A disfunção de músculos esqueléticos (DME) é comum na síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) causada por infecções (sepse). Tal disfunção é relacionada à presença de citocinas, espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO). Contudo, não existem dados sobre a ocorrência de DME durante SIRS causada por isquemia e reperfusão intestinal (IRI). Assim, este trabalho teve como objetivo analisar a presença de algumas citocinas, marcadores da produção de ROS e NO em músculo diafragma (DIAF) e tibial anterior (TA) de ratos após reperfusão (R) de 2 e 6 h. Avaliamos também o consumo de oxigênio (CO) e a função contrátil (FC) do DIAF em após 2 h de R. Os resultados mostram que a IRI aumenta a expressão de citocinas, altera a via L-arginina-NO e causa danos oxidativos em lipídeos e proteínas em DIAF e TA, porém de forma dependente do tecido e do tempo de R. Ainda, o CO estimulado por malato está aumentado após 2 h de R. Estas alterações não afetam a FC do DIAF após 2 h de R, mas podem ser importantes para o desenvolvimento de DME em tempos posteriores. / Skeletal muscle dysfunction (SMD) is common during systemic inflammatory response syndrome (SIRS) caused by infection (sepsis). SMD is associated with increased production of cytokines, nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS). However, there are no data concerning its occurrence during SIRS caused by intestinal ischemia and reperfusion (IIR). Then, our objectives were to analyze the presence of some cytokines, NO and markers of ROS production in diaphragm (DIA) and in tibialis anterior (TA) from rats submitted to 2 and 6 h of reperfusion (R) after ischemia. We also evaluated oxygen consumption (OC) and contractile force (CF) of DIA after 2 h of R. Results show that IIR increases inflammatory cytokines, causes oxidative damages in lipids and proteins, and changes L-arginine-NO pathway. Both DIA and TA are affected but in different patterns and depending on R period. Moreover, OC stimulated by malate was increased. These alterations did not affect CF of DIA after 2 h of R, but must be important to the development of SMD in more prolonged periods of R.

Avaliamos o efeito da administração de sinvastatina no processo inflamatório induzido através de lesão muscular esquelética. Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos, sendo que um grupo não recebeu nenhuma intervenção, um segundo grupo recebeu tratamento com sinvastatina durante 15 dias consecutivos, um terceiro grupo recebeu o mesmo tratamento com sinvastatina e foi submetido a um protocolo de lesão do músculo tibial anterior, enquanto o último grupo apenas foi submetido ao protocolo de lesão muscular. Realizamos análise histológica, atividade de CK, extravasamento protéico, níveis de proteína c-reativa, expressão gênica de COX-1, COX-2 e TNF-a, níveis de citocinas inflamatórias (TNF-a, IL-1b e IL-6) e níveis de PGE2. O tratamento com sinvastatina provocou danos morfológicos e estruturais no músculo esquelético, confimados pela análise histólogica e atividade elevada de CK. Porém não observamos alteração nos níveis de citocinas inflamatórias e outros marcadores do processo inflamatório, sugerindo possível efeito-antiinflamatório do fármaco. / We evaluated the effect of simvastatin administration in inflammatory process induced by skeletal muscle injury. Male Wistar rats were divided into four experimental groups, the first group does not received any intervention, the second group was treated with simvastatin for 15 consecutive days, the third group was also treated at same way with simvastatin and animals were submitted to muscle injury of anterior tibialis, and the fourth group was just submitted to skeletal muscle injury protocol. We performed histological analysis, CK, protein extravasation, CRP levels, gene expression of COX-1, COX-2 and TNF-a, inflammatory cytokine levels (TNF-a, IL-1b and IL-6) and PGE2 levels. Treatment with simvastatin was able to promote morphological and structural damages in skeletal muscle, which was confirmed by histological analysis and enhanced CK activity. However this does not changed inflammatory cytokine levels and other inflammatory markers, which suggests a possible anti-inflammatory effect of this drug.

