O patógeno Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae causa a mancha oleosa ou bacteriose do maracujazeiro, uma doença que acarreta prejuízos à cultura em decorrência da baixa produção de frutos, podendo causar a morte das plantas. Uma coleção de 87 isolados deste patovar, oriundos de 22 cidades dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Paraná e do Distrito Federal, foi usada para estudar a diversidade genética por rep-PCR e AFLP. Nove isolados de outros patovares foram incluídos nas análises genéticas. A técnica rep-PCR revelou pouca diversidade entre os isolados do patovar passiflorae, mas diferenciou, claramente, os diferentes patovares. Todavia, a técnica AFLP revelou considerável diversidade genética entre os isolados do patovar passiflorae. A análise molecular da variância mostrou que a maior parte da diversidade (49,4%) se encontra entre as cidades de coleta. O agrupamento gerado com base nos coeficientes de similaridade e os resultados do teste de atribuição pelo programa Structure revelaram clusters genotípicos homogêneos. Isto evidencia que a variação está mais associada à geografia, ou seja, às cidades de coleta, e que o fluxo desses isolados é pequeno. Cinco conjuntos de primers foram desenhados para a detecção do patógeno em plantas. Desses, um conjunto de primers foi desenhado a partir da seqüência intergênica 16S-23S rRNA e se mostrou específico para o patovar passiflorae. Nenhum amplicon foi detectado nos patovares controles. O restante dos primers foi desenhado a partir do seqüenciamento de locos de AFLP, monomórficos para o patovar passiflorae e ausentes nos demais patovares. Estes primers não foram totalmente específicos; no entanto, todos podem ser recomendados para o diagnóstico da mancha oleosa, uma vez que não há registros de outras Xanthomonas em pomares de maracujá. / The pathogen Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae is responsible for the bacterial leaf spot of passion fruits, a disease that provokes commercial losses due to low levels of fruit production and even plant death. A group of 87 isolates of this pathovar, collected from 22 localities of São Paulo, Minas Gerais and Paraná States as in the Federal District was used to evaluate the genetic diversity based on rep-PCR and AFLP. Isolates from other nine pathovars were included in the genetic analyses. Low level of genetic diversity was revealed by the rep- PCR technique, which clearly distinguished the different pathovars. However, considerable diversity between isolates of the pathovar passiflorae was revealed by the AFLP technique. The analysis of molecular variance showed that differences between localities contributed to most part of the variance (49.4%). Groups generated based on similarity coefficients as well as results produced by the software Structure assigning isolates to groups, revealed homogeneous genotypic clusters. This confirms that variance is associated with geographic origin e.g. sampling localities, and that flow of isolates is restricted among localities. Five primer sets were designed for pathogen detection in plants; a primer set was designed for PCR amplification of the intergenic sequence 16-23S rRNA, which was shown to be specific to the pathovar passiflorae. No amplicons were detected in the controls. The remaining primers were designed after sequencing AFLP bands that were monomorphic within the pathovar passiflorae but absent in the other pathovars. These primers were not absolutely specific but all could be recommended for diagnosis of leaf spot as there is no report on the occurrence of other Xanthomonas species in passion fruit orchards.

Há muitos estudos sobre plantas medicinais brasileiras, porém a carência de pesquisas relacionadas à segurança alimentar de plantas brasileiras usadas como alimento ainda é consideravelmente grande. A maioria dos alcaloides são substâncias tóxicas que podem ser encontrados em uma grande variedade de plantas medicinais e alimentícias, inclusive em espécies de Passiflora chamadas popularmente no Brasil de \"maracujá\". As pesquisas sobre as diversas espécies de Passiflora, em grande parte estão relacionadas com as folhas e frutos e na maioria das vezes as sementes são consideradas como resíduo. As metodologias analíticas modernas para análises na área de alimentos, utilizando SBSE com fase extratora de PDMS, tem o objetivo de facilitar o preparo de amostras complexas e diminuir os resíduos orgânicos gerados na etapa de preparo da amostra. Para isso, este estudo teve como objetivo a análise de alcaloides harmânicos pelo método SBSE/CLAE-Flu dual, adaptado para a quantificação de harmana e de harmina em sementes de maracujá azedo. O método foi especifico e linear para os alcaloides estudados (r2 = 0,996 para harmana e r2 = 0,999 para harmina). Os ensaios de repetibilidade e de precisão intermediária confirmam a precisão do método. Os testes de recuperação (entre 92,34% a 105,90% para a harmana e 83,61% a 117,76% para a harmina) indicam a exatidão do método. A amostra analisada continha (3,094x10-2 ± 5,874x10-5) µg de harmana por grama de sementes secas de maracujá azedo e (8,108x10-3±7,599x10-4) µg de harmina por grama de sementes secas de maracujá azedo. A detecção por fluorescência foi um método sensível e seletivo para a detecção da harmana (LOD = 30 ng L-1 e LOQ = 200 ng L-1) e para a harmina (LOD = 100 ng L-1 e LOQ = 400 ng L-1). Conclui-se que o método SBSE/CLAE-Flu dual pode ser usado para a análise dos alcaloides harmânicos nas sementes de maracujá azedo. / There are many studies of Brazilian medicinal plants, but the lack of research related to food safety of Brazilian plants used as food is still high. Most of the alkaloids are toxic chemicals found in a wide variety of medicinal plants and edible plants, including Passiflora species popularly known in Brazil as \"maracujá\". Researches about most of the Passiflora species are largely related about the leaves and the fruits and in most of the cases, the seeds are considered as waste. Modern analytical methodologies for food analysis, using SBSE with PDMS as the extraction phase, have the purpose of make easier the preparation of complex samples and to reduce the organic waste generated in the sample preparation step. For that, this study had the aim to analyze harman alkaloids by a dual SBSE/HPLC-Flu method, adapted to the quantification of harmane and harmine in sour passion fruit seeds. The method was specific and linear for the studied of the alkaloids (r2 = 0.996 for harmane and r2 = 0.999 for harmine). The repeatability and accuracy intermediate assays confirm the precision of the method. The recovery assay (between 92.34% and 105.90% to harmane and between 83.61% and 117.76% to harmine) indicate the accuracy of the method. The sample analyzed contained (3.094x10-2 ± 5.874x10-5) µg of the harmane in 1.0 g of dried seeds of sour passion fruit and (8.108x10-3 ± 7.599x10-4) µg of the harmine in 1.0 g of dried seeds of sour passion fruit. The fluorescence detection was a sensitive and selective method for detection of harmane (LOD = 30 ng L-1 and LOQ = 200 ng L-1) and harmine (LOD = 100 ng L-1 and LOQ = 400 ng -1). It was concluded that the dual SBSE/HPLC-Flu method can be used for the analysis of the harman alkaloids in dried seeds of sour passion fruit.

O Brasil é um dos principais países produtores de abacate. A competitividade do país no comércio internacional desta fruta demanda a minimização de danos pós-colheita, especialmente os causados pela antracnose. Este trabalho objetivou: (i) identificar e quantificar os danos pós-colheita em abacates Fuerte e Hass; (ii) identificar e caracterizar isolados de Colletotrichum do abacateiro, comparando-os com isolados de outras frutíferas; (iii) avaliar o efeito de temperatura e período de molhamento sobre a germinação de conídios e formação de apressórios, bem como, sobre a infecção e colonização de Colletotrichum gloeosporioides em abacates; (iv) avaliar o efeito de fungicidas e sanitizantes no controle da antracnose do abacateiro em pós-colheita. As incidências da antracnose e de outros danos póscolheita foram avaliadas periodicamente em abacates amostrados em três etapas do beneficiamento em packinghouse e revelaram que a antracnose foi a principal doença póscolheita, com incidências média de 45,7% para o abacate Fuerte e 68,7% para Hass. Identificação, caracterização e análise comparativa foram realizadas para 93 isolados obtidos de abacate, manga, maracujá e pêssego, por meio do aspecto da colônia e taxa de crescimento em diferentes temperaturas, formato e dimensões dos conídios, análise molecular (PCR com oligonucleotídeos espécie-específicos e análise de sequências de nucleotídeos das regiões ITS e -tubulina), patogenicidade e atividade enzimática (amilase, catalase, celulase, lacase, lípase, pectinase e proteinase). Todos os isolados de abacate e manga, e alguns isolados de pêssego e maracujá foram identificados como C. gloeosporioides. As espécies C. acutatum e C. boninense foram detectadas em pêssego e maracujá, respectivamente. A análise filogenética associada a algumas características morfo-culturais permitiu a separação das espécies e revelou diferenças intra-específicas entre os isolados de C. gloeosporioides, de acordo com o hospedeiro de origem. Os isolados de manga compuseram um grupo distinto dentro da espécie. Entretanto, independente do hospedeiro de origem, as três espécies de Colletotrichum promoveram infecções cruzadas nos quatro hospedeiros avaliados, indicando a ausência de especificidade patogênica. Para todas as características avaliadas houve alta variabilidade entre os isolados. Germinação de esporos e formação de apressórios de C. gloeosporioides sobre abacates Fuerte incubados a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40ºC com período de molhamento de 3, 6, 12, 24h revelou que o fungo pode explorar ampla faixa de temperatura, germinando e formando apressórios entre 10 e 35ºC, com temperatura ótima de 23,4ºC e 24,0ºC, respectivamente. Aumento no período de molhamento promoveu maiores percentagens de esporos germinados e formação de apressórios. Os efeitos da temperatura (10, 15, 20, 25, 30ºC) e períodos de molhamento (6, 12, 24h) na infecção e colonização por esta espécie foram avaliados em frutos de Hass e Fuerte, inoculados com ferimento. Exceto a 10ºC, houve manifestação de sintomas em todas as temperaturas, com maiores lesões e taxas de progresso da doença a 30ºC. Para controle das doenças testou-se tratamento dos frutos por imersão em calda contendo azoxistrobina, cloreto de benzalcônio, dióxido de cloro, Ecolife®, hipoclorito de sódio, imazalil, procloraz e tiabendazol. Dentre esses, procloraz e imazalil foram os mais eficientes. / Brazil is one of the most important avocado producers in the world. However, to compete in the international avocado business it is necessary reduction of post-harvest damages, especially those caused by anthracnose. This work had the following objectives: (i) to identify and to quantify post-harvest damages in Fuerte and Hass avocados; (ii) to identify and to characterize the avocado isolates of Colletotrichum, comparing them with other fruit isolates; (iii) to evaluate the effect of temperature and wetness period in the conidia germination and appressoria formation, as well as in the infection and colonization of Colletotrichum gloeosporioides in avocado; (iv) to evaluate the post-harvest control of anthracnose in avocado using fungicides and sanitizers. Both the anthracnose incidence and other post-harvest damages were evaluated periodically using avocado samples collected at three steps in the packinghouse. It was revealed that anthracnose was the major factor of post-harvest damages, with average incidence of 45.7% in Fuerte and 68.7% in Hass. Identification, characterization and comparative analyses were performed with 93 isolates from avocado, mango, passion fruit and peach according to the colony aspect and growth rate in different temperatures, conidia shape and size, molecular analyses (species-specific PCR and sequencing of ITS and -tubulin genes), pathogenicity and enzymatic activity (amylase, catalase, cellulase, laccase, lipase, pectinase and proteinase). All of the avocado and mango isolates and some isolates from peach and passion fruit were identified as C. gloeosporioides. The species C. acutatum and C. boninense also were indentified in peach and passion fruit, respectively. Phylogenetic analyses performed with some morphological data allowed species differentiation and revealed intra-specific differences between C. gloeosporioies according to the original host. Mango isolates were grouped together into the C. gloesporioides clade. However, independently of the original host, these three Colletotrichum species showed to cross-infect the four evaluated hosts, suggesting lack of pathogenical specificity. There was high variability for all evaluated characteristic. For C. gloeosporioides, spores germination and appressoria formation on the surface of Fuerte avocado incubated under 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40 ºC and wetness periods of 3, 6, 12 and 24 hours showed that this fungus could explore a wide range of temperature. Germination and appressoria formation were observed between 10 and 35 ºC, with optimal temperatures of 23.4 and 24.0 ºC, respectively. Both the germination and appressoria formation were higher with the increase in the wetness period. The effect of temperature (10, 15, 20, 25, 30 ºC) and the wetness period (6, 12, 24h) were evaluated on the infection and colonization of C. gloeosporioides in Fuerte and Hass avocado, which were wound-inoculated. Except at 10 ºC, all tested temperatures led to symptoms expression. The highest disease progress rate and lesion diameter were verified at 30 ºC. Fruit immersion on fungicides solution was tested to control post-harvest diseases using azoxystrobin, benzalkonium chloride, chlorine dioxide, Ecolife, sodium hypochloride, imazalil, procloraz and thiabendazol. Among these fungicides, prochloraz and imazalil were the most efficient in controlling post-harvest diseases in avocado.

O gênero Passiflora é um excelente modelo para estudos de transição de fase, pois há diferenças morfológicas evidentes entre as plantas nas fases juvenil, adulta vegetativa e adulta reprodutiva. Há relatos de que quando se introduzem ápices de plantas adultas de Passiflora edulis, quer estejam na fase vegetativa ou reprodutiva, em condições de cultivo in vitro, observa-se a regressão à fase juvenil. O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar as modificações morfológicas envolvidas na reversão à juvenilidade de ápices caulinares adultos de P. edulis quando cultivados em meio de cultura sem adição de reguladores de crescimento além de avaliar o efeito de reguladores de crescimento no intuito de evitar a reversão à juvenilidade no cultivo in vitro de P. edulis. O trabalho foi desenvolvido a partir da combinação da técnica da micropropagação in vitro e microscopia eletrônica de varredura, sendo dividido em três experimentos: o cultivo in vitro de ápices caulinares em meio MSM sem reguladores de crescimento e análise de amostras em microscópio eletrônico de varredura, cultivo in vitro de ápices caulinares em meio MSM com reguladores de crescimento e cultivo in vitro de ápices caulinares em meio MSM adicionados com BAP na concentração de 10?M com análises de amostras em microscópio estereoscópico. Através de micrografias eletrônicas e imagens estereoscópicas, foi possível caracterizar as fases do desenvolvimento de P. edulis, demonstrando os caracteres morfológicos assim como a manutenção das estruturas cultivadas in vitro. Não foi possível observar o rejuvenescimento in vitro quando ápices caulinares foram cultivados em meio ½ MS ou MSM sem adição de reguladores de crescimento. O rejuvenescimento de ápices caulinares adultos de P. edulis foi obtido a partir do cultivo em meio MSM com adição de 10?M de BAP. Entretanto, o rejuvenescimento foi parcial, pois nem todas as características foram revertidas. A formação de folhas lanceoladas in vitro e o desenvolvimento de brotos adventícios in vitro caracterizaram a reversão à juvenilidade em P. edulis. O meio MSM suplementado com 10 ?M de BAP foi favorável ao desenvolvimento de gemas axilares, além de facilitar a indução do rejuvenescimento dos ápices caulinares. Logo, a reversão à juvenilidade foi alcançada sob as condições in vitro adotadas / The genus Passiflora is an excellent model for phase transition studies because there are obvious morphological differences between plants in the juvenile, adult vegetative and adult reproductive phases. It has been reported that when introducing shoot tips of adult plants of Passiflora edulis, whether in the vegetative or reproductive phase, under in vitro culture conditions, regression to the juvenile phase is observed. The general objective of this work was to characterize the morphological changes involved in the reversion to juvenility of adult shoot tips of P. edulis when grown in culture medium without addition of growth regulators in addition to evaluating the effect of growth regulators in order to avoid reversion to juvenility in the in vitro cultivation of P. edulis. The work was developed from the combination of in vitro micropropagation and scanning electron microscopy, and was divided in three experiments: in vitro culture of shoot tips in MSM medium without growth regulators and analysis of samples in scanning electron microscope; in vitro culture of shoot tips in MSM medium with growth regulators and in vitro culture of shoot tips in MSM medium added with BAP at the concentration of 10?M and analysis of samples under a stereoscopic microscope. Through electronic micrographs and stereoscopic images, it was possible characterize the phases of the development of P. edulis, demonstrating the morphological traits as well as the maintenance of the structures cultivated in vitro. In vitro rejuvenation could not be observed when shoot tips were grown in ½ MS or MSM medium without addition of growth regulators. The rejuvenation of P. edulis adult shoot tips was obtained from the cultivation in MSM medium with the addition of 10?M BA. However, the rejuvenation was partial, since not all the characteristics were reversed. The formation of in vitro lanceolated leaves and the development of in vitro adventitious shoots characterized the reversion to juvenility in P. edulis. The MSM medium supplemented with 10?M BA was favorable to the development of axillary buds, in addition to facilitating the induction of the rejuvenation of the shoot tips. Therefore, the reversion to juvenility was achieved under the in vitro conditions adopted

Um dos desafios atuais da pesquisa em frutíferas tropicais é incorporar abordagens baseadas em marcadores moleculares nos programas convencionais de melhoramento. O maracujá-doce (Passiflora alata) é uma espécie diploide, de fecundação cruzada e pouco explorada. Recentemente, nosso grupo construiu um mapa de ligação de P. alata composto de diferentes tipos de marcadores moleculares. Além disso, dispõe-se de um conjunto de transcritos de Passiflora edulis, obtidos a partir de duas bibliotecas de expressão: forward e reverse onde foram isolados transcritos diferencialmente expressos na planta inoculada com Xanthomonas axonopodis (Xap) (672) e na planta controle, não inoculada (310), respectivamente. Assim, neste estudo, este conjunto de transcritos foi explorado visando ao desenvolvimento de marcadores SSR e SNP com o intuito de enriquecer, posteriormente, o mapa de ligação de P. alata com marcadores funcionais putativos. Para o desenvolvimento dos marcadores SSRs, as 672 sequências da biblioteca forward foram investigadas e em 91 delas foram encontrados 115 SSRs. Como esperado, a classe de repetições trinucleotídicas foi a mais abundante, sendo o motivo (AG)n o mais comum entre as repetições dinucleotídicas. Desenhou-se primers para amplificar 42 desses SSRs. Dois acessos de P. edulis e seis indivíduos da população de mapeamento de P. alata foram usados nos testes de transferibilidade e avaliação do polimorfismo. Trinta e quatro pares de primers apresentaram bom padrão de amplificação, porém apenas 10 deles revelaram polimorfismo em P. alata. Para o desenvolvimento dos marcadores SNPs, 118 sequências selecionadas das bibliotecas de expressão forward e reverse foram usadas para o desenho de primers; 37 delas foram usadas para avaliar o polimorfismo no mesmo set de indivíduos de P. alata. Foram encontrados 34 locos contendo SNPs bialélicos em 16 fragmentos gênicos, cujas sequencias variaram em tamanho de 332 a 872 pb. Considerando todos os fragmentos gênicos (16), foi analisado um total de 10.003 pb; a frequência de SNPs foi estimada como sendo 1 a cada 294 pb. Observou-se a mesma ocorrência de SNPs (50%, 17/34) em regiões codantes e não-codantes. Uma função putativa pôde ser atribuída a todos os fragmentos gênicos de P. alata, sendo que 82% mostraram homologia com as mesmas proteínas das sequências de origem, isoladas de P. edulis. No geral, os locos marcadores apresentaram baixo nível de polimorfismo molecular. Este é o primeiro trabalho sobre o desenvolvimento de locos marcadores funcionais putativos em Passiflora usando transcritos expressos em resposta à Xap. / One of the current challenges of tropical fruit research is to incorporate molecular marker-based approaches into conventional breeding programs. The sweet passion fruit (Passiflora alata) is a diploid, outcrossing and underexploited species. Recently, our group has constructed a P. alata linkage map consisted of different types of molecular markers. Moreover, we have a set of transcripts of Passiflora edulis obtained from two expression libraries: the forward and the reverse where differentially expressed transcripts were isolated from a plant inoculated with Xanthomonas axonopodis (Xap) (672), and from the control plant, uninoculated (310), respectively. Thus, in this study, this set of transcripts were exploited aiming at the development of SNP and SSR markers for future enrichment of the P. alata linkage map with putative functional markers. For the development of SSR markers, the 672 sequences from the forward library were investigated and 91 of them were found to have 115 SSRs. As expected, the trinucleotide class of repeats was the most abundant, and the (AG)n motif was the most common among the dinucleotide repeats. Primers were designed to amplify 42 of these SSRs. Transferability tests and polymorphism investigation were carried out using two accessions of P. edulis and six individuals of the mapping population of P. alata. Thirty-four primer pairs showed a good amplification pattern but only 10 loci revealed polymorphism in P. alata. For the development of SNP markers, 118 sequences selected from forward and reverse expression libraries were used for designing primers; 37 were used to assess the polymorphism in the same set of individuals of P. alata. Thirty-four biallelic SNPs were found in 16 gene fragment sequences that ranged in size from 332 to 872 bp. Considering all gene fragments, a total of 10,003 bp was obtained; the frequency of SNPs was estimated to be 1 every 294 bp. The same prevalence of SNPs (50%, 17/34) was observed within coding and non-coding regions. A putative function was assigned to all gene fragments of P. alata; 82% of them have shown homology to the original protein sequences isolated from P. edulis. Overall, the marker loci showed a low level of molecular polymorphism. This is the first report on the development of putative functional marker loci in Pasiflora using transcripts induced in response to Xap.

O maracujá azedo, Passiflora edulis, e o maracujá doce, Passiflora alata, são as duas espécies pertencentes à família Passifloraceae de maior importância econômica para o Brasil, sendo seus frutos amplamente comercializados como alimentos. Um grupo de substâncias conhecido como alcaloides β-carbolínicos são componentes minoritários desses frutos, no entanto, a literatura indica que substâncias pertencentes a esse grupo podem ter atividade tóxica. Este trabalho apresentou três objetivos específicos, com o intuito de ampliar o conhecimento sobre a fitoquímica dos frutos de P. edulis e de P. alata e da aplicação da SBSE como método de preparo de amostra: quantificação de harmana e de harmina na polpa e nas sementes de P. alata utilizando SBSE-PDMS e análise por HPLC/Flu; identificação de alcaloides β-carbolínicos nas cascas de P. edulis através de análises por HPLC/Flu e por UHPLC/MS; estudo do processo de extração de norharmana por SBSE com duas fases extratores diferentes (PDMS e EG-Silicone) por HPLC/Flu. A quantificação de harmana e harmina na polpa e nas sementes de P. alata foi realizada após preparo de amostra por SBSE-PDMS e análises por HPLC/Flu. A concentração de harmana encontrada foi 1,0328 . 10-1 ± 3,1217 . 10-3 μg L-1 na polpa, enquanto que nas sementes foi encontrada a concentração de 7,4391 . 10-5 ± 2,5501 . 10-6 μg g-1. As concentrações de harmina ficaram abaixo do LOD e do LOQ na polpa e nas sementes de P. alata, respectivamente. Na identificação dos alcaloides β-carbolínicos nas cascas de P. edulis, os extratos para análises por HPLC/Flu e por UHPLC/MS foram preparados pelo método clássico, sendo identificados os alcaloides norharmana, harmana, harmina, harmol e harmalol. Nas análises por HPLC/Flu de extrato das cascas de P. edulis preparado utilizando SBSE-PDMS, o alcaloide norharmana foi identificado como majoritário e por esse motivo, foi realizado o estudo do processo de extração de norharmana por SBSE com duas fases extratoras diferentes, PDMS e EG-Silicone, utilizando planejamento fatorial fracionário, tendo como objetivo obter a melhor recuperação percentual possível. Com as melhores condições para extração definidas, os ensaios utilizando PDMS e EG-Silicone apresentaram recuperação percentual de cerca de 50 % e 80 %, respectivamente. A quantificação de harmana na polpa e nas sementes do maracujá doce, P. alata, indicou quantidades muito pequenas desse alcaloide nessas partes dos frutos, levando à conclusão que um fruto de P. alata, apresenta cerca de 140 vezes menos alcaloides β-carbolínicos do que o fruto de P. edulis, levando em consideração as quantidades de harmana e harmina no maracujá azedo relatadas na literatura. A identificação dos alcaloides β-carbolínicos nas cascas de P. edulis é um importante passo para a compreensão sobre a fitoquímica dessa parte do fruto, que, nos últimos anos, deixou de ser apenas resíduo industrial e passou a ser produto alimentício com valor agregado, comercializadas como farinhas das cascas de maracujá. O estudo sobre a utilização da SBSE como técnica de extração de norharmana mostrou-se promissor, atingindo recuperação percentual aceitável para o futuro desenvolvimento de um método de quantificação de norharmana nas cascas de maracujá. / Sour passion fruit, Passiflora edulis, and sweet passion fruit, Passiflora alata, are the two species of Passifloraceae of greater economic importance to Brazil, and their fruits are widely marketed as food. A class of compounds known as β-carboline alkaloids is a minor component of these fruits, however, the literature indicates that substances belonging to this group may have toxic activity. This work presents three specific objectives, in order to increase knowledge about the phytochemistry of P. edulis and P. alata and the application of SBSE as a sample preparation method: quantification of harmane and harmine in the pulp and in the seeds of P. alata using SBSE-PDMS and HPLC/Flu analysis; identification of β-carboline alkaloids in P. edulis peels using HPLC/Flu and UHPLC/MS analysis; study of the SBSE extraction process of norharmane using two different phases (PDMS and EG-Silicone), by HPLC/Flu analysis. Quantification of harmane and harmine in the pulp and the seeds of P. alata was performed after sample preparation by SBSE-PDMS and analysis by HPLC/Flu. The concentration of harmane was 1,0328 . 10-1 ± 3,1217 . 10-3 μg L-1 in the pulp while the in the seeds it was found 7.4391 . 10-5 ± 2.5501 . 10-6 μg g-1 harmane. The concentrations of harmine were below the LOD and LOQ in the pulp and in the seeds of P. alata, respectively. For the identification of the β-carboline alkaloids in the peels of P. edulis, the extracts were prepared by using the classic method and analyzed by HPLC/Flu and UHPLC/MS, and the alkaloids norharmane, harmane, harmine, harmol and harmalol were identified. In the HPLC/Flu analysis of the extract of P. edulis peels prepared using SBSE-PDMS, the alkaloid norharmane was identified as a major constituent and, for this reason, it was performed a study about the extraction process of norharmane by SBSE, evaluating two different phases, PDMS and EG-Silicone, by using fractional factorial design, aiming to get the best percentage recovery. Defined the best conditions for extraction, the experiments performed by using PDMS and EG-Silicone bars showed percentage recovery about 50% and 80%, respectively. Quantification of harmane in the pulp and seeds of sweet passionfruit, P. alata, indicated very small amounts of this alkaloid in these parts of the fruits, leading to the conclusion that the fruits of P. alata, has around 140 times less β-carboline alkaloid than the fruits of P. edulis, taking into account the amounts of harmana and harmine on sour passionfruit reported in the literature. Identification of β-carboline alkaloids in P. edulis peels is an important step for understanding the phytochemistry of this part of the fruits, which, in recent years, is no longer just an industrial waste and became a food product with added value, marketed as passion fruit peels flour. The study about the utilization of SBSE as extraction technique of norharmane showed to be promising, reaching acceptable recovery percentage, for the future development of a method for quantification of norharmane in passion fruit peels.

O maracujá-amarelo é uma espécie alógama, auto-incompatível, o que prejudica a geração de linhagens endogâmicas e, por conseqüência, a construção e integração de mapas de ligação pelas metodologias convencionais. A exemplo do que tem sido feito em outras espécies vegetais, populações F1 (com diferentes tipos de segregação) foram utilizadas para a construção dos mapas genéticos de maracujá. Mapas individuais para cada genitor do cruzamento foram gerados fazendo uso apenas de marcas com segregação 1:1. A integração desses mapas é possível com base em marcadores bi-parentais, quando ambos os genitores são heterozigóticos para os mesmos alelos que segregam na proporção 3:1 em F1. Apesar disso, o uso de marcadores codominantes e multialélicos, como os microssatélites, possuem maior valor, uma vez que permite a obtenção de estimativas de freqüência de recombinação e da fase de ligação com um menor viés. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de marcadores microssatélites utilizando bibliotecas genômicas enriquecidas, visando à construção e a integração de mapas genéticos de maracujáamarelo. Foram usadas 160 plantas oriundas do cruzamento entre os acessos IAPAR-123 x IAPAR-06, marcadores AFLP com segregação 1:1 e 3:1 e marcadores microssatélites desenvolvidos no presente estudo. Para a construção dos mapas utilizou-se um algoritmo que estima, simultaneamente, a fase de ligação e a freqüência de recombinação. A biblioteca genômica enriquecida forneceu 107 clones contendo microssatélites, com uma eficiência de enriquecimento da ordem de 11%. Todas as seqüências contendo microssatélites foram analisadas e 26 locos mostraram-se polimórficos: 16 deles segregaram na proporção de 1:1; 1 na proporção de 3:1; 2 na proporção de 1:2:1 e 7 na proporção de 1:1:1:1. Com relação aos dados de AFLP, 253 locos mono-parentais (em 114 deles, o alelo dominante estava presente no genitor 06 e 139, no genitor 123) mostraram-se polimórficos com segregação 1:1. Outros 116 locos mostraram-se bi-parentais, segregando na proporção de 3:1. Foram obtidos 11 grupos de ligação (GL) sendo 8 grupos integrados e um GL com apenas dois marcadores. Também, um GL para cada genitor foi obtido, cuja integração não foi possível por falta de marcadores bi-parentais. Foi possível alocar no framework dos mapas genéticos, além dos microssatélites, as marcas de AFLP com segregação do tipo 3:1, que contribuíram para uma maior saturação e integração de oito dos nove grupos de ligação de maracujá-amarelo (2n = 18). Foram obtidos, em média, 25 marcadores por GL, que forneceram um comprimento de mapa de 1.765,6 cM. Este é o primeiro relato em Passiflora sobre o uso de marcadores microssatélites e do algoritmo proposto por Wu et al. (2002) visando à integração dos mapas anteriormente construídos com base na estratégia duplo pseudocruzamento teste. Este mapa integrado será útil na alocação de QTL (Quantitative Trai Loci) relacionados à resistência a doenças e a características de interesse agronômico, assim como para estudos genéticos e evolutivos. / The yellow passion fruit is an out-breeding, self-incompatible species, but those features impose severe constraints on the generation of inbred lines, consequently impairing the building and integration of linkage maps using conventional methodologies. Similar to the reports from other plant species, F1 populations (with distinct segregation modes) were used to build passion fruit genetic maps. Individual maps, one for each parent involved in the cross were generated solely employing genetic markers with 1:1 segregation. However, the integration of those maps is feasible using bi-parental markers, i.e. when both parents are heterozygous for the same alleles that show 3:1 segregation in F1. However, the use of co-dominant multi-allele markers, such as the microsatellites is even more important, since it allows recombination frequency and linkage phase estimates to be obtained less effected by bias. The goal of this research was the development of microsatellite markers using enriched genomic libraries for constructing and integrating genetic maps of yellow passion fruit. We have used 160 plants from a cross between the accessions IAPAR-123 x IAPAR-06, AFLP markers showing 1:1 and 3:1 segregations and microsatellite markers developed in the present work. The maps were built employing an algorithm that simultaneously estimates the linkage phase and the recombination frequency. The enriched library allowed us to obtain 107 microsatellite-containing clones, at an enrichment efficiency of 11%. All microsatellite-containing sequences were analyzed and 26 loci were shown to be polymorphic: 16 of them with a 1:1 segregation; 1 with a 3:1 segregation, 2 showing a 1:2:1 proportion and 7 with a 1:1:1:1 segregation pattern. In relation to the AFLP data, 253 mono-parental loci were shown to be polymorphic with a 1:1 segregation proportion (in 114 loci the dominant allele was present in the parent 06, and in 139 loci, the dominant allele was found in the parent 123). The remaining 116 loci were shown to be bi-parental, segregating in a 3:1 proportion. Eleven linkage groups (LG) were obtained, 8 of them being integrated and one LG with only two markers. Moreover, one LG for each parent was obtained, but due to the absence of bi-parental markers they were not integrated. It was possible to locate on the framework of the genetic maps, along with the microsatellites those AFLP markers showing a 3:1-segregation type, which contributed to a greater level of map saturation and to the integration of eight of the nine linkage groups of yellow passion fruit (2n=18). On average, we have obtained 25 markers per LG, providing a map distance of 1,765.6 cM. This is the first report in Passiflora on the use of microsatellite markers and the algorithm proposed by Wu et al. (2002) to integrate maps previously constructed using the double pseudo-testcross strategy. The integrated map will be useful for locating QTL (Quantitative Trai Loci) related to disease resistance and agriculturally interesting traits, as well as to provide tools for genetic and evolutionary studies.

O maracujá-doce (Passiflora alata Curtis) é uma espécie nativa no Brasil. Seu cultivo tem crescido nos últimos anos devido a sua valorização no mercado in natura e seus usos na fitoterapia. Entretanto, os cultivos comerciais enfrentam problemas devido a ocorrência da bacteriose (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). O patógeno é endêmico no país, apresentando considerável variabilidade genética em suas populações naturais. Este trabalho teve como objetivo identificar QTL relacionados à resistência de P. alata à bacteriose em uma população F1 segregante oriunda do cruzamento entre acessos não endogâmicos. Foram avaliados os caracteres: área total da folha (TA), idade de queda da folha inoculada (IK), área total da lesão foliar (LA), área de clorose foliar (CA) e área da necrose foliar (NEA). Apenas um dos isolados apresentou diferenças de severidade em relação aos demais, sendo o menos agressivo (PA8-2). A inoculação do isolado M-129 mostrou que há variação significativa na resposta da população ao patógeno, sendo possível a identificação de genótipos transgressivos. A herdabilidade dos caracteres variou de 45% a 71%%. Foi construído um mapa de ligação integrado com 1.786 cM e uma densidade média de 4,5 cM. A análise de marcas individuais indicou a associação de 51 marcas aos fenótipos avaliados. O mapeamento de QTL, realizado por intervalo composto e utilizando uma estratégia diferenciada para populações F1 segregantes, identificou regiões associadas a 26 QTL para os cinco caracteres avaliados, sendo 16 deles referentes à LA, CA e NEA. A variação fenotípica explicada individualmente pelos marcadores variou de 0,8% a 16,7%. Sugere-se que a resistência à bacteriose é quantitativa, com predominância de efeitos genéticos aditivos. / The sweet passion fruit (Passiflora alata Curtis) is a specie native to Brazil. Its cultivation has increased in recent years due to its market valuation in natura and their uses in herbal medicine. However, crops are facing problems due to the occurrence of bacterial blight (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). The pathogen is endemic in the country, with considerable genetic variability in their natural populations. This study aimed to identify QTL related to resistance of P. alata to bacterial blight in an F1 segregant population from the cross between outbred accessions. Five traits were evaluated: total area of the leaf (TA), age of inoculated leaf fall (IK), area of the leaf´s lesion (LA), area of the leaf´s chlorosis (CA) and area of the leaf´s necrosis (NEA). Only one of the isolates showed differences in severity in relation to others, being the least aggressive (PA8-2). The inoculation of the isolate M-129 showed significant variation in population response to the pathogen, making it possible to identify transgressive genotypes. The heritability of characters ranged from 45% to 71%. An integrated linkage map was constructed, with a length of 1,786 cM and an average density of 4.5 cM. The analysis of individual marks indicated the association of 51 markers to phenotypes. The QTL mapping was performed using composite interval and a special strategy for segregating F1 populations, identified 26 regions associated with QTL for the five traits, 16 of them related to LA, CA and NEA. The phenotypic variation explained by individual markers ranged from 0,8% to 16,7%. It is suggested that the resistance to bacterial blight is quantitative, with a predominance of additive genetic effects.

A nanotecnologia é um fenômeno que se aplica a praticamente todos os setores da ciência, sendo que na área cosmética o elevado investimento neste campo tem reforçado a idéia de que produtos nanotecnológicos proporcionam vantagens reais aos consumidores. A crescente exigência do consumidor e os avanços no conhecimento sobre obtenção e estabilidade dos sistemas dispersos viabilizam o desenvolvimento de veículos diferenciados como, por exemplo, nanoemulsões, que além da inerente estabilidade, apresentam aspecto sensorial agradável, alta capacidade de espalhabilidade e hidratação, além de poderem facilitar a penetração de ativos. Existem dois métodos de obtenção de nanoemulsões: os que empregam baixa ou alta energia de emulsificação. O uso de óleos vegetais em produtos cosméticos tem sido intensamente valorizado, baseando-se no conceito de que são seguros e biocompatíveis. O óleo de maracujá é extensamente empregado em formulações cosméticas e o óleo essencial de lavanda é citado na literatura pelo efeito cicatrizante e antiinflamatório, dentre outros. Esta pesquisa teve como objetivo desenvolver nanoemulsões à base de óleo de maracujá e óleo essencial de lavanda nas concentrações de 1,0, 2,0 e 5,0%, a partir de método a frio de baixa energia de emulsificação, bem como avaliar a influência da adição de outros componentes e dos parâmetros relacionados ao método de obtenção na estabilidade e tamanho de glóbulos das nanoemulsões e posteriormente avaliar a atividade antiinflamatória tópica da emulsão contendo 5,0% do óleo essencial em camundongos sem pêlo. Os resultados demonstraram que a adição do óleo essencial de lavanda no sistema provocou redução no tamanho de glóbulos e aumento da estabilidade física e que o método de emulsificação a frio foi eficaz na formação de nanoemulsões estáveis. O valor de EHL, o par de tensoativos, a proporção entre as fases aquosa/ oleosa e tensoativa, bem como a adição de silicones e eletrólitos e a velocidade de agitação influenciam sobremaneira as características e a estabilidade das dispersões obtidas. No estudo de estabilidade acelerada, observou-se a alteração significativa dos valores de pH e condutividade elétrica, o que possivelmente é decorrente da hidrólise de compostos presentes no óleo essencial. Os valores de potencial zeta e tamanho de glóbulos não demonstraram alteração relevante em 30 dias de estabilidade acelerada. Na avaliação in vivo, a nanoemulsão adicionada de 5,0% do óleo essencial de lavanda apresentou resultados significativos quando comparado aos demais grupos, o que sugere boa perspectiva na utilização tópica do óleo essencial de lavanda, sendo este merecedor de estudos complementares para a elucidação dos mecanismos antiinflamatórios envolvidos, dos componentes fito-químicos responsáveis por esta ação e da concentração a ser utilizada. / Nanotechnology is a phenomenon that applies to mainly all sectors of science and in the cosmetics area the high investment in this field has strengthened the idea that nanotechnology products offer real advantages to consumers. The growing demand of consumers and the advances in knowledge about production and stability of dispersed systems enable the development of differentiated vehicles such as nanoemulsions, which besides the inherent stability, have pleasant sensory aspect, high spread ability and hydration power, in addition they can facilitate the penetration of actives. There are two methods of obtaining nanoemulsions: those that employ low or high energy of emulsification. The use of vegetable oils in cosmetics has been intensely valued, based on the concept that is safe and biocompatible. Passion fruit oil is widely used in cosmetic formulations and lavender essential oil is reported in the literature for healing and anti-inflammatory effects, among others. The aim of this study was to develop nanoemulsion based in passion fruit oil and lavender essential oil in the concentrations of 1.0, 2.0 and 5.0%, from low-energy method of emulsification, not employing heating, and evaluate the influence of the addition of other materials and parameters related to the production method in the system stability and droplets size of nanoemulsions and then evaluate the anti-inflammatory activity of topical nanoemulsion containing 5.0% of lavender essential oil in hairless mice. The results demonstrated that the addition of lavender essential oil in the system caused reduction in the droplets size and increasing in the physical stability and that the method of emulsification used was effective in the formation of stable nanoemulsions. The HLB value, the pair of surfactants, the ratio between aqueous/oily and surfactant phase, the addition of silicones and electrolytes and speed of agitation particularly affect the characteristics and stability of the obtained dispersions. In the accelerated stability tests, there was a significant change in the pH and electrical conductivity values, which is possibly resulting from the hydrolysis of compounds present in the essential oil. The values of zeta potential and droplets size showed no relevant change in 30 days of accelerated stability. In the in vivo evaluation, the nanoemulsion added of 5.0% of the lavender essential oil showed significant results when compared to the other groups, which suggests good perspective on topical use of this oil, which is worthy of further studies to the elucidation of the anti-inflammatory mechanisms involved, the phyto-chemical components responsible for this action and the concentration of use.

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adeline Chaicouski Meneguzzo.pdf: 1276340 bytes, checksum: 02b7c8e69340d28ceb45b8fabb4d2651 (MD5) Previous issue date: 2014-04-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The pectic substances, carbohydrates found in plant cell wall, are involved in the change of texture in the ripening process under action of pectinolytic enzymes, among which pectinmethylesterase. The production and consumption have increased the passion, also indicating an increase in the amount of waste generated, among which the albedo. The objective of this study was to evaluate the enzymatic activity of the crude extract obtained pectinametileserase albedo yellow passion fruit. The sequence of experiments was to determine the extraction protocol of the enzyme and characterization of the enzyme activity in the crude extract obtained from the albedo of yellow passion fruit, as the stage of maturation, NaCl concentration and substrate storage time, pH and temperature. When comparing the level of passion fruit in green and ripe, fresh and lyophilized maturation, the best result was found in green lyophilized samples. Among the five extraction methods used, two of them stood out and were adapted, and made the triple rinsing the material with cold water to remove soluble substances, followed by extraction with pectinmethylesterase PVPP and NaCl. The best salt concentration for higher activity obtained with NaCl 1,0 mol L- 1, both in the extraction, as in the determination of pectin methyl esterase activity. The best substrate concentration found was 1,0 % citrus pectin. The influence of the storage period of raw material showed that the freeze-dried fruit enzyme activity remained for a longer period, followed by the frozen sample and then refrigerated. The optimum pH was found to be 8 and the optimum temperature of 50 °C. The enzyme was heat-stable. The ideal range of precipitation with ammonium sulphate was 40-60 % of the salt. With the studies was possible to detect and study the pectinmethylesterase in extracts obtained from samples of albedo yellow passion fruit, with influence of various factors such as salt concentration and pH. / As substâncias pécticas, carboidratos presentes na parede celular de vegetais, estão envolvidas na mudança da textura no processo de amadurecimento, sob atuação das enzimas pectinolíticas, dentre as quais a pectinametilesterase. A produção e o consumo do maracujá têm aumentado, indicando também aumento na quantidade de resíduos gerados, dentre os quais o albedo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade enzimática da pectinametileserase em extrato bruto obtido do albedo de maracujá-amarelo. A sequência dos experimentos foi determinação do protocolo de extração da enzima e caracterização da atividade enzimática em extrato bruto obtido do albedo de maracujá-amarelo, quanto ao estádio de maturação, concentração de NaCl e substrato, período de armazenamento, pH e temperatura. Quando comparados os maracujás em estádio de maturação verde e maduro, fresco e liofilizado, o melhor resultado foi encontrado em amostras verdes liofilizadas. Dentre os cinco métodos de extração utilizados, dois deles se destacaram e foram adaptados, sendo realizada a tripla lavagem do material com água gelada para remoção de substâncias solúveis, seguida da extração da pectinametilesterase com PVPP e NaCl. A melhor concentração salina para maior atividade foi obtida com NaCl 1,0 mol L-1, tanto na extração, quanto na determinação da atividade da pectinametilesterase. A melhor concentração de substrato encontrada foi 1,0 % de pectina cítrica. A influência do período de armazenamento da matéria-prima mostrou que o fruto liofilizado manteve a atividade enzimática por um período maior, seguido da amostra congelada e depois a refrigerada. O pH ótimo encontrado foi de 8 e a temperatura ótima de 50 ºC. A enzima mostrou-se termoestável. A faixa ideal de precipitação com sulfato de amônio foi de 40-60 % do sal. Com os estudos realizados foi possível detectar e estudar a pectinametilesterase em extratos obtidos de amostras de albedo de maracujá-amarelo, com influência de vários fatores tais como concentração de NaCl e pH do meio.