDs CD83+ tendeu a ser maior nas biópsias com FI/AT em comparação com SR (p=0,065), mas não na RA. Pacientes com alta expressão de FOXP3 apresentaram maior número de CDs CD83+ na biópsia: 0,86 (0,25-4,0) vs. 0,44 (0-1,12) células/mm2, p=0,032. A sobrevida cumulativa do enxerto em 5 anos não foi influenciada pela expressão do RNAm de FOXP3 (p = 0,69, log-rank test). Na análise de regressão Cox, RNAm e proteína de FOXP3 não foram preditores independentes da perda do enxerto, somente maior TFGe foi fator protetor contra perda do enxerto. Conclusões: Este estudo mostra que a análise molecular de FOXP3 em tecido parafinado do enxerto renal é possível, uma vez que o RNAm e proteína correlacionaram-se positiva e significativamente. Como esperado, houve uma expressão aumentada de FOXP3 em biópsias com RA. Bióspias com alta expressão de FOX3 tiveram maior densidade de células dendríticas. Nesta coorte, o FOXP3 não foi associado à melhor função ou sobrevida do enxerto renal. / Background. The transcription factor FOXP3 is increased in acute rejection in renal transplant recipients, but its influence in graft function and survival is not clear yet. The aim of this study was to correlate FOXP3 gene and protein expression with graft outcomes, and to evaluate its association with antigen presenting cells in kidney graft biopsies. Methods. We assessed 91 kidney transplant recipients undergoing allograft biopsy for acute or chronic dysfunction, classified by Banff histology. FOXP3 mRNA was analyzed by real-time PCR, and FOXP3 protein and dendritic cells (CD83+ DCs) by immunohistochemistry. All analyzes were done in formalinfixed, paraffin-embedded tissue. The magnitude of FOXP3 expression was established by the receiver operating characteristics (ROC) curve. Graft function and survival at 5 years post transplantation were assessed, as well as independent predictors of graft loss. Results. Intra-graft FOXP3 gene and protein expression were significantly correlated (r=0.541, p<0.001). Both FOXP3 mRNA and protein were increased in patients with acute rejection (AR) as compared to those with no rejection (NR) (p=0.039 and p<0.001, respectively) or interstitial fibrosis/tubular atrophy (IF/TA) (p=0.035 and p=0.034, respectively). FOXP3-RNAmhigh (≥ 2.36 log10RNAm ) or FOXP3-proteinhigh (≥ 2.5 FOXP3+ cells/mm2) did not correlate with demographic or transplant variables, but patients with FOXP3-RNAmhigh had higher glomerular filtration rates (GFR) and tended to have a positive delta of GFR at last follow up. CD83+ DCs tended to be increased in biopsies with IF/TA as compared to NR (p=0.065), but were not associated to AR. Patients with FOXP3-RNAmhigh had more CD83+ DCs on biopsy: 0.86 (0.25-4.0) vs. 0.44 (0-1.12) cells/mm2, p=0.032. The cumulative 5-year graft survival of these renal allografts was not influenced by FOXP3 mRNA expression (p=0.69, log-rank test). Neither FOXP3 mRNA or protein were predictors of graft survival, only higher eGFR at biopsy was a protective factor against graft loss. Conclusions: This study gives support for performing FOXP3 molecular analysis in archival tissue of renal graft biopsies, where FOXP3 mRNA and protein had a good correlation. As expected, there was an increased FOXP3 expression in biopsies with AR, and biopsies with FOXP3-RNAmhigh associated with greater number of dendritic cells. In this cohort, FOXP3 was not associated with better renal graft outcomes.

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Inúmeras pesquisas atuais sobre a depressão vêm contribuindo para o avanço da terapia farmacológica e para o surgimento de novos fármacos antidepressivos. Diretrizes atuais para testes de genotoxicidade de novos medicamentos sugerem a importante utilidade de ensaios que detectem danos ao DNA, ou seja, testes para avaliar a indução de quebras no DNA. Entretanto, o número escasso de dados sobre a genotoxicidade de fármacos faz com que seja reduzido o número de fármacos que realmente podem ser usados em segurança. Portanto, é de extrema importância estudos sobre a avaliação genotoxicológica de fármacos, principalmente, drogas utilizadas por um longo período de tempo como é o caso dos antidepressivos. A duloxetina é um antidepressivo novo, pertencente à classe dos inibidores seletivos da recaptação de serotonina e noradrenalina (ISRSN), utilizada no tratamento sintomático da depressão. Apesar da existência de trabalhos demonstrando que alguns fármacos antidepressivos são genotóxicos, não existe até hoje nenhum estudo sobre a possível genotoxicidade da duloxetina em células de origem humana. Assim, o presente estudo tem como objetivo explorar o possível potencial genotóxico in vitro da duloxetina em culturas primárias de linfócitos humanos através das técnicas de detecção de aberrações cromossômicas e micronúcleos. Culturas primárias de linfócitos sanguíneos de voluntários sadios foram expostas a diferentes concentrações de duloxetina (10-150 ng/ml) e ciclofosfamida (6 μg/ml) como controle positivo. Aberrações cromossômicas estruturais, índice mitótico, índice de divisão nuclear, índice de binucleação, número de células com um, dois, três e quatro micronúcleos e o número de células com pontes nucleoplasmáticas foram avaliadas. Todos os índices das culturas incubadas com duloxetina foram significativamente menores que aqueles dos grupos controles, indicando um certo grau de citotoxicidade da droga. Entretanto, só as concentrações de 100 e 150 ng/ml provocaram o aumento significativo da presença de aberrações cromossômicas e micronúcleos. Considerando que essas concentrações ficam perto do limite superior da faixa terapêutica da droga usada em humanos, nossos resultados alertam já sobre a necessidade de aprofundar no conhecimento da genotoxicidade humana da duloxetina. / Antidepressants are widely used for the symptomatic treatment of depressive disorder. Numerous current research on depression has contributed to the advancement of drug therapy and the emergence of new antidepressant drugs. Current guidelines for genotoxicity testing of new drugs suggests the important utility of assays that detect DNA damage, or tests to evaluate the induction of DNA breakage. However, the small number of data on the genotoxicity of drugs causes the number of drugs that can actually be used safely is reduced. Therefore, it is of utmost importance genotoxicology studies on the evaluation of drugs, especially drugs used for a long period of time such as antidepressants. Duloxetine is a new antidepressant belonging to the class of selective serotonin reuptake inhibitors of serotonin and norepinephrine (SNRIs), used in the symptomatic treatment of depression. Despite the existence of studies showing that some antidepressant drugs are genotoxic, there is to date no study on the possible genotoxicity of duloxetine in human cells. Thus, this study aims to explore the possible genotoxic potential of duloxetine in vitro in primary cultures of human lymphocytes through the techniques of detection of chromosomal aberrations and micronuclei. Primary cultures of blood lymphocytes of healthy volunteers were exposed to different concentrations of duloxetine (10-150 ng/ml) and cyclophosphamide (6 μg/ml) as a positive control. Structural chromosomal aberrations, mitotic index, nuclear division index, index binucleation, number of cells with one, two, three and four micronuclei and the number of cells with nucleoplasmáticas bridges were evaluated. All cultures incubated with indices of duloxetine were significantly lower than those of the control groups, indicating a degree of cytotoxicity of the drug. However, only concentrations of 100 and 150 ng/ml caused a significant increase in the presence of chromosomal aberrations and micronuclei. Whereas these concentrations are close to the upper limit of the therapeutic range of the drug used in humans, our results call already on the need to deepen their understanding of human genotoxicity of duloxetine.

