Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais comum e mais maligno tumor cerebral. O péssimo prognóstico é parcialmente devido à baixa biodisponibilidade dos quimioterápicos no tecido tumoral, recorrência originada por células precursoras resistentes ao tratamento e um sistema imune comprometido. De fato, linfócitos regulatórios modulam o sistema imune para uma resposta pró-tumoral, tornando ainda mais difícil o tratamento. Nesse contexto, nanocápsulas lipídicas (LNCs) têm sido amplamente estudadas a fim de aumentar especificidade dos fármacos ao tecido tumoral. Metotrexato (MTX) e trans-resveratrol (RSV) possuem ação antitumoral já descrita, mas necessitam doses relativamente altas para ação anti-glioblastoma in vivo. O MTX também possui ação imunossupressora através do aumento de adenosina no meio extracelular. A Adenosina, por sua vez, pode modular tanto células efetoras quanto células regulatórias no microambiente tumoral. Dessa forma, a hipótese apresentada nessa tese é que o RSV e o MTX possam ser mais eficazes quando carreados por nanocápsulas em modelos de GBM. Além disso, buscamos avaliar se o MTX poderia interferir com enzimas do sistema purinérgico. Por fim, pesquisamos como a adenosina poderia modular linfócitos B e T através das enzimas CD39 e ecto-5’-NT/CD73. O RSV em nanocápsulas e o MTX em nanocápsulas (RSV-LNCs e MTX-LNCs) aumentaram a atividade anti-tumoral em relação aos compostos em solução, induzindo parada no ciclo celular e apoptose em células de GBM. O MTX diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica BCL-2 e aumentou a caspase-3 ativa, levando as células de GBM à apoptose. Além disso, o MTX aumentou a expressão da enzima ecto-5’-NT/CD73 tanto em células de glioma quanto em linfócitos T presentes no microambiente dos gliomas. Esse aumento da expressão foi acompanhado da diminuição em linfócitos T efetores e T regulatórios. Também, demonstramos que linfócitos B que possuem alta expressão da enzima CD39, tem capacidade supressiva sobre linfócitos efetores. Em conjunto, os resultados apresentados nessa Tese apresentaram possíveis novas alternativas de tratamento e contribuíram para melhor compreender esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most malignant brain tumor. The awful prognosis is in part due to the low bioavailability of chemotherapy agents in the tumoral tissue, recurrence originated from treatment-resistant progenitor cells and an impaired immune system. Indeed, regulatory lymphocytes modulate the immune system toward a pro-tumoral response, turning the treatment even more difficult. In this sense, lipid-core nanocapsules (LNCs) have been widely studied to raise the drug specificity to the tumor. Methotrexate (MTX) and trans-resveratrol (RSV) have antitumoral activity, but need relatively high doses to the anti-glioblastoma outcome in vivo. MTX has immunosuppressive capability mediated by the increase of adenosine in the extracellular milieu. Adenosine in turn may modulate both effector and regulatory immune cells in the tumoral microenvironment. Thereby, the hypothesis presented is that RSV and MTX may have an antitumor improvement when loaded into LNCs in GBM models. Moreover, we sought to evaluate whether MTX could interfere with purinergic enzymes. Lastly, we evaluated how adenosine could modulate B- and T-lymphocytes through CD39 and ecto-5’NT enzymes. RSV- and MTX-loaded lipid-core nanocapsules (RSV-LNCs or MTX-LNCs) increased their antitumoral outcome in relation to the solution compounds, inducing both cell cycle arrest and apoptosis in GBM cells. MTX decreased the expression of the antiapoptotic protein BCL-2 and increased the active caspase-3, triggering glioblastoma cells to apoptosis. Furthermore, MTX increased the expression of ecto-5’-NT/CD73 in glioma cells and T lymphocytes of the glioma microenvironment. This up-regulation was followed by decreasing in T effector and T regulatory lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Taken together, the results presented herein indicate newfound treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

A coevolução parasita-hospedeiro pode ser apontada como uma das principais responsáveis pela grande diversificação de genes envolvidos na resposta imunológica. A chamada “região do MHC” (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), localizada no braço curto do cromossomo 6 humano, é a região mais polimórfica e densa do nosso genoma. Os três genes mais polimórficos deste locus codificam a cadeia pesada de um complexo referido como MHC de classe I, responsável pela apresentação (na superfície celular) de peptídeos provenientes da degradação de proteínas intracelulares. Este mecanismo é central na resposta antiviral, permitindo que células infectadas sejam identificadas e eliminadas pelos Linfócitos T Citotóxicos. Apesar de estruturalmente similares, cada molécula de MHC apresenta maior afinidade por peptídeos com determinadas características bioquímicas. Assim, quanto maior a variabilidade de MHCs em uma dada população, menor o risco de que todos os indivíduos sejam incapazes de apresentar pelo menos alguns alvos derivados de um determinado vírus. Por outro lado, a resposta imunológica celular e a geração de memória contra este alvo apresentado pelo MHC, depende do reconhecimento específico deste complexo peptídeo:MHC (pMHC) por uma dada população de linfócitos. Neste trabalho empregamos ferramentas de bioinformática para realizar a análise estrutural de complexos pMHC, identificando propriedades envolvidas na estimulação da resposta imunológica celular. Nossos resultados in silico, corroborados por experimentos in vitro e ex vivo, sugerem que a similaridade estrutural de complexos pMHC (em termos de topografia e potencial eletrostático) desempenha um papel central na reatividade cruzada de linfócitos T, com implicações sobre imunidade heteróloga, imunopatologia e desenvolvimento de vacinas. / Host-pathogen coevolution can be implicated as one of the main features driving the great diversity of genes involved with immunological response. The so-called “MHC region” (Major Histocompatibility Complex), located at the short arm of human chromosome 6, is the most polymorphic and dense region of our genome. The three most polymorphic genes in this locus encode the heavy chain of a complex referred as MHC class I, which is responsible for presentation (at cell surface) of peptides derived from the digestion of cytosolic proteins. This mechanism plays a key role in antiviral immune response, allowing infected cells to be identified and eliminated by Cytotoxic T Lymphocytes. Although structurally similar, each MHC molecule presents higher affinity for peptides with certain biochemical properties. Therefore, the greater the variability of MHCs in a given population, the smaller the risk that all individuals are unable to present at least some targets derived from a given virus. On the other hand, cellular immune response and memory generation against the target presented by the MHC, depends on specific recognition of this peptide:MHC (pMHC) complex by a given T cell population. In this work, we use bioinformatics tools to perform structural analysis of pMHC complexes, identifying features involved in triggering cellular immune responses. Our in silico results, corroborated by in vitro and ex vivo experiments suggest that structural similarity among pMHC complexes (topography and electrostatic potential) plays a central role in cross-reactivity of cytotoxic T cells, with implications over heterologous immunity, immunopathology and vaccine development.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-02T20:16:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Raphaela Silva Leandro Santos.pdf: 2858553 bytes, checksum: fed89296295c51fb6999d3c552b880f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-03T21:59:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Raphaela Silva Leandro Santos.pdf: 2858553 bytes, checksum: fed89296295c51fb6999d3c552b880f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Raphaela Silva Leandro Santos.pdf: 2858553 bytes, checksum: fed89296295c51fb6999d3c552b880f5 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Introdução: Pouco se sabe sobre o papel modulador exercido pelos linfócitos T reguladores (Treg) e pelas diferentes citocinas envolvidas no desenvolvimento e manutenção dos cistos radiculares (CR). Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar a imuno-expressão dos marcadores CD4, CD25, interleucina-10 (IL-10), interleucina -17 (IL-17) e forkhead box P3 (FoxP3) em CR e associar esses achados com características histológicas dessas lesões. Métodos: Cinquenta e cinco espécimes teciduais de CR foram analisados quanto às suas características histológicas e submetidos à análise imuno-histoquímica utilizando os anticorpos anti-CD4, anti-CD25, anti IL-10, anti-IL-17 and anti-FoxP3. Os resultados da imunoexpressão foram correlacionados com a intensidade do infiltrado inflamatório e a espessura do revestimento epitelial cístico. Resultados: Todos os casos apresentaram marcação positiva para todos os marcadores estudados, mas com intensidades de expressão diferentes. A expressão de CD4, CD25, IL-10 e FoxP3 foi considerada fraca para todos os casos avaliados, enquanto que a IL-17 apresentou expressão forte e foi observada tanto nas células inflamatórias quanto no revestimento epitelial. Não foi observada diferença estatisticamente significante entre os marcadores avaliados e a intensidade do infiltrado inflamatório e a espessura do revestimento epitelial. Foi observada correlação positiva as marcações de IL-17 e FoxP3. Conclusão: Os presentes resultados evidenciaram uma participação menos expressiva de células Treg em cistos radiculares, através da fraca expressão de CD4, CD25, IL-10 e FoxP3, em detrimento de uma presença mais significativa de IL-17. / Introduction: Little is known about T regulatory (Treg) lymphocytes and cytokines modulation in development and maintenance of radicular cysts (RC). In this perspective, the aim of this study was to evaluate immunoexpression of the markers CD4, CD25, interleukin-17 (IL-17) and interleukin-10 (IL-10) and forkhead box P3 (FoxP3) in RC and to correlate these findings with the histological features of these lesions. Methods: Fifty five RC tissue specimens were analyzed for their histological characteristics and submitted to immunohistochemical analysis using anti-CD4, anti-CD25, anti IL-10, anti-IL-17 and anti-FoxP3 antibodies. The results of immunoexpression were correlated with the intensity of the inflammatory infiltrate and thickness of the epithelial lining. Results: All cases were positive to all studied markers, but with different expression intensity. The immunoexpression of CD4, CD25, IL-10 and FoxP3 was weak for all evaluated cases, whereas IL-17 exhibited strong expression in all cases. In addition, IL-17 was expressed in both inflammatory and epithelial cells of cystic lining. No significant differences in the number of positive cells were observed in terms of the intensity of the inflammatory infiltrate or epithelial thickness. It was observed positive correlations between the immunoexpressions of IL- 17 and FoxP3. Conclusion: The present results showed a less expressive participation of Treg cells in radicular cysts due to weak expression of CD4, CD25, IL-10 and FoxP3 in detriment to a more significant presence of IL-17.

