La metformine est utilisée chez les patients et patientes atteints du diabète de type II. Elle est également administrée lors d’une infertilité liée à une insulino-résistance ou à un désordre métabolique. Mon projet de recherche a été d’analyser les effets de cet antidiabétique sur la fonction gonadique administré au stade foetal ou à la puberté. Nous avons montré par une approche in vivo sur deux modèles animaux: 1) qu'une administration orale de metformine à des poulets pré-pubères entraine un retard de puberté. Il se caractérise par une réduction du poids testiculaire, du diamètre des tubes séminifères et par une baisse de la testostérone sérique. 2) qu’une exposition des foetus mâles à de la metformine, chez la souris, conduit une fois adulte a une diminution de la taille des portées de 30%. Ce dysfonctionnement est associé à des marques épigénétiques sur l’ADN et des anomalies morphologiques de la tête des spermatozoïdes. Des techniques à haut débit (protéomique et métabolomique) réalisées sur des cultures de cellules de Sertoli immatures traitées ou non à la metformine ont permis de démontrer : 1) que le traitement mène à un métabolisme cellulaire de type Warburglike. 2) que des protéines présentent des différences d’abondance entre les deux conditions et qu’elles sont impliquées dans l’organisation du cytosquelette, de l’adhésion cellulaire, de la compaction de l’ADN, de la régulation de la réponse cellulaire à l’hypoxie et de l’immunité. Les résultats obtenus suggèrent que les grandes fonctions de sécrétion, de support et de protection des cellules de Sertoli sont modifiées par cet antidiabétique et qu’une exposition in utero à la metformine pourrait agir sur la fertilité et sur le métabolisme. / Metformin is used to treat patients with type II diabetes, it could be also administered to improve infertility associated to insulin-resistance or metabolic disorder. My research project was to analyse the consequence of a metformin exposure on gonad function from fetal to adult period. We showed by an in vivo approach on two animal models: 1) that oral administration of metformin to young chickens delay the puberty. It is characterized by a reduction in the testis weight, diameter of seminiferous tubule and decrease in testosterone level. 2) that mice, exposed in utero with metformin leads at adulte age to a lower fertility. This dysfunction is associated with morphological abnormalities of the sperm head and epigenetic marks on DNA. The second approach used proteomic and metabolomic strategy on cultured Sertoli cells treated or not with metformin. We demonstrated : 1) that the treatment leads to Warburg-like cellular metabolism. 2) that proteins present differences of abundances are involved in cytoskeleton organization, cell adhesion, DNA compaction, reponsiveness to hypoxia and immunity. The results suggest that the main function of secretion, support and protection of germ cell by Sertoli cells are modified by this antidiabetic, and that in utero exposure to metformin could act on the fertility and metabolism.

O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:49:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isabella dos Santos Guimaraes.pdf: 1486152 bytes, checksum: 65f12f2a8d639d0b762766b845fea774 (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Triple-negative breast cancer (TNBC) is a heterogeneous and poor prognostic disease, partially due to its ineligibility to target therapy, and the high relapse index, despite the initial satisfactory response to antineoplastic drugs. Therefore, the identification of alternative substances is urgent, as herein presented with regard to metformina and TNBC (lineage MDAMB231). Despite the low percentage of apoptotic/necrotic cells induced by metformin, 4.1% (10 μM) e 8.8% (54 mM), there was a discrete increase of cells in sub-G0, which is in agreement with the low value, despite doubled, of apoptosis/necrosis induced by metformina 54 mM. Metformin reverted ERK constitutive activation, possible antineoplastic mechanism; however, only reduced cellular proliferation at high doses (10 μM vs. 54 mM, 9.8% vs. 45.23%, respectively), possibly due to the modulation of other mechanisms of action. Paclitaxel 0.25 μM induced apoptosis/necrosis