A Artrite reumatoide é uma doença autoimune que acomete cerca de 1% da população mundial adulta, sendo caracterizada pela participação de linfócitos Th17 no seu desenvolvimento. Na busca por novos alvos terapêuticos e pela compreensão da fisiopatologia, se destacam os inflamassomas que são plataformas proteicas, caracterizados pela produção de citocinas pró-inflamatórias por células do sistema imune inato. De forma interessante, foi demonstrado que linfócitos T CD4 também expressam alguns sensores dessas plataformas, como o Nlrp12. Adicionalmente, este sensor é responsável pela modulação negativa do NF-?B, demonstrando outra característica atípica em relação aos outros inflamassomas. Nesse sentido, foi avaliada a participação do Nlrp12 no desenvolvimento da artrite experimental e na diferenciação linfócitos Th17. Foi verificado nesse estudo que o Nlrp12 é regulado positivamente durante o desenvolvimento da artrite experimental, sendo um modulador negativo desse processo. Isso se deve a uma redução na resposta inflamatória inata do modelo e pela modulação negativa na resposta Th17. Nesse sentido, o controle da resposta Th17 e o desenvolvimento da artrite experimental ocorre por um mecanismo dependente da fosforilação do fator de transcrição Stat3, que é crítico na diferenciação de linfócitos Th17. Desta forma, este estudo demonstra uma nova função para o sensor Nlrp12 no desenvolvimento da artrite experimental, por modular a resposta imune adaptativa de forma direta nos linfócitos T CD4 / Rheumatoid Arthritis is an autoimmune disease that occurs in approximately 1% of the adult population worldwide, with critical role of Th17 cells in your development. In the search for new therapeutic targets and the understanding of the pathophysiology, there are inflammasomes which are protein platforms, characterized through pro-inflammatory cytokines production by innate immune system cells. Interestingly, it was demonstrated that CD4 T cells express some inflammasome sensors, as Nlrp12. Additionally, this sensor is responsible for downregulation of NF-?B, showing another atypical feature in relation to other inflammasomes. Thereby, it was evaluated the role of Nlrp12 on experimental arthritis development and Th17 differentiation. It was found in this study that Nlrp12 is upregulated during experimental arthritis development, working as negative regulator of this process. Thus, Nlrp12 downregulates innate inflammatory response from experimental model and Th17 response. Therefore, experimental arthritis development and Th17 differentiation control occurs in a Stat3 phosphorylation dependente-manne, which is a critical transcription factor on Th17 differentiation. Thus, this study demonstrates a new function for Nlrp12 on experimental arthritis development, by directly to modulate adaptive immune response in CD4 cells

Nos últimos anos, um importante destaque tem sido dado aos linfócitos Th17 para o desenvolvimento e manutenção da inflamação associada à autoimunidade. A esclerose múltipla é uma doença autoimune desmielinizante do SNC, cuja patogênese está associada à resposta do padrão Th17. Evidências têm demonstrado que estas células são submetidas a uma reprogramação metabólica após serem ativadas, sendo essa adequação essencial para sua completa diferenciação e aquisição de funções efetoras. A enzima Piruvato Quinase M2 (PKM2) participa da etapa final da glicólise convertendo fosfoenolpiruvato em piruvato. Estudos recentes demonstraram que a fosforilação de PKM2 a torna capaz de translocar para o núcleo, onde adquire um papel no controle da expressão gênica. Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o envolvimento da PKM2 na diferenciação de linfócitos Th17, bem como sua participação no desenvolvimento da encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo animal de esclerose múltipla. Observou-se que durante o processo de diferenciação, os linfócitos Th17 aumentam a expressão gênica de PKM2 bem como a sua forma fosforilada (Y105). De forma interessante, tanto a inibição farmacológica como a deleção gênica da PKM2 especificamente em linfócitos T promoveram uma redução da diferenciação e expansão da subpopulação Th17, que foi associada com diminuição na expressão de moléculas efetoras e fatores de transcrição chave para o estabelecimento do fenótipo Th17. Em um contexto de resposta autoimune, notou-se que PKM2 é superexpressa nos órgãos linfóides periféricos e sistema nervoso central de animais com EAE, sendo correlacionada com o infiltrado de células inflamatórias. Corroborando com os dados in vitro, a deficiência de PKM2 em linfócitos T promoveu redução dos sinais clínicos da EAE, acompanhada de baixa frequência de linfócitos Th17 e menor expressão de moléculas inflamatórias do perfil Th17. Adicionalmente, o tratamento farmacológico com o inibidor da PKM2 atenuou a progressão e gravidade da EAE. Portanto, esses achados implicam um importante papel para PKM2 em doenças autoimunes por regular o desenvolvimento e função de linfócitos Th17. / Over the past few years, an important highlight has been given to Th17 lymphocytes for the development and maintenance of autoimmunity-associated inflammation. Multiple sclerosis is a CNS demyelinating autoimmune disease that is associated to Th17-mediated response. Some evidences have demonstrated that those cells undergo metabolic reprogramming after being activated, which is essential for their complete differentiation and acquisition of effector functions. The enzyme Pyruvate kinase M2 (PKM2) participates at the final step of glycolysis by converting phosphoenolpyruvate into pyruvate. Recent studies have demonstrated that PKM2 phosphorylation allows its translocation into the nucleus, where it plays a role in controlling gene expression. Thus, the aim of this study was to evaluate the involvement of PKM2 in Th17 lymphocytes differentiation, as well as its role in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model for multiple sclerosis. It was perceived that during differentiation process, Th17 lymphocytes increase PKM2 gene expression, and also its phosphorylated form (Y105). Interestingly, both pharmacological inhibition and T-lymphocyte-specific PKM2 gene deletion promoted a reduction in differentiation and expansion of Th17 subpopulation, being associated to diminished expression of effector molecules and key transcription factors for the establishment of Th17 phenotype. In the context of an autoimmune response, it was noticed that PKM2 is overexpressed in peripheral lymphoid organs and central nervous system of EAE-bearing mice, which was correlated with the inflammatory cell infiltration. Corroborating with in vitro data, the deficiency of PKM2 in T lymphocytes led to a reduction of EAE clinical score along with low Th17 frequency and diminished expression of Th17-related inflammatory molecules. Additionally, pharmacological treatment with the PKM2 inhibitor attenuated EAE progression and severity. Therefore, these findings imply an important role for PKM2 in autoimmune diseases by regulating the development and function of Th17 lymphocytes.

A infecção pelo HPV é correlacionada com processos neoplásicos ginecológicos e vários estudos têm sido conduzidos sobre a influência da resposta imune interferindo na oncogênese. A epidemia do HIV e as doenças sexualmente transmissíveis, inicialmente concentradas em grupos de riscos masculinos, apresentam atualmente, uma maior prevalência em mulheres, o que tem aumentado o número de infecção concomitante HPV e HIV. O estudo da resposta imune in situ é uma ferramenta essencial para a compreensão destes processos, medindo diretamente no órgão alvo a resposta imune existente. Nas mucosas, a IgA é a principal responsável pelo controle de várias infecções. As células TCD4+ e TCD8+ têm como principal função auxiliar a resposta imune e as TCD8+ agem também como citotóxicos.Neste trabalho, estudou-se 81 biópsias de vagina de mulheres que foram distribuídas em três grupos: I - com AIDS e HPV (55); II - com infecção pelo HPV e HIV negativa (13); III - HIV e HPV negativas (13). Foram realizados: exame colposcópico, avaliação semiquantitativa dos achados histológicos, hibridização in situ, estudo imuno-histoquímico para IgA, TCD4+ e TCD8+. Observou-se que o padrão citológico suspeito de NIVA mostrou relacionar-se com a quantidade tecidual de células TCD8+ e a infecção pelo HPV, mas não com o número de células TCD4+ ou IgA. A análise colposcópica definiu quadros que tiveram relação significativa com as lesões histopatológicas encontradas e com a infecção pelo HPV, mas sem relação com a co-infecção pelo HIV/HPV, uso de terapia anti-retroviral ou número de TCD4+ circulantes. Verificou-se que a expressão in situ de IgA nas biópsias de vagina de pacientes com vaginite crônica inespecífica, infecção pelo HPV ou co-infecção HPV/HIV não é um parâmetro relevante para discriminar a resposta imune humoral protetora entre esses grupos de pacientes e que o padrão citológico inflamatório é menos expressivo nos casos de infecção pelo HPV que nos casos de vaginite crônica não especifica. Outrossim, a imunidade adquirida revelou maior expressão de células TCD8+ in situ em casos de NIVA que nas vaginites crônicas não relacionadas ao HIV ou HPV e tendência a expressão de maior número de linfócitos TCD4+ em casos de NIVA e condiloma. Por outro lado, as alterações de proliferação epitelial tais como hiperqueratose e metaplasia escamosa epidermóide tiveram relação com NIVA de alto grau e condiloma. Os achados de acantose e hiperqueratose relacionaram-se à infecção pelo HIV/HPV, assim como alterações colposcópicas mais acentuadas. / The infection by HPV (Human papillomavirus) is correlated to gynecologic neoplasic processes and several studies have been performed on the influence of the immune response with interference in the oncogenesis. The HIV (Human Immunodeficiency Virus) epidemic and the sexually-transmitted diseases, initially concentrated in risk groups of men, currently show a higher prevalence in women, which has been increasing the number of concurrent HPV and HIV infection. The study of the in situ immune response is an essential tool for the understanding of these processes, measuring the existing immune response directly in the target organ. In the mucosae, IgA (Immunoglobulin A) is the main responsible for the control of several infections. The main function of the TCD4+ and TCD8+ cells (T cells that express CD4 and CD8) is to help the immune response and TCD8+ cells also play a cytotoxic role. In this work, 81 vagina biopsies have been studied, of women distributed into three groups: I - with AIDS and HPV (55); II - with HPV infection and HIV negative (13); III - HIV and HPV negative (13). It was performed: colposcopic examination, semi-quantitative evaluation of the histological findings, in situ hybridization, immunochemical study for IgA, TCD4+ and TCD8+. It was observed that the suspect cytological pattern of VAIN (Vaginal intraepithelial neoplasia) showed to be related to the total tissue quantity of TCD8+ cells and the HPV infection, but not to the number of TCD4+ cells or IgA. The colposcopic analysis defined conditions that have been significantly related to the histopathological lesions found and to the HPV infection, but not related to the HIV/HPV co-infection, use of antiretroviral therapy or number of TCD4+ in circulation. It was observed that the in situ expression of IgA in the vagina biopsies of patients experiencing nonspecific chronic vaginitis, HPV infection or HPV/HIV co-infection is not a relevant parameter to distinguish the protective humoral immune response among those patient groups and that the inflammatory cytological pattern is less expressive in the cases of HPV infection than in the cases of nonspecific chronic vaginitis. In addition, the acquired immunity showed a higher in situ expression of TCD8+ cells in VAIN cases than in the chronic vaginitis not related to HIV or HPV and the tendency to the expression of a higher number of TCD4+ lymphocytes in VAIN and condyloma cases. On the other hand, the alterations in the epithelial proliferation, such as hyperkeratosis and epidermoid squamous metaplasia were related to high-grade VAIN and condyloma. The findings of acanthosis and hyperkeratosis were related to the HIV/HPV infection, as well as the most remarkable colposcopic alterations.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000392212-Texto+Completo-0.pdf: 1435232 bytes, checksum: c5e320809f8271743be3719e2d01aeda (MD5) Previous issue date: 2007 / Introduction and Objectives: HTLV-I/II viruses have a special tropism for infecting T cells and inducing spontaneous lymphocyte proliferation. Leukemia and inflammatory states such as neurological manifestations are associated with HTLV-I/II infections and treatment is usually based on antiinflammatory drugs including glucocorticoids. Although steroid resistance has been reported, it is unknown whether this condition is related to the viral infection itself or treatment. Here, we investigated whether spontaneous cell proliferation is associated to T-cell sensitivity to glucocorticoids (dexamethasone – DEX). Materials ad Methods: Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from assinthomatic drug-free HTLV-I (n=18) and HTLVII (n=10) infected patients, as well as from healthy subjects (Control, n=11) and cultivated with and without phytohemmaglutinin (PHA 1%).Cells were also cultivated with PHA 1% and several concentrations of DEX (10-9 a 10-4 M). Results and Discussion: Patients with HTLV-I/II showed similar unstimulated and stimulated T-cell proliferation as well as comparable sensitivity to dexamethasone in vitro. There were no group differences in the frequency of glucocorticoid responders versus non-responders. However, T cells of patients with spontaneous proliferation were unresponsive to mitogenic stimulation and remarkably more resistant to dexamethasone than cells of patients with normal proliferation. These data suggest that the poor clinical response to steroids may be associated to spontaneous cell proliferation during HTLV infection. / Introdução e Objetivos: As infecções por HTLV-I/II se caracterizam pelo tropismo viral por infectar células T humanas e promover um estado de proliferação espontânea deste tipo celular. Leucemia e doenças inflamatórias graves, com destaque para as doenças neurológicas, estão fortemente associadas às infecções por HTLV-I/II e o tratamento usual destas patologias envolve a administração de antiinflamatórios da classe dos glicocorticóides. Embora haja relatos de resistência farmacológica à terapia com glicocorticóides, não se sabe ao certo se essa condição se deve à infecção viral ou ao hospedeiro. Neste estudo, avaliou-se a relação entre proliferação celular espontânea e sensibilidade de linfócitos T aos efeitos dos glicocorticóides (dexametasona - DEX). Materiais e Métodos: Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas de pacientes assintomáticos e livres de tratamento, com infecção por HTLV-I (n=18) e HTLV-II (n=10), e foram cultivadas na presença e na ausência do mitógeno fitohemaglutinina (PHA 1%).Células foram também cultivadas com PHA 1% e concentrações variadas de DEX (10-9 a 10-4 M). Para fins comparativos, as mesmas avaliações foram realizadas em sujeitos saudáveis (Controle, n=11). Resultados e Discussão: Os pacientes com HTLV-I/II apresentaram taxas similares de proliferação estimulada (PHA 1%) e não-estimulada (PHA 0%), bem como sensibilidade comparável à DEX. Não houve diferença na freqüência de indivíduos resistentes versus sensíveis à DEX entre os grupos HTLV-I e HTLV-II. Entretanto, linfócitos T de pacientes com proliferação espontânea não responderam ao estímulo mitogênico por PHA e foram mais resistentes à modulação por DEX do que as células de pacientes com proliferação normal. Os resultados aqui apresentados sugerem que a baixa resposta clínica à terapia com glicocorticóides pode estar associada a um estado de proliferação celular espontânea decorrente da infecção por HTLV.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000449724-Texto+Completo-0.pdf: 6148140 bytes, checksum: 12da4cf8a6d912387d56ee8f32c58f7b (MD5) Previous issue date: 2013 / The irritant contact dermatitis (ICD) is a non-allergic inflammatory reaction of the skin that occurs independently of the T cells participation. ICD is caused by exposure to low molecular weight chemicals and it is initiated by damage or activation of epidermal cells which trigger the activation of the innate immune system. The purine nucleotide adenosine triphosphate (ATP) is the universal energy molecule and appears as is an important extracellular messenger. In healthy tissues, ATP is almost exclusively localized intracellularly, whereas in pathological conditions as inflammation, the tissue injury leads to the release of large amounts of ATP to the extracellular medium. In the extracellular medium, ATP can be hydrolyzed by nucleotidases to their breakdown products ADP and AMP. These nucleotidases control the availability of nucleotides for purinergic receptors. Currently, experimental observations indicate that extracellular ATP acting via purinergic receptors plays a relevant role on skin inflammation. Several models in vitro and in vivo had been used to study the mechanisms of ICD. However, this pathology is still poor understood. This study aimed to evaluate the involvement of the purinergic receptor P2X7 in ICD using in vivo and in vitro approaches. The croton oil (CrO) is a chemical irritant that has been shown to exert its effects independent of inflammatory