LRP1 est un récepteur d’endocytose multifonctionnel capable non seulement d’interagir avec de nombreux ligands et de réguler leur endocytose, mais également de moduler certaines voies de signalisation intracellulaire. Ce récepteur se révèle implique dans de nombreux mécanismes physiologiques et pathologiques, comme l’athérosclérose, la maladie d’Alzheimer ou encore le cancer. La multiplicité de ses partenaires fait émerger le concept selon lequel LRP1 est capable de réguler le protéome membranaire et ainsi d’influencer le comportement migratoire de nombreuses cellules. De plus, les résultats récents obtenus au sein de notre laboratoire indiquent que ce récepteur d’endocytose est capable de contrôler la dynamique d’adhérence des cellules tumorales. Nous avons donc cherche à identifier un nouveau partenaire membranaire de LRP1, capable de participer à la régulation de l’adhérence tumorale. Notre étude s’est portée sur le récepteur d’adhérence CD44. L’utilisation de RAP, un antagoniste de LRP1 révèle que ce récepteur d’endocytose module la présence de CD44 à la membrane plasmique. Nous avons également découvert que ces deux récepteurs colocalisent fortement dans la cellule tumorale, que ce soit à la surface cellulaire ou au niveau intracellulaire. De plus LRP1 et CD44 co-immunoprécipitent à partir d’extraits totaux et membranaires, indiquant que ces deux récepteurs sont fortement associés au sein d’un même complexe moléculaire. L’étude de la répartition membranaire du complexe LRP1/CD44 a montré qu’il était en grande partie situé dans les radeaux lipidiques et particulièrement les cavéoles. Toutefois ces structures n’apparaissent pas nécessaires à l’établissement du complexe et ne sont pas impliquées dans les processus d’endocytose relatifs à ces récepteurs. En effet, des expérimentations visant à quantifier l’endocytose de CD44 couplées à différents traitements (β-MCD, conditions hyperosmotiques) révèlent que l’endocytose de ce complexe implique principalement la voie des vésicules tapissées de clathrine. Nous avons également démontré que ce mécanisme dynamique permettait de réguler l’adhérence tumorale. Enfin, des travaux sur le shedding de CD44 ont permis d’identifier les protéases impliquées (MT1MMP, ADAMs 10 et 17) et mettent en évidence un effet protecteur de LRP1 sur le clivage de l’ectodomaine de CD44. / The low-density lipoprotein receptor-related protein-1(LRP-1) is a large endocytic recept or mediating the clearance of various molecules from the extracellular matrix. In the field of cancer, LRP1-metiated endocytosis was first associated to anti-properties. However, recent results suggested that LRP-1 may coordinate the adhesion-deadhesion balance in malignant cells to support tumor progression. Here, we observed that LRP-1-silencing or RAP (receptor-associated protein) treatment led to tumor cell surface accumulation of CD44. Moreover, we evidenced a tight interaction between CD44 and LRP-1, not exclusively localized in lipid rafts. Overexpression of LRP-1-derived mini-receptors indicated that the fourth ligand-binding cluster of LRP-1 is required to bind CD44. CD44 labeling with EEA1 and LAMP-1 showed that internalized CD44 was highly reduced under hyperosmotic conditions but poorly affected by membrane cholesterol depletion, revealing that it proceeds mostly via clathrin-coated pits. Finally, we demonstrated that CD44-silencing abolishes RAP-induced tumor cell attachment, revealing that cell-surface accumulation of CD44 under LRP-1 blockade is mainly responsible for the stimulation for tumor cell adhesion. Altogether, our data shed light on the LRP-1 mediated internalization of CD44 that appeared critical to define the adhesive properties of tumor cells.

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ShcA (Src Homology and Collagen A) est une protéine adaptatrice qui se lie à la partie cytoplasmique de LRP1 (Low Density Lipoprotein-related receptor 1), un récepteur transmembranaire qui protège contre l'athérosclérose. La calcification vasculaire est une complication majeure de cette maladie et ses mécanismes ressemblent au processus d’ostéochondrogenèse. Nous avons étudié le rôle de ShcA endothélial dans la formation des lésions d’athérosclérose ainsi que les rôles de ShcA et LRP1 dans la chondrogenèse. ShcA endothélial participe à la formation des lésions d’athérosclérose in-vivo. En inhibant la NOS endothéliale et activant l’expression de ICAM-1 via ZEB1, ShcA favorise l’adhésion des monocytes. La suppression de ShcA dans les chondrocytes a conduit au développement de souris présentant un phénotype de nanisme par une inhibition de la différenciation hypertrophique des chondrocytes. Ceci conduit également à une diminution du développement de l’arthrose liée au vieillissement. La suppression de LRP1 dans les chondrocytes conduit également à un phénotype de nanisme chez la souris, mais par des mécanismes différents. / ShcA (Src Homology and Collagen A) is an adaptor protein that binds to the cytoplasmic tail of the Low Density Lipoprotein-related receptor1 (LRP1), a trans-membrane receptor that protects against atherosclerosis. Vascular calcification is a major complication of this disease and its mechanisms highly resemble the process of osteochondrogenesis. We studied the role of endothelial ShcA in atherosclerotic lesion formation as well as the roles of ShcA and LRP1 in chondogenesis. Endothelial ShcA participates in the formation of atherosclerotic lesions in-vivo. By inhibiting endothelial NOS and activating the expression of ICAM-1 via ZEB1, ShcA enhances monocyte adhesion. The deletion of ShcA in chondrocytes led to the development of mice with a dwarfism phenotype by inhibiting chondrocyte hypertrophic differentiation. This also led to a decrease in the development of age-related osteoarthritis. The deletion of LRP1 in chondrocytes also led to a dwarfism phenotype in our mouse model, but trough different mechanisms.

CXCR3 appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G. Avec ses ligands, les chimiokines CXC, CXCR3 régule diverses fonctions biologiques et participe à de nombreux processus comme l’angiogenèse, l’inflammation et le cancer. La complexité de CXCR3 provient de son épissage alternatif qui conduit à des isoformes distinctes. CXCR3-A est reconnu pour promouvoir la prolifération, la survie et la migration cellulaire tandis que CXCR3-B induit des signaux inhibiteurs de la croissance cellulaire.Le modèle cellulaire U87, dérivé d’un glioblastome humain, a été utilisé afin d’étudier les mécanismes moléculaires régulant l'activité et le trafic des isoformes de CXCR3 dans les cellules tumorales. CXCR3 est le récepteur fonctionnel de l’activité angiostatique de CXCL4 et son variant CXCL4L1. En fonction de leur état d'oligomérisation, ces deux chimiokines ont des interactions préférentielles avec les isoformes de CXCR3. L’activation de CXCR3-A conduit à un important changement conformationnel et induit des voies de signalisation pro-migratoires. L’étude du trafic souligne l’importance de la clathrine et du réseau Trans-Golgi dans l’internalisation et le recyclage de CXCR3-A. Pour la première fois, LRP-1 a été identifié comme nouveau partenaire de CXCR3-A. LRP1 n’est pas seulement reconnu comme un récepteur de l’endocytose mais également comme une protéine de la signalisation. LRP1 interagit avec CXCR3-A au niveau extracellulaire et régule sa conformation, son trafic et son activité pro-tumorale.L'utilisation de modèles cellulaires d'adénocarcinome pancréatique a permis de caractériser CXCL4L1 comme facteur pro-tumoral, via l’activation de CXCR3-A dans les cellules tumorales. CXCL4L1 apparait pour la première fois comme un biomarqueur important dans la progression du cancer pancréatique.Dans les différents modèles, les signalisations chimiokines CXC/CXCR3-A induisent une augmentation des propriétés invasives tumorales. Au niveau moléculaire, l’association de CXCR3 à diverses protéines (ligands et partenaires) est essentielle pour réguler les fonctions biologiques de la cellule tumorale.Les nanoparticules sont désormais connues comme une nouvelle génération d'anticorps thérapeutiques présentant de nombreux avantages par rapport aux anticorps