in 29% of the cells, which is comparable to the 36.34% of dead cells obtained by MTT. Despite the cell cycle arrest in G2/M that favours its mechanism of action, its antineoplastic efficacy can be compromised by ERK constitutive activation, which is related to taxane chemoresistance. Metformin 10 μM combined with paclitaxel 0,25 μM, although synergic with regard to the antineoplastic effect (dead cells = 53.20%), kept constant the induction of apoptosis/necrosis when compared to paclitaxel alone, as the benefit of arresting the cell cycle at G2/M can be overcome by ERK constitutive activation. When administered at their IC50, metformin 54 mM and paclitaxel 0,25 μM, the percentage of apoptotic/necrotic cells increased to 41%, which is comparable to the decrease in cell proliferation (59.9% of dead cells). Worthwhile pointing that: i) ERK constitutive activation was reversed, favoring paclitaxel toxicity; ii) the number of cells in sub-G0 increased. Indeed, among the 41% apoptotic/necrotic cells, 21.4% derived from late apoptosis, thus justifying sub-G0 expansion. The data point to mutual synergism between metformina and paclitaxel. Our findings support that, among other mechanisms of action, metformina is an indirect inhibitor of ERK, possibly of mTOR as well, explaining, therefore, its potential application in the treatment of TNBC, a major challenge of clinical oncology / O câncer de mama triplo-negativo (TNBC) configura doença heterogênea e de prognóstico ruim, dentre outras razões, por não ser responsivo às terapias-alvo e pelo elevado índice de relapso da doença apesar da responsividade inicial satisfatória aos antineoplásicos. Sendo assim, há urgência na identificação de substâncias alternativas, como ora apresentado em relação à metformina e TNBC (linhagem MDAMB231). Embora a porcentagem total de células em apoptose/necrose induzida por metformina seja pequena, 4,1% (10 μM) e 8,8% (54 mM), houve aumento discreto de células na fase sub-G0; aspecto concordante com o valor baixo, ainda que dobrado, de indução apoptose/necrose por metformina 54 mM. Metformina reverteu a ativação constitutiva de ERK, possível mecanismo antineoplásico da droga, mas somente reduziu a proliferação celular em doses elevadas (10 μM vs. 54 mM, 9,8% vs. 45,23%, respectivamente), possivelmente pela modulação de outros mecanismos de ação. Paclitaxel 0,25 μM promoveu apoptose/necrose em 29% das células, valor compatível os 36,34% de células mortas por MTT. Apesar da parada do ciclo celular em G2/M, favorecendo seu mecanismo de ação, sua eficácia antineoplásica limitada pode decorrer da sustentação da ativação constitutiva de ERK, já relacionada à quimiorresistência ao taxano. A combinação de metformina 10 μM com paclitaxel 0,25 μM, embora seja sinérgica quanto à ação antineoplásica (células mortas = 53,20%), manteve constante a indução de apoptose/necrose quando comparado ao paclitaxel sozinho, já que o benefício do aumento de células em G2/M pode ter sido sobreposto pela ativação de ERK. Quando administradas em suas IC50, metformina 54 mM e paclitaxel 0,25 μM, o percentual total de células apoptóticas/necróticas aumentou para 41%, valor mais próximo àquele de diminuição da proliferação celular (59,9% de células mortas). É notório ter havido: i) reversão da ativação constitutiva de ERK, favorecendo a citotoxicidade de paclitaxel; ii) aumento de células em sub-G0. De fato, dos 41% de células em apoptose/necrose, 21,4% derivaram de efeito apoptótico tardio, justificando a expansão de sub-G0. Os dados apontam para sinergismo mútuo entre metformina e paclitaxel. Nossos achados evidenciam que, dentre outros possíveis mecanismos, a metformina atua como inibidor indireto de ERK, possivelmente também de mTOR, explicando, portanto, seu uso potencial no tratamento do TNBC, um dos grandes desafios da clínica oncológica