T cells, therefore we used the mice model of irritant contact dermatitis induced by CrO to investigate the involvement of P2X7 receptor in the immunes mechanisms of ICD. We use several pharmacological approaches, in vitro and in vivo tests and mice with gene deletion to P2X7 receptor and showed evidences that the P2X7 receptor activation by ATP in macrophages and dendritic cells (DCs) is connected with neutrophil recruitment induced by CrO. Furthermore, we demonstrated that CrO decreased the hydrolysis of ATP and ADP in the serum of mice and caused necrosis of keratinocytes in culture, both effects related to activation of P2X7. Taken together, the data obtained in this study suggested that CrO exerts its toxic effects by promoting keratinocytes necrosis and decreasing the activity of ectonucleotidades leading to an increase of ATP extracellular levels. Then, extracellular ATP promotes the P2X7 receptor activation in DCs and macrophages causing the release of IL-1β, which is partially responsible for the neutrophils recruitment observed in irritant contact dermatitis induced by croton oil. Noteworthy, the treatment with the selective P2X7 receptor antagonist A438079 decreased the edema and others proinflammatory effects induced by croton oil, pointing the P2X7 receptor as an important pharmacological target for the treatment of ICD. / A dermatite de contato irritante (ICD, irritant contact dermatitis) é uma reação inflamatória local não alérgica da pele que ocorre independentemente da participação de células T. É ocasionada pela exposição a substâncias químicas de baixo peso molecular e acredita-se que seja iniciada por dano ou ativação de células epidermais que desencadeiam a ativação do sistema imune inato. O nucleotídeo ATP é uma molécula energética que desempenha importantes funções como mensageiro extracelular. Em tecidos saudáveis, o ATP está localizado quase exclusivamente no meio intracelular, entretanto quando ocorre injúria tecidual, grandes quantidades de ATP são liberadas para o meio extracelular. No meio extracelular, o ATP pode ser hidrolisado por nucleotidases gerando ADP e AMP. As nucleotidases controlam a disponibilidade do ATP para os receptores purinérgicos. Muitas observações experimentais têm indicado que o ATP atuando via receptores purinérgicos desempenha um papel preponderante em processos inflamatórios na pele. Vários modelos in vitro e in vivo têm sido utilizados para o estudo da ICD, entretanto a fisiopatologia da doença ainda é pouco conhecida. Este estudo teve como objetivo avaliar o envolvimento do receptor purinérgico P2X7 (P2X7R) na ICD utilizando abordagens in vivo e in vitro.O óleo de cróton (CrO) é um irritante químico que tem mostrado exercer seus efeitos inflamatórios independente de células T, portanto nós utilizamos o modelo de dermatite de contato irritante induzida por CrO em camundongos para investigar o envolvimento do receptor P2X7 nos mecanismos imunopatológicos da ICD. Através da utilização de diversas abordagens farmacológicas in vitro e in vivo e do uso de camundongos com deleção gênica para o receptor P2X7, nós primeiramente mostramos evidências de que a ativação do P2X7R por ATP em macrófagos e células dendríticas (DCs) está relacionada com o recrutamento de neutrófilos induzido por CrO. Além disso, foi demonstrado que o CrO decresce a hidrólise de ATP e ADP no soro de camundongos e provoca a necrose de queratinócitos em cultura, ambos os efeitos foram relacionados com a ativação do receptor P2X7. Portanto, a partir dos dados obtidos neste estudo, nós sugerimos que o óleo de croton exerce seus efeitos tóxicos promovendo a morte celular de queratinócitos, diminuindo a atividade de ectonucleotidades e aumentando os níveis extracelulares de ATP. O ATP extracelular, via ativação de P2X7R em DCs e macrófagos, provoca a liberação de IL-1β que é parcialmente responsável pelo recrutamento de neutrófilos observado na dermatite de contato irritante induzida por óleo de cróton. Digno de nota, o tratamento com o antagonista seletivo do receptor P2X7, A438079, diminuiu o edema e outros efeitos pró-inflamatórios induzidos pelo óleo de cróton, apontando o receptor P2X7 como um alvo farmacológico importante para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento da ICD.

Resumo não disponível

O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

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