conventionnels. Ainsi, le développement de nanoparticules associées à des inhibiteurs de CXCR3 apparaît comme une nouvelle stratégie thérapeutique anti-tumorale prometteuse. / CXCR3 belongs to the G-protein-coupled receptors family. With its ligands, the CXC chemokines, CXCR3 regulates several biological functions and plays important roles in angiogenesis, inflammation and cancer. The interaction with CXCR3 is rather complex due to the presence of distinct spliced isoforms. CXCR3-A is known to promote cell proliferation, survival, and migration while CXCR3-B leads to cell growth inhibition.The human glioblastoma cell model, U87, was used to study the molecular mechanisms regulating the activity and trafficking of CXCR3 isoforms in tumor cells. CXCR3 has been reported as the functional receptor for the angiostatic activity of CXCL4 and its variant CXCL4L1. Depending on their oligomerization status, these two chemokines present preferential interaction with CXCR3 isoforms. Activation of CXCR3-A leads to an important conformational change and induces pro-migratory signaling pathways. Studies on the vesicular trafficking highlight the importance of the clathrin and the Trans-Golgi network for both internalization and recycling of CXCR3-A. For the first time, LRP-1 is identified as a new partner of CXCR3-A. LRP1 is not only recognized as an endocytic receptor but also as a signaling protein. LRP1 interacts with CXCR3-A via its extracellular α subunit and regulates CXCR3-A conformation, trafficking and pro-tumoral activity.Pancreatic ductal adenocarcinoma cell models were used to characterize CXCL4L1 as a pro-tumoral factor that activates CXCR3-A in tumor cells. For the first time, CXCL4L1 appears as an important biomarker for pancreatic cancer progression.In the different cell models, signaling pathways of CXC chemokine/CXCR3-A lead to an increase in tumor invasive properties. At the molecular level, the association of CXCR3 with various proteins (ligands and partners) is essential to regulate tumor cell biological functions.The nanoparticles are now known as a new generation of therapeutic antibodies with many advantages over conventional antibodies. Thus, the development of nanoparticles associated to CXCR3 inhibitors appears as a new promising pharmacological targeted strategy to treat cancer.

Tesi realitzada al Centre d' Investigació Cardiovascular (CSIC-ICCC), de l' Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona / Las alteraciones del metabolismo lipídico causadas por la isquemia miocárdica tienen profundos efectos en el estado fisiológico del corazón. En el corazón isquémico, la hipoxia incrementa la formación de vacuolas lipídicas en zonas periféricas al área de riesgo al aumentar la síntesis endógena de triglicéridos y reducir la beta-oxidación de ácidos grasos. A su vez, durante la hipoxia, las células musculares lisas de la pared vascular (VSMC) tienen una captación incrementada de lipoproteínas de baja densidad (LDL). Se ha descrito un efecto sinérgico entre la hipoxia y la acumulación de lipoproteínas en la inducción de genes inflamatorios y genes involucrados en el metabolismo lipídico. Los estudios realizados in vitro e in vivo demuestran que el receptor de LDL (LDLR) no es el responsable de la captación incrementada de colesterol en células vasculares sometidas a hipoxia pues está regulado positivamente por los SREBP de tal forma que la acumulación de colesterol inhibe su expresión. Sin embargo el receptor LRP1 está regulado negativamente por los SREBP por lo que, independientemente de los niveles de colesterol intracelular, es capaz de captar el colesterol de las lipoproteínas y sobreacumularlo en la célula. Además el LRP1 está sobreexpresado por la hipoxia en las VSMC de las arterias coronarias y puede explicar mecanísticamente los efectos sinérgicos entre hipoxia e hipercolesterolemia en la acumulación lipídica intracelular. Actualmente se desconoce el papel del LRP1 en el cardiomiocito y las consecuencias de las alteraciones en su expresión sobre el metabolismo lipídico. Se ha descrito que la lipoprotein lipasa presente en la superficie de los cardiomiocitos media la captación de lipoproteinas utilizando un receptor no identificado hasta el momento para la captación selectiva de colesterol. Por otro lado, se sabe que el LRP1 media la captación selectiva de colesterol por células vasculares. Todos estos resultados sugieren que el LRP1 podría participar en la captación de lípido por el cardiomiocito, y