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:44:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yano_ClaudiaLumy_D.pdf: 4912629 bytes, checksum: 823824d694d0140eada41a1aa8e689a5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Metais pesados como o cádmio são considerados agentes tóxicos devido sua extensiva utilização nas indústrias e agropecuária e, como conseqüência, são amplamente dispersados no meio ambiente. No entanto, o cádmio tem sido foco, também, de inúmeras pesquisas relacionadas a exposição humana e suas conseqüências patológicas como o câncer. Estudos, claramente, caracterizam as relações de tumor de pulmão com a inalação do cádmio e mostram a possível participação deste metal tanto na iniciação quanto na progressão tumoral. Por outro lado, são raros os relatos da literatura envolvendo o mecanismo de ação do cádmio em tecido muscular, uma vez que já foi observado acúmulo desse metal em musculatura esquelética de animais. A administração do cloreto de cádmio, metal pesado designado como carcinogênico, em linhagem de células musculares esqueléticas C2C12 promoveu lesões consistentes com estresse oxidativo, observado pela diminuição da viabilidade celular, aumento da peroxidação de lipídios (conteúdo de malondialdeído) e conseqüente diminuição da enzima antioxidante glutationa transferase (GST). O estresse oxidativo, possivelmente, alterou a adesão celular e, conseqüentemente, houve retração dos miotúbulos, observada através de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura (Capítulo I- Trabalho publicado no periódico Free Radical Biology & Medicine, 2005). A atenuação das lesões promovidas pelo cloreto de cádmio em linhagem de células C2C12 foi verificada com o pré-tratamento com o sulfato de zinco antecedendo o tratamento com cloreto de cádmio. Os efeitos protetores foram observados através da preservação da viabilidade celular, da GST, e diminuição do conteúdo de malondialdeído. A ação protetora foi verificada, também, na maior preservação da adesão celular, principalmente, contra as maiores concentrações de cádmio (Capítulo II- Trabalho a ser submetido ao periódico Free Radical Biology & Medicine). Por outro lado, a exposição crônica de células tumorais, linhagem de adenocarcinoma de cólon MAC13, ao cloreto de cádmio promoveu alterações morfológicas associadas ao aumento da atividade mitocondrial, interferência quanto à atividade lisossomal e diminuição da viabilidade celular, principalmente, na maior concentração de cádmio, após 24hs de exposição (Capítulo III- Trabalho a ser submetido ao periódico International Journal of Cancer) / Abstract: The heavy metals as cadmium are a toxic agent since it is extensively utilized in industry and can be amply distributed in environment. The cadmium is research focused as its pathological consequences in human exposure as it has been classified as carcinogenic agent. This fact is evident since the cadmium inhalation can be related to lung tumour and many studies show the possible participation of the cadmium on tumoral cells initiation and progression. However, few studies observed that cadmium can be accumulated in animal skeletal muscle cells and its action mechanisms are not completed known. The cadmium chloride exposure promoted oxidative stress and morphologic changes in C2C12 myotubes cell, in vitro, associated to decrease on cellular viability, high lipid peroxidation (increase on malondialdehyde content, MDA) and decrease on glutathione-S-transferase (GST) activity. The cadmium chloride produced chances on the cellular adhesion, integrity and retraction in C2C12 myotubes cells. These effects could be attenuated by zinc sulphate pre-treatment, which maintained the cellular viability, GST activity, reducing the MDA content. The zinc sulphate pre-treatment preserved the cellular adhesion, especially in high cadmium chloride concentration. Additionally, the tumoral cells (colon adenocarcinoma MAC 13) chronically exposed to cadmium chloride showed increase on the mitochondrial activity, and reduction on lysosomal and cellular viability, especially at high cadmium chloride concentration after 24h of treatment, probably indicating the tumoral cell changes / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Introdução: O pré-condicionamento isquêmico tem a capacidade de minimizar as lesões decorrentes do processo de isquemia e reperfusão. O pós-condicionamento isquêmico, descrito posteriormente, apresenta resultados semelhantes na proteção contra as lesões por isquemia e reperfusão em miocárdio, cérebro, rins, músculo esquelético e medula espinhal. Objetivo: Avaliar o efeito do pré e do pós-condicionamentos isquêmicos bem como sua associação sobre a lesão tecidual em músculo esquelético de ratos submetidos ao processo de isquemia e reperfusão. Método: Foram utilizados 50 ratos Wistar, distribuídos em cinco grupos de 10 animais: grupo Controle, em que se realizou isquemia parcial por clampeamento aórtico infra-renal (240 min) e reperfusão (60 min); Grupo Sham, fez-se o mesmo procedimento cirúrgico, porem sem o clampeamento da aorta abdominal; grupo Pós-condicionamento, onde precedendo o início da reperfusão, foi realizado o pós-condicionamento isquêmico (três ciclos de um minuto de reperfusão intercalados por três ciclos de um minuto de isquemia); grupo Pré-condicionamento, precedendo ao período isquêmico procedeu-se ao pré-condicionamento isquêmico(três ciclos de 5 min de isquemia intercalados por três ciclos de 5 min de reperfusão); grupo Pré e Pos-condicionamento, neste grupo associaram-se os dois métodos. Avaliaram-se os resultados pela dosagem de enzimas tissulares (aspartato aminotransferase-AST, creatinofosfoquinase-CK e desidrogenase lática-DHL), malondialdeído (MDA) e glicogênio tissular com tratamento estatístico. Resultado: Houve elevação significativa dos níveis de CK em todos os grupos em relação ao grupo sham. A AST elevou-se no grupo pré+pós-condicionamento em relação ao grupo controle. O comportamento da LDH foi semelhante entre os grupos. O marcador de lesão de membrana celular representado pelo MDA mostrou-se elevado em todos os grupos, exceto no grupo pós-condicionamento em relação ao grupo sham. Não ocorreu diferença entre os grupos isquêmicos e reperfundidos. Quanto à reserva energética ocorreu queda significativa do glicogênio no grupo controle em relação aos grupos sham, pré-condicionamento e pré+pós-condicionamento, exceto no grupo pós. Conclusão: Concluiu-se que o pré-condicionamento bem como a associação do pré com o pós-condicionamento isquêmico foram capazes de minimizar a lesão tecidual em musculatura estriada de ratos submetidos à isquemia e reperfusão, porém a associação dos métodos não trouxe vantagens adicionais sobre os mesmos aplicados isoladamente / Background: Ischemic preconditioning has the ability to reduce injuries resulting from ischemia and reperfusion. Ischemic post-conditioning, described later, shows similar protective results against injury by ischemia and reperfusion in myocardium, brain, kidney, skeletal muscle, and spinal cord. Objective: To evaluate the effect of ischemic pre- and post-conditioning and their combination on protection against skeletal muscle tissue injury in rats subjected to ischemia and reperfusion. Methods: We used 50 Wistar rats divided into five groups of 10 animals each: Control group, subjected to partial ischemia by infrarenal aortic clamping (240 min) and reperfusion (60 min); Sham group, subjected to the same surgical procedure but without clamping of the abdominal aorta; Post-conditioning group, in which ischemic post-conditioning was performed before the onset of reperfusion (three cycles of one min of reperfusion interspersed with three cycles of one min ischemia); pre-conditioning group, subjected to ischemic pre-conditioning prior to the ischemic period (three cycles of 5 min ischemia interspersed with three cycles of 5 min reperfusion); pre-and post-conditioning group, in which the two methods were used in combination. Results were evaluated by measuring levels of tissue enzymes (aspartate aminotransferase (AST), creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA) and tissue glycogen, with statistical analysis. Results: There was a significant elevation of CK levels in all groups compared to the sham group. AST increased in the pre- + post-conditioning group compared to the control group. The behavior of LDH was similar for all groups. The marker of cell membrane damage represented by MDA was high in all groups except the post-conditioning one compared to the sham group. No significant difference was observed between the ischemic and reperfused groups. As to the energy reserve (glycogen), a significant decrease occurred in the control group compared to the sham, pre-conditioning and pre- + post-conditioning groups, but not in the post-conditioning group. Conclusion: We conclude that pre-conditioning and combined pre - and post-conditioning were able to minimize tissue injury in the skeletal muscle of rats subjected to the ischemia and reperfusion process, but the combined methods did not bring about additional advantages compared to each method applied aloneT

Lesões musculoesqueléticas são a principal causa de perda econômica na indústria do cavalo de corrida. Levantamentos epidemiológicos sobre lesões e acidentes ocorridos durante a corrida e os treinamentos dentro dos Jockey Clubes e centros de treinamento têm sido realizados mundialmente. Em geral, encontram-se diferenças regionais nos padrões dessas lesões. O Serviço de Veterinária do Jockey Club do Rio Grande do Sul é responsável por realizar a avaliação e liberação clínica dos animais antes de cada prova. Animais não aptos a participar da corrida são submetidos ao “forfait” veterinário. Com o objetivo de identificar as principais alterações que afetaram os cavalos durante os treinamentos de corrida foi feita a avaliação dos registros veterinários de “forfait” do Jockey Club do Rio Grande do Sul. Além disso, objetivou-se também verificar a influência de fatores como idade e gênero do cavalo e a estação do ano sobre a frequência e distribuição das alterações musculoesqueléticas. Foram analisados 1940 registros de forfait veterinário entre os anos de 1999 e 2009. Realizou-se uma análise epidemiológica analítica descritiva através de uma estatística não paramétrica além de uma análise estatística de correspondência múltipla a fim de verificar a associação das variáveis envolvidas na frequência das lesões. Do total de alterações registradas, 69% (1338) estavam relacionadas ao sistema musculoesquelético e as afecções mais incidentes foram localizadas nos membros torácicos que corresponderam por mais de 79,23% do total enquanto que as alterações localizadas nos membros pélvicos responderam por 14,72% do total de alterações musculoesqueléticas. Alterações musculares e de coluna contribuíram com 6,05% do total. As afecções mais frequentes (p<0,05) foram as da articulação metacarpofalangeana, seguidas pelas afecções do carpo e casco. Houve significativa influência (p<0,05) da faixa etária na maior parte das alterações avaliadas, sendo o maior número de alterações observada em cavalos de 3 anos de idade. Foi constatado que o gênero também influiu significativamente em algumas alterações, sendo os machos mais acometidos. Por sua vez, as estações do ano também apresentaram diferenças significativas, sendo no inverno a maior ocorrência de “forfait” veterinário por alterações musculoesqueléticas. / Musculoskeletal injuries are the major cause of economic loss in the horse racing industry. Epidemiological surveys on injuries and accidents during the race and training within the Jockey Club and training centers have been conducted worldwide. In general, are regional differences in the patterns of these lesions. There are some peculiarities in the training of race horses as the work on the lane, early in the life of animals and intensity of athletic training. The Veterinary Service Commission Racing of the Jockey Club of Rio Grande do Sul is responsible for performing the clinical evaluation and release of animals prior to each event. Animals not able to participate in the race are subject to "forfait" veterinarian. In order to identify the main changes that affected horses during training race was made the evaluation of veterinary records of "forfait" the Jockey Club of Rio Grande do Sul also aimed to also check the influence of factors such as age, gender of the horse and the season on the frequency and distribution of musculoskeletal abnormalities. We analyzed 1940 records of veterinary “forfait” between the years 1999 and 2009. There was a descriptive analysis by analytical epidemiological a non-parametric statistics and a statistical analysis of multiple correspondence to verify the association of the variables involved in the frequency of lesions. The total changes recorded, 69% (1338) were related to musculoskeletal disorders and more incidents were found in the forelimbs, which corresponded for more than 79% of the total while the localized changes in the hindlimbs accounted for 14% of total musculoskeletal abnormalities. Muscle disorders and column contributed 6% of the total. The most frequent diseases (p <0.05) were the metacarpophalangeal joint, followed by disorders of the carpus and hull. There was a significant influence (p <0.05) of age most of the changes evaluated, with the largest number of changes observed in horses 3 years old. It was found that gender also significantly influenced in some changes, with males being more affected. In turn, the seasons also showed significant differences, and in winter the greater occurrence of "winter holidays" vet for musculoskeletal abnormalities.

