Os mastocitomas caninos são neoplasias originárias de mastócitos, sendo bastante prevalente entre os cães, por isso a importância de averiguar novas terapias para esta doença. O objetivo geral deste projeto foi investigar o efeito do DCA em mastocitomas caninos, por meio da realização de ensaios in vitro. Também foram investigados os efeitos do tratamento com DCA associado ao omeprazol ou merformina em linhagens de mastocitoma canino. As linhagens de mastocitoma canino utilizadas, grau 2 e 3, foram estabelecidas no Laboratório de Oncologia Experimental e Comparadas da FMVZ/USP e foram cultivadas em meio AIM-V. As células foram tratadas com diversas concentrações de DCA (de 0,31 a 100mM). O DCA 0,1; 0,5; 1,0; 5; 10 e 20mM foi também testado em associação com metformina (0,02; 0,2 e 2mM) ou com omeprazol (0,02; 0,1 e 0,2mM). Após os tratamentos, foi realizado ensaio para analisar a viabilidade celular utilizando o método do cristal violeta, com leituras em 3 e 5 dias. Ao contrário do que era esperado, o tratamento com dicloroacetato isolado ou com associações aumentou a população de células neoplásicas principalmente nas concentrações de 10 e 20mM. Num experimento realizado com três linhagens diferentes de mastocitomas caninos foram utilizadas concentrações de 10 a 100mM de DCA, e mostrou que a partir de 60mM há diminuição da viabilidade celular, sendo que o efeito se intensifica com o aumento das concentrações de DCA. Concluímos que o tratamento com DCA isoladamente, em concentrações de até 60mM, ou as associações com metformina e omeprazol não foram eficazes em diminuir a população de células de mastocitomas canino de graus 2 e 3 in vitro. Consideramos que a realização deste estudo foi importante para obter informações sobre os efeitos do DCA e associações em mastocitomas caninos. Os resultados deverão ser divulgados e evitarão o uso indiscriminado deste fármaco, cujas consequências poderