Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont des pathogènes majeurs pour l’homme responsables de toxi-infections alimentaires pouvant évoluer vers des complications potentiellement mortelles. La pathogénicité de ces souches est essentiellement due à la production de Shiga-toxines (Stx), même si d’autres facteurs semblent jouer un rôle important dans la virulence, comme des facteurs d’adhésion. La survie et la régulation des facteurs de virulence des EHEC dans l’environnement digestif humain sont des facteurs clés dans la pathogénicité bactérienne, mais restent à ce jour mal décrits, essentiellement en raison d’un manque de modèles d’étude adaptés. De plus, l’absence de traitement spécifique a conduit à s’intéresser à des moyens préventifs et/ou curatifs alternatifs, comme l’utilisation de probiotiques. L’objectif de ce travail de thèse est (i) de mieux comprendre le comportement de la souche de référence EHEC O157:H7 EDL933 dans l’environnement digestif humain simulé, et en particulier ses interactions avec le microbiote résident et l’épithélium intestinal, et (ii) d’évaluer l’effet antagoniste d’une souche de levure probiotique vis-à-vis de la survie, la virulence et l’interaction du pathogène avec l’épithélium intestinal, à l’aide d’approches in vitro et in vivo complémentaires. En modèles digestifs in vitro, la souche EHEC survit dans l’estomac, voire se multiplie dans les parties distales de l’intestin grêle, alors qu’elle ne se maintient pas dans l’environnement colique. Les gènes de virulence codant les Stx et des adhésines majeurs (intimine et « Long Polar Fimbriae » ou Lpf) sont surexprimés dès les parties hautes du tractus digestifs, et ce, même en absence de cellules épithéliales. Les conditions rencontrées dans le tractus digestif supérieur de l’enfant, comparativement à celui de l’adulte, conduisent à une survie et un niveau d’expression des gènes codant les Stx et les Lpf plus élevés chez l’enfant, ce qui peut contribuer à expliquer la grande sensibilité de cette population aux infections à EHEC. Enfin, les Lpf semblent jouent un rôle clé dans le ciblage spécifique des cellules M et le tropisme des EHEC pour les plaques de Peyer, et ce, à la fois in vitro (cellules M en culture) et in vivo (anses iléales murines). Même si elle ne modifie pas la survie du pathogène dans l’environnement colique, la levure probiotique S. cerevisiae CNCM I-3856 a montré des propriétés antagonistes intéressantes vis-à-vis d’EHEC O157:H7 en (i) modulant favorablement l’activité fermentaire du microbiote intestinal, (ii) diminuant significativement l’expression des gènes codant les Stx et (iii) inhibant la translocation bactérienne au travers des plaques de Peyer et les lésions hémorragiques associées. Par ailleurs, l’effet du pathogène et des probiotiques sur le microbiote colique est individu dépendant, confortant l’hypothèse que des facteurs associés à l’hôte, comme le microbiote, pourraient conditionner l’évolution clinique des infections à EHEC et l’efficacité d’une stratégie probiotique.Ce travail de thèse contribue à une meilleure compréhension du comportement des EHEC dans l’environnement digestif humain et confirme l’intérêt d’une stratégie probiotique dans la lutte contre le pathogène. Une étude plus approfondie du transcriptome du pathogène dans l’environnement digestif et une analyse par des méthodes haut débit du microbiote intestinal permettraient de continuer à mieux décrire la physiopathologie des infections à EHEC et comprendre les mécanismes associés à l’effet antagoniste des probiotiques. / The enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are major zoonotic pathogens responsible for food-borne infectionwhich leads to life-threatening complications in humans. The main virulence determinant of EHEC is the production of Shigatoxins (Stx), even if other factors seem to play an important role in virulence, such as adhesion factors. Survival and virulenceof EHEC strains in the human digestive environment are a key factor in bacterial pathogenesis but remains unclear owing tolack of relevant model. Moreover, no specific treatment has led to interest in preventative and / or curative alternatives, suchas using probiotics. The objective of this study is to better understand the behavior of the reference strain EHEC O157:H7EDL933 in the entire digestive tract, and in particular its interaction with the resident microbiota and the intestinal epithelium,and to evaluate the antagonistic effect of the probiotic yeast, Saccharomyces cerevisiae CNCM I-3856, using in vitro and in vivo complementary approaches.In vitro, bacterial mortality was noticed in the stomach, whereas bacterial growth resumption was observed in thedistal parts of the small intestine and the pathogen was not able to maintain in the human colonic conditions. Virulence genesencoding Stx and adhesins (intimin and “Long polar fimbriae”) are upregulated in the upper parts of the digestive tract. A ten-time higher amount of cells was found in the ileal effluents of infant compared to adult. stx genes were over-expressed (up to25-fold) in infant conditions compared to the adult ones. This results show that differences in digestive physicochemicalparameters of the upper gastrointestinal tract may partially explain why infants are more susceptible to EHEC infection thanadults. And finally, Lpf seem to play a key role in the interactions of EHEC with murine Peyer’s patches and are needed for anactive translocation of the pathogen across M cells, and both in vitro (M cells culture) and in vivo (murine ileal loops).S. cerevisiae had not effect on EHEC survival in the colonic environment but (i) favorably influenced gut microbiotaactivity through beneficial modulation of short chain fatty acid production, (ii) leading to significantly decrease stx expressionand (iii) significantly reduced EHEC translocation through M cells and inhibited in vivo interactions of the pathogen withPeyer’s patches and the associated hemorrhagic lesions. Probiotic had donor-dependent effect on the gut microbiota strengthenthe hypothesis that host-associated factors such as microbiota could influence the clinical evolution of EHEC infection and theeffectiveness of a probiotic strategy.This work contributes to a better understanding of the behavior of EHEC in the human digestive environment andconfirms the interest of probiotic strategy in controlling EHEC infections. Further transcriptome studies are warranted for thepathogen in the human digestive environment, with or without probiotics for the better understanding of the pathophysiologyof EHEC and so on the mechanisms involved in the antagonistic effect of probiotics.

Le projet HODISS dans le cadre duquel s'effectue nos travaux adresse la problématique de la synchronisation globale des systèmes complexes sur puce (System-on-Chip ou SOCs, par exemple un multiprocesseur monolithique). Les approches classiques de distribution d'horloges étant devenues de plus en plus obsolètes à cause de l'augmentation de la fréquence d'horloge, l'accroissement des temps de propagation, l'accroissement de la complexité des circuits et les incertitudes de fabrication, les concepteurs s’intéressent (pour contourner ces difficultés) à d'autres techniques basées entre autres sur les oscillateurs distribués. La difficulté majeure de cette dernière approche réside dans la capacité d’assurer le synchronisme global du système. Nous proposons un système d'horlogerie distribuée basé sur un réseau d’oscillateurs couplés en phase. Pour synchroniser ces oscillateurs, chacun d'eux est en fait une boucle à verrouillage de phase qui permet ainsi d'assurer un couplage en phase avec les oscillateurs des zones voisines. Nous analysons la stabilité de l'état synchrone dans des réseaux cartésiens identiques de boucles à verrouillage de phase entièrement numériques (ADPLLs). Sous certaines conditions, on montre que l'ensemble du réseau peut synchroniser à la fois en phase et en fréquence. Un aspect majeur de cette étude réside dans le fait que, en l'absence d'une horloge de référence absolue, le filtre de boucle dans chaque ADPLL est piloté par les fronts montants irréguliers de l'oscillateur local et, par conséquent, n'est pas régi par les mêmes équations d'état selon que l'horloge locale est avancée ou retardée par rapport au signal considéré comme référence. Sous des hypothèses simples, ces réseaux d'ADPLLs dits "auto-échantillonnés" peuvent être décrits comme des systèmes linéaires par morceaux dont la stabilité est notoirement difficile à établir. L'une des principales contributions que nous présentons