Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Objetivou-se com esse trabalho selecionar bactérias residentes de filoplano de maracujazeiro como possível agente de biocontrole da mancha-bacteriana que tem como agente causal a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap) e estudar os mecanismos de ação envolvidos no controle biológico. A primeira etapa de seleção baseou-se em testes in vivo com 224 isolados obtidos a partir de folhas sadias de maracujazeiro amarelo coletadas em pomares comerciais, sendo 102 oriundos do estado de Roraima, 72 do Pará e 50 de São Paulo. Estes foram testados em casa-de-vegetação no controle das bactérias fitopatogénicas originadas dos estados de Roraima (Xap-RR), São Paulo (Xap-SP) e Pará (Xap-PA). Após esta etapa, foram selecionados os residentes de filoplano RR-46; RR-29; RR-133; RR-98 e RR-14, oriundo de Roraima e SP-11; SP-18; SP-22; SP-48 e SP-28, provenientes de São Paulo devido apresentarem baixos níveis de severidade da doença 2,3; 2,8; 2,9; 3,5; 3,6; 3,2; 3,25; 3,55; 4,25 e 6,25%, respectivamente. Não houve nenhum antagonista detectado como promissor proveniente do estado do Pará. Foram selecionados os isolados RR-14; RR-29; RR-46; RR-98; RR-133; SP-11; SP-18; SP-22; SP-28 e SP-48, para a segunda etapa de seleção. Esta realizada, in vitro onde os isolados foram submetidos aos ensaios para verificação da utilização de fontes únicas de carbono para verificação de sobreposição de nicho, antibiose por difusão em meio de cultura, produção de sideróforos e influencia na atividade da enzima peroxidase na planta. Os resultados demonstraram que os isolados RR-98 e RR-113 foram capazes de competir por nicho somente contra Xap-RR, através da sobreposição de nicho. Na antibiose, por difusão em meio de cultura o isolado RR-29, foi capaz de inibir três isolados de Xap, provenientes de RR, SP, PA e o isolado SP-28 inibiu apenas as duas últimas. A produção de sideróforos foi observada somente pelos isolados RR-29 e SP-28. Nenhum antagonista foi capaz de influenciar no aumento da atividade de peroxidases nas plantas de maracujazeiro o que indica que não são capazes de induzirem resistência. A sobreposição de nicho, competição por ferro e/ou antibiose são fatores que explicam a capacidade de controle da mancha-bacteriana, mediadas pelos isolados RR-98 e RR-133, RR-29 e SP-28. / The mass selection in vivo is a step of great importance that there be no targeting of biological control mechanisms involved, but only about the efficacy of the biocontrol agent. The objective of this work was to select residents phylloplane bacteria passion fruit as possible biocontrol agent of bacterial spot which is the causal agent Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. 224 isolates were obtained from healthy leaves of yellow passion fruit collected from commercial orchards, and 102 from the state of Roraima, 72 from Pará and 50 from São Paulo. The isolation was done using a half of definitive leave soaked in sterile saline (0.85% NaCl) with 0,3% Tween 80 and maintained in a shaker for 20 minutes, followed by serial dilutions and seeding in Petri dishes containing culture medium 523. Four steps to select for isolates of Roraima, three for isolates from São Paulo and three isolates from Pará were conducted in greenhouse so there would be a confirmation of the antagonistic efficacy of these isolates. Disease severity ranged between 1,1% and 15,3% for isolates from Roraima, 1,15% to 27,5% for isolates from São Paulo and 1,5% to 36,4% for isolates Pará were selected residents phylloplane RR-43, RR-29, RR-133, RR-98 and RR-14, derived from Roraima and SP-11, SP-18, SP-22, SP-48 and SP-28, coming from São Paulo because they presented low levels of disease severity 2,3; 2,8; 2,9; 3,5; 3,6; 3,2; 3,25; 3,55; 4,25 and 6.25%, respectively. There was no antagonist detected from Pará. Were selected isolates RR-43, RR-29, RR-133, RR-98, RR-14 SP-11, SP-18, SP-22, SP-48 and SP-28, for in vitro assays.

Este trabalho teve por objetivo selecionar estirpes fracas do Passion fruit woodiness virus (PWV) e avaliar o seu efeito protetor para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro. Foram selecionadas seis estirpes fracas do PWV. Três a partir de plantas de elite, encontradas em pomares severamente afetados pelo vírus (F-101, F-102 e F-103) e três a partir de bolhas formadas em folhas de maracujazeiro com mosaico (F-99, F-144 e F-145). O efeito protetor das estirpes fracas foi avaliado em maracujazeiros, em casa de vegetação e em campo. Em casa de vegetação foi observada uma proteção parcial das estirpes F-101, F-102 e F-144, contra a estirpe severa PWV-SP. Em campo, num primeiro experimento, as seis estirpes fracas selecionadas foram avaliadas e aproximadamente 4 meses após o desafio com a estirpe PWV-SP, todas as plantas apresentaram sintomas severos da doença. Diante da proteção parcial em casa de vegetação e da ausência total de proteção no experimento de campo, duas hipóteses foram apresentadas para explicar a intensificação de sintomas em maracujazeiros premunizados e desafiados com a estirpe severa do virus: a) a ocorrência de baixa concentração e/ou distribuição irregular das estirpes fracas nos tecidos das plantas premunizadas permite a infecção e estabelecimento da estirpe severa posteriormente inoculada e b) as estirpes fracas selecionadas são de uma espécie diferente de Potyvirus, serologicamente relacionada com o PWV, mas que não oferecem proteção contra a estirpe severa deste último. A primeira hipótese foi estudada repetindo-se o experimento com maracujazeiros premunizados com as estirpes F-101 e F-144, separadamente, e cultivados em campo sob condições de telado. Antes do desafio, foram feitos estudos quantitativos das estirpes F-101 e F-144, em diferentes folhas das plantas, através do DAS-ELISA indireto. Foi observada uma grande variação na concentração das estirpes fracas nos tecidos de diferentes folhas da mesma planta. Em 68,3 %, de 300 discos foliares, as estirpes fracas não foram detectadas pelos critérios adotados nessa investigação. Mais uma vez todas as plantas premunizadas e desafiadas apresentaram sintomas severos da doença, quatro meses após o desafio. A segunda hipótese foi estudada através de testes de proteção em plantas de crotalária premunizadas com as estirpes F-101 e F-144 e da análise da seqüência de nucleotídeos do gene da capa protéica das estirpes F-101, F-103 e PWV-SP. Nos testes de proteção, todas as plantas premunizadas com as estirpes fracas ficaram protegidas contra a infecção e/ou manifestação dos sintomas causados pela estirpe severa PWV-SP. Estudos quantitativos das estirpes fracas nessa hospedeira revelaram uma maior uniformidade na concentração do vírus nos tecidos foliares. A análise da seqüência de nucleotídeos do gene que codifica a capa protéica, apontaram identidade de 99,7 % entre as estirpes fracas e de 97,5 % destas com a estirpe severa, mostrando tratarem-se de estirpes do mesmo vírus. Esses resultados mostram que a premunização não parece ser uma alternativa adequada para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, devido à falha na proteção. Essa quebra de proteção parece estar relacionada com a baixa concentração e/ou distribuição irregular das estirpes fracas nas folhas do maracujazeiro, que propiciam a existência de sítios de infecção para a estirpe severa posteriormente inoculada. / The main purpose of this work was to select mild strains of Passion fruit woodiness virus (PWV) and to evaluate their protective effect in passion flower (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) challenged with a severe strain of the virus. Three mild strains were selected from outstanding plants found in orchards severely affected by the virus (F-101, F-102 and F-103) and three others were obtained from blisters formed in passion flower leaves with mosaic (F-99, F-144 and F-145). The protective effect of the mild strains was evaluated in passion flower under greenhouse and field conditions. Plants preimmunized with mild strains F-101, F-102 and F-144, under greenhouse conditions, showed partial protection after challenge inoculation with the severe strain PWV-SP. Total absence of protection was observed in passion flower preimmunized with all six mild strains and challenged with PWV-SP in the first field experiment. Due to these results, two hypotheses were raised to explain the intensification of symptoms in passion flower preimmunized with mild strains and challenged with the severe strain of the virus: a) the occurrence of low concentration and/or irregular distribution of the mild strains in the tissues of the preimmunized plants allow the infection and establishment of the later inoculated severe strain and b) the selected mild strains belong to a different species of Potyvirus, serologically related to PWV, but that do not offer protection against the severe strain of PWV. The first hypothesis was studied in a field experiment with passion flower preimmunized with mild strains F-101 and F-144, separately, and cultivated under screenhouse. Before the challenge inoculation, leaf samples were taken from five leaves of all protected plants and the concentration of the mild strains was estimated by indirect DAS-ELISA. A group of plants was challenged in three expanded leaves of the vine and another group was challenged with viruliferous aphids placed on the tip of the vine. All preimmunized plants showed severe symptoms of the disease, four months after the challenge inoculation. A great variation was observed in the concentration of the mild strains in the tissues of different leaves of the same plant. The ELISA test was not able to detect the mild strains in extracts of 205 out of 300 leaf disks. The second hypothesis was tested with crotalaria plants (Crotalaria juncea L.) preimmunized with mild strains F-101 and F-144 and analysis of the nucleotide sequence of the coat protein gene of the F-101, F-103 and PWV-SP strains. All preimmunized crotalaria plants were protected against the infection and/or manifestation of the symptoms caused by the severe strain PWV-SP. Quantitative studies of the mild strains in crotalaria revealed a larger uniformity in the concentration of the virus in the leaves. The analysis of the nucleotide sequence of the coat protein gene pointed out identity of 99.7% among the mild strains. The severe strain shared 97.5 % identity with both mild strains, showing that they are all strains of the same virus. These results showed that preimmunization does not seem to be an appropriate alternative for the control of the passion fruit woodiness disease in passion flower due to the breakdown in protection. Failure in protection seems to be related to the low concentration and/or irregular distribution of the mild strains in the leaves of the passion flower, which allow the occurrence of infection sites available for superinfection with the severe strain.

O Brasil é um dos principais países produtores de abacate. A competitividade do país no comércio internacional desta fruta demanda a minimização de danos pós-colheita, especialmente os causados pela antracnose. Este trabalho objetivou: (i) identificar e quantificar os danos pós-colheita em abacates Fuerte e Hass; (ii) identificar e caracterizar isolados de Colletotrichum do abacateiro, comparando-os com isolados de outras frutíferas; (iii) avaliar o efeito de temperatura e período de molhamento sobre a germinação de conídios e formação de apressórios, bem como, sobre a infecção e colonização de Colletotrichum gloeosporioides em abacates; (iv) avaliar o efeito de fungicidas e sanitizantes no controle da antracnose do abacateiro em pós-colheita. As incidências da antracnose e de outros danos póscolheita foram avaliadas periodicamente em abacates amostrados em três etapas do beneficiamento em packinghouse e revelaram que a antracnose foi a principal doença póscolheita, com incidências média de 45,7% para o abacate Fuerte e 68,7% para Hass. Identificação, caracterização e análise comparativa foram realizadas para 93 isolados obtidos de abacate, manga, maracujá e pêssego, por meio do aspecto da colônia e taxa de crescimento em diferentes temperaturas, formato e dimensões dos conídios, análise molecular (PCR com oligonucleotídeos espécie-específicos e análise de sequências de nucleotídeos das regiões ITS e -tubulina), patogenicidade e atividade enzimática (amilase, catalase, celulase, lacase, lípase, pectinase e proteinase). Todos os isolados de abacate e manga, e alguns isolados de pêssego e maracujá foram identificados como C. gloeosporioides. As espécies C. acutatum e C. boninense foram detectadas em pêssego e maracujá, respectivamente. A análise filogenética associada a algumas características morfo-culturais permitiu a separação das espécies e revelou diferenças intra-específicas entre os isolados de C. gloeosporioides, de acordo com o hospedeiro de origem. Os isolados de manga compuseram um grupo distinto dentro da espécie. Entretanto, independente do hospedeiro de origem, as três espécies de Colletotrichum promoveram infecções cruzadas nos quatro hospedeiros avaliados, indicando a ausência de especificidade patogênica. Para todas as características avaliadas houve alta variabilidade entre os isolados. Germinação de esporos e formação de apressórios de C. gloeosporioides sobre abacates Fuerte incubados a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40ºC com período de molhamento de 3, 6, 12, 24h revelou que o fungo pode explorar ampla faixa de temperatura, germinando e formando apressórios entre 10 e 35ºC, com temperatura ótima de 23,4ºC e 24,0ºC, respectivamente. Aumento no período de molhamento promoveu maiores percentagens de esporos germinados e formação de apressórios. Os efeitos da temperatura (10, 15, 20, 25, 30ºC) e períodos de molhamento (6, 12, 24h) na infecção e colonização por esta espécie foram avaliados em frutos de Hass e Fuerte, inoculados com ferimento. Exceto a 10ºC, houve manifestação de sintomas em todas as temperaturas, com maiores lesões e taxas de progresso da doença a 30ºC. Para controle das doenças testou-se tratamento dos frutos por imersão em calda contendo azoxistrobina, cloreto de benzalcônio, dióxido de cloro, Ecolife®, hipoclorito de sódio, imazalil, procloraz e tiabendazol. Dentre esses, procloraz e imazalil foram os mais eficientes. / Brazil is one of the most important avocado producers in the world. However, to compete in the international avocado business it is necessary reduction of post-harvest damages, especially those caused by anthracnose. This work had the following objectives: (i) to identify and to quantify post-harvest damages in Fuerte and Hass avocados; (ii) to identify and to characterize the avocado isolates of Colletotrichum, comparing them with other fruit isolates; (iii) to evaluate the effect of temperature and wetness period in the conidia germination and appressoria formation, as well as in the infection and colonization of Colletotrichum gloeosporioides in avocado; (iv) to evaluate the post-harvest control of anthracnose in avocado using fungicides and sanitizers. Both the anthracnose incidence and other post-harvest damages were evaluated periodically using avocado samples collected at three steps in the packinghouse. It was revealed that anthracnose was the major factor of post-harvest damages, with average incidence of 45.7% in Fuerte and 68.7% in Hass. Identification, characterization and comparative analyses were performed with 93 isolates from avocado, mango, passion fruit and peach according to the colony aspect and growth rate in different temperatures, conidia shape and size, molecular analyses (species-specific PCR and sequencing of ITS and -tubulin genes), pathogenicity and enzymatic activity (amylase, catalase, cellulase, laccase, lipase, pectinase and proteinase). All of the avocado and mango isolates and some isolates from peach and passion fruit were identified as C. gloeosporioides. The species C. acutatum and C. boninense also were indentified in peach and passion fruit, respectively. Phylogenetic analyses performed with some morphological data allowed species differentiation and revealed intra-specific differences between C. gloeosporioies according to the original host. Mango isolates were grouped together into the C. gloesporioides clade. However, independently of the original host, these three Colletotrichum species showed to cross-infect the four evaluated hosts, suggesting lack of pathogenical specificity. There was high variability for all evaluated characteristic. For C. gloeosporioides, spores germination and appressoria formation on the surface of Fuerte avocado incubated under 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40 ºC and wetness periods of 3, 6, 12 and 24 hours showed that this fungus could explore a wide range of temperature. Germination and appressoria formation were observed between 10 and 35 ºC, with optimal temperatures of 23.4 and 24.0 ºC, respectively. Both the germination and appressoria formation were higher with the increase in the wetness period. The effect of temperature (10, 15, 20, 25, 30 ºC) and the wetness period (6, 12, 24h) were evaluated on the infection and colonization of C. gloeosporioides in Fuerte and Hass avocado, which were wound-inoculated. Except at 10 ºC, all tested temperatures led to symptoms expression. The highest disease progress rate and lesion diameter were verified at 30 ºC. Fruit immersion on fungicides solution was tested to control post-harvest diseases using azoxystrobin, benzalkonium chloride, chlorine dioxide, Ecolife, sodium hypochloride, imazalil, procloraz and thiabendazol. Among these fungicides, prochloraz and imazalil were the most efficient in controlling post-harvest diseases in avocado.

A nanotecnologia é um fenômeno que se aplica a praticamente todos os setores da ciência, sendo que na área cosmética o elevado investimento neste campo tem reforçado a idéia de que produtos nanotecnológicos proporcionam vantagens reais aos consumidores. A crescente exigência do consumidor e os avanços no conhecimento sobre obtenção e estabilidade dos sistemas dispersos viabilizam o desenvolvimento de veículos diferenciados como, por exemplo, nanoemulsões, que além da inerente estabilidade, apresentam aspecto sensorial agradável, alta capacidade de espalhabilidade e hidratação, além de poderem facilitar a penetração de ativos. Existem dois métodos de obtenção de nanoemulsões: os que empregam baixa ou alta energia de emulsificação. O uso de óleos vegetais em produtos cosméticos tem sido intensamente valorizado, baseando-se no conceito de que são seguros e biocompatíveis. O óleo de maracujá é extensamente empregado em formulações cosméticas e o óleo essencial de lavanda é citado na literatura pelo efeito cicatrizante e antiinflamatório, dentre outros. Esta pesquisa teve como objetivo desenvolver nanoemulsões à base de óleo de maracujá e óleo essencial de lavanda nas concentrações de 1,0, 2,0 e 5,0%, a partir de método a frio de baixa energia de emulsificação, bem como avaliar a influência da adição de outros componentes e dos parâmetros relacionados ao método de obtenção na estabilidade e tamanho de glóbulos das nanoemulsões e posteriormente avaliar a atividade antiinflamatória tópica da emulsão contendo 5,0% do óleo essencial em camundongos sem pêlo. Os resultados demonstraram que a adição do óleo essencial de lavanda no sistema provocou redução no tamanho de glóbulos e aumento da estabilidade física e que o método de emulsificação a frio foi eficaz na formação de nanoemulsões estáveis. O valor de EHL, o par de tensoativos, a proporção entre as fases aquosa/ oleosa e tensoativa, bem como a adição de silicones e eletrólitos e a velocidade de agitação influenciam sobremaneira as características e a estabilidade das dispersões obtidas. No estudo de estabilidade acelerada, observou-se a alteração significativa dos valores de pH e condutividade elétrica, o que possivelmente é decorrente da hidrólise de compostos presentes no óleo essencial. Os valores de potencial zeta e tamanho de glóbulos não demonstraram alteração relevante em 30 dias de estabilidade acelerada. Na avaliação in vivo, a nanoemulsão adicionada de 5,0% do óleo essencial de lavanda apresentou resultados significativos quando comparado aos demais grupos, o que sugere boa perspectiva na utilização tópica do óleo essencial de lavanda, sendo este merecedor de estudos complementares para a elucidação dos mecanismos antiinflamatórios envolvidos, dos componentes fito-químicos responsáveis por esta ação e da concentração a ser utilizada. / Nanotechnology is a phenomenon that applies to mainly all sectors of science and in the cosmetics area the high investment in this field has strengthened the idea that nanotechnology products offer real advantages to consumers. The growing demand of consumers and the advances in knowledge about production and stability of dispersed systems enable the development of differentiated vehicles such as nanoemulsions, which besides the inherent stability, have pleasant sensory aspect, high spread ability and hydration power, in addition they can facilitate the penetration of actives. There are two methods of obtaining nanoemulsions: those that employ low or high energy of emulsification. The use of vegetable oils in cosmetics has been intensely valued, based on the concept that is safe and biocompatible. Passion fruit oil is widely used in cosmetic formulations and lavender essential oil is reported in the literature for healing and anti-inflammatory effects, among others. The aim of this study was to develop nanoemulsion based in passion fruit oil and lavender essential oil in the concentrations of 1.0, 2.0 and 5.0%, from low-energy method of emulsification, not employing heating, and evaluate the influence of the addition of other materials and parameters related to the production method in the system stability and droplets size of nanoemulsions and then evaluate the anti-inflammatory activity of topical nanoemulsion containing 5.0% of lavender essential oil in hairless mice. The results demonstrated that the addition of lavender essential oil in the system caused reduction in the droplets size and increasing in the physical stability and that the method of emulsification used was effective in the formation of stable nanoemulsions. The HLB value, the pair of surfactants, the ratio between aqueous/oily and surfactant phase, the addition of silicones and electrolytes and speed of agitation particularly affect the characteristics and stability of the obtained dispersions. In the accelerated stability tests, there was a significant change in the pH and electrical conductivity values, which is possibly resulting from the hydrolysis of compounds present in the essential oil. The values of zeta potential and droplets size showed no relevant change in 30 days of accelerated stability. In the in vivo evaluation, the nanoemulsion added of 5.0% of the lavender essential oil showed significant results when compared to the other groups, which suggests good perspective on topical use of this oil, which is worthy of further studies to the elucidation of the anti-inflammatory mechanisms involved, the phyto-chemical components responsible for this action and the concentration of use.

O maracujá-doce (Passiflora alata Curtis) é uma espécie nativa no Brasil. Seu cultivo tem crescido nos últimos anos devido a sua valorização no mercado in natura e seus usos na fitoterapia. Entretanto, os cultivos comerciais enfrentam problemas devido a ocorrência da bacteriose (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). O patógeno é endêmico no país, apresentando considerável variabilidade genética em suas populações naturais. Este trabalho teve como objetivo identificar QTL relacionados à resistência de P. alata à bacteriose em uma população F1 segregante oriunda do cruzamento entre acessos não endogâmicos. Foram avaliados os caracteres: área total da folha (TA), idade de queda da folha inoculada (IK), área total da lesão foliar (LA), área de clorose foliar (CA) e área da necrose foliar (NEA). Apenas um dos isolados apresentou diferenças de severidade em relação aos demais, sendo o menos agressivo (PA8-2). A inoculação do isolado M-129 mostrou que há variação significativa na resposta da população ao patógeno, sendo possível a identificação de genótipos transgressivos. A herdabilidade dos caracteres variou de 45% a 71%%. Foi construído um mapa de ligação integrado com 1.786 cM e uma densidade média de 4,5 cM. A análise de marcas individuais indicou a associação de 51 marcas aos fenótipos avaliados. O mapeamento de QTL, realizado por intervalo composto e utilizando uma estratégia diferenciada para populações F1 segregantes, identificou regiões associadas a 26 QTL para os cinco caracteres avaliados, sendo 16 deles referentes à LA, CA e NEA. A variação fenotípica explicada individualmente pelos marcadores variou de 0,8% a 16,7%. Sugere-se que a resistência à bacteriose é quantitativa, com predominância de efeitos genéticos aditivos. / The sweet passion fruit (Passiflora alata Curtis) is a specie native to Brazil. Its cultivation has increased in recent years due to its market valuation in natura and their uses in herbal medicine. However, crops are facing problems due to the occurrence of bacterial blight (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). The pathogen is endemic in the country, with considerable genetic variability in their natural populations. This study aimed to identify QTL related to resistance of P. alata to bacterial blight in an F1 segregant population from the cross between outbred accessions. Five traits were evaluated: total area of the leaf (TA), age of inoculated leaf fall (IK), area of the leaf´s lesion (LA), area of the leaf´s chlorosis (CA) and area of the leaf´s necrosis (NEA). Only one of the isolates showed differences in severity in relation to others, being the least aggressive (PA8-2). The inoculation of the isolate M-129 showed significant variation in population response to the pathogen, making it possible to identify transgressive genotypes. The heritability of characters ranged from 45% to 71%. An integrated linkage map was constructed, with a length of 1,786 cM and an average density of 4.5 cM. The analysis of individual marks indicated the association of 51 markers to phenotypes. The QTL mapping was performed using composite interval and a special strategy for segregating F1 populations, identified 26 regions associated with QTL for the five traits, 16 of them related to LA, CA and NEA. The phenotypic variation explained by individual markers ranged from 0,8% to 16,7%. It is suggested that the resistance to bacterial blight is quantitative, with a predominance of additive genetic effects.

O maracujá-amarelo é uma espécie alógama, auto-incompatível, o que prejudica a geração de linhagens endogâmicas e, por conseqüência, a construção e integração de mapas de ligação pelas metodologias convencionais. A exemplo do que tem sido feito em outras espécies vegetais, populações F1 (com diferentes tipos de segregação) foram utilizadas para a construção dos mapas genéticos de maracujá. Mapas individuais para cada genitor do cruzamento foram gerados fazendo uso apenas de marcas com segregação 1:1. A integração desses mapas é possível com base em marcadores bi-parentais, quando ambos os genitores são heterozigóticos para os mesmos alelos que segregam na proporção 3:1 em F1. Apesar disso, o uso de marcadores codominantes e multialélicos, como os microssatélites, possuem maior valor, uma vez que permite a obtenção de estimativas de freqüência de recombinação e da fase de ligação com um menor viés. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de marcadores microssatélites utilizando bibliotecas genômicas enriquecidas, visando à construção e a integração de mapas genéticos de maracujáamarelo. Foram usadas 160 plantas oriundas do cruzamento entre os acessos IAPAR-123 x IAPAR-06, marcadores AFLP com segregação 1:1 e 3:1 e marcadores microssatélites desenvolvidos no presente estudo. Para a construção dos mapas utilizou-se um algoritmo que estima, simultaneamente, a fase de ligação e a freqüência de recombinação. A biblioteca genômica enriquecida forneceu 107 clones contendo microssatélites, com uma eficiência de enriquecimento da ordem de 11%. Todas as seqüências contendo microssatélites foram analisadas e 26 locos mostraram-se polimórficos: 16 deles segregaram na proporção de 1:1; 1 na proporção de 3:1; 2 na proporção de 1:2:1 e 7 na proporção de 1:1:1:1. Com relação aos dados de AFLP, 253 locos mono-parentais (em 114 deles, o alelo dominante estava presente no genitor 06 e 139, no genitor 123) mostraram-se polimórficos com segregação 1:1. Outros 116 locos mostraram-se bi-parentais, segregando na proporção de 3:1. Foram obtidos 11 grupos de ligação (GL) sendo 8 grupos integrados e um GL com apenas dois marcadores. Também, um GL para cada genitor foi obtido, cuja integração não foi possível por falta de marcadores bi-parentais. Foi possível alocar no framework dos mapas genéticos, além dos microssatélites, as marcas de AFLP com segregação do tipo 3:1, que contribuíram para uma maior saturação e integração de oito dos nove grupos de ligação de maracujá-amarelo (2n = 18). Foram obtidos, em média, 25 marcadores por GL, que forneceram um comprimento de mapa de 1.765,6 cM. Este é o primeiro relato em Passiflora sobre o uso de marcadores microssatélites e do algoritmo proposto por Wu et al. (2002) visando à integração dos mapas anteriormente construídos com base na estratégia duplo pseudocruzamento teste. Este mapa integrado será útil na alocação de QTL (Quantitative Trai Loci) relacionados à resistência a doenças e a características de interesse agronômico, assim como para estudos genéticos e evolutivos. / The yellow passion fruit is an out-breeding, self-incompatible species, but those features impose severe constraints on the generation of inbred lines, consequently impairing the building and integration of linkage maps using conventional methodologies. Similar to the reports from other plant species, F1 populations (with distinct segregation modes) were used to build passion fruit genetic maps. Individual maps, one for each parent involved in the cross were generated solely employing genetic markers with 1:1 segregation. However, the integration of those maps is feasible using bi-parental markers, i.e. when both parents are heterozygous for the same alleles that show 3:1 segregation in F1. However, the use of co-dominant multi-allele markers, such as the microsatellites is even more important, since it allows recombination frequency and linkage phase estimates to be obtained less effected by bias. The goal of this research was the development of microsatellite markers using enriched genomic libraries for constructing and integrating genetic maps of yellow passion fruit. We have used 160 plants from a cross between the accessions IAPAR-123 x IAPAR-06, AFLP markers showing 1:1 and 3:1 segregations and microsatellite markers developed in the present work. The maps were built employing an algorithm that simultaneously estimates the linkage phase and the recombination frequency. The enriched library allowed us to obtain 107 microsatellite-containing clones, at an enrichment efficiency of 11%. All microsatellite-containing sequences were analyzed and 26 loci were shown to be polymorphic: 16 of them with a 1:1 segregation; 1 with a 3:1 segregation, 2 showing a 1:2:1 proportion and 7 with a 1:1:1:1 segregation pattern. In relation to the AFLP data, 253 mono-parental loci were shown to be polymorphic with a 1:1 segregation proportion (in 114 loci the dominant allele was present in the parent 06, and in 139 loci, the dominant allele was found in the parent 123). The remaining 116 loci were shown to be bi-parental, segregating in a 3:1 proportion. Eleven linkage groups (LG) were obtained, 8 of them being integrated and one LG with only two markers. Moreover, one LG for each parent was obtained, but due to the absence of bi-parental markers they were not integrated. It was possible to locate on the framework of the genetic maps, along with the microsatellites those AFLP markers showing a 3:1-segregation type, which contributed to a greater level of map saturation and to the integration of eight of the nine linkage groups of yellow passion fruit (2n=18). On average, we have obtained 25 markers per LG, providing a map distance of 1,765.6 cM. This is the first report in Passiflora on the use of microsatellite markers and the algorithm proposed by Wu et al. (2002) to integrate maps previously constructed using the double pseudo-testcross strategy. The integrated map will be useful for locating QTL (Quantitative Trai Loci) related to disease resistance and agriculturally interesting traits, as well as to provide tools for genetic and evolutionary studies.

Um dos desafios atuais da pesquisa em frutíferas tropicais é incorporar abordagens baseadas em marcadores moleculares nos programas convencionais de melhoramento. O maracujá-doce (Passiflora alata) é uma espécie diploide, de fecundação cruzada e pouco explorada. Recentemente, nosso grupo construiu um mapa de ligação de P. alata composto de diferentes tipos de marcadores moleculares. Além disso, dispõe-se de um conjunto de transcritos de Passiflora edulis, obtidos a partir de duas bibliotecas de expressão: forward e reverse onde foram isolados transcritos diferencialmente expressos na planta inoculada com Xanthomonas axonopodis (Xap) (672) e na planta controle, não inoculada (310), respectivamente. Assim, neste estudo, este conjunto de transcritos foi explorado visando ao desenvolvimento de marcadores SSR e SNP com o intuito de enriquecer, posteriormente, o mapa de ligação de P. alata com marcadores funcionais putativos. Para o desenvolvimento dos marcadores SSRs, as 672 sequências da biblioteca forward foram investigadas e em 91 delas foram encontrados 115 SSRs. Como esperado, a classe de repetições trinucleotídicas foi a mais abundante, sendo o motivo (AG)n o mais comum entre as repetições dinucleotídicas. Desenhou-se primers para amplificar 42 desses SSRs. Dois acessos de P. edulis e seis indivíduos da população de mapeamento de P. alata foram usados nos testes de transferibilidade e avaliação do polimorfismo. Trinta e quatro pares de primers apresentaram bom padrão de amplificação, porém apenas 10 deles revelaram polimorfismo em P. alata. Para o desenvolvimento dos marcadores SNPs, 118 sequências selecionadas das bibliotecas de expressão forward e reverse foram usadas para o desenho de primers; 37 delas foram usadas para avaliar o polimorfismo no mesmo set de indivíduos de P. alata. Foram encontrados 34 locos contendo SNPs bialélicos em 16 fragmentos gênicos, cujas sequencias variaram em tamanho de 332 a 872 pb. Considerando todos os fragmentos gênicos (16), foi analisado um total de 10.003 pb; a frequência de SNPs foi estimada como sendo 1 a cada 294 pb. Observou-se a mesma ocorrência de SNPs (50%, 17/34) em regiões codantes e não-codantes. Uma função putativa pôde ser atribuída a todos os fragmentos gênicos de P. alata, sendo que 82% mostraram homologia com as mesmas proteínas das sequências de origem, isoladas de P. edulis. No geral, os locos marcadores apresentaram baixo nível de polimorfismo molecular. Este é o primeiro trabalho sobre o desenvolvimento de locos marcadores funcionais putativos em Passiflora usando transcritos expressos em resposta à Xap. / One of the current challenges of tropical fruit research is to incorporate molecular marker-based approaches into conventional breeding programs. The sweet passion fruit (Passiflora alata) is a diploid, outcrossing and underexploited species. Recently, our group has constructed a P. alata linkage map consisted of different types of molecular markers. Moreover, we have a set of transcripts of Passiflora edulis obtained from two expression libraries: the forward and the reverse where differentially expressed transcripts were isolated from a plant inoculated with Xanthomonas axonopodis (Xap) (672), and from the control plant, uninoculated (310), respectively. Thus, in this study, this set of transcripts were exploited aiming at the development of SNP and SSR markers for future enrichment of the P. alata linkage map with putative functional markers. For the development of SSR markers, the 672 sequences from the forward library were investigated and 91 of them were found to have 115 SSRs. As expected, the trinucleotide class of repeats was the most abundant, and the (AG)n motif was the most common among the dinucleotide repeats. Primers were designed to amplify 42 of these SSRs. Transferability tests and polymorphism investigation were carried out using two accessions of P. edulis and six individuals of the mapping population of P. alata. Thirty-four primer pairs showed a good amplification pattern but only 10 loci revealed polymorphism in P. alata. For the development of SNP markers, 118 sequences selected from forward and reverse expression libraries were used for designing primers; 37 were used to assess the polymorphism in the same set of individuals of P. alata. Thirty-four biallelic SNPs were found in 16 gene fragment sequences that ranged in size from 332 to 872 bp. Considering all gene fragments, a total of 10,003 bp was obtained; the frequency of SNPs was estimated to be 1 every 294 bp. The same prevalence of SNPs (50%, 17/34) was observed within coding and non-coding regions. A putative function was assigned to all gene fragments of P. alata; 82% of them have shown homology to the original protein sequences isolated from P. edulis. Overall, the marker loci showed a low level of molecular polymorphism. This is the first report on the development of putative functional marker loci in Pasiflora using transcripts induced in response to Xap.

A cultura do maracujá-doce (Passiflora alata Curtis, 2n = 18) não apresenta expressão comercial como à do maracujá-amarelo. No entanto, por se tratar de uma frutífera relativamente nova nos mercados, com grande potencial de expansão devido ao seu valor agregado, há necessidade de se realizarem estudos genéticos e de melhoramento visando a sua expansão comercial, que deve vir acompanhada pela geração de conhecimento científico. Assim, o objetivo deste estudo foi enriquecer o mapa genético integrado da espécie com marcadores funcionais e mapear QTL relacionados à produção e qualidade de fruto. Para tal, foi utilizada uma população F1 composta por 180 indivíduos, provenientes do cruzamento simples entre dois acessos de maracujá-doce. Para a construção do mapa de ligação, utilizou-se um algoritmo que estima, por verossimilhança, simultaneamente, a fase de ligação e a frequência de recombinação, especialmente desenhado para espécies não endogâmicas. Em paralelo, 100 genótipos dessa mesma população foram avaliados fenotipicamente em dois locais, durante dois anos, para caracteres de interesse agronômico. As análises de QTL foram feitas pelo método de mapeamento por intervalo composto e marcadores com diferentes padrões de segregação. Os dados fenotípicos mostraram que existe variabilidade genética na população F1 para ser explorada com fins de melhoramento. Um novo mapa de ligação integrado foi gerado com 1786,11 cM, com uma densidade entre marcas de 4,16 cM. Foram alocados no mapa integrado cinco marcadores do tipo RGA nos grupos de ligação I, II e VI. De um total de 39 QTL, seis QTL estão associados ao caráter diâmetro médio de fruto, quatro ao comprimento médio de fruto, cinco ao peso médio de fruto, cinco à espessura média da casca, cinco ao peso médio da casca, quatro ao peso médio da polpa, cinco ao teor de sólidos solúveis totais, três ao número médio de frutos e dois ao caráter produção. A porcentagem da variação fenotípica explicada por estes QTLs variou de 5,67, para o caráter produção, a 23,52%, para o caráter teor de sólidos solúveis totais. A despeito do número e da importância dos QTL mapeados neste trabalho, é necessário o desenvolvimento de marcadores moleculares mais informativos para a saturação do mapa genético e a obtenção de estimativas cada vez mais acuradas, visando incorporar dados moleculares em programas de melhoramento genético da cultura. / The sweet passion fruit crop (Passiflora alata, 2n = 18) does not present a commercial value as the yellow passion fruit crop. However, as it is a crop that recently entered the markets, with increasing potential for expansion due to its aggregated value, it is important to develop genetic and breeding studies to allow this expansion, which need to be accompanied by scientific knowledge generation. Therefore, the aim of the present study was to enrich the integrated genetic map of the species with functional markers and mapping QTL related to yield and fruit quality. We used an F1 population composed of 180 individuals derived from a single cross between two accessions of sweet passion fruit. For linkage map construction, a likelihood-based algorithm for simultaneously estimating linkage phase and recombination fraction, specially designed for outcrossing species, was used. Separately, 100 genotypes of the same population were phenotypic evaluated in two localities, during two years, for agronomic traits. QTL mapping was carried out by performing composite interval analysis and using markers with different segregation ratios. Phenotypic data showed that there is genetic variability in the F1 population to be exploited in breeding programs. A novel linkage map spanning 1786,11 cM, with an average marker density of 4,16 cM was constructed. We attributed five RGA markers in the linkage groups I, II and VI. Out of 39 QTL, six were associated with the trait average fruit width, four with average fruit length, five with average fruit weight, five with average skin thickness, five with average skin weight, four with average pulp weight, five with soluble solids content, three with average fruit number and two QTL were detected for fruit yield. The percentage of phenotypic variation explained by these QTL ranged from 5,67, for the trait yield to 23,52% for the trait soluble solids content. Despite of the number and importance of the QTL here mapped, new and informative markers are necessary to be developed to achieve map saturation, and providing more accurate estimates aiming at incorporating molecular information in breeding programs of the crop.

O presente trabalho teve por objetivos avaliar métodos de inoculação de Nectria haematococca e Phytophthora parasitica e idades de Passiflora edulis f. flavicarpa suscetíveis à infecção; avaliar a ocorrência de damping-off e podridão de colo do maracujazeiro em solo infestado; avaliar o comportamento de diferentes Passsifloraceas e genótipos de maracujazeiro amarelo aos respectivos patógenos; realizar testes de controle químico in vitro, tratamento químico erradicante em solo infestado e tratamento químico curativo em P. edulis f. flavicarpa para os respectivos patógenos. Inoculações no colo das plantas de P. edulis f. flavicarpa proporcionaram maiores níveis de doença comparadas às inoculações no sistema radicular, previamente ferido. Os resultados sugerem que N. haematococca seja um patógeno que penetra através de ferimentos. A mortalidade foi maior quando a inoculação foi realizada em plantas mais jovens e quando os patógenos N. haematococca e P. parasitica estavam em associação. Dentre as 17 espécies de Passiflora avaliadas para resistência aos patógenos, as espécies P. nitida, P. laurifolia e P. alata apresentaram as menores médias de lesões de N. haematococca, enquanto que para P. parasitica foram as espécies P. suberosa, P. foetida e P. morifolia as menos afetadas. Passiflora sidaefolia, P. edulis f. flavicarpa e P. edulis f. edulis foram as mais suscetíveis a ambos os patógenos, com sintomas que culminaram com a morte de plantas. Os genótipos de P. edulis f. flavicarpa mais resistentes a N. haematococca foram os procedentes de Morretes (PR) e a variedade Maguari e de Sapucaí (SP), enquanto que para P. parasitica foram os genótipos de Morretes (PR), Jaboticabal (SP) e LE13P2 (IAC) os menos afetados. A variedade Sul-Brasil e o genótipo de Livramento (BA) foram altamente suscetíveis a ambos os patógenos, com sintomas que culminaram com a morte de plantas. No teste de fungitoxidade in vitro avaliou-se a eficiência dos fungicidas na inibição do crescimento micelial de N. haematococca e P. parasitica. Na dose 100 ppm somente prochloraz inibiu totalmente o crescimento micelial de N. haematococca e nenhum produto inibiu acima de 82 % o crescimento de P. parasitica. Os fungicidas prochloraz, thiabendazole, thiram+thiabendazole, carbendazim, triflumizole e captan exerceram controle erradicante em solo infestado com N. haematococca, inibindo a incidência da doença em plantas com seis semanas pós-germinação. O mesmo foi observado com os produtos kif, dimethomorph, metalaxyl+mancozeb, mancozeb, cymoxanil+maneb e oxicloreto de cobre para P. parasitica. Os fungicidas testados em tratamento curativo inibiram o desenvolvimento da doença com melhores resultados quando aplicados dois dias após a inoculação, comparado a sete dias. Os fungicidas prochloraz e carbendazim destacaram-se por evitar a morte de plantas inoculadas com N. haematococca e os fungicidas kif, dimethomorph, metalaxyl+mancozeb e cymoxanil+maneb apresentaram eficiência semelhante entre si e superior a fosetyl- Al no controle de P. parasitica. / The objectives of the present work were to evaluate methods of inoculation of Nectria haematococca and Phytophthora parasitica and ages of Passiflora edulis f. flavicarpa which are susceptible to infection; to evaluate the damping-off and collar rot of passion fruit plant in infested soil; to evaluate the behavior of different Passsifloraceas and yellow genotypes of passion fruit to the respective pathogens; to carry out tests of chemical control in vitro, eradicative chemical treatment in infested soil and curative chemical treatment in P. edulis f. flavicarpa for the respective pathogens. Inoculations in the collar zone of P. edulis f. flavicarpa plants provided higher levels of disease when compared to the inoculations in the radicular system previously wounded. The results suggest that N. haematococca is a pathogen that penetrates through wounds. Mortality was higher when the inoculation was carried out in younger plants and when both pathogens were together. Amongst the 17 species of Passiflora tested for resistance to the pathogens, P. nitida, P. laurifolia, and P. alata showed the lowest average of N. haematococca lesions, while P. suberosa, P. morifolia, and P. foetida were the least affected species by P. parasitica. Passiflora sidaefolia, P. edulis f. flavicarpa, and P. edulis f. edulis were the most susceptible to both pathogens, showing symptoms that culminated with the death of the plants. The most resistant genotypes of P. edulis f. flavicarpa to N. haematococca were those from Morretes (PR), Maguari variety, and those from Sapucaí (SP); with respect to P. parasitica, the genotypes from Morretes (PR), Jaboticabal (SP), and LE13P2 (IAC) were the least affected. The Sul- Brasil variety and the genotype from Livramento (BA) had been highly susceptible to both pathogens, having symptoms that culminated with the death of plants. The in vitro efficiency of the fungicides in the inhibition of the mycelial growth of N. haematococca and P. parasitica was evaluated. At 100 ppm, only prochloraz inhibited totally the mycelial growth of N. haematococca and no product inhibited over 82 % the growth of P. parasitica. Prochloraz, thiabendazole, thiram+thiabendazole, carbendazim, triflumizole, and captan controlled eradicatively the soil infested by N. haematococca, inhibiting the incidence of the disease in plants which were six weeks old. The same was observed for the products kif, dimethomorph, metalaxyl+mancozeb, mancozeb, cymoxanil+maneb, and copper oxychloride for P. parasitica. The tested fungicides in curative treatment inhibited the development of the disease with better results when applied two days after the inoculation, compared to seven days. Prochloraz and carbendazim were outstanding for preventing the death of plants inoculated with N. haematococca. Kif, dimethomorph, metalaxyl+mancozeb, and cymoxanil+maneb showed similar efficiency and were superior to fosetyl-Al in the control of P. parasitica.

This study aimed to characterize pineapple, passion fruit and mango byproducts and select the material with the greatest potential as food ingredient to be applied in two food products: beef burger and corn extruded product. Fiber was the major component present in pineapple and passion fruit byproducts (>50%), and, due to this, they showed considerable water holding capacity. The fruit byproducts had considerable phenolic content and antioxidant activity, especially the mango byproduct. The results of the microbial counts and the content of pesticides residues of the byproducts were within the limits established by the Brazilian law and were safe for food application. Due to the high fiber amount and the functional properties presented, the byproducts were explored considering this potential. Thus, the sample with the best results was selected and evaluated as partial fat replacer in beef burger and as source of fiber in a corn extruded product. The first step of the beef burger application evaluated each byproduct in four concentrations (1.0, 1.5, 2.0, and 2.5%), along with canola oil, as partial fat replacers. All byproducts improved the cooking properties of the burgers, especially the pineapple. Sensory analysis showed that color, odor and overall acceptance were not affected by the treatments. Based on the results, pineapple byproduct, at the concentration of 1.5%, was selected for further studies. Pineapple byproduct (1.5%) and canola oil (5%) were evaluated as partial animal fat replacers in low-fat beef burger. Five treatments were performed: conventional (20% fat) and four formulations with 10% of fat: control, with pineapple byproduct, with canola oil, and with pineapple byproduct and canola oil. Pineapple byproduct incorporation improved the cooking properties and the texture (shear force) and canola oil addition improved the lipid profile, without reducing the shelf life of the burgers. The quantitative descriptive analysis indicated that the use of the two fat replacers together can be an alternative choice to minimize the sensory alterations of the fat reduction. As the final step of this study, the potential application of pineapple byproduct in a corn extruded product for fiber enhancement was evaluated. During extrusion, byproduct (0, 10.5, and 21%), moisture (14, 15, and 16%) and temperature (140 and 160 °C) were evaluated. Pineapple byproduct addition decreased expansion and luminosity, while increasing redness of the extrudates compared to the control (0% byproduct/14% moisture/140 °C). When hardness, yellowness, water absorption, and bulk density were compared to the control, there was no effect of 10.5% addition on the extrudates, indicating that, at this level, pineapple byproduct could be added without promoting significant alterations in the properties of the final extruded product. The results of this study highlight the potential of pineapple byproduct in the development of new products, bringing the opportunity to convert them into value-added food ingredients. / Este estudo objetivou caracterizar subprodutos de abacaxi, maracujá e manga e selecionar aquele com maior potencial como ingrediente alimentício para ser aplicado em dois produtos: hambúrguer bovino e extrusado de milho. A fibra foi o maior componente presente nos subprodutos de abacaxi e maracujá (>50%) e, devido a isto, eles mostraram considerável capacidade de retenção de água. Os subprodutos de frutas apresentaram teor de compostos fenólicos e atividade antioxidante considerável, especialmente o de manga. Os resultados das contagens microbianas e dos teores de resíduos de agrotóxicos dos subprodutos apresentaram-se dentro dos limites estabelecidos pela legislação brasileira, estando seguros para aplicação em alimentos. Devido ao alto teor de fibra e às propriedades funcionais apresentadas, os subprodutos foram explorados considerando-se este potencial. Dessa forma, a amostra com melhores resultados foi selecionada e avaliada como substituto parcial de gordura em hambúrguer bovino e como fonte de fibras em extrusado de milho. A primeira etapa da aplicação em hambúrguer bovino avaliou cada subproduto em quatro concentrações (1,0, 1,5, 2,0 e 2,5%), juntamente com o óleo de canola, como substitutos parciais de gordura. Todos os subprodutos melhoraram as propriedades de cozimento dos hambúrgueres, especialmente o de abacaxi. A análise sensorial mostrou que cor, odor e aceitação global não foram afetados pelos tratamentos. Através dos resultados, o subproduto de abacaxi, na concentração de 1,5%, foi selecionado para estudos complementares. Subproduto de abacaxi (1,5%) e óleo de canola (5%) foram avaliados como substitutos parciais de gordura animal em hambúrguer bovino com teor reduzido de gordura. Cinco tratamentos foram realizados: convencional (20% gordura) e quatro formulações com 10% de gordura: controle, com subproduto de abacaxi, com óleo de canola, e com subproduto de abacaxi e óleo de canola. A incorporação do subproduto de abacaxi melhorou as propriedades de cozimento e a textura (força de cisalhamento) e a adição do óleo de canola melhorou o perfil lipídico, sem reduzir a vida útil dos hambúrgueres. A análise descritiva quantitativa indicou que o uso dos dois substitutos de gordura em conjunto pode ser uma alternativa adequada para minimizar alterações sensoriais da redução da gordura. Como fase final deste estudo, o potencial da aplicação de subproduto de abacaxi em extrusado de milho visando o aumento do teor de fibras foi avaliado. Durante a extrusão, subproduto (0, 10,5, 21%), umidade (14, 15, e 16%) e temperatura (140 e 160 °C) foram avaliados. A adição do subproduto de abacaxi diminuiu a expansão e a luminosidade, enquanto que aumentou a intensidade de cor vermelha dos extrusados comparados com o controle (0% subproduto/14% umidade/140 °C). Quando a dureza, intensidade de cor amarela, absorção de água e densidade foram comparadas com o controle, não houve efeito da adição de 10,5% sobre os extrusados, indicando que, neste nível, o subproduto de abacaxi pode ser adicionado, sem promover alterações significativas sobre as propriedades do produto final. Os resultados deste estudo destacam o potencial do subproduto de abacaxi no desenvolvimento de novos produtos, trazendo a oportunidade de convertê-los em ingredientes alimentícios com valor agregado.