Orientadores: Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Juliano Lara Fernandes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:44:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teo_FabioHaach_M.pdf: 2875757 bytes, checksum: 05e700b681fa1d2f1ab33728ed6b7f2e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A aterosclerose é uma doença inflamatória caracterizada por uma intensa atividade imunológica que culmina na formação de lesões nos vasos sanguíneos. As síndromes coronarianas agudas (SCA) representam graves complicações da aterosclerose. Pacientes com SCA podem ser diferenciados de indivíduos saudáveis pela frequência aumentada de células T CD4+ CD28null no sangue periférico. Tais células têm sido relacionadas a processos inflamatórios crônicos, como os que ocorrem em indivíduos portadores de fatores de risco clássicos para a doença aterosclerótica. O objetivo do presente estudo foi avaliar as possíveis diferenças quanto ao número e as características das células T CD4+ CD28null presentes no sangue periférico de pacientes com doença coronariana e indivíduos saudáveis com ou sem fatores de risco para o desenvolvimento de aterosclerose. Para tanto, células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de controles (C), indivíduos portadores de fatores de risco (FR), pacientes com angina estável (AE) e pacientes com síndromes coronarianas agudas (SCA) foram diretamente submetidas à citometria de fluxo (ex vivo) para quantificação de células CD4+ CD28null e detecção de perforina, granzimas A e B, granulisina, CD161, CCR5, CCR7, CXCR3, IFN-? e TNF-?. As células foram cultivadas na presença de anti-CD3 e ionóforo de cálcio por 6hs com posterior análise da expressão de citocinas inflamatórias e também com LPS por 48hs, seguida da avaliação da expressão de moléculas citotóxicas e receptores de homing frente a estímulo inflamatório. A concentração plasmática da proteína C reativa (PCR) também foi determinada. Nossos resultados mostraram que a porcentagem de células CD4+ CD28null em relação aos linfócitos totais do sangue periférico foi similar em todos os grupos. A análise ex vivo mostrou que a população de células CD4+ CD28null apresenta maior expressão de grânulos citotóxicos (granzimas A e B, perforina e granulisina) e dos receptores de homing CCR5 e CD161 quando comparadas à população de células CD4+CD28+, enquanto que a expressão do CCR7 e do CXCR3 é menor. A frequência de células IFN-g+ foi maior na população CD4+ CD28null. Tal padrão se repetiu em todos os grupos, com praticamente todos os parâmetros se comportando dessa maneira. Entretanto, quando comparamos as células CD4+ CD28null dos diferentes grupos, verificamos que a perforina e as granzimas A e B foram mais frequentes nas células de indivíduos com fatores de risco e pacientes com SCA. Com relação às moléculas de homing e ao IFN-?, houve maior positividade para CCR7 nas CD4+ CD28null de controles e pacientes AE, enquanto o IFN-? foi mais frequente nas células dos pacientes AE. A estimulação das CMSP com anti-CD3 e ionóforo de cálcio mostrou que as células CD4+ CD28null dos grupos FR e SCA têm maior capacidade inflamatória quando comparadas às células de controles e de pacientes AE, o que foi evidenciado por um maior aumento na positividade para o TNF-?. Após estimulação das CMSP com LPS, a população CD4+ CD28null apresentou diminuição da expressão dos grânulos citotóxicos analisados, o que ocorreu em todos os grupos. Com relação às moléculas de homing, a estimulação com LPS causou uma diminuição da frequência de CD4+ CD28null positivas para CCR5 em todos os grupos, enquanto houve aumento da positividade para o CXCR3 nas células do grupo AE. Os pacientes SCA apresentaram as maiores concentrações plasmáticas de PCR, seguido pelos indivíduos do grupo FR e finalmente pelos controles e pacientes AE. Coletivamente, nossos resultados mostraram que os fatores de risco para aterosclerose causam alterações fenotípicas na população CD4+ CD28null, tornando-a mais citotóxica e inflamatória, o que poderia estar associado com a inflamação subclínica observada nessas condições. Além disso, os dados sugerem que as células CD4+ CD28null degranulam e alteram a expressão de receptores de homing quando estão em ambiente inflamatório, como ocorre na placa aterosclerótica e/ou na vigência de infecções microbianas / Abstract: Atherosclerosis is an inflammatory disease characterized by an intense immunological activity, resulting in vascular lesions. The acute coronary syndromes (ACS) are one of the complications of atherosclerotic disease. Patents with SCA can be differentiated from healthy individuals by an increased frequency of CD4+ CD28null T cells in peripheral blood. These cells have been associated with chronic inflammatory processes, which occur in individuals with risk factors for coronary artery disease. This study aimed to evaluate the possible differences regarding the number and characteristics of peripheral blood CD4+ CD28null cells from patients with coronary artery disease and healthy individuals with and without risk factors for atherosclerosis. In order to achieve this goal, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy controls (C), individuals with risk factors (RF), patients with stable angina (SA) and patients with acute coronary syndromes (ACS) were analyzed by flow cytometry (ex vivo) to quantify CD4+CD28null cells and to detect the expression of perforin, granzymes A and B, granulysin, CD161, CCR5, CCR7, CXCR3, IFN-? and TNF-?. Cells were cultured with anti-CD3 and calcium ionophore for 6 h and analyzed regarding inflammatory cytokine expression. The cells were also cultured with LPS for 48h to evaluate expression of cytotoxic molecules and homing receptors in response to inflammatory stimulus. The plasmatic concentrations of C reactive protein (CRP) were also measured. Our results showed that the percentage of CD4+ CD28null cells in relation to total lymphocytes in peripheral blood was similar in all groups. Regarding the CD4+ CD28null population phenotype, it was observed an increased expression of cytotoxic molecules (granzymes A and B, perforin and granulysin) and homing receptors CCR5 and CD161 compared to CD4+CD28+ population. In contrast, expression of CCR7 and CXCR3 was decreased in CD4+ CD28null population. IFN-? frequency was also increased in CD4+ CD28null cells. This pattern was found in all groups, in relation to almost all analyzed parameters. Nevertheless, when CD4+ CD28null cells from the different groups were compared, it was observed that the positivity for perforin and granzymes A and B were increased in cells from individuals with risk factors and ACS patients. On the other hand, granulysin was more frequent in CD4+ CD28null cells from AS patients and controls. Moreover, the positivity for CCR7 was increased in CD4+ CD28null cells from control and SA patients while IFN-? was more frequent in cells from SA patients. PBMC stimulation with a anti-CD3 and calcium ionophore for 6h showed that CD4+ CD28null cells from RF and ACS groups have an increased inflammatory capacity when compared to cells from control subjects and AE patients, which is evidenced by a bigger increase in positivity for TNF-?. After PBMC stimulation with LPS for 48hs, CD4+ CD28null population had a decrease in cytotoxic molecules expression, fact that occurred in all groups. Regarding the homing molecules, LPS stimulation caused a huge decrease of CCR5 frequency in CD4+ CD28null cells from all groups while there was a significant increase of positivity for CXCR3 in the cells from SA patients. The highest CRP plasmatic concentrations were found in ACS patients, followed by subjects from RF group. The lowest levels were found in controls and SA patients. Taking together, our results show that risk factors for atherosclerosis lead to phenotypic alterations in CD4+ CD28null population, which became more cytotoxic and inflammatory. Such alterations may be associated with the low-grade inflammation found in patients with hypertension, diabetes, dyslipidemia and smocking. Beyond that, our data suggests that CD4+ CD28null cells degranulate and modify homing receptor patterns when they are in an inflammatory environment, which takes place in atherosclerotic lesions and/or infections / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-11T12:55:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-11T12:56:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T12:56:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2017-12-05 / FAPERO - Fundação Rondônia de Amparo ao Desenvolvimento das Ações Científicas e Tecnológicas e à Pesquisa do Estado de Rondônia / BjcuL is a type C lectin