est la définition de règles de conception simples qui doivent être satisfaites sur les coefficients de chaque filtre de boucle afin d'obtenir une synchronisation dans un réseau cartésien de taille quelconque. Les simulations transitoires indiquent que cette condition nécessaire de synchronisation peut également être suffisante pour une classe particulière d'ADPLLs "auto-échantillonnés". / The HODISS project, context in which this work is achieved, addresses the problem of global synchronization of complex systems-on-chip (SOCs, such as a monolithic multiprocessor). Since the traditional approaches of clock distribution are less used due to the increase of the clock frequency, increased delay, increased circuit complexity and uncertainties of manufacture, designers are interested (to circumvent these difficulties) to other techniques based among others on distributed synchronous clocks. The main difficulty of this latter approach is the ability to ensure the overall system synchronization. We propose a clock distribution system based on a network of phase-coupled oscillators. To synchronize these oscillators, each is in fact a phase-locked loop which allows to ensure a phase coupling with the nearest neighboring oscillators. We analyze the stability of the synchronized state in Cartesian networks of identical all-digital phase-locked loops (ADPLLs). Under certain conditions, we show that the entire network may synchronize both in phase and frequency. A key aspect of this study lies in the fact that, in the absence of an absolute reference clock, the loop-filter in each ADPLL is operated on the irregular rising edges of the local oscillator and consequently, does not use the same operands depending on whether the local clock is leading or lagging with respect to the signal considered as reference. Under simple assumptions, these networks of so-called “self-sampled” all-digital phase-locked-loops (SS-ADPLLs) can be described as piecewise-linear systems, the stability of which is notoriously difficult to establish. One of the main contributions presented here is the definition of simple design rules that must be satisfied by the coefficients of each loop-filter in order to achieve synchronization in a Cartesian network of arbitrary size. Transient simulations indicate that this necessary synchronization condition may also be sufficient for a specific class of SS-ADPLLs.

<p>U radu se proučava poreklo funkcija, veza sistema povreatnih sprega sa uspostavljanjem funkcija, primarne funkcije kao funkcije fizičkog protoka između adaptivnih sistema i njihovog okruženja, perceptivno-analitičke funkcije kao funkcije informacionih protoka između adaptivnih sistema i okruženja, strukture obrazaca prirodnog i ljudskom rukom oblikovanih delova okruženja i sistemi ideja u oblikovanju okruženja.</p> / <p>Origins of functions, connections of feedback systems with emerging of<br />functions, primary functions as functions of physical flow between adaptive<br />systems and their environment, perceptual-analytical functions as functions<br />of information flow between adaptive systems and their environment,<br />structures of patterns (levels of form) of natural and human designed<br />elements of environment, historical developement and complexification of<br />relationships of human soci-eties with their environment.</p>

Le microscope à force atomique (AFM) est un outil privilégié pour sonder la matière à l'échelle nanométrique. Dans cette thèse, nous l'utilisons comme instrument de mesure de force. Nous montrons que la mesure des fluctuations thermiques des ressorts permet de déterminer précisément leur raideur à condition d'utiliser un modèle qui prend en compte la forme des modes et la méthode de détection. A l'aide de nouvelle méthodes d'analyse des courbes de rétraction, nous étudions la conformation de polymères et de copolymères adsorbés, ainsi que l'interaction spécifique entre un complexe du nickel (Ni-NTA) et l'acide aminé histidine. Nous mettons en évidence des comportements inattendus en présence de liens multiples et nous en proposons une interprétation basée sur un équilibre entre formations et ruptures des liaisons. Nous présentons des premiers résultats expérimentaux concernant la transition conformationnelle de la polylysine sous étirement.

Magnetic Resonance Imaging, Computed Tomography, and other image modalities are routinely used to visualize a particular structure in the patient's body. The classification of the image region corresponding to this structure is called segmentation. For applications in Neuroscience, it is important for the segmentation of a brain scan to represent the boundary of the brain as a folded surface with no holes. However the segmentation of the brain generally exhibits many erroneous holes. Consequently we have developed an algorithm for automatically correcting holes in segmented medical scans while preserving the accuracy of the segmentation. Upon concepts of Discrete Topology, we remove the holes based on the smallest modification to the image. First we detect each hole with a front propagation and a Reeb graph. Then we search for a number of loops around the hole on the isosurface of the image. Finally we correct the hole in the image using the loop that minimizes the modification to the image. At each step we limit the size of the data in memory. With these contributions our algorithm removes every hole in the image with high accuracy and low complexity even for images too large to fit into the main memory. To help doctors and scientists to obtain segmentations without holes, we have made our software publicly available at http://www.OpenTopology.org. / Les images par Résonance Magnétique, la Tomographie par Rayons X et les autres modalités d'imagerie médicale sont utilisées quotidiennement pour visualiser une structure particulière dans le corps du patient. La classification de la région de l'image qui correspond à cette structure s'appelle la segmentation. Pour des applications en Neuroscience, il est important que la segmentation d'une image du cerveau représente la surface extérieure du cerveau comme une surface pliée sans trous. Cependant la segmentation du cerveau présente généralement de nombreux trous. Par conséquent, nous avons développé un algorithme pour corriger automatiquement les trous dans les images médicales segmentées tout en préservant la précision de la segmentation. Sur des concepts de Topologie Discrète, nous enlevons les trous en fonction de la plus petite modification apportée à l'image. D'abord nous détectons chaque trou avec un certain nombre de boucles autour du trou sur l'isosurface de l'image. Finalement nous corrigeons le trou dans l'image en utilisant la boucle qui minimise la modification de l'image. A chaque étape, nous limitons la taille des données en mémoire. Grâce à ces contributions notre algorithme enlève tous les trous dans l'image avec une grande précision et une faible complexité même pour des images trop grandes pour tenir dans la mémoire de l'ordinateur. Pour aider les médecins et les chercheurs à obtenir des segmentations sans trous, nous avons rendu notre logiciel disponible publiquement à http://www.OpenTopology.org.

Ultra narrow-band filters and the use of two loops in a cascade configuration dominate current clock conditioners based on phase-locked-loop (PLL) schemes. Since a PLL exhibits a low-pass transfer function with respect to the reference clock, the noise performance at very close-to-carrier offset frequencies is still determined by the input signal. Although better cleaning can be achieved with extremely narrow loops, an ultra low cut-off frequency could not be selected since the stability of the configuration deteriorates as the filter bandwidth is reduced. This fact suggests that a full-spectrum clock conditioning is not possible using traditional PLL architectures, and an alternative scheme is necessary to attenuate the very-close-to-carrier phase noise (PN). In addition, ultra-narrow loop filters can compromise on-chip integration because of the large size capacitors needed when chosen as passive. Input signal attenuation with relaxed bandwidth requirements becomes the main aspect that a comprehensive clock cleaner must address to effectively regenerate a reference signal. This dissertation describes the Band-Reject Nested-PLL (BRN-PLL) scheme, a modified PLL-based architecture that provides an effective signal cleaning procedure by introducing a notch in the input transfer function through inner and outer loops and a high-pass filter (HPF). This modified response attenuates the reference-signal PN and reduces the size of the loop-filter capacitors substantially. Ultra narrow loops are no longer required because the notch size is related to the system bandwidth. The associated transfer function for the constitutive blocks (phase detectors and local oscillators) show that the output close-to-carrier and far-from-carrier PN sections are mainly dominated by the noise from the inner-PLL phase detector (PD) and local oscillator (LO) located in the outer loop, respectively. The inner-PLL PD transfer function maintains a low-pass characteristic with a passband gain inversely proportional to the PD gain becoming the main contribution around the carrier signal. On the other hand, the PN around the transition frequency is determined mainly by the reference and the inner-PLL LO. Their noise contributions to the output will depend on the associated passband local maxima, which is located at the BRN-PLL transition frequency. Hence, in this region, the inner-PLL LO is selected so that its effect can be held below that of the outer-PLL PD. The BRN-PLL can use a high-Q MEMS-based VCO to further improve the transition region of the output PN profile and an LC-VCO as outer-PLL LO to reduce the noise floor of the output signal. In particular, two tuning mechanisms are explored for the MEMS-VCO: series tuning using varactors and phase shifting of a resonator operating in nonlinear regime. Both schemes are implemented to generate a tunable oscillator with no PN-performance degradation.

This thesis reports the inspection and manipulation of thin ferroelectric films of lead titanate (PbTiO3 : PTO), lead zirconium titanate (Pb(Zr0.25Ti0.75)O3 : PZT), and barium titanate (BaTiO3 : BTO) by means of scanning force microscopy - specifically Piezoresponse and Kelvin-Probe. The film thickness of the investigated samples ranged between 50nm and 800nm. This experimental work focussed on the following issues: native domain structures, creation of domains by short voltage pulses and area-switching with the force microscope, local qualitative and quantitative measurements of the ferroelectric hysteresis loops, and investigations at the interface between film and platinum-electrode in the PZT/Pt-System. Lamellar domain structures were visualized with high lateral resolution of 5nm on the surface of the PTO-samples, whereas the PZT- and BTO-samples showed prepolarisation and no domains. In the switching experiments a pronounced thickness dependence was found and partly a good agreement to macroscopic measurements. For BTO-films of 50nm and 125nm thickness no stable switching of polarisation could be observed. Using appropriate preparation methods it was possible to provide evidence of a 200nm thick interface layer with reduced polarisation above the electrode in the PZT/Pt-system. / Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung dünner ferroelektrischer Schichten von Bleititanat (PbTiO3 : PTO), Bleizirkoniumtitanat (Pb(Zr0.25Ti0.75)O3 : PZT) und Bariumtitanat (BaTiO3 : BTO) und deren Manipulation auf der sub-µm-Skalamittels Rasterkraftmikroskopie. Die Dicke der Schichten lag im Bereich von 50nm bis 800nm. Zum Einsatz kamen die Meßmodi Piezoresponse und Kelvin-Sonde. Die experimentelle Arbeit erstreckte sich über die Abbildung von Domänenstrukturen, die Erzeugung von Domänen durch kurze Spannungspulse und flächiges Umschalten mit dem Kraftmikroskop, lokale qualitative und quantitative Messungen der ferroelektrischen Hysterese, sowie Untersuchungen an der Grenzschicht zwischen Film und Platin-Elektrode am PZT/Pt-System. Lamellenartige Domänenstrukturen konnten mit hoher lateraler Auflösung von 5nm auf der Oberfläche von PTO abgebildet werden. Die PZT- und BTO-Proben waren vorpolarisiert und es ließen sich keine Domänen nachweisen. Bei den Schaltversuchen wurde eine ausgeprägte Schichtdickenabhängigkeit der Koerzitivfeldstärken und teilweise gute Übereinstimmung mit makroskopischen Messungen gefunden. Für dünne BTO-Schichten von 50nm und 125nm Dicke konnte kein stabiles Umschalten der Polarisation gezeigt werden. Mittels geeigneter Präparation der PZT/Pt-Grenzschicht konnte durch direkte Messung eine Schicht von 200nm Dicke mit verminderter Polarisation oberhalb der Elektrode nachgewiesen werden.