dejan entrever la importancia de los mecanismos moleculares involucrados en su modulación. En primera instancia los objetivos fueron analizar el efecto de la hipoxia en la expresión del receptor LRP1 en cardiomiocitos neonatales de rata y HL-1, así como los mecanismos involucrados en este efecto. También determinar el papel del LRP1 en la captación de VLDL en condiciones de hipoxia por los cardiomiocitos. Nuestros resultados, publicados en el artículo “Low-density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates hypoxia-induced very low density lipoprotein-cholesteryl ester uptake and accumulation in cardiomyocytes”, demostraron que la hipoxia incrementa la expresión del LRP1 a través del factor inducible por hipoxia HIF-1α, y ésta sobreexpresión induce la captación y acumulación de colesterol esterificado procedente de VLDL en cardiomiocitos. A continuación estudiamos el efecto de dosis hipercolesterolémicas de LDL e hipertrigliceridémicas de VLDL en la expresión del LRP1 en cardiomiocitos, así como la correlación entre la expresión del LRP1 y la acumulación lipídica en el ventrículo izquierdo de pacientes con cardiomiopatía isquémica. Publicados en el artículo “Low-density lipoprotein receptor-related protein 1 expression correlates with cholesteryl ester accumulation in the myocardium of ischemic cardiomyopathy patients” nuestros resultados sugieren que la regulación al alza del LRP1 juega un papel primordial en la acumulación de ésteres de colesterol en el miocardio de corazones isquémicos y esto puede suponer un “target” con el fin de prevenir efectos deletéreos de esta acumulación en la cardiomiopatía isquémica. Por último, en el tercer artículo, “Low-density lipoproteins promote unstable calcium handling linked to reduced SERCA2 and connexin-40 expression in cardiomyocytes”, observamos que el colesterol procedente de LDL desestabiliza el manejo del calcio por parte de cardiomiocitos HL-1 al reducir la expresión de SERCA2 y la velocidad de conducción del calcio por la Conexina40. / "Role of the low density lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP1) in ischemia and cardiovascular pathophysiology" Currently, it is unknown the role of LRP1 in the cardiomyocyte and the consequences of its changes in expression on lipid metabolism. It has been reported that lipoprotein lipase, present on the surface of cardiomyocytes, mediates the uptake of lipoproteins using an unidentified receptor so far for the selective uptake of cholesterol. Furthermore, it is known that the LRP1 mediates the selective uptake of cholesterol by vascular cells. All these results suggest that LRP1 may be involved in lipid uptake and accumulation by the cardiomyocyte and show the importance of understanding the molecular mechanisms involved in the modulation of LRP1 by hypoxia. In the first instance the objectives were to analyze the effect of hypoxia on LRP1 receptor expression in neonatal rat cardiomyocytes and HL-1, and the mechanisms involved in this effect. Also determine the role of LRP1 in VLDL uptake under hypoxia by cardiomyocytes. Our findings, published in the article "Low-density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates hypoxia-induced very low density lipoprotein-cholesteryl ester uptake and accumulation in cardiomyocytes", showed that hypoxia increases LRP1 expression through transcription factor HIF-1α, and this overexpression induces the uptake and accumulation of cholesteryl esters from VLDL in cardiomyocytes. Then, we estudied the effect of LDL and VLDL in the LRP1 expression, and the correlation between LRP1 expression and lipid accumulation in the left ventricle of patients with ischemic cardiomyopathy. Published in the article "Low-density lipoprotein receptor-related protein 1 Expression Correlates with cholesteryl ester accumulation in the myocardium of ischemic cardiomyopathy patients" our results suggested that the LRP1 upregulation plays a role in cholesterol accumulation in the ischemic myocardium and this could be a "target" in order to prevent deleterious effects of this accumulation. Finally we analyzed the effects of LDL on calcium handling by cardiomyocytes HL-1. In the third article, "Low-Density Lipoproteins Promote unstable linked to calcium handling Reduced SERCA2 and connexin-40 expression in cardiomyocytes", we observed that colesterol from LDL destabilizes calcium handling by cardiomyocytes HL-1 reducing SERCA2 expression and calcium conduction velocity by Connexin40.

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LRP1 (low-density lipoprotein receptor–related protein 1), un récepteur endocytaire multifonctionnel, a récemment été identifié comme pivot d’un réseau de biomarqueurs pour la prédiction pronostique de plusieurs types de cancers. Son rôle dans le cancer du côlon n'a pas été caractérisé. Notre travail porte sur l’étude de la relation entre expression de LRP1 et cancer du côlon.L'expression de l'ARNm LRP1 a été déterminée dans des échantillons d'adénocarcinome et de muqueuses coliques appariées, ainsi que dans les cellules stromales et tumorales obtenues après microdissection laser. Les associations clinicopathologiques et moléculaires ont été étudiées par immunohistochimie dans une série de cancer colique (n = 307). La présence de méthylation ou mutation du gène LRP1 et l'expression de miR-205 ont été évaluées et comparées aux niveaux d'expression de LRP1.L’ARNm de LRP1 est sous exprimé dans les cellules d'adénocarcinome colique par rapport à la muqueuse colique par rapport aux cellules stromales. La faible expression immunohistochimique de LRP1 dans les adénocarcinomes était associée à un âge plus élevé, à localisation droite, une perte d'expression de CDX2, une expression d'Annexine A10, un statut CIMP-H, MSI-H et BRAFV600E muté. Cette faible expression était associée à un mauvais pronostic, en particulier chez les patients de stade IV. Les mutations du gène LRP1 entrainaient une sous-expression de LRP1. L’expression était peu modifiée par miR-205. Le promoteur de LRP1 n'était jamais méthylé.La perte d'expression de LRP1 est associée à un profil clinico-pathologique et moléculaire particulier et à un un mauvais pronostic dans les cancers du côlon. / LRP1 (low-density lipoprotein receptor–related protein 1), a multifunctional endocytic receptor, has recently been identified as a hub in a biomarker network for multi-cancer clinical outcome prediction. Its role in côlon cancer has not been characterized. Here, we investigate the relationship between LRP1 and colon cancer.LRP1 mRNA expression was determined in colon adenocarcinoma and paired colon mucosa samples, and in stromal and tumoral cells obtained after laser capture microdissection. The clinical potential was further investigated by immunohistochemistry in a population-based colon cancer series (n = 307). LRP1 methylation, mutation and miR-205 expression were evaluated and compared to LRP1 expression levels.LRP1 mRNA levels are significantly decreased in colon adenocarcinoma cells compared to colon mucosa and stromal cells. Low LRP1 immunohistochemical expression in adenocarcinomas was associated with higher age, right-sided tumor, loss of CDX2 expression, Annexin A10 expression, CIMP-H, MSI-H and BRAFV600E mutation. Low LRP1 expression correlates with poor clinical outcome, especially in stage IV patients. LRP1 expression was downregulated by LRP1 mutation. LRP1 expression was slightly modified by miR-205 expression. LRP1 promoter was never methylated.Loss of LRP1 expression is associated with peculiar clinocopathological and molecular characteristics and with worse colon cancer outcomes.