Orientador: Denise Vaz de Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T10:10:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gandra_PauloGuimaraes_D.pdf: 3901290 bytes, checksum: ee5d5ae8b4367d8ada3a77f8e845aec2 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A presente tese apresenta os resultados de dois estudos utilizando análise proteômica, sobre os efeitos agudos e crônicos do exercício de endurance no músculo de ratos. No primeiro estudo foram coletadas amostras de gastrocnemio de animais controle não exercitados, e exercitados em teste incremental de media duração em esteira ate a exaustão. Os ratos foram sacrificados 3h e 24h após o exercício. Utilizamos a abordagem clássica da análise proteômica quantitativa, que utiliza a eletroforese bidimensional (2DE) para separação das proteínas, e a espectrometria de massas para identificação destas proteínas. Seis spots apresentaram alterações significativas no volume relativo. Os spots identificados como gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase 1, subunidade beta da piruvato desidrogenase E1, carnitina palmitoil transferase 2 e HSC70 mostraram-se mais abundantes apos o exercício. Já o spot identificado como ?-actina mostrou-se menos abundante apos o exercício. Estes resultados sugerem que um único estímulo de endurance em animais destreinados não estimula a síntese de proteínas miofibrilares, mas sim de proteínas sarcoplasmáticas e mitocondriais. Essas alterações no músculo destreinado serviriam para precondicionar o músculo para realização de um exercício subsequente. No segundo estudo apresentamos a análise proteômica da porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnemio de ratos controle não treinados (C), de ratos bem adaptados ao exercício de endurance (T1), e de ratos treinados e submetidos a um período de overtraining (T2). Os ratos do grupo T2 foram subdivididos ainda em grupo overreaching funcional (FOR), que exibiram aumento ou manutenção do desempenho após o overtraining, e grupo overreaching não funcional (NFOR), cujo nível de desempenho estava diminuído apos o overtraining. Na comparação entre C, T1 e T2, 32 spots demonstraram alterações no GV e 22 no GB. No GV as maiores alterações ocorreram no grupo T2. As proteínas com aumento na abundancia indicam aumento da biogênese mitocondrial, da capacidade de captar lipídeos, maior capacidade antioxidante, maiores abundancia de chaperonas e transformação das fibras no sentido de rápidas para lentas, sugerindo que um período de overtraining e eficiente em adaptar o músculo esquelético. Já no GB as adaptações esperadas com o treinamento de endurance não foram aparentes. A diminuição da abundância de spots da aconitase sugere um maior ataque oxidativo no GB do que no GV. Após o estímulo crônico proteínas do miofilamento e de interação com o miofilamento e citoesqueleto demonstraram abundância alterada. No seu conjunto, nossos resultados sugerem que a resposta inicial do músculo a um único estimulo de endurance envolve um aumento inespecífico da capacidade de produção de ATP, enquanto a estimulação crônica aumenta somente a capacidade oxidativa, com uma concomitante diminuição da abundancia de proteínas glicoliticas. Além disso, chamam a atenção para um papel chave das mitocôndrias e proteínas dos miofilamentos e citoesqueleto no processo adaptativo e maldaptativo ao exercício. / Abstract: In the present work the acute and chronic changes in rat skeletal muscle in response to endurance exercise were investigated by proteomic analysis. The results are presented in two separated studies. In the first study gastrocnemius muscle were sampled from control non exercised animals and from animals exercised to exhaustion in an incremental manner in a treadmill. Exercised rats were sacrificed 3 and 24h after exercise cessation. We used the classic proteomic approach which utilizes two dimensional electrophoresis (2DE) to separate the proteins and mass spectrometry to identify these proteins. Six spots presented significant alterations in their relative volume. Spots identified as GAPDH, triose phosphate isomerase 1, beta subunit of pyruvate dehydrogenase E1, carnitine palmitoil transferase 2 and HSC70 were up-regulated after exercise. The spot identified as ?-actin was down-regulated after exercise. This results suggests that one bout of endurance exercise in untrained muscle may stimulate sarcoplasmic and mitochondrial proteins synthesis but not myofibril proteins. Proteins presenting increased abundance after one single bout of endurance exercise may be important for the preconditioning of skeletal muscle for a subsequent exercise bout. In the second study we present the proteomic analysis of the red (RG) and white portion (WG) of gastrocnemius muscle sampled from rats well adapted to endurance exercise (T1), well trained and submitted to an overtraining period (T2) and from control non exercised rats (C). Rats from group T2 were also subdivided in a functional overreaching group (FOR) which is composed by rats demonstrating an enhanced or unchanged performance after the overtraining period or a non functional overreaching group (NFOR) which is composed by rats demonstrating decreased performance levels after the overtraining period. When comparing C, T1 and T2, 32 spots demonstrated altered abundance in RG and 22 in the WG. The main alterations in RG were observed in the T2 group and indicated increased mitochondrial biogenesis, increased capacity of lipid uptake, antioxidant capacity, chaperone function, and a shift of fiber type from a fast-glycolytic to a slow-oxidative pattern. All these changes demonstrated the efficiency of an intensified training period to adapt skeletal muscle. The expected adaptations to endurance training were not evident in WG and the results such as decreased aconitase spots volume suggest higher oxidative stress levels in WG than in RG during overtraining. Myofilament and myofilament interacting proteins abundance were altered after chronic endurance stimuli. The results presented here suggests that the initial response of skeletal muscle to one single bout of endurance exercise encompasses an nonspecific increase of ATP production capacity while chronic stimulation increases only the oxidative capacity with a concomitant decrease in glycolytic proteins abundance. Also the results draw attention to the roles of mitochondria and myofilament proteins in adaptation and maladaptation to endurance exercise. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling, Albetiza Lôbo de Araújo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa-Souza_Valeria_M.pdf: 7722866 bytes, checksum: 7544e873dc1e9f79280e8045930c4c37 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os acidentes por serpentes venenosas podem causar alterações locais graves e de rápido desenvolvimento. O veneno de Bothrops lanceolatus (VBL) contém, dentre outras toxinas, metaloproteinases hemorrágicas e pouco hemorrágicas (SVMPI e SVMPIII) e atividade pró-trombina que causam inflamação (vias das ciclooxigenases-COX e lipoxigenases), alterações hemostáticas e degenerativas. O veneno de Bothrops lanceolatus (100 ?g/100 ?l) foi injetado no gastrocnêmio de ratos para investigar a patogênese da mionecrose (1,3,6,18 horas 1, 2 dias) e regeneração muscular (3,7,14 e 21 dias) ocasionada pelo envenenamento através de análise histológica quantitativa (medida do menor diâmetro 1 hora e 21 dias pós- VBL) e imunohistoquímica para a osteopontina (OPN), citocina inflamatória, quimiotática, com sítios de ligação para integrinas de matriz e células. A medida da expressão dos macrófagos residentes (CD68+) e dos macrófagos migrantes (CD163+), de myoD e miogenina, membros da família de fatores transcricionais miogênicos foi feita com o objetivo de correlacionar com a expressão da OPN nos diferentes estágios patológicos (n=6/período) ao longo do período experimental. Os grupos controles foram injetados com PBS (100 ?l). O envenenamento produziu hemorragia local, edema, infiltrado neutrofílico e macrofágico e desorganização das bainhas perimisiais de tecido conjuntivo, após 48 horas. As fibras mionecróticas apresentavam-se em número moderado. Aos 3 dias, havia focos de deposição de colágeno (tipo I) no meio dos quais se viam mioblastos. O número de macrófagos CD68+ atingiu o máximo às 24 horas, e manteve-se significativamente maior que nos grupos controles até aos sete dias. A expressão de OPN foi significativamente maior das 6 horas aos 3 dias e dos 7 aos 14 dias, sendo expressa em fibras musculares, macrófagos, mioblastos, miotubos e fibroblastos. Não foi obtida marcação para anti-myoD; a expressão de miogenina, que tipicamente é nuclear, foi observada também no citoplasma de mioblastos e miotubos até o 70 dia (pico), sendo sua expressão somente nuclear aos 14 dias. A retenção de miogenina no citoplasma tem sido interpretada como mecanismo de retardo na diferenciação, já que a presença no núcleo é necessária para o seu papel regulador transcricional. Aos 21 dias as fibras regeneradas, com núcleo central, não haviam atingido o tamanho das fibras maduras intactas (VBL) e dos controles. Considerando que as SVMPs e a enzima com atividade tipo trombina de VBL, podem aumentar a capacidade de ligação de sítios da OPN a integrinas de matriz e de superfícies de células, sugerimos que durante a patogênese da regeneração muscular post- VBL a OPN estaria criticamente envolvida no processo inflamatório agudo, e como tal atuaria primordialmente como citocina ativadora de células satélites quiescentes, seguida por atividade quimiotática e adesiva, favorecendo migração, proliferação de mioblastos e a diferenciação de miotubos. Segundo a literatura a OPN é profibrótica em certas doenças. Sugerimos que a fibrose intersticial observada, mais a presença tardia de macrófagos no local, mais a expressão citoplasmática da miogenina podem ter sido fatores relevantes que levaram ao atraso da regeneração das fibras musculares, como constatado pelo tamanho menor diâmetro das fibras. Sugere-se para a OPN um papel dual, isto é, tanto próregenerativo, como anti-regenerativo na patogênese das alterações causadas pelo veneno de B. lanceolatus / Abstract: Accident caused by venomous snakes can lead to local changes of serious and rapid development. Bothrops lanceolatus venom (BLV) contains, among other toxins, hemorrhagic metalloproteinases and non-hemorrhagic (SVMPI and SVMPIII) and prothrombin activity. As result, the venom causes hemostatic and inflammatory (via lipoxygenase and cyclooxygenase) and degenerative alterations. In this study, Bothrops lanceolatus venom (100 ?g/100?l) was injected into the gastrocnemius of rats to investigate the pathogenesis of myonecrosis (one, three, six, 18 hours and two days) and regeneration (three, seven, 14 and 21 days) by quantitative histological analysis (measurement of the small diameter one hour and 21 days post-BLV injection) and immunohistochemistry for osteopontin (OPN) protein, an inflammatory and chemotactic cytokines, with integrin binding sites to matrix proteins and cells. The number of macrophages CD68+ (resident macrophages), and CD163 (migrants macrophages), the expression of myoD and myogenin, members of the myogenic, both transcription factors family were correlated (n = 6/period). Control groups were injected with PBS (100?l). The envenomation produced local hemorrhage (initially massive), acute interstitial edema and myofibers, neutrophil and macrophage infiltration, and disruption of the perimysium sheath of connective tissue. These changes were observed up to 48 hours. The number of myonecrotic fibers was in moderate number. At 3 days, there were foci of collagen (type I) deposition surrounding groups of myoblasts. The number of macrophages (CD68 +) peaked at 24 hours, and remained significantly higher for seven days: there was no expression of CD163 macrophages. The OPN expression showed two steps, a significant increase in, from six hours to three