Orientadores: Maria Helena Andrade Santana, Heizir Ferreira de Castro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T20:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_CleideMaraFaria_M.pdf: 5966176 bytes, checksum: 181a14205ef4b15d71734d115dd39efe (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A metodologia de preparação do biocatalisador pode influenciar no processo catalítico. De acordo com estudos anteriores a lipase de Candida rugosa pode ser imobilizada com presença de alta atividade em sílica de porosidade controlada (SPC) ativada com glutaraldeído. Neste trabalho, foram desenvolvidas estratégias para otimizar a estabilidade operacional desta preparação de lipase imobilizada. Para atingir este propósito, foram testados diferentes tipos de agentes estabilizantes com a finalidade de proteger a enzima de efeitos de agregação ou desnaturação que ocorrem devido à presença dos silanos usados durante a formação da matriz de sílica. Os aditivos usados como estabilizantes foram as proteínas (albumina e lecitina) e os polímeros orgânicos (P-ciclodextrina e polietilenoglicol) e seus efeitos foram comparados ao controle (lipase imobilizada sem aditivo). A metodologia de planejamento experimental foi utilizada para selecionar o aditivo que fornecesse maior rendimento de imobilização. Foram realizados três planejamentos fatoriais completos 22, com repetição no ponto central para avaliar a variável resposta, em função do tipo de aditivo e concentração de enzima. Entre todos os aditivos testados, rendimentos mais elevados foram obtidos quando PEG-1500 foi utilizado como agente estabilizante. De acordo com os resultados estatísticos, um novo planejamento fatorial completo 22, com repetição no ponto central foi realizado, para avaliar o rendimento de imobilização em função da concentração de PEG-1500 e lipase. Utilizandose da metodologia de superficie resposta, obteve-se o seguinte modelo matemático para o rendimento de imobilização: Y = 50,91+4,70X1 - 9,89X2 + 4,04 XI X2 onde X I e X2 correspondem aos valores codificados para as variáveis concentração de aditivo e enzima, respectivamente. A estabilidade operacional das preparações de lipase imobilizada na presença de PEG-1500 foi determinada na síntese de butirato de butila em regime de bateladas consecutivas. Adotando a estratégia proposta neste trabalho, o tempo de meia vida da lipase imobilizada em SPC foi aumentado em 13 vezes, quando comparado com o tempo de meiavida do controle (lipase imobilizada em SPC sem aditivo) / Abstract: The method for preparing the biocatalyst can influence the catalytic processo In agreement with previous studies Candida rugosa lipase can be immobilized with high activity retention on silanized controlled pore silica (CPS) activated with glutaraldehyde. This work aimed at improving the performance of the immobilized form in long-term operation. Five additives were tested in the immobilization step in order to select the most activity derivative for esterification reactions. This strategy is suggested to protect the enzyme from aggregation effects or denaturation that occur due to the presence of silane precursors used in the formation of the silica matrix. Proteins (albumin and lechitin) and polymers (B-cyclodextrin and polyethyleneglycol) were added during the immobilization procedure and their effects are reported and compared with the behavior of the immobilized biocatalyst in the absence of additive. The methodology of experimental design was used to select the most efficient additive considering the coupling yield as a response variable. Three 22 full factorial design with repetitions at the center point were employed to evaluate the immobilization yield as a function of additive type and lipase loading. The best stabilizing effect was found when small amounts of PEG-1500 and lipase were added simultaneously to the lipase onto support. According to statistic results, further 22 full factorial design with 2 repetitions at the center point were employed to evaluate the immobilization yield as a function of PEG and lipase concentrations. A response surface methodology permitted to obtain the following mathematical model for immobilization yield: Y = 50.91+4.70X1 - 9.89X2 + 4.04 Xl X2 where: Xl and X2 are the codified values for additive PEG-1.500 and enzyme concentrations, respectively. This immobilized system was used to perform esterification reactions under repeated batch cycles (for the synthesis of butyl butyrate as a model). The half-life of the lipase immobilized on CPS in the presence of PEG-1500 was found to increase 13 times when compared with the control (immobilized lipase on CPS without additive) / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientadores: Telma Teixeira Franco, Gustavo Paim Valença / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:00:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ayres_BiancaMairaTeixeira_M.pdf: 702836 bytes, checksum: 9d7d2a539cf470dfe7892bf64c17518d (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O presente trabalho estudou as melhores condições para a produção de monoacrilato de frutose a partir da esterificação de ácido acrílico com D-frutose catalisada pela lípase comercial de Cândida antárctica (Novozyme 435). O interesse na produção deste éster se dá devido à promissora propriedade absorvente de água do polímero a ser produzido, com diferentes aplicações possíveis. Esterificações enzimáticas são reações de equilíbrio cujo subproduto é a água. A presença desta tem de ser controlada para possibilitar atividade enzimática e evitar a hidrólise dos ésteres. A adição de peneira molecular 3 Á ao sistema foi investigada para remoção da água produzida e favorecimento do deslocamento do equilíbrio para síntese dos ésteres. A produção exclusiva de monoéster foi observada quando a razão molar frutose:ácido acrílico de 1:3, 55 °C, agitação de 200 rpm e 20 mg mL-1 de lípase foram empregadas. Quando a razão molar foi aumentada para 1:5 a conversão de frutose aumentou, mas o equilíbrio foi deslocado para a produção de di- e triéster de frutose. A adição de 3 g de peneira molecular em 25 mL de sistema reacional resultou na produção de 49.5 mM de monoacrilato de frutose com 84 % de conversão da frutose inicial e 41 % da conversão de ácido acrílico após 24 h de reação. Devido à inexistência de padrões de acrilatos de frutose no mercado, um método para quantificação destes por fatores de resposta de CLAE foi desenvolvido baseado nos dados cinéticos da reação / Abstract: The optimal conditions for the enzymatic production of fructose acrylates were studied. Fructose to acrylic acid molar ratio, the amount of immobilized lipase Candida antarctica and the influence of molecular sieve in the reaction media were studied. The results of these variables in converting sugar were monitored. Enzymatic esterifications are equilibrium reactions whose subproduct is water. The presence of this must be controlled to allow enzymatic activity of the lipase and to avoid hydrolysis of esters. The addition of molecular sieve 3 A to the system was investigated to remove of produced water and to shift the equilibrium to the synthesis of ester. The exclusive production of monoester was observed when the molar ratio of fructose: acrylic acid of 1:3, 55 °C, 200 rpm and 20 mg ml-1 of immobilized lipase was employed. When the molar ratio is increased the conversion of fructose increases, but the equilibrium was shifted to the production of di- and triester. The addition of 3 g of molecular sieve resulted in the production of 49.5 mM of fructose monoacrylates, 84 % conversion of the initial fructose and 41 % conversion of acrylic acid after 24 hours of reaction. Since sugar acrylates are not available, it were obtained the concentrations of esters from the determination of response factors of each ester by HPLC-RI based on linear regression / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestre em Engenharia Química

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Biodiesel is a mixture of fatty acid alkyl esters produced by the reaction between vegetable oils and short chain alcohols, like methanol and ethanol, using a catalyst that can be acid, basic or enzymatic. However, the high cost of the raw material when refined vegetable oil is used, have made biodiesel production economically unattractive. Therefore, research with waste oils has increased, showing the technical viability of the production of biodiesel using the residential and industrial residues as raw material. Another variable that has influenced this type of reaction is the type of alcohol. In Brazil, the use of ethanol is interesting because the country has become one of the top worldwide producers of ethanol from vegetables sources, a cheaper and less toxic product than methanol, decreasing our petroleum dependence. The type of catalyst also influences biodiesel production. Alkali is the catalysts that is more often used in industry, but when the vegetable oil has a high acid value, it can not be used because soap is produced, diminishing the esters yield. In this case an acid or an enzyme is used as a catalyst. Based on the previous explanation, the results of this work correspond to the study of enzymatic production of biodiesel using waste oil and ethanol. The immobilized Candida antarctica lipase (Novozym 435) behavior was studied in the oleic acid esterification, studying the effect of the variables that has influence in the process. The variables chosen were: temperature (30 â 50oC), molar ratio acid:alcohol (1:1 â 1:6) and water content (0 â 20%). The reaction were performed in closed reactors with a capacity of 250 mL containing 10 g of oil, a known amount content of alcohol, pre-determined by experimental design and enzyme content of 5% p/p, based on the oil mass. The reaction medium was kept under constant stirring, 200 rpm. Maximum conversion of 88,36% was achieved when high molar ration, the lower temperature and water content values were used. However, by the kinetic study, it can be concluded that it is not necessary to use an alcohol excess to achieve good conversions. After that, the behavior of Candida Antarctica lipase B immobilized in chitosan was studied in acid oleic esterification. A slower initial rate of reaction was observed in comparison to Novozym 435. The behavior of both lipases was also studied in the esterification of waste coconut oil, showing good stability and giving a conversion of about 80% in 60 minutes. Both biocatalyst could be reused 10 times, keeping the same activity. In order to compare the behavior of Novozym 435 in two different mediums, an experimental design was performed with waste cotton oil, which had a low acid value. The same negative influence of the temperature and molar ratio was observed, but with a high reaction time, getting a maximum conversion of 82,66% in 72 hours of reaction. To calculate the conversions, the decreasing of the acid value was used when the raw material had a high acid value, and when the raw material had a low acid value the glycerol production was used. / O biodiesel à uma mistura de Ãsteres alquÃlicos de Ãcidos graxos resultante da reaÃÃo entre Ãleos vegetais e Ãlcoois de cadeia curta, como metanol ou etanol, auxiliada por um catalisador, que pode ser Ãcido, bÃsico ou enzimÃtico. Entretanto, o alto custo da matÃria-prima quando se utiliza Ãleo vegetal de grau alimentÃcio tem inviabilizado economicamente a produÃÃo desse biocombustÃvel. Por isso, as pesquisas com Ãleo residual tem aumentado, mostrando a viabilidade tÃcnica da produÃÃo de biodiesel a partir de resÃduos residenciais e industriais. Outro fator que influencia a reaÃÃo de produÃÃo de biodiesel à o tipo de Ãlcool. No Brasil, o uso do etanol à interessante desde que o nosso paÃs se tornou um dos maiores produtores mundiais de etanol vegetal, um produto mais barato e menos tÃxico que o metanol, diminuindo assim a nossa dependÃncia do petrÃleo. O catalisador tambÃm exerce influÃncia nesse tipo de reaÃÃo. Os catalisadores mais usados industrialmente sÃo as bases, mas quando o Ãleo vegetal tem um alto teor de Ãcidos graxos livres, o que acontece, geralmente, com os Ãleos residuais, nÃo à possÃvel usar catalisador bÃsico por favorecer a formaÃÃo de sabÃo e diminuir o rendimento em Ãsteres. Nesse caso, usa-se um catalisador Ãcido ou enzimÃtico. Partindo dessa premissa, os resultados constantes nessa dissertaÃÃo correspondem ao estudo da produÃÃo enzimÃtica de biodiesel utilizando Ãleo residual e etanol. Avaliou-se o comportamento da lipase comercial imobilizada de CÃndida antarctica tipo B (Novozym 435) na esterificaÃÃo do Ãcido olÃico comercial, estudando as variÃveis que influenciam no processo. As variÃveis escolhidas foram: temperatura (30-50o C), razÃo molar Ãcido:Ãlcool (1:1-1:6) e a concentraÃÃo de Ãgua presente no meio (0-20%). As reaÃÃes foram conduzidas em erlenmeyers de 250 mL fechados contendo 10 g de Ãleo e a quantidade de Ãlcool prÃ-determinada pelo planejamento de experimentos, mantendo-se a agitaÃÃo fixa em 200rpm e a concentraÃÃo de enzima em 5% m/m baseada na massa de Ãleo medida, obtendo-se uma conversÃo mÃxima de 88,36% na condiÃÃo de maior razÃo molar, menor temperatura e menor concentraÃÃo de Ãgua. Entretanto, pelo estudo cinÃtico concluÃ-se que nÃo à necessÃrio um excesso de Ãlcool para conseguir boas conversÃes. Em seguida, avaliou-se o comportamento de uma lÃpase do tipo B de CÃndida antarctica imobilizada em quitosana na esterificaÃÃo do Ãcido olÃico, observando um comportamento semelhante ao da Novozym 435 mas com uma taxa inicial de reaÃÃo mais lenta. Avaliou-se tambÃm o comportamento das duas lÃpases na esterificaÃÃo do Ãleo de coco residual Ãcido, observando uma boa estabilidade para ambos os biocatalisadores que forneceram uma conversÃo acima de 80% com 60 minutos de reaÃÃo e puderam ser reutilizados por no mÃnimo 10 vezes consecutivas sem perda considerÃvel de atividade. Para comparar o comportamento da Novozym 435 em dois meios distintos, realizou-se um planejamento experimental fatorial com um Ãleo de algodÃo residual de baixa acidez livre, observando a mesma influÃncia negativa da temperatura e da razÃo molar entre reagentes, mas com um tempo de reaÃÃo maior, pois uma conversÃo mÃxima de 82,66% sà foi atingida com 72 horas de reaÃÃo. Para o cÃlculo da conversÃo, utilizou-se a reduÃÃo do Ãndice de acidez quando a matÃria-prima tinha um alto teor de Ãcidos graxos livres e o mÃtodo do periodato de sÃdio na determinaÃÃo da glicerina quando a matÃria-prima tinha uma baixa acidez livre.