Le surenroulement de l’ADN est important pour tous les processus cellulaires qui requièrent la séparation des brins de l’ADN. Il est régulé par l’activité enzymatique des topoisomérases. La gyrase (gyrA et gyrB) utilise l’ATP pour introduire des supertours négatifs dans l’ADN, alors que la topoisomérase I (topA) et la topoisomérase IV (parC et parE) les éliminent. Les cellules déficientes pour la topoisomérase I sont viables si elles ont des mutations compensatoires dans un des gènes codant pour une sous-unité de la gyrase. Ces mutations réduisent le niveau de surenroulement négatif du chromosome et permettent la croissance bactérienne. Une de ces mutations engendre la production d'une gyrase thermosensible. L’activité de surenroulement de la gyrase en absence de la topoisomérase I cause l’accumulation d’ADN hyper-surenroulé négativement à cause de la formation de R-loops. La surproduction de la RNase HI (rnhA), une enzyme qui dégrade l’ARN des R-loops, permet de prévenir l’accumulation d’un excès de surenroulement négatif. En absence de RNase HI, des R-loops sont aussi formés et peuvent être utilisés pour déclencher la réplication de l’ADN indépendamment du système normal oriC/DnaA, un phénomène connu sous le nom de « constitutive stable DNA replication » (cSDR). Pour mieux comprendre le lien entre la formation de R-loops et l’excès de surenroulement négatif, nous avons construit un mutant conditionnel topA rnhA gyrB(Ts) avec l’expression inductible de la RNase HI à partir d’un plasmide. Nous avons trouvé que l’ADN des cellules de ce mutant était excessivement relâché au lieu d'être hypersurenroulé négativement en conditions de pénurie de RNase HI. La relaxation de l’ADN a été montrée comme étant indépendante de l'activité de la topoisomérase IV. Les cellules du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) forment de très longs filaments remplis d’ADN, montrant ainsi un défaut de ségrégation des chromosomes. La surproduction de la topoisomérase III (topB), une enzyme qui peut effectuer la décaténation de l’ADN, a corrigé les problèmes de ségrégation sans toutefois restaurer le niveau de surenroulement de l’ADN. Nous avons constaté que des extraits protéiques du mutant topA rnhA gyrB(Ts) pouvaient inhiber l’activité de surenroulement négatif de la gyrase dans des extraits d’une souche sauvage, suggérant ainsi que la pénurie de RNase HI avait déclenché une réponse cellulaire d’inhibition de cette activité de la gyrase. De plus, des expériences in vivo et in vitro ont montré qu’en absence de RNase HI, l’activité ATP-dépendante de surenroulement négatif de la gyrase était inhibée, alors que l’activité ATP-indépendante de cette enzyme demeurait intacte. Des suppresseurs extragéniques du défaut de croissance du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) qui corrigent également les problèmes de surenroulement et de ségrégation des chromosomes ont pour la plupart été cartographiés dans des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des R-loops, ou la formation de fimbriae. La deuxième partie de ce projet avait pour but de comprendre les rôles des topoisomérases de type IA (topoisomérase I et topoisomérase III) dans la ségrégation et la stabilité du génome de Escherichia coli. Pour étudier ces rôles, nous avons utilisé des approches de génétique combinées avec la cytométrie en flux, l’analyse de type Western blot et la microscopie. Nous avons constaté que le phénotype Par- et les défauts de ségrégation des chromosomes d’un mutant gyrB(Ts) avaient été corrigés en inactivant topA, mais uniquement en présence du gène topB. En outre, nous avons démontré que la surproduction de la topoisomérase III pouvait corriger le phénotype Par- du mutant gyrB(Ts) sans toutefois corriger les défauts de croissance de ce dernier. La surproduction de topoisomérase IV, enzyme responsable de la décaténation des chromosomes chez E. coli, ne pouvait pas remplacer la topoisomérase III. Nos résultats suggèrent que les topoisomérases de type IA jouent un rôle important dans la ségrégation des chromosomes lorsque la gyrase est inefficace. Pour étudier le rôle des topoisomérases de type IA dans la stabilité du génome, la troisième partie du projet, nous avons utilisé des approches génétiques combinées avec des tests de « spot » et la microscopie. Nous avons constaté que les cellules déficientes en topoisomérase I avaient des défauts de ségrégation de chromosomes et de croissance liés à un excès de surenroulement négatif, et que ces défauts pouvaient être corrigés en inactivant recQ, recA ou par la surproduction de la topoisomérase III. Le suppresseur extragénique oriC15::aph isolé dans la première partie du projet pouvait également corriger ces problèmes. Les cellules déficientes en topoisomérases de type IA formaient des très longs filaments remplis d’ADN d’apparence diffuse et réparti inégalement dans la cellule. Ces phénotypes pouvaient être partiellement corrigés par la surproduction de la RNase HI ou en inactivant recA, ou encore par des suppresseurs isolés dans la première partie du projet et impliques dans le cSDR (dnaT18::aph et rne59::aph). Donc, dans E. coli, les topoisomérases de type IA jouent un rôle dans la stabilité du génome en inhibant la réplication inappropriée à partir de oriC et de R-loops, et en empêchant les défauts de ségrégation liés à la recombinaison RecA-dépendante, par leur action avec RecQ. Les travaux rapportés ici révèlent que la réplication inappropriée et dérégulée est une source majeure de l’instabilité génomique. Empêcher la réplication inappropriée permet la ségrégation des chromosomes et le maintien d’un génome stable. La RNase HI et les topoisomérases de type IA jouent un rôle majeur dans la prévention de la réplication inappropriée. La RNase HI réalise cette tâche en modulant l’activité de surenroulement ATP-dependante de la gyrase, et en empêchant la réplication à partir des R-loops. Les topoisomérases de type IA assurent le maintien de la stabilité du génome en empêchant la réplication inappropriée à partir de oriC et des R-loops et en agissant avec RecQ pour résoudre des intermédiaires de recombinaison RecA-dépendants afin de permettre la ségrégation des chromosomes. / DNA supercoiling is important for all cellular processes that require strand separation and is regulated by the opposing enzymatic effects of DNA topoisomerases. Gyrase uses ATP to introduce negative supercoils while topoisomerase I (topA) and topoisomerase IV relax negative supercoils. Cells lacking topoisomerase I are only viable if they have compensatory mutations in gyrase genes that reduce the negative supercoiling level of the chromosome to allow bacterial growth. One such mutation leads to the production of a thermosensitive gyrase (gyrB(Ts)). Gyrase driven supercoiling during transcription in the absence of topoisomerase I causes the accumulation of hypernegatively supercoiled plasmid DNAs due to the formation of R-loops. Overproducing RNase HI (rnhA), an enzyme that degrades the RNA moiety of R-loops, prevents the accumulation of hypernegative supercoils. In the absence of RNase HI alone, R-loops are equally formed and can be used to prime DNA replication independently of oriC/DnaA, a phenomenon known as constitutive stable DNA replication (cSDR). To better understand the link between R-loop formation and hypernegative supercoiling, we constructed a conditional topA rnhA gyrB(Ts) mutant with RNase HI being conditionally expressed from a plasmid borne gene. We found that the DNA of topA rnhA gyrB(Ts) cells was extensively relaxed instead of being hypernegatively supercoiled following the depletion of RNase HI. Relaxation was found to be unrelated to the activity of topoisomerase IV. Cells of topA rnhA gyrB(Ts) formed long filaments full of DNA, consistent with segregation defect. Overproducing topoisomerase III (topB), an enzyme that can perform decatenation, corrected the segregation problems without restoring supercoiling. We found that extracts of topA rnhA gyrB(Ts) cells inhibited gyrase supercoiling activity of wild type cells extracts in vitro, suggesting that the depletion of RNase HI triggered a cell response that inhibited the supercoiling activity of gyrase. Gyrase supercoiling assays in vivo as well as in crude cell extracts revealed that the ATP dependent supercoiling reaction of gyrase was inhibited while the ATP independent relaxation reaction was unaffected. Genetic suppressors of a triple topA rnhA gyrB(Ts) strain that restored supercoiling and corrected the chromosome segregation defects mostly mapped to genes that affected DNA replication, R-loop metabolism and fimbriae formation. The second part of this project aimed at understanding the roles of type IA DNA topoisomerases (topoisomerase I and topoisomerase III) in chromosome segregation and genome maintenance in E. coli. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in chromosome segregation we employed genetic approaches combined with flow cytometry, Western blot analysis and microscopy (for the examination of cell morphology). We found that the Par- phenotypes (formation of large unsegregated nucleoid in midcell) and chromosome segregation defects of a gyrB(Ts) mutant at the nonpermissive temperature were corrected by deleting topA only in the presence of topB. Moreover, overproducing topoisomerase III was shown to correct the Par- phenotype without correcting the growth defect, but overproducing topoisomerase IV, the major cellular decatenase, failed to correct the defects. Our results suggest that type IA topoisomerases play a role in chromosome segregation when gyrase is inefficient. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in genome maintenance, in the third part of the project, we employed genetic approaches combined with suppressor screens, spot assays and microscopy. We found that cells lacking topoisomerase I suffered from supercoiling-dependent growth defects and chromosome segregation defects that could be corrected by deleting recQ, recA or overproducing topoisomerase III and by an oriC15::aph suppressor mutation isolated in the first part of the project. Cells lacking both type 1A topoisomerases formed very long filaments packed with diffuse and unsegregated DNA. Such phenotypes could be partially corrected by overproducing RNase HI or deleting recA, or by suppressor mutations isolated in the first part of the project, that affected cSDR (dnaT18::aph and rne59::aph). Thus, in E. coli, type IA DNA topoisomerases play a role in genome maintenance by inhibiting inappropriate replication from oriC and R-loops and by preventing RecA-dependent chromosome segregation defect through their action with RecQ. The work reported here reveals that inappropriate and unregulated replication is a major source of genome instability. Preventing such replication will ensures proper chromosome segregation leading to a stable genome. RNase HI and type IA DNA topoisomerases play a leading role in preventing unregulated replication. RNase HI achieves this role by modulating ATP dependent gyrase activity and by preventing replication from R-loops (cSDR). Type IA DNA topoisomerases ensure the maintenance of a stable genome by preventing inappropriate replication from oriC and R-loops and by acting with RecQ to prevent RecA dependent-chromosome segregation defects.

Thesis (Doctora).

Malgré les vastes études démontrant le rôle de la conformation génomique dans le contrôle transcriptionnel, de nombreuses questions restent en suspens, et en particulier, comment ces structures chromatiniennes sont formées et maintenues. Pour mieux comprendre les liens entre l’état de la chromatine au niveau des éléments régulateurs, la topologie de la chromatine et la régulation de la transcription, nous utilisons la technique CHi-C basée sur la technologie de capture de la conformation chromosomique (3C). En utilisant deux stratégies de capture ciblant deux différentes structure chromatiniennes (les boucles chromatiniennes et les domaines topologiques), nous avons pu décrypter la structure chromatinienne associée à la différenciation des thymocytes et mettre en évidence des mécanismes de contrôle transcriptionnel de certains gènes. Les expériences futures de l’équipe vont consister à examiner les facteurs (hors transcription) qui peuvent influencer l'architecture de la chromatine, comme la liaison différentielle des CTCF, et comment ces facteurs peuvent être coordonnés par le contrôle de transcription. / Chromosome folding takes place at different hierarchical levels, with various topologies correlated with control of gene expression. Despite the large number of recent studies describing chromatin topologies and their correlations with gene activity, many questions remain, in particular how these topologies are formed and maintained. To understand better the link between epigenetic marks, chromatin topology and transcriptional control, we use CHi-C technique based on the chromosome conformation capture (3C) method. By using two capture strategies targeting two different chromatin structures (chromatin loops and topological domains), we have been able to decipher the chromatin structure associated with thymocyte differentiation and to highlight mechanisms for the transcriptional control of certain genes. Future experiments of the lab will examine mechanisms other than transcription which may influence chromatin architecture, such as differential binding of CTCF, and how these may interplay with transcriptional control and chromatin architecture.