L’athérosclérose débute par l’accumulation de cholestérol dans les cellules des parois artérielles, formant des plaques d’athéromes. LRP1 protège contre la maladie en inhibant l’accumulation intracellulaire de cholestérol et nous avions montré qu’une signalisation Wnt5a était impliquée dans cette inhibition. Le projet de thèse consistait à caractériser les mécanismes moléculaires de cette inhibition et à vérifier l’effet athéroprotecteur de Wnt5a. Nous avons montré in vitro et in vivo que Wnt5a inhibe l’accumulation de cholestérol via la stimulation de son export et l’inhibition de sa synthèse endogène. Nous avons ensuite observé que l’invalidation de Wnt5a spécifiquement dans les CMLv de souris LDLR-/- conduit à une augmentation des lésions athéromateuses après un régime riche en cholestérol, confirmant alors son rôle athéroprotecteur. Nos travaux ont ainsi permis de révéler le potentiel de Wnt5a en tant que cible thérapeutique dans le traitement contre l’athérosclérose. / Protects against intracellular cholesterol accumulation and we identified the secreted protein Wnt5a as a partner of this inhibitory effect of LRP1. The aim of this thesis is to determine the molecular mechanisms by which the LRP1/Wnt5a signaling pathway prevents cholesterol accumulation in cells and to study the antiatherogenic potential of Wnt5a. We first showed in vitro and in vivo that Wnt5a decreases cellular cholesterol content by stimulating its efflux through the induction of cholesterol transporters expression and by down-regulating the expression of HMGCoA-reductase. Then we used mice deleted for Wnt5a specifically in smooth muscle cells, which present more atherosclerotic lesions than control mice after a high cholesterol diet. This confirms that Wnt5a protects against atherosclerosis and could be an interesting therapeutic target in the treatment of the disease.

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques est nécessaire. Dans ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à deux pathologies cardiovasculaires : l’athérosclérose et l’insuffisance cardiaque. Récemment, nous avons identifié le récepteur LRP1 et la protéine adaptatrice ShcA comme étant deux protéines impliquées dans deux de ces pathologies cardiovasculaires. Nousavons montré que ShcA joue un rôle protecteur dans l’insuffisance cardiaque. Chez les souris déficientes en ShcA au niveau cardiaque, nous observons une cardiomyopathie caractérisée par une dilatation du ventricule gauche associée à une perte de la contractilité. Nous avons montré que ShcA est essentiel à l’organisation des sarcomères et ceci très tôt durant l’embryogenèse. Dans une deuxième partie nous avons montré qu’en l’absence de PPARgamma, LRP1 était nécessaire à la calcification vasculaire en activant la voie prochondrogénique de Wnt5a. Nous avons montré que PPARgamma protège de la calcification vasculaire en induisant l’expression de Sfrp2 qui agit comme un antagoniste de Wnt5a. / Cardiovascular disease is the number one cause of death worldwide. A better understanding of the pathophysiological mechanisms is necessary. In this thesis we are focused on two cardiovascular diseases: atherosclerosis and heart failure. Recently, we identified the LRP1 receptor and the adapter protein ShcA as two proteins involved in two of these cardiovascular diseases. We have shown that ShcA exerts a protective role against heart failure. Mutant mice lacking ShcA in the heart exhibit a dilated cardiomyopathy with reduced cardiac contractility. Myocyte ultrastructure analysis shows that Shc A is essential to maintain sarcomeric intégrity in early embryonic heart development. in last part we have shown vascular calcification in the absence of PPARgamma requires expression of LRP1 in vascular smooth muscle cells. LRP1 promotes a Wnt5a-dependent prochondrogenic pathway. We show that PPARgamma protects against vascular calcification by inducing the expression of secreted frizzled-related protein-2 (Sfrp2, wich functions as a Wnt5a antagonist.