days and seven to 14 days, and it was expressed in muscle fibers, macrophages, myoblasts, myotubes and fibroblasts. There was no MyoD imunolabeling. The myogenin expression, which is known to be typically nuclear, was also observed in the cytoplasm of myoblasts and myotubes until 7 days (peak). At 14 days, the myogenin expression became nuclear. The cytoplasmic retention of myogenin has been interpreted as a mechanism to delay myotube differentiation, since the presence in the nucleus is required for its transcriptional regulatory role. At 21 days, the regenerated fibers with central nucleus had not reached the size of intact fibers (VBL), nor that of controls. Whereas SVMPs and an enzyme with thrombin-like activity are known to increase the capacity of OPN binding to integrin of matrix and cell surfaces, we suggest that, during the pathogenesis of muscle regeneration post-VBL injection, OPN would be critically involved in an acute inflammatory process. OPN would act primarily as a cytokine activator of quiescent satellite cells and later play chemotactic and adhesive activities, promoting migration, proliferation of myoblasts, and formation and differentiation of myotubes. According to the literature, OPN is profibrotic in certain diseases. We suggest that the foci of interstitial fibrosis and the late presence of macrophages at the site of regeneration, as well as the cytoplasmic expression of myogenin may be relevant factors that lead to regeneration delay. It is suggested a pro-regenerative and anti-regenerative roles for OPN in the pathogenesis of alterations caused by B. lanceolatus venom / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Maeli Dal Pai Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T02:52:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_FernandaLosiAlvesde_D.pdf: 2894265 bytes, checksum: 520fa8f4b513d918c8eeeaeef4851198 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Nos peixes, o crescimento muscular ocorre por hipertrofia e hiperplasia a partir da proliferação e diferenciação das células satélites, processos regulados pela expressão de fatores de transcrição e de crescimento. Os objetivos desse trabalho foram: (1) avaliar a morfologia, morfometria e expressão gênica da MyoD, miogenina e IGF-I na musculatura branca do pacu (Piaractus mesopotamicus) com 45, 90, 180, 400 dias pós-eclosão (dpe) e adultos (n=8) e (2) avaliar a expressão gênica da MyoD, miogenina e miostatina na musculatura branca e vermelha de pacus adultos (n=8). Em todos os grupos, fragmentos da musculatura branca foram dissecados e congelados em nitrogênio líquido. Nos adultos, também foram coletados fragmentos de músculo vermelho. Cortes histológicos (10 ?m) da musculatura branca, obtidos em criostato, foram corados com hematoxilina-eosina para avaliação da morfologia e morfometria. Em cada animal, foi determinado o menor diâmetro de 100 fibras musculares brancas que foram distribuídas em classes, na dependência do seu diâmetro (<20 ?m, 20-50 ?m, >50 ?m), para avaliar a hiperplasia e hipertrofia. A expressão gênica foi analisada por reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa em tempo real. A morfologia da musculatura branca foi semelhante em todos os grupos. No grupo 45 dpe, a alta freqüência de fibras brancas com diâmetro <20 ?m indica intensa hiperplasia; nos adultos, a alta freqüência de fibras com diâmetro > 50 ?m indica intensa hipertrofia. Nos grupos 90, 180 e 400 dpe, a alta freqüência de fibras com diâmetro entre 20 e 50 ?m indica a ocorrência de hiperplasia e hipertrofia. A expressão gênica da MyoD e miogenina foi semelhante nos grupos 45, 90, 400 dpe e adultos, aumentando significativamente nos animais com 180 dpe; nos grupos 180 dpe e adultos, essa expressão foi similar. Nossos resultados sugerem que a alta expressão de MyoD e miogenina no grupo 180 dpe está relacionada com a proliferação e diferenciação de células satélites, respectivamente, contribuindo para a hiperplasia e hipertrofia. Nos adultos, essa expressão está controlando a hipertrofia. A expressão gênica de IGF-I foi semelhante nos grupos 45 e 90 dpe, diminuindo nos animais com 180 dpe e adultos; os grupos 45, 90 e 400 dpe apresentaram expressão similar. Nos grupos 45 dpe e adultos, a expressão de IGF-I está relacionada com a proliferação de células satélites durante a hiperplasia e hipertrofia, respectivamente; nos animais com 90, 180 e 400 dpe, essa expressão está controlando ambos os mecanismos de crescimento. Entre os músculos branco e vermelho dos animais adultos, a expressão de MyoD, miogenina e miostatina foi semelhante. No músculo branco, a expressão de MyoD e miogenina está relacionada com a proliferação e diferenciação das células satélites, respectivamente, durante a hipertrofia. Na musculatura vermelha, essa expressão é responsável pela manutenção do fenótipo das fibras musculares. A expressão de miostatina, nas fibras brancas e vermelhas, está relacionada com a regulação do crescimento e manutenção da massa muscular constante nesses compartimentos / Abstract: In fish, skeletal muscle growth occurs by hypertrophy and hyperplasia and is dependent of the proliferation and differentiation of satellite cells, events regulated by the expression of transcription and growth factors. The purposes of this study were: (1) to evaluate the morphology, morphometry and MyoD, myogenin and IGF-I gene expression in white skeletal muscle from pacu (Piaractus mesopotamicus) at 45, 90, 180, 400 days post- hatching (dph) and adult (n=8) and (2) to analyze the MyoD, myogenin and myostatin gene expression in white and red muscles of adult pacu (n=8). In all groups, white skeletal muscle fragments were dissected out and frozen in liquid nitrogen. In adults, red muscle fragments were also collected. Transverse sections (10 ?m) from white muscle fragments, obtained in a cryostat, were stained with haematoxilin-eosin to evaluate muscle morphology and morphometry. In each animal fiber cross-section diameter (?m) was