O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Objetivo: A resistÃncia insulÃnica com hiperinsulinemia compensatÃria exerce importante papel fisiopatolÃgico na SÃndrome dos OvÃrios MicropolicÃsticos (SOMP). Neste sentido o uso de substÃncias sensibilizantes à insulina, dentre as quais a melhor estudada à a metformina, tem sido proposto como terapia inicial na patologia. Nosso estudo se propÃe a avaliar a efetividade da metformina na dose de 1.000 mg ao dia por 90 dias, nos parÃmetros antropomÃtricos, metabÃlicos, da morfologia ultrassonogrÃfica ovariana, e dos efeitos colaterais, em pacientes portadoras de SOMP. Pacientes e MÃtodo: Ensaio clÃnico prospectivo, randomizado por tabela de nÃmeros aleatÃrios, duplo-cego e controlado por placebo, com 21 pacientes com SOMP, sendo 13 alocadas no grupo experimental (metformina), e oito alocadas no grupo controle (placebo). Foram analisados e comparados as mÃdias e desvio-padrÃes dos parÃmetros dentro de cada grupo, e entre os grupos, no recrutamento do estudo e apÃs 90 dias de tratamento. Resultados: As mÃdias das medidas basais das variÃveis estudadas foram semelhantes entre os grupos garantindo sua comparabilidade. As pacientes tratadas com metformina obtiveram reduÃÃo significativa de sua circunferÃncia da cintura e glicemia de jejum. Todos os outros parÃmetros analisados nÃo mostraram diferenÃa significativa entre os grupos. Efeitos colaterais foram relatados por 92,31% e 71,43% das pacientes dos grupos experimental e controle, respectivamente. Apenas trÃs (23,07%) pacientes do grupo experimental e nenhuma do grupo controle reportaram efeitos colaterais graves que requereram ajustes da medicaÃÃo. NÃo houve abandono da terapia ou perda de seguimento.ConclusÃo: o uso da metformina na dose de 1.000 mg por 90 dias reduziu significativamente a circunferÃncia da cintura e a glicemia de jejum em pacientes com SOMP, com boa tolerabilidade geral e mÃnima incidÃncia de efeitos colaterais relevantes. Talvez a melhora de parÃmetros mais diretamente relacionados à resistÃncia insulÃnica como a relaÃÃo cintura/quadril requeira doses mais altas e/ou maior tempo de administraÃÃo / Objectives: Insulin resistance that leads to hyperinsulinaemia plays major pathogenic role in Polycystic Ovary Syndrome. This way, the use of insulin-sensitizing agents, like metformin that has been the most extensively studied drug, is suggested as the initial therapy for the disease. Our aim was to evaluate the effectiveness of metformin 1,000 mg a day for 90 days in anthropometric and metabolic measurements, ovarian ultrasonographic morphology, and side effects, on patients with Polycystic Ovary Syndrome (PCOS). Patients and Method: A randomized, by means of random numbers table, double-bind, placebo-controlled trial, including 21 PCOS patients. Thirteen patients were allocated at the treatment (metformin) group, and eight at the placebo group. The mean and standard-deviation of the measures were taken and analyzed into each group and between the groups on recruitment of the trial and after 90 days. Results: The mean values of the studied baseline characteristics were similar between the groups. The metformin group had significant reductions on waist circumference and fasting glucose. There were no significant differences in any other of the measurements. Side effects were referred by 92.31% and 71.43% of the treatment and placebo groups, respectively. Only three (23.07%) patients of treatment group and none of placebo group referred major side effects that request drug dose adjust. There were no drop-outs or lost of follow up. Conclusions: metformin at doses of 1,000 mg a day for 90 days was effective at waist circumference and fasting glucose reduction on PCOS patients, with good acceptance and mild side effects. Improvement of characteristics more related to insulin resistance, like the waist/hip ratio, probably need higher doses or longer course of use

O diabetes mellitus (DM) está associado com alguns tipos de câncer. No entanto, estudos realizados sobre a associação entre DM e câncer de cabeça e pescoço (CCP) apresentaram resultados controversos. Na avaliação da associação entre DM e câncer, destaque deve ser dado à metformina, medicamento utilizado no DM tipo 2, que se mostra inversamente associado a alguns tumores. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre DM e CCP, bem como o impacto do uso de metformina no risco de CCP. Este estudo caso-controle incluiu 1021 casos de CCP com confirmação histológica de carcinoma espino celular selecionados em cinco hospitais de grande porte no estado de São Paulo entre 2011 e 2014. Os 1063 controles foram recrutados nos mesmos hospitais, pareados por frequência com os casos por sexo e idade (em grupos de 5 anos). Para avaliar o risco de CCP associado ao DM, odds ratios (OR) e intervalos com 95 por cento de confiança (IC 95 por cento ) foram estimados por meio de regressão logística não condicional. Os participantes diabéticos tiveram associação inversa com o CCP (OR = 0,68; IC 95 por cento : 0,49-0,95), e a proteção foi maior entre diabéticos usuários metformina (OR = 0,54; IC 95 por cento : 0,29-0,99). Diabéticos usuários de metformina que eram fumantes (OR = 0,13; IC 95 por cento : 0,04-0,44), ou consumidores de álcool acima de 40 g/ dia (OR = 0,31; IC 95 por cento : 0,11-0,88) apresentaram proteção ainda maior com relação ao CCP, comparado aos não diabéticos. Em conclusão, os indivíduos diabéticos apresentaram risco inverso de CCP e o uso de metformina pode explicar, ao menos parcialmente, esta associação. / Diabetes mellitus (DM) is directly associated with some cancers. However, studies on the association between DM and head and neck cancer (HNC) have rendered controversial results. Assessing DM and cancer, emphasis should be given to metformin, a medication used for DM type 2, which is shown to be inversely associated with some cancers. The objective of this study was to evaluate the association between DM and HNC, as well as the impact of metformin use on the risk of HNC. This case-control study included 1021 HNC cases with squamous cell carcinoma, histologically confirmed, and admitted in five large hospitals in the state of São Paulo, from 2011 to 2014. A total of 1063 controls were selected in the same hospitals and were frequency-matched to cases by sex and age (in 5-year groups). In order to assess the risk of CCP associated with DM, odds ratios (OR) and 95 per cent confidence intervals (CI 95 per cent ) were estimated using unconditional logistic regression. Diabetic participants had an inverse risk of HNC (OR=0.68; 95 per cent CI: 0.49 0.95), and this inverse association was more intense among diabetic metformin users (OR=0.54; 95 per cent CI: 0.29-0.99). Diabetic metformin users that were current smokers (OR=0.13; 95 per cent CI: 0.04-0.44) or had an alcohol consumption of >40 g/day (OR=0.31; 95 per cent CI: 0.11-0.88) had lower risk of HNC than non-diabetic participants. In conclusion, DM patients have um inverse risk of HNC and the use of metformin may at least partially explain this association.

OBJETIVO: avaliação da expressão gênicado receptor do fator de crescimento semelhante à insulina de (Insulin-Like Growth Factor- IGF) 1 em células da granulosa luteinizadas do cumulusde mulheres não obesas, com sensibilidade à insulina normal, com síndrome dos ovários policísticos (SOP) tratadas e não tratadas com metformina. MODELO DO ESTUDO: prospectivo, longitudinal, randomizado. PACIENTES E MÉTODOS: avaliamos 12 mulheres com ciclosovulatórios, 9 mulheres com SOP e 8 mulheres com SOP e tratadas com metformina, ao menos 8 semanas na dose de 1.700 mg/dia. Todos os grupos foram similares com relação ao peso, ao índice de massa corporal (IMC), à circunferência da cintura e com sensibilidade à insulina normal. Todas as mulheres foram submetidas à estimulação ovariana controlada com uso de agonista de GnRH em protocolo longo e gonadotrofinas para ciclos de FIV/ICSI. As células da granulosa do cumulusforam obtidas por microdissecção dos cinco maiores folículos pré-ovulatórios. A expressão gênica do receptor de IGF-1 foi determinada com técnica da Reação da Polimerase em Cadeia a partir da Transcrição Reversa (Reverse transcriptase - Polymerase Chain ReactionRT-PCR) emiquantitativa. Foram avaliadas as concentrações séricas e foliculares de estradiol, progesterona, testosterona, hormônio folículo estimulante (Follicle-Stimulating Hormone- FSH), hormônio luteinizante (Luteinizing Hormone - LH), Sex Hormone-Binding Globulin(SHBG), glicose, insulina e IGF-1. Para análise estatística, foram utilizados os testes: ANOVA, Newman-Keuls, coeficiente de Pearsone regressão linear múltipla, sendo considerado nível de significância de 5%. RESULTADOS: não foram observadas diferenças com relação à expressão gênica do receptor de IGF-1 nos três grupos analisados (P>0,05). O número de oócitos (20,4 vs. 13,1 vs.11,5, P= 0,009), os níveis séricos de estradiol (1.896,00 pcg/mL vs. 985,20 pcg/mL vs.908,10 pcg/mL,P = 0,03) e testosterona (1,43 ng/mL vs.0,89 ng/mL vs. 0,82 ng/mL pcg/mL,P = 0,02) foram maiores no grupo de mulheres com SOP não tratadas com metformina em comparação com as mulheres com ciclos ovulatórios e tratadas com metformina, respectivamente. As mulheres com ciclos ovulatórios (50.710±42.520 ng/mL) apresentaram maiores concentrações foliculares de progesterona quando comparados com as mulheres com SOP tratadas (13.660±5.212 ng/mL) e não tratadas com metformina (17.680±6.644 ng/mL) (P=0,01). Na avaliação da regressão múltipla, a testosterona sérica não sofreu influência da expressão gênica do receptor de IGF-1 ou do IMC. CONCLUSÕES: as altas concentrações séricas de estradiol e testosterona, maior número de oócitos no grupo de mulheres com SOP não tratadas com metformina nos levam a concluir que mulheres com SOP provavelmente têm uma maior sensibilidade à estimulação da esteroidogênese ovariana quando comparadas com mulheres sem essa doença, embora não tenhasido encontrada diferença na expressão do receptor de IGF-1 nos trêsgrupos analisados. A similaridade dos resultados deste estudo entre mulheres com SOP tratadas com metformina e com ciclos ovulatórios nos levam a \"hipotetizar\" que um dos possíveis mecanismos de ação da metformina no sistema IGF-1 nas células da granulosa do cumulus poderia ser por mecanismos pós-receptores. / OBJECTIVE: evaluation of the gene expression of the IGF-I receptor in luteinized cumulus granulosa cells from non-obese women with normal insulin sensitivity and with polycystic ovarian syndrome (PCOS)treated or nor with metformin. STUDY MODEL: prospective,longitudinal, randomized. PATIENTS AND METHODS: we evaluated 12 women withovulatory cycles and 9 women with PCOS who had been treated for at least 8 weeks with a metformin dose of 1700 mg/day. All groups were similar interms of weight, body mass index (BMI), and waist circumference and all had normal insulin sensitivity. All women were submitted to controlled ovarian stimulation with a GnRH agonist in a long protocol and with gonadotropins for IVF/ICSI cycles. Cumulus granulosa cells were obtained by microdissection of the five largest pre-ovulatory follicles. Gene expression of the IGF-1 receptor was determined by semiquantitative RT-PCR. Serum and follicular concentrations of estradiol, progesterone, testosterone, FSH, LH, insulin, SHBG, and IGF-1 were determined. Data were analyzed statistically by ANOVA and by the Newman-Keuls test and the Pearson coefficient and linear multiple regression were calculated, with the level of significance set at 5%. RESULTS: no difference in geneexpression of the IGF-I receptor were observed between the three groups studied (P>0.05). The number of oocytes (20.4 vs. 13.1 vs. 11.5, P= 0.009) and the serum levels of estradiol (1,896.00 pcg/mL vs. 985.20 pcg/mL vs.908.10 pcg/mL,P = 0.03) and testosterone (1.43 ng/mL vs.0.89 ng/mL vs. 0.82 ng/mL pcg/mL,P = 0.02) were higher in the group of women with PCOS not treated with metformin than in women with ovulatory cycles and in women treated with metformin, respectively. The women with ovulatory cycles (50.710±42.520 ng/mL) presented higher follicular concentrations of progesterone compared with women with PCOS treated (13.660±5.212 ng/mL) or not with metformin (17.680±6.644 ng/mL) (P=0.01). Multiple regression revealed that serum testosterone was not affected by the gene expression of the IGF-1 receptor or by BMI. CONCLUSIONS: the high serum concentrations of estradiol and testosterone and the larger number of oocytes in the group ofwomen with PCOS not treated with metformin lead us to conclude that women with PCOS probably have greater sensitivity to stimulation ofovarian steroidogenesis than women without the disease, although no difference was detected in the expression of the IGF-I receptor between the three groups studied. The similarity ofthe present results for the women with PCOS treated with metformin and for the women with ovulatory cycles leads us to hypothesize that one of the possible mechanisms of action of metformin on the IGF-1 system in cumulus granulosa cells may be of the post-receptor type.

La metformine, un composé antidiabétique reste de nos jours recommandée comme traitement de première intention pour le diabète de type 2. Ses mécanismes d’action en tant que composé anti-hyperglycémiant sont de plus en plus documentés. En revanche, son action anorexigène et ses cibles centrales demeurent peu étudiées. Par ailleurs, des données croissantes de la littérature semblent indiquer que l’activité physique, souvent associée aux thérapies anti-obésité et antidiabétiques, pourrait accroitre la sensibilité des réseaux neuronaux aux signaux endogènes permettant de réguler la prise alimentaire et le poids corporel. Ceci suggère que l’efficacité des thérapies induisant des modulations d’expression de ces signalisations pourrait être directement augmentée par l’activité physique. Dans le présent travail, nous avons cherché i) à explorer les effets centraux de la metformine chez la souris et ii) à déterminer si l’activité physique pouvait potentialiser les effets de la metformine. L’ensemble de mon travail de thèse, réalisée en partenariat avec la société BIOMEOSTASIS, a permis d’apporter des éléments nouveaux quant aux mécanismes impliqués dans les effets centraux de la metformine et d’identifier la nesfatine-1 comme un acteur potentiel dans les effets anorexigènes de ce composé. / Metformin, an antidiabetic compound, still remains a first-line treatment for type 2 diabetes. The mechanisms by which this compound exerts its antihyperglycemic effect are increasingly documented. However, its anorectic action and central targets remain less studied. Furthermore, increasing data in the literature suggest that physical activity, commonly associated with anti-obesity and anti-diabetic therapies, may increase neural networks’ sensitivity to endogenous signals involved in food intake and body weight control. This suggests that the efficacy of therapies inducing expression modulation of these signals may be directly enhanced by physical activity. In the present study, we sought i) to explore the central effects of metformin in mice and, ii) determine whether physical activity could potentiate the effects of metformin. All my work, in partnership with the company BIOMEOSTASIS brought new elements about mechanisms involved in the central effects of metformin and identified nesfatin-1 as a potential actor for the anorectic effects of this compound.

Prevalence of obesity and associated diseases like type 2 diabetes has increased rapidly during last years. These diseases closely relate to each other. Obesity leads to insulin resistence, which directly precedes type 2 diabetes. Metformin is the most prescribed medicament for type 2 diabetic patients and insulin resistant people. It improves glucose tolerance and insulin resistance. Enzyme AMP-activated protein kinase (AMPK) is strogly involved in metformin action. The latest studies using transgenic models lacking AMPK suggest, that notable part of mechanisms involved in metformin action is independent on AMPK. n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA), namely eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), which are abundant in sea fish, have beneficial effects on metabolism. These fatty acids lower plasma lipids and exert cardioprotective effects. n-3 PUFA also prevent development of insulin resistence and type 2 diabetes in rodents. The aim of this thesis was to characterise acute effects of metformin on glucose homeostasis, impact of short term diet intervention with diet rich in n-3 PUFA on metformin action and the role of insulin stimulated signalling pathways and AMPK. Results suggest that early effect of metformin is dose dependent and that single dose of metformin...

Abstract Patients with type 2 diabetes (T2D) are at a greater risk of some cancer types, possible together with worse prognosis. Various types of antidiabetic medication have been reported to have different relationships to cancer prognosis. Metformin seems to reduce mortality in some forms of cancer and it has effects on cell cycle arrest and apoptosis in vitro. T2D is a risk factor of coronary heart disease, which is widely treated with statins. Statins are associated with both reduced incidence and better prognosis in some cancers. Epidemiological studies on the associations between metformin and statin use and breast and ovarian cancer have reported inconclusive results. The aim of the present epidemiological study was to find out whether metformin and statin use are associated with reduced incidence and mortality in ovarian and/or breast cancer. The source population for the study was drawn from the Finnish nationwide diabetes database (FinDM; n = 244,322), supplemented with other Finnish registry data. The data from FinDM was combined with data from the Finnish Cancer Registry. The use of metformin and/or statins was found not to be associated with the incidence of either ovarian (n=303) or breast cancer (n=2,300) in women with type 2 diabetes. The use of insulin seemed to be associated with a higher incidence of breast cancer. Metformin use was not observed to be associated with mortality from ovarian or breast cancer but mortality from other causes seemed to be lower in breast cancer patients among metformin users compared with the users of other types of oral antidiabetic medication. Prediagnostic statin use seemed to be associated with decreased mortality from breast cancer and other causes in breast cancer patients, but in ovarian cancer, an association with reduced mortality was seen only in connection with ovarian cancer itself. On the basis of our study results, it would not be reasonable to initiate metformin or statin treatment solely in order to avoid ovarian or breast cancer development in a woman with T2D. However, the results suggest that tailoring of glycaemic and hypercholesterolaemia treatment might have far-reaching consequences to both cancer development and survival. / Tiivistelmä Tyypin 2 diabetesta sairastavilla potilailla on yleensä suurentunut riski sairastua maksa-, haima- ja suolistosyöpiin, ja tämä heikentää ainakin näiden syöpien ennustetta. Diabeteslääkkeillä on todettu olevan toisistaan poikkeava vaikutus syöpäennusteeseen. Metformiini vaikuttaa alentavan kuolleisuutta, ja solutöissä sillä on todettu olevan vaikutuksia solusyklin pysähtymiseen ja ohjelmoituun solukuolemaan. Tyypin 2 diabetes on riskitekijä sydän- ja verisuonisairauksiin, ja sen vuoksi diabetespotilaiden hoitoon kuuluu usein kolesterolia alentavat statiinit. Statiinien käyttö on yhdistetty joidenkin syöpäsairauksien vähenemiseen ja niiden parempaan ennusteeseen. Epidemiologiset tutkimukset metformiinin ja statiinien käytön välisestä yhteydestä munasarja- ja rintasyöpiin ovat kuitenkin epäyhtenäisiä. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko metformiinin ja statiinien käytöllä yhteyttä munasarja- ja rintasyöpätapausten vähenemiseen ja niiden paranemisennusteeseen. Lähdeaineistona on käytetty erilaisia suomalaisia rekistereitä yhdistävää kansallista diabetes-tietokantaa (FinDM; n = 244 322), jonka tiedot on yhdistetty Suomen Syöpärekisteriin. Metformiinin ja statiinien käytöllä ei todettu olevan yhteyttä munasarjasyövän (n = 303) tai rintasyövän (n = 2 300) ilmaantuvuuteen tyypin 2 diabetesta sairastavilla naisilla. Insuliinin käytöllä oli sen sijaan yhteys korkeampaan rintasyövän ilmaantuvuuteen. Metformiinin käytöllä ei todettu olevan yhteyttä munasarja- tai rintasyöpäkuolleisuuteen. Rintasyöpää sairastavilla naisilla muista syistä johtuva kuolleisuus oli metformiinin käyttäjillä kuitenkin matalampaa verrattaessa muihin suun kautta otettavien diabeteslääkkeiden käyttäjiin. Ennen syöpädiagnoosia aloitettu statiinien käyttö vaikutti vähentävän kuolleisuutta sekä rintasyöpään että muihin syihin rintasyöpäpotilailla. Munasarjasyövän suhteen yhteys todettiin ainoastaan munasarjasyöpäkuolleisuudessa. Tutkimuksemme mukaan ei ole perusteltua aloittaa metformiinia tai statiineja tyypin 2 diabetesta sairastavalle naiselle pelkästään ehkäisemään munasarja- tai rintasyöpää. Kuitenkin tutkimuksemme osoittaa, että niin diabetes- kuin kolesterolilääkitykselläkin voi olla yhteyttä sekä syövän kehittymiseen että paranemisennusteeseen.