that depends on calcium ions to develop its biological activities. This protein is composed of two identical subunits that constitute the homodimer molecular structure. BjcuL has specificity for carbohydrate binding through its CDR region and exhibits hemagglutinating activity, inhibits proliferation of tumor cells, as well as the formation of bacterial biofilms. The purpose of this study was to investigate the effect of BjcuL under the human T lymphocyte mediated immune response and its different subpopulations. Results showed that BjcuL is not toxic to PBMCs and also does not exert mitogenic activity on these cells at concentrations of 5 and 10 μg/mL which can be regulated by the reactive oxygen species (ROS). The data evidenced that T lymphocytes are the cells responsible for ROS production induced by BjcuL, which contributes to the non-mitogenic activity for this lectin. BjcuL-FITC interacted with monocytes, B lymphocytes, Natural Killer cells and with subpopulations of T lymphocytes. The result of this interaction was the cellular activation that induced the production of pro-inflammatory cytokines such as IL-6 and TNF-α, and antiinflammatory cytokine such as IL-10. In addition, the data showed that the cells responsible for TNF-α production are mainly Natural Killer cells and monocytes, whereas IL-10 is produced by CD4+ T cells and Treg lymphocytes when stimulated by BjcuL. The cytokine profile produced by the cells when stimulated by this lectin allows us to confirm that BjcuL develops immunomodulatory activity. The results obtained may serve as a basis for the development of new drugs of clinical interest and as tools for biotechnological prospecting. / A BjcuL é uma lectina do tipo C que depende de íons cálcio para desenvolver suas atividades biológicas. Essa proteína é composta por duas subunidades idênticas que constituem a estrutura molecular de homodímero. A BjcuL tem especificidade para ligação a carboidratos por meio de sua região CDR, apresenta atividade hemaglutinante, inibe a proliferação de células tumorais, e a formação de biofilmes bacterianos. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da BjcuL sob a resposta imunológica mediada por linfócitos T humanos e suas diferentes subpopulações. Os resultados mostraram que a BjcuL não é tóxica para os PBMCs e também não exerce atividade mitogênica sobre essas células, nas concentrações de 5 e 10 μg/mL, os quais podem ser regulados pela produção de espécies reativas do oxigênio (EROS). Os dados evidenciaram que os linfócitos T são as células responsáveis pela produção de EROS induzidas por BjcuL, contribuindo para a atividade não mitogênica dessa lectina. A BjcuL acoplada ao FITC interagiu com monócitos, linfócitos B, células Natural Killer e também com subpopulações de linfócitos T. O resultado dessa interação foi a ativação celular que induziu a produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e TNF-α, e antiinflamatórias como IL-10. Além disso, os dados mostraram que as células responsáveis pela produção de TNF-α são as células Natural Killer e os monócitos. A IL-10 é produzida pelas células T CD4+ e pelos linfócitos Treg, quando estimuladas pela BjcuL. O perfil de citocinas produzidas pelas células quando estimuladas por essa lectina permite afirmar que a BjcuL desenvolve atividade imunomoduladora. Os resultados obtidos poderão servir de base para o desenvolvimento de novos farmacos com interesse clínico e como ferramentas de prospecção biotecnológica.

Submitted by Gabriele Rodrigues (gabriele_r.valentim@hotmail.com) on 2016-09-02T15:40:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Francivaldo de Oliveira Lima Versiani.pdf: 3895432 bytes, checksum: de4557b6f975ae78826ce659e47f9f2f (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-13T12:53:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Francivaldo de Oliveira Lima Versiani.pdf: 3895432 bytes, checksum: de4557b6f975ae78826ce659e47f9f2f (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-13T12:58:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Francivaldo de Oliveira Lima Versiani.pdf: 3895432 bytes, checksum: de4557b6f975ae78826ce659e47f9f2f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T12:58:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Francivaldo de Oliveira Lima Versiani.pdf: 3895432 bytes, checksum: de4557b6f975ae78826ce659e47f9f2f (MD5) Previous issue date: 2011-08-30 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Paclitaxel é um agente quimioterápico muito utlizado no tratamento do câncer de mama e ovário, inclusive em estágios avançados. Devido sua hidrofobicidade, o Paclitaxel foi incorporado a uma nanoemulsão lipídica rica em colesterol (LDE) e teve um grupamento de ácido oléico associado à molécula primária, originando o oleato de Paclitaxel. Este trabalho teve a finalidade de avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade do oleato de Paclitaxel incorporado à nanoemulsão lipídica rica em colesterol (LDE), comparando os resultados com o Paclitaxel comercial (Taxilan). Foram encontrados os seguintes resultados para o teste de hemólise em camundongos: LDE+OPTX: 59,04 μM (26,95-129,4); OPTX, TAX, OA, PTX : >100 μM; LDE: 58,26 μM (42,59-79,69). No teste de hemólise em eritrócitos humanos nenhuma substância causou hemólise, exceto o OA (94,2%). A citotoxicidade em ACP02 mostrou as CI50: LDE+OPTX: 17,65 μM (15,91-19,58); OPTX, PTX, OA: >100 μM; LDE: 51,75 μM (48,43-55,30). A citotoxicidade em MCF-7 mostrou as CI50: LDE+OPTX: 12,41 μM (9,38-16,41); OPTX, PTX, OA: >100 μM; LDE: 25,53 μM (21,23-30,70). A citotoxicidade em MDA-MB-231 mostrou as CI50: LDE+OPTX: 21,82 μM (19,20-24,80); OPTX, PTX, OA: >100 μM; LDE: 26,29 μM (24,17-28,59). A citotoxicidade em linfócitos humanos mostrou os seguintes resultados para CI50 em 24h: LDE+OPTX, LDE, OPTX, OA: >100 μM; TAX: 40,39 (28,23-57,78). Para 48h: OPTX, OA: >100 μM; TAX: 24,61 (15,61- 38,79); LDE: 47,20 μM (37,00-60,23); LDE+OPTX: 40,78μM (31,41-52,93); TAX: 24,61 μM. Para 72h: OPTX, OA: >100 μM; LDE: 39,06 μM; LDE+OPTX: 33,99 μM. O teste do Cometa mostrou que a nanoemulsão é genotóxica tanto em linfócitos quanto em células tumorais gástricas e de mama. No teste do Micronúcleo em 24 e 48 horas não houve aumento de frequência de micronúcleos em nenhuma substância. Portanto, verificou-se que a nanoemulsão rica em colesterol com oleato de Paclitaxel é citotóxica em células tumorais e em células normais, causando danos ao DNA de linfócitos e células de adenocarcinoma gástrico e de mama, somente nas maiores concentrações testadas (7,5 e 10 μM). / O Paclitaxel é um agente quimioterápico muito utlizado no tratamento do câncer de mama e ovário, inclusive em estágios avançados. Devido sua hidrofobicidade, o Paclitaxel foi incorporado a uma nanoemulsão lipídica rica em colesterol (LDE) e teve um grupamento de ácido oléico associado à molécula primária, originando o oleato de Paclitaxel. Este trabalho teve a finalidade de avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade do oleato de Paclitaxel incorporado à nanoemulsão lipídica rica em colesterol (LDE), comparando os resultados com o Paclitaxel comercial (Taxilan). Foram encontrados os seguintes resultados para o teste de hemólise em camundongos: LDE+OPTX: 59,04 μM (26,95-129,4); OPTX, TAX, OA, PTX : >100 μM; LDE: 58,26 μM (42,59-79,69). No teste de hemólise em eritrócitos humanos nenhuma substância causou hemólise, exceto o OA (94,2%). A citotoxicidade em ACP02 mostrou as CI50: LDE+OPTX: 17,65 μM (15,91-19,58); OPTX, PTX, OA: >100 μM; LDE: 51,75 μM (48,43-55,30). A citotoxicidade em MCF-7 mostrou as CI50: LDE+OPTX: 12,41 μM (9,38-16,41); OPTX, PTX, OA: >100 μM; LDE: 25,53 μM (21,23-30,70). A citotoxicidade em MDA-MB-231 mostrou as CI50: LDE+OPTX: 21,82 μM (19,20-24,80); OPTX, PTX, OA: >100 μM; LDE: 26,29 μM (24,17-28,59). A citotoxicidade em linfócitos humanos mostrou os seguintes resultados para CI50 em 24h: LDE+OPTX, LDE, OPTX, OA: >100 μM; TAX: 40,39 (28,23-57,78). Para 48h: OPTX, OA: >100 μM; TAX: 24,61 (15,61- 38,79); LDE: 47,20 μM (37,00-60,23); LDE+OPTX: 40,78μM (31,41-52,93); TAX: 24,61 μM. Para 72h: OPTX, OA: >100 μM; LDE: 39,06 μM; LDE+OPTX: 33,99 μM. O teste do Cometa mostrou que a nanoemulsão é genotóxica tanto em linfócitos quanto em células tumorais gástricas e de mama. No teste do Micronúcleo em 24 e 48 horas não houve aumento de frequência de micronúcleos em nenhuma substância. Portanto, verificou-se que a nanoemulsão rica em colesterol com oleato de Paclitaxel é citotóxica em células tumorais e em células normais, causando danos ao DNA de linfócitos e células de adenocarcinoma gástrico e de mama, somente nas maiores concentrações testadas (7,5 e 10 μM).

A isquemia e reperfusão (IR) é a principal causa de insuficiência renal aguda. Evidências mostram a participação de linfócitos T e células dendríticas (DC) na lesão por IR. Entretanto, os mecanismos envolvidos não estão claros. A enzima heme oxigenase (HO)-1 está relacionada à diminuição de respostas inflamatórias. Neste trabalho, investigamos a participação de linfócitos T CD4+ e DC na proteção da lesão por IR induzida pela HO-1. Injetamos em camundongos um indutor de HO-1 (Hemin), e realizamos a IR. Avaliamos a lesão pela uréia e creatinina no soro, a expressão de citocinas por RT-PCR, nível de proteínas por bioplex e perfil celular por FACS. Observamos que a HO-1 protegeu da lesão por IR. A diminuição de INFg com a HO-1 sugeriu uma menor ativação de linfócitos T. No entanto, a transferência de células CD4+ tratadas com Hemin não apresentou diferença. Vimos que a HO-1 alterou o fenótipo das DC após IR e suprimiu a produção de TNFa pelas mesmas. Concluímos que a proteção pela HO-1 é capaz de modular a resposta inflamatória de DC, diminuindo o TNFa. / The ischemia and reperfusion (IR) is the main acute kidney injury. Evidences have shown the role of CD4+ T cells and dendritic cells (DC) in the IR injury. However, the mechanisms involved in the participation of these cells are not clear. The heme oxygenase (HO)-1 enzyme is associated to decrease in inflammatory responses. In this work, we investigated the role of CD4+ T cells and DC in renal injury protection induced by HO-1. We injected in mice a HO-1 inducer (Hemin), and we did the IR. Renal injury was evaluated by serum levels of urea and creatinine, cytokines expression by RT-PCR, proteins level by bioplex and cell profile by FACS. We observed that HO-1 lead to IR injury protection. The IFNg decrease with HO-1 suggested less T cells activation. However, transfer of hemin treated CD4+ cells did not differ from the other group. We observed that HO-1 altered DC phenotype after IR and suppressed TNFa production by these cells. We concluded that the protection by HO-1is able to modulate DC inflammatory response, diminishing TNFa.

A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.

A lesão renal induzida pela I/R é a principal causa de IRA nos rins nativos e nos rins transplantados e estudos enfatizam a participação de células inflamatórias na sua patogênese, através da caracterização de lesão endotelial, infiltração leucocitária e a geração de mediadores inflamatórios pelas células epiteliais tubulares. Evidências recentes mostram que as células T CD4+ exercem um papel fundamental como mediadoras da agressão renal na I/R, ressaltando-se o envolvimento do paradigma Th1/Th2 como um possível mecanismo efetor. O presente estudo foi realizado com o objetivo de estudar a participação de algumas citocinas Th1 e Th2 no desenvolvimento da lesão de I/R renal. Para tanto, nós nos propusemos a desenvolver um modelo experimental de I/R renal em camundongos deficientes em IL-12, IFN-, e duplo deficientes em IFN- e IL-12 (representando defeito da via de ativação Th1), camundongos deficientes em IL-4 e IL-10 (representando defeito da via de ativação Th2) e duplo deficientes em IL-10 e IL-12, tendo como controles camundongos normais (selvagens). Todos os animais foram submetidos a uma lesão de I/R por ligadura reversível do pedículo renal por 45 minutos seguidos de 24 horas de reperfusão. Após a indução da isquemia, nós analisamos as alterações funcionais (creatinina e uréia por método bioquímico colorimétrico) e morfológicas renais (morfometria renal), além de investigar a expressão molecular de HO-1 (um gene de proteção tecidual), de t-bet (um transcrito envolvido na diferenciação Th1), de GATA-3 (um transcrito envolvido na diferenciação Th2), citocina pró-inflamatória IL-6 e de uma quimiocina pró-inflamatória MCP-1, visando caracterizar a influência da polarização Th1/Th2 da resposta imune na lesão renal induzida pela I/R. Nós mostramos que os camundongos deficientes em IL-4, IFN-, IL-10/IL-12 e IL-10 apresentaram uma disfunção renal importante, caracterizada por altos níveis séricos de creatinina e uréia e por um alto grau de agressão morfológica renal, avaliada pela percentagem de área de necrose tubular. Todos estes resultados foram significativamente mais acentuados que obtidos nos camundongos deficientes em IL-12 e IFN-/IL-12, sendo comparáveis aos animais selvagens. Por outro lado, a capacidade de reparação renal, medida pela percentagem de área de regeneração tubular, foi mais precoce nos camundongos deficientes em IFN-, quando comparada com os camundongos deficientes em IL-12 e IFN-/IL-12. A análise molecular quantitativa, utilizando-se o PCR em tempo real mostrou uma expressão significantimente maior de RNAm de HO-1, IL-6 MCP-1 e do fator transcricional pata Th2 (GATA-3) nos camundongos deficientes em IL-4, IFN-, IL-10/IL-12 e IL-10, em comparação com os camundongos deficientes em IL-12, IFN-/IL-12 que apresentaram baixa expressão do fator transcricional para Th1 (T-bet), em 24 horas após a I/R renal. Quando fomos fazer a transferência adotiva de médula óssea de animais deficientes em IL-12 e IL-4 para animais selvagens previamente com depleção subletal celular, esses animais vieram apresentar resultados semelhantes aos animais deficientes em IL-12 e IL-4, onde os animais selvagens reconstituídos com medula óssea dos animais IL-12 apresentaram menor níveis de uréia sérica e menor expressão de RNAm IL-6, enquanto que os animais selvagens recontituídos com medula óssea dos animais IL-4 apresentaram maior níveis de uréia sérica e maior expressão de RNAm IL-6, esses dados comprovam que realmente a citocina IL-12 parece ser a principal citocina envolvida no processo inflamatório desencadeado pela lesão de isquemia e reperfusão renal. Tais achados favorecem a hipótese dos efeitos deletérios das células com per_l Th1 e o papel protetor das células Th2 na lesão isquêmica renal. Estes novos episódios podem fornecer a base para uma melhor compreensão fisiopatológicos, bem como para o desenvolvimento de métodos preventivos e terapêuticos para a insuficiência renal aguda isquêmica. / Renal ischemia/reperfusion injury (I/R) is the major cause of acute renal failure (ARF) in the native as well as in the transplanted kidneys, with a complex pathogenesis that involves many components of inflammatory response such as leukocyte infiltration and generation of inflammatory mediators by tubular cells. Recent evidences show a critical role of the CD4+ T cell, with the Th1/Th2 paradigm as a possible ejectors mechanism. The present study has the objective to investigate the participation of some main Th1 and Th2 cytokines in the development of the renal of I/R. For that, we developed an experimental model of renal I/R in deficient in IL-12, IFN-, double deficient IFN- and IL-12 (representing defect of the pathway Th1), IL-4 and IL-10 (representing defect of the pathway Th2) and in double deficient IL-10 and IL-12 knockout mice, having wild-type mice as controls. All animals were submitted to renal I/R by reversible ligation of the renal pedicles for 45 minutes followed by 24 hours of reperfusion. After induction of the ischemia, we analyzed renal function and morphometric histological analyzes. Furthermore, we quantified the expression of HO-1 (cytoprotection gene), t-bet (transcription factor involved in the differentiation Th1), GATA-3 (transcription factor involved in the differentiation Th2), and cytokine pro-inflammatory IL-6 and chemokine pro-inflammatory MCP-1, aiming to characterize the influence of Th1/Th2 polarization in the immune response driven by the renal I/R. We showed that the IL-4, IFN-, IL-10 and IL-10/IL-12-de_cient mice presented an important kidney dysfunction, characterized by higher levels serum creatinine and tubular necrosis, being comparable to the wild-type animals. The molecular analyses, utilizing the real-time PCR, showed a significantly higher expression of HO-1, IL-6, MCP-1 and transcription factor involved in the differentiation Th2 (GATA-3) in the in IL-4, IFN-, IL-10 and IL-10/IL-12-defficient mice, in comparison with the in IL-12, IFN-/IL-12-de_cient mice showed lower expression transcription factor involved in the differentiation Th1 (T-bet) . Moreover, the renal dysfunction seen in Th2-de_cient mice was followed by a higher expression of IL-6. When we make the transfer adoptive of bone marrow of animals deficient in IL-12 and IL-4 to wild animals previously with sublethal cell depletion, these animals produce similar results to animals deficient in IL-12 and IL-4, where the animals reconstituted wild animals with bone marrow IL-12 showed lower levels of serum urea and lower expression mRNA of IL-6, while the wild animals reconstituted with bone marrow of animals IL-4 showed higher levels of serum urea and greater expression of mRNA IL-6. These data show that really the cytokine IL-12 appears to be the main cytokine involved in the inflammatory process triggered by the injury of ischemia and reperfusion kidney. Such _ndings favor the hypothesis of the deleterious effects of Th1 cells with prole and the protective role of Th2 cells in ischemic renal injury. These novel insights may provide basis for the better pathophysiological understanding, as well as for development of preventive and therapeutic methods for the ischemic acute renal failure.