determined by measuring 100 white muscle fibers which were grouped into three diameter classes (<20?m, 20-50?m, and >50?m) to evaluate the hyperplasia and hypertrophy. Gene expression was analyzed by reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction. White muscle morphology was similar at all groups. The high frequency of <20?m diameter white fiber in 45 dph indicates intense hyperplasia; the high frequency of >50?m diameter fiber in adults shows intense hypertrophy. In 90, 180, and 400 dph groups the high frequency of 20-50?m diameter fibers indicates the occurrence of hyperplasia and hypertrophy. MyoD and myogenin gene expression was similar in 45, 90, and 400 dph and adult fish, peaking at 180 dph; in 180 dpe and adult groups this expression was similar. Our results suggest that the high MyoD and myogenin expression at 180 dph is related to the satellite cells proliferation and differentiation, respectively, during hyperplasia and hypertrophy. In adult fish, this expression is controlling the hypertrophy. The IGF-I gene expression was similar in 45 and 90 dpe stages, decreasing in 180 dpe and adult fish; the 45, 90 and 400 dpe groups have showed similar expression. In 45 dpe and adult groups, IGF-I expression is related to satellite cells proliferation during hyperplasia and hypertrophy, respectively; in 90, 180 and 400 dpe fish, this expression is controlling the both muscle growth mechanims. In red and white muscles from adults the the MyoD, myogenin and myostatin gene expression was similar. In white muscle, the MyoD and myogenin expression is related to the satellite cells proliferation and differentiation, respectively, during hypertrophy. In red muscle, this expression is responsible to the maintenance of fiber-type phenotype. Myostatin expression in white and red muscles is related to the growth regulation and maintenance of constant muscle mass in these compartments / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maeli Dal Pai Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:06:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_RobsonFrancisco_D.pdf: 1253559 bytes, checksum: e244961263e728fe00882d5f5d14b262 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Introdução: A Insuficiência Cardíaca (IC) está associada a uma miopatia do músculo esquelético com aumento da expressão das isoformas rápidas da cadeia pesada de miosina (MHC) e alterações na matriz extracelular (MEC). Os mecanismos moleculares que controlam a expressão de MHC durante a IC ainda não foram descritos. Os fatores de regulação miogênica (MRF), uma família de fatores transcricionais que controlam vários genes músculo-específicos, podem estar relacionados com essa miopatia. As alterações da MEC podem estar associadas a um aumento na expressão de RNA mensageiro e na atividade das metaloproteinases da MEC (MMP), uma família de endopeptidases dependentes de zinco que degradam a maioria dos componentes da MEC e que são indispensáveis para a remodelação do tecido conjuntivo ao redor das fibras musculares. Objetivos: Analisar no músculo esquelético de ratos Wistar com IC induzida pela monocrotalina: 1) a expressão de RNA mensageiro para os MRF, as isoformas proteicas de MHC e a atrofia nos músculos Sóleo (SOL) e Extensor Longo dos Dedos (EDL); 2) a expressão de RNA mensageiro e a atividade das MMP nos músculos SOL, EDL e diafragma (DIA). Métodos: A expressão do RNA mensageiro para MyoD, miogenina, MRF4, MMP2 e MMP9 foi determinada por RT-PCR; as isoformas de MHC foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e a atividade das MMP, por eletroforese em gel de poliacrilaminda contendo gelatina na presença de SDS em condições não redutoras. Resultados: 1) Embora a composição de MHC do músculo esquelético de ratos com IC não tenha sido alterada, a expressão relativa do RNA mensageiro para a MyoD nos músculos SOL e EDL, e a de MRF4 no músculo SOL foi significativamente diminuída, enquanto que a expressão relativa de RNA mensageiro para a miogenina não se alterou em ambos os músculos. A diminuição na expressão relativa de RNA mensageiro para o MRF4 está associada à atrofia do SOL em resposta à IC. 2) A IC aumentou a expressão de RNA mensageiro e a atividade da MMP9 nos músculos SOL, EDL e DIA, e aumentou a expressão de RNA mensageiro da MMP2 no músculo DIA. Conclusão: Nossos resultados sugerem um potencial papel para os MRF e para as MMP na miopatia do músculo esquelético na IC / Abstract: Background: Heart failure (HF) is associated with a skeletal muscle myopathy with increased expression of fast myosin heavy chains (MHC) and extracellular matrix (ECM) alterations. The skeletal muscle-specific molecular regulatory mechanisms controlling MHC expression during HF have not been described. Myogenic regulatory factors (MRF), a family of transcriptional factors that control the expression of several skeletal muscle-specific genes, may be related to these alterations. The ECM alterations may be associated with enhanced mRNA expression and activity of matrix metalloproteinases (MMP), a family of zinc-dependent endopeptidases that degrade most ECM components and appear indispensable for the breakdown of the connective tissue surrounding muscle fibers. Objectives: This investigation was undertaken in order to examine in Wistar rat skeletal muscle with monocrotaline-induced HF: 1) potential relationships between MRF mRNA expression and MHC protein isoforms and atrophy in Soleus (SOL) and extensor digitorum longus (EDL) muscles; 2) MMP mRNA expression and their potential relationships with changes in MMP activity in SOL, EDL, and diaphragm (DIA) muscles. Methods: MyoD, myogenin, MRF4, MMP2, and MMP9 were determined by using RTPCR; MHC isoforms were separated by using polyacrylamide gel electrophoresis, and MMP activity by electrophoresis in gelatin-containing polyacrylamide gel in the presence of SDS under nonreducing conditions. Results: 1) Despite no change in MHC composition of Wistar rat skeletal muscles with