Esta tese está dividida em duas partes. Na Parte I, blendas de polietileno maleado (M-PE) e butirato acetato de celulose (CAB) (5-50% em massa) e compósitos de polietileno (PE) ou M-PE e 20% em massa de celulose, acetato de celulose (CA), propionato acetato de celulose (CAP) ou CAB foram preparados em um misturador. As estruturas e propriedades das misturas foram estudadas através de ensaios mecânicos, calorimetria exploratória diferencial, microscopia eletrônica de varredura, extração com solvente seletivo seguida de espectroscopia FTIR e difração de raios-X (XRD). As blendas M-PE/CAB e os compósitos PE/polissacarídeo e M-PE/polissacarídeo não apresentaram mudanças significativas nos valores da temperatura de fusão (Tm) quando comparados aos valores de Tm do PE e do M-PE. Dados de XRD mostraram que a adição das cargas não causou mudança na estrutura cristalina do PE ou M-PE, mas aumentou a região amorfa dos materiais, indicado que a miscibilidade ocorre na parte amorfa do PE. Compósitos preparados com M-PE apresentaram tensão no escoamento e elongação superiores do que os preparados com PE, evidenciando o efeito compatibilizante do anidrido maléico. Na parte II, o efeito de dois bons solventes, acetona e acetato de etila, nas características e propriedades superficiais dos filmes finos (50nm&#60;espessura<200nm) e ultrafinos (espessura<6nm) de CA, CAP ou CAB preparados por revestimento rotacional ou adsorção, respectivamente, foram caracterizados por elipsometria, microscopia de força atômica (AFM) e medidas de ângulo de contato. Os resultados foram discutidos baseados na taxa de evaporação do solvente e na energia de interação substrato-solvente. Os efeitos do recozimento e do tipo de éster de celulose na espessura, morfologia e molhabilidade da superfície foram investigados. Após o recozimento, os filmes ultrafinos de ésteres de celulose tornam-se hidrofóbicos, indicando uma reorientação molecular na interface sólido-ar. Os filmes ultrafinos preparados a partir de soluções de acetona são estáveis, enquanto que os preparados a partir de soluções de acetato de etila apresentaram dewetting. A estabilidade dos filmes foi monitorada por AFM e explicada pelos valores da constante de Hamaker, determinados pela primeira vez para estes materiais. A imobilização de lipase sobre os filmes ultrafinos estáveis de CA, CAP e CAB com e sem recozimento foi quantificada para avaliar a possibilidade de aplicação destes filmes como substratos para biomoléculas. A adsorção de lipase sobre os filmes de CA e CAP com recozimento foi mais pronunciada do que nos mesmos filmes sem recozimento. A atividade enzimática da lipase foi avaliada com medidas espectrofotométricas do produto formado a partir da hidrólise do para-nitrofenol dodecanoato. A lipase imobilizada sobre os filmes mais hidrofóbicos apresentou uma atividade maior do que a lipase livre e manteve a atividade alta após três usos. As amostras foram estocadas por até 30 dias. A lipase imobilizada sobre os filmes mais hidrofóbicos manteve 70% da sua atividade, e a lipase imobilizada sobre os filmes mais hidrofílicos manteve apenas 30% da atividade. Estes resultados indicaram que preservação da estrutura conformacional da enzima foi favorecida pela hidrofobicidade do substrato polimérico e interações entre os resíduos polares da lipase e as partes de glucopiranosil dos ésteres de celulose. / This thesis is divided into two parts. In the first part, blends of maleated polyethylene (M-PE) and cellulose acetate butyrate (CAB) (5-50wt%) and composites of polyethylene (PE) or M-PE and 20wt% of cellulose, cellulose acetate (CA) or cellulose acetate propionate (CAP) were prepared in an laboratory mixer. The mixtures structures and properties have been studied by means of tensile testing, differential scanning calorimetry, scanning electron microscopy, X-ray diffraction (XRD) and extraction with a selective solvent followed by Raman spectroscopy. No significant change on the melting temperature (Tm) values obtained for M-PE/CAB blends or PE/polysaccharides or M-PE/polysaccharides composites could be observed, when compared with the Tm values obtained for PE and M-PE. X-ray diffraction showed that the addition of the polysaccharides had no influence on the lattice constants of PE or M-PE, but it increased the PE amorphous region, indicating that the miscibility happens on the amorphous region of the PE. Composites prepared with M-PE presented yield stress and elongation values higher than those prepared with PE, showing the compatibilizer effect of maleic anhydride. In the second part, the effect of two good solvents, acetone and ethyl acetate, on the characteristics and surface properties of thin (30nm&#60;thickness<200nm) and ultrathin (thickness<6nm) cellulose ester films obtained by spin coating or adsorption, respectively, has been investigated by means of ellipsometry, atomic force microscopy (AFM) and contact angle measurements. The results were discussed in the light of solvent evaporation rate and interaction energy between substrate and solvent. The effects of annealing and type of cellulose ester on film thickness, film morphology and surface wettability were also studied. Upon annealing, ultrathin films of cellulose ester became hydrophobic, evidencing molecular re-orientation at the solid-air interface. Ultrathin films prepared from acetone solutions are stable, but the ones prepared from ethyl acetate solutions presented dewetting. Film stability was followed by AFM and explained with basis on the Hamaker constant values, calculated for the first time for CA, CAP and CAB. The adsorption of lipase onto stable ultrathin films of cellulose esters, with and without annealing, was quantified in order to evaluate the possibility of applying such films as support for biomolecules. Lipase adsorption onto annealed CA and CAP films was more pronounced than that onto CA and CAP untreated films. Enzymatic activity was evaluated by the spectrophotometric measurement of the product formed from the hydrolysis of para-nitrophenyl dodecanoate. Lipase immobilized onto more hydrophobic films presented higher activity than free lipase and could be reused three times retaining activity at a high level. The effect of storing time on the activity of immobilized lipase was studied. Lipase immobilized onto more hydrophobic films retained 70% of activity after one month, reaching the same level of activity of free lipase, and lipase immobilized onto more hydrophilic films retained just 30% of activity after 30 days. These results indicated that enzyme preservation was favored by polymeric substrate hydrophobicity and by the interactions between the polar residues of lipase and the glucopyranosyl moieties of cellulose ester.

As enzimas constituem parte essencial à vida, sendo catalisadores capazes de aumentar em várias ordens de grandeza a velocidade da reação. As lipases, que catalisam a hidrólise de triacilglicerídeos, são enzimas versáteis e de fácil obtenção e por isso estão presentes em diversos setores da indústria e também constituem tema de estudo no meio acadêmico. Tem-se como os objetivos principais deste trabalho a elaboração de um método para se avaliar a cinética hidrólise de lipase suportada por intermédio de espectroscopia de fluorescência. O sistema utilizado foi o DAQ (diaceto-quinizarina) / quinizarina. Este sistema é propício, pois a DAQ, que não é fluorescente, quando hidrolisada resulta na quinizarina, altamente fluorescente. Para se tratar a cinética de hidrólise foi desenvolvido um modelo considerando-se duas etapas seqüenciais de hidrólise, uma vez que a enzima catalisa a quebra de apenas um grupo éster por ciclo catalítico. O modelo mostrou-se bastante fiel no ajuste dos dados experimentais obtidos, sendo possível obter a constante cinética envolvida no processo global de hidrólise, que constitui uma combinação linear das constantes cinéticas dos processos elementares. / Enzymes are essential to life and are capable to increase in many orders of magnitude the velocity of reaction. Lipases, that catalyses the hydrolysis of triacylglyceride, are versatile enzymes and easy to obtain and are present in many industry segments and also constitutes academic studies. The objective of this work is the elaboration of a method to evaluate the hydrolysis kinetic of immobilized lipase through fluorescence spectroscopy. The system used was DAQ (diacetate-quinizarin) / quinizarin. This system is auspicious because DAQ, not-fluorescent, when hydrolyzed results quinizarin, highly fluorescent. To treat the hydrolysis kinetic, a model that consider a twostep sequential reaction were developed, once the enzymes breaks only one ester in each catalytic cycle. The model agreed with the experimental data, and it was possible to obtain the global kinetic constant, that is a linear combination of the elementary constants

Les biocapteurs sont des moyens d'analyse en plein essor à la fois rapides, sélectifs et peu coûteux applicables à des domaines extrêmement variés (environnement, santé, agroalimentaire,…). Dans ce type d'outil, un élément sensible de nature biologique (anticorps, enzyme, microorganisme, ADN…) doté d'un pouvoir de reconnaissance pour un analyte ou un groupe d'analytes est associé à un transducteur pouvant être de type électrochimique, optique ou thermique. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au développement de différents biocapteurs, en se basant à l'immobilisation d'enzymes sur des microélectrodes en vue de la détection électrochimique d'analytes d'intérêt dans le domaine environnemental. Nous avons montré les potentialités d'application de deux biocapteurs conductimétrique et impédimétrique à base de lipase Candida Rugosa pour la détection directe et rapide des pesticides organophosphorés. Nous avons cherché à mieux comprendre le fonctionnement des biocapteurs et optimisé le procédé d'immobilisation des enzymes ainsi que différents paramètres de mesure afin de maximiser les performances analytiques des outils développés. Nous avons également élaboré un biocapteur impédimètrique pour une détermination très sensible de la phospholipase A2 en utilisant les nanoparticules d'or afin de renforcer la conductivité électrique. Enfin, nous avons développé un biocapteur de tyrosinase pour la détection du Bisphénol A, en se basant sur la modification électrochimique des électrodes de diamant dopé qui possèdent des propriétés électriques remarquables et uniques, avec l'ajout de nanotube de carbone multi-feuillet, ce qui permet d'améliorer des performances analytiques du biocapteur, en particulier sa limite de détection et sa stabilité. Les biocapteurs à base de lipase et de tyrosinase ont été appliqués avec succès à la quantification des composés organophosphorés et du bisphénol A respectivement dans plusieurs échantillons d'eaux réelles / A biosensor is an analytical device, used for the detection of an analyte, that combines a biological component so-called a receptor (e.g. enzyme, antibody, DNA, microorganism) to a physical transducer (e.g. electrochemical, optical or thermal). In last decade, biosensors are quite promising tools since they are rapid, selective and cost effective, with an increasing interest for their application in various fields (e.g environment, food, health). In this work, we developed different biosensors based on immobilized enzymes onto microelectrodes in view of electrochemical detection. First, we demonstrated the potentialities of conductometric and impedimeteric biosensors based on lipase from Candida Rugosa for direct and rapid detection of organophosphate pesticides. In order to enhance the analytical performances of the developed devices, we tried to optimize enzyme immobilization as well as several operational parameters. We also elaborated an impedimetric biosensor for a sensitive determination of phospholipase A2 activity. Finally, a tyrosinase biosensor was developed for ultra-sensitive detection of Bisphenol A, based on the unique proprieties of boron doped diamond electrodes and taking advantage the use of multi walled carbon naotubes to improve the stability and detection limit of biosensor. We also demonstrated the applicability of both biosensors based on lipase and tyrosinase for the detection of organophosphate pesticides and bisphenol A in river water

La famille des lipases pancréatiques est constituée de trois sous-familles : la lipase pancréatique classique (PL) et les lipases pancréatiques apparentées de type 1 et 2 (PLRP1 et PLRP2). Contrairement à la PL, qui est active seulement sur les triglycérides, la PLRP2 possède trois types d’activités enzymatiques : lipase, phospholipase de type A1 et surtout galactolipase. Cette dernière activité est particulièrement intéressante car les galactolipides, principalement les monogalactosyldiacylglycérols (MGDG) et les digalactosyldiacylglycérols (DGDG) sont les lipides les plus abondants dans la nature. Un test continu, spécifique et fiable de dosage de l’activité galactolipase à été mis au point en utilisant la technique du pH-stat et un galactolipide synthétique à chaîne moyenne comme substrat, le MGDG en C8. Ce nouveau test de dosage nous a permis de mesurer pour la première fois des activités spécifiques importantes avec les PLRP2 humaine (HPLRP2) et du cobaye (GPLRP2) (1786±100 et 5420±85 U/mg, respectivement). Nous avons par la suite utilisé cette même technique pour étudier l’hydrolyse par les PLRP2 des galactolipides naturels à chaînes longues purifiés à partir de feuilles d’épinard. Les activités spécifiques mesurées sont du même ordre de grandeur que celles mesurées avec le MGDG en C8 mais aussi le DGDG en C8 synthétique, montrant ainsi que l’activité galactolipase n’est affectée ni par la longueur de la chaîne acyle ni par la présence d’un ou de deux résidus galactoses. Grâce à ce test nous avons pu réaliser un criblage de lipases microbiennes de différentes origines à la recherche d’activités galactolipase. Dans une deuxième partie, nous avons étudié les propriétés physico-chimiques du bis-monoacylglycérol-phopshate (BMP). Nous avons montré que non seulement ce phospholipide rare est hydrolysé par la PLRP2, mais le BMP et la PLRP2 humaine peuvent être trouvés dans la même cellule, le monocyte, suggérant un nouveau rôle physiologique pour la PLRP2. / The pancreatic lipase family consists of three sub-families : the classical pancreatic lipase (PL) and the pancreatic lipase-related proteins 1 and 2 (PLRP1 and PLRP2). On the contrary to PL, which is active only on triglycerides, the PLRP2 possesses three types of enzymatic activities: lipase activity, phospholipase A1 activity and especially galactolipase activity. This latter activity is particularly interesting because monogalactosyl-diacylglycerol (MGDG) and digalactosyldiacyl-glycerol (DGDG) are the most abundant lipids in nature. A specific, continuous and robust galactolipase assay using the pH-stat technique and a synthetic medium chain MGDG as substrate was developed, and recombinant human (rHPLRP2) and guinea pig (rGPLRP2) pancreatic lipase-related proteins 2 were tested as model enzymes. This new assay allowed us to measure for the first time high specific activities with both PLRP2 (1786±100 and 5420±85 U/mg, respectively). We then used this technique to study the hydrolysis by PLRP2 of natural long chain galactolipids purified from spinach leaves. The length of acyl chains and the nature of the galactosyl polar head of the galactolipid did not have major effects on the specific activities of PLRP2, which were found to be very high on both medium chain and long chain galactolipids. We also used the pH-stat technique and medium chain MGDG and DGDG for screening several microbial lipases for their galactolipase activity.In a separate study, we investigated the physico-chemical properties of bis-monoacylglycorol-phopshate (BMP) and found that this rare phospholipid was hydrolyzed by PLRP2. Moreover, BMP and human PLRP2 could be found in the same cell, the monocyte, suggesting a new physiological role for PLRP2.

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_ladiel_luiz_pedrozo_tavares.pdf: 1056271 bytes, checksum: 10d14c9baea2d68dab838c2177a14816 (MD5) Previous issue date: 2011-10-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The bacterium Bacillus licheniformis is a versatile, and has been used currently in production of various bitecnológicos. Lipases ( E.C.3.1.1.3) are enzymes found in nature and may be obtained from animal sources, plants and microbes, the latter being widely used due to several advantages presented against the other. The use of industrial wastes for production and formulation of means of production of various bioproducts, has emerged as an alternative to minimize the disposal of tailings from various manufacturing industries, especially those from food. Ice creams are food products obtained from an emulsion of fats and proteins, with or without the addition of other ingredients and substances which have been subjected to freezing their production generates large-scale solid-liquid waste with a large amount of fat and other organic wastes. In this work I study was conducted to select an alternative means for lipase production by B. licheniformis (UCP 1014). And then the formulation of an alternative means of production, using waste from ice cream industry through a factorial design, 24. The tests occurred during 96h at 37oC The results indicated that the middle called C (glucose 1.0%, peptone 2.0%, 0.5% yeast extract, olive oil, 1.0%, NaNO3 0.1%, 0.1% KH2PO4, MgSO4. 7H2O 0.05%), indicating a lipase activity of 256 (U / ml) / min. Tests of the factorial design, the test indicated that 11 had the highest activity of 480 U / mL for lipase production. The results suggest the reuse of waste oil from the ice cream industry for the development and production of microbial lipase. / O Bacillus licheniformis é uma bactéria versátil, e tem sido utilizada atualmente na produção de diversos produtos bitecnológicos. As lipases (E.C.3.1.1.3 ) são enzimas encontradas na natureza, podendo ser obtidas de fontes animais, vegetais e microbianas, sendo essas últimas bastante utilizadas devido a série de vantagens apresentadas frente as demais. A utilização de rejeitos industriais para produção e formulação de meios de produção de diversos bioprodutos, tem surgido como uma alternativa de minimizar o descarte de rejeitos das diversas indústrias de produção, principalmente as de origem alimentícia. Sorvetes são produtos alimentícios obtidos a partir de uma emulsão de gorduras e proteínas, com ou sem a adição de outros ingredientes e substâncias que tenham sido submetidas ao congelamento, a sua produção em larga escala gera resíduos sólido-líquidos com uma grande quantidade de gorduras e outros resíduos orgânicos. Neste trabalho, inicialmente foram realizados estudos para selecionar meio alternativo para produção de lipase por B. licheniformis (UCP 1014). E a seguir a formulação de um meio alternativo de produção, utilizando um resíduo da indústria de sorvete através de um planejamento fatorial de 24. Os ensaios ocorreram durante 96h, a 37oC Os resultados obtidos indicaram que o meio denominado de C (glicose 1,0%, peptona, 2,0%, extrato de levedura 0,5%, óleo de oliva, 1,0%, NaNO3 0,1%, KH2PO4 0,1%, MgSO4. 7H2O 0,05%), apresentando uma atividade lipolítica de 256 (U/ml)/min. Os ensaios referentes ao planejamento fatorial, indicaram que o ensaio 11 apresentou a maior atividade de 480 U/mL, para a lipase produzida. Os resultados obtidos sugerem o reaproveitamento de resíduos oleosos provenientes da indústria de sorvete para formulação e produção de lipase microbiana.

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 roberta_leite_santos_reis.pdf: 1050930 bytes, checksum: b8b3fa607a305cc7525e614247e5febb (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / With the advance in biotechnology, especially related to technology of fermentation, aumejam pespectivas for bioremediation of waste. The term waste is used in a broad sense, adding not only more solid also the wastewater and the materials present in air emissions. The waste water generated in general that dairy industries have high levels of biochemical demand (BOD) and chemical oxygen (COD) with a view to a high content of fats, increase the concentration of organic matter, justifying the need to bioprocessing. In this sense we assessed the biotechnological potential of the fungus Aspergillus parasiticus isolated from soil of the Caatinga, PE, Brazil, in the production of biomolecules lipase enzyme and lipid seeking their application in bioremediation of waste from laticíneos industry. Confirmation of enzyme production by Aspergillus parasiticus was performed by culturing in standard medium in the presence of olive oil 0.5 g / L for 120 h, incubated at 28 ° C and 37 ° C respectively. The results showed that the best condition was obtained in 96 hours of cultivation at 28 ° C with a Idice 5.2 U / ml. Then tests were carried out with waste rich in oils, serum leiten (SL) and the ice cream residue (RS) from the dairy industry waste, using a 22 factorial design with three replications at the center point, for 120 hours at 28 ° C. Observed that the test 4, with 45% (RS) and 30% (SL) showed the best results in the production of biomass 68.1 g / L and lipase activity 20.0 U / mL, and greater accumulation of lipids in their biomass reaching 67.61% in lipids, suggesting that the biotreatment is possible, in addition to other applicability in biotechnology in particular the production of biodiesel, in the case of an oleaginous fungus. / Com o Avanço na área da biotecnologia, principalmente relacionadas à tecnologia das fermentações, almejam pespectivas para o biotratamento de resíduos. O termo resíduo é utilizado em sentido amplo, juntando não somente sólidos mais também os efluentes líquidos e os materiais presentes nas emissões atmosféricas. Os efluentes industriais gerados em indústrias de laticínios que em geral possuem elevados teores de demanda bioquímica (DBO) e química de oxigênio (DQO), tendo em vista um elevado conteúdo de gorduras, aumentam a concentração de matéria orgânica, Justificando a necessidade de biotratamento. Neste sentido foram avaliados o potencial biotecnológico do fungo Aspergillus parasiticus isolado do solo da Caatinga, PE, Brasil, na produção de biomoléculas de enzima lipase e lípídeos, visando à aplicação no biotratamento de resíduos da indústria de laticíneos. A confirmação da produção da enzima por A. parasiticus foi realizada com o cultivo em meio padrão na presença do óleo de oliva 0,5 g/L durante 120 h, incubados a 28°C e 37ºC, respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que a melhor condição foi obtida em 96 h de cultivo a 28°C com um ídice de 5,2 U/ml. Em seguida foram realizados ensaios com resíduos ricos em óleos, o soro de leite (SL) e o resíduo de sorvete (RS), provenientes de rejeitos das indústrias lácteas, utilizando um planejamento fatorial 22, com três repetições no ponto central, durante 120 horas a 28°C. Observam-se que o ensaio 4, com 45% de (RS) e 30% (SL) demonstravam os melhores resultados na produção de biomassa 68,1 g/L e atividade lipolítica 20,0 U/mL, e um maior acumulo de lipídeos em sua biomassa atingindo 67.61 %, sugerindo que o biotratamento é possível, além de outras aplicabilidades na biotecnologia em especial a produção de biodiesel, se tratando de um fungo oleaginoso.

O ambiente Antártico é caracterizado por condições ambientais restritivas de clima, hábitat e biogeografia. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade de leveduras em amostras marinhas e terrestres do ambiente Antártico, além da prospecção de lipases que atuem em processos que requerem baixas e moderadas temperaturas. De acordo com os resultados obtidos, 97 leveduras foram recuperadas por semeadura em meio de cultura PDA e YMA a partir de diferentes amostras coletadas na OPERANTAR XXVIII (verão 2010), das quais foram identificados 12 gêneros e 21 espécies. Destas, 45 apresentaram atividade de lipase e duas foram selecionadas para o ensaio de otimização da produção enzimática: C. laurentii L59 e L. scotti L117. A extração de lipase de L. scottii L117 foi avaliada por Sistema de Duas fases Aquosas e o sistema micelar utilizando TX-114 foi o mais eficiente para purificação parcial desta enzima. Por fim, a avaliação da diversidade das 405 leveduras isoladas de macroalgas e liquens (coletadas na OPERANTAR XXXII no verão de 2013) revelou a ocorrência de 24 taxons de leveduras a partir das amostras de macroalgas e 18 taxons a partir das amostras de liquens, sendo apenas cinco espécies comuns a estes dois substratos. / The Antarctic continent is characterized by restrictive environmental conditions of climate, habitats and biogeography. In this sense, the objective of this study was to evaluate the diversity of yeasts in marine and terrestrial samples of the Antarctic environments, as well as the propspecting of lipases that can act in proceses that require low and moderate temperatures. According to the results, 97 yeasts were recovered from different samples collected in OPERANTAR XXVIII (summer 2010), representing 21 different species. Among them, 45 showed lipase activity and two were selected for the optimization of enzyme production: C. laurentii L59 and L. scotti L117. Extraction of L. scottii L117 lipase was assessed by Aqueous Two-Phase System and the micellar system TX-114 was the most efficient for partial enzyme purification. Finally, the diversity evaluation of 405 isolates from seaweeds and lichens (collected in XXXII OPERANTAR, summer of 2013) revealed the occurrence of 24 taxa from macroalgae samples and 18 taxa from lichens samples, being only five substrates common to these two substrata.