HF, the mRNA relative expression of MyoD in SOL and EDL muscles and that of MRF4 in SOL muscle were significantly reduced, whereas myogenin was not changed in both muscles. This down-regulation in the mRNA relative expression of MRF4 in SOL was associated with atrophy in response to HF. 2) HF increased MMP9 mRNA expression and activity in SOL, EDL, and DIA and MMP2 mRNA expression in DIA. Conclusion: Taken together; our results show a potential role for MRF and MMP in skeletal muscle myopathy during HF / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maeli Dal Pai Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barretto_JeaneMarleneFogacadeAssis_D.pdf: 16620509 bytes, checksum: f55fbc50c521ec1697bb9e56f7c70d08 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: o desenvolvimento da musculatura em animais utilizados como alimento tem importância na qualidade e no aumento da massa muscular. Esse estudo teve por objetivo avaliar as características morfológicas e o crescimento da musculatura miotomal em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) submetida à dieta com suplementação de vitamina C. O experimento foi realizado a partir da primeira alimentação exógena até 60 dias. As larvas foram distribuídas em cinco tratamentos, numa densidade de 10 indivíduos/L onde foram administrados os seguintes níveis de suplementação de vitamina C/ kg de ração balanceada: T1 = sem suplementação, T2 = 250 mg, T3 = 500 mg, T4 =1000 mg, T5 = sem suplementação até o vigésimo dia do tratamento, e com suplementação de 500 mg do vigésimo primeiro ao sexagésimo dia de experimento. Foram realizadas cinco repetições por tratamento com distribuição randômica. Cinco peixes de cada tratamento foram anestesiados com Ms-222 - SIGMA, sacrificados e a biometria foi efetuada após 20, 40 e 60 dias de experimento. Após isso, amostras de músculo foram congeladas em n-hexana resfriada em nitrogênio líquido e cortes histológicos foram submetidos à coloração HE (para análise da morfologia geral da musculatura), à reação mATPase, após pré incubação ácida (para a análise das características da ATPase miofibrilar) e à reação NADH-TR (para análise do metabolismo oxidativo das fibras). Aos 20 e 60 dias do experimento, cinco amostras de cada tratamento foram submetidos às reações imunohistoquímicas MyoD e miogenina (fatores de transcrição miogênica - para avaliar o grau de proliferação e diferenciação das celulas precursoras miogênicas). Também foram coletadas amostras de músculo para fixação em formalina neutra tamponada, processadas para serem embebidos em paraplast e os cortes histológicos foram submetidos à reação imunohistoquímica PCNA (Antígeno Nuclear de Proliferação Celular). A suplementação com os maiores níveis de vitamina C e após o período de restrição promoveu maior ganho de massa corpórea. O crescimento muscular em todos os tratamentos ocorreu principalmente por hiperplasia. Durante o experimento não foram observadas alterações morfológicas e histoquímicas nas fibras musculares. A suplementação de 500mg vit C kg-1da ração após a restrição por 20 dias promoveu a proliferação e a diferenciação das células precursoras miogênicas 500mg vit C kg-1 da ração foi o nível de suplementação apropriado para a miogênese e o desenvolvimento da Tilápia / Abstract: Muscle development in animais utilized for food has importance to muscle quality and mass increase. The aim of this study was evaluate the morphologic and the growth characteristics of the miotomal muscle in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) submitted to a vitamin C supplemented diet. The experiment was carried through from the first exogenous feeding up to 60 days. The larvae were distributed into five treatments, in aquaria at 10/L density. The levels of vitamin C supplement/kg of ration were: T1=no supplement, T2=250mg vit C kg-1 of diet, T3=500mg vit C kg-1of diet, T4= 1000mg vit C kg-1 of diet, T5= no supplement until 20 days and 500mg vit C kg-1 of diet on days 20 to 60. There were 5 repetitions for each treatment. After 20, 40 and 60 days, 5 fish from each treatment were anaesthetized with MS-222 - SIGMA, sacrificed and weighed. Muscle fragments were cooled in liquid nitrogen. Histological sections were submitted to the following reactions: Haematoxilin-Eosin (for analysis of the muscle morphology and to determine muscle fibers diameters); Nicotinamide Adenine Dinucleotide Tetrazolium Reductase (NADH-TR), for muscle fibre metabolic evaluation (oxidative and glycolitic); and miofibrillar ATPase (mATPase), in pH 9.4, after acid preincubation to study myosin ATPase characteristics. After 20 and 60 days, muscle samples from five fish of each treatment were immersed in n-Hexane cooled in liquid nitrogen and histological sections were submitted to the MyoD and myogenin immunohistochemical reaction to evaluate cell proliferation and differentiation. Another five fish per treatment were embedded in Paraplast and histological sections were submitted to PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) immunohistochemical reaction to evaluate the degree of cell proliferation per treatment. During the experiment, ali treatments increased in weight and length. Weight differences were significant only on day 60. Supplementation with high vitamin C levels and after a period of restriction promoted an increase in body mass. Muscle fiber morphology, metabolic and myosin ATPase characteristics were normal and similar in all treatments. Muscle growth in all treatments was predominantly by hyperplasia. Proliferation and differentiation of myogenic precursor cells was higher with 500mg vit C kg-1 of supplemented diets throughout the experiment. Restriction of this supplementation for 20 days did not harm differentiation and still promoted myogenic precursor cell proliferation. The appropriate levei of vitamina C to myogenesis and the development of the Tilapia was 500mg vit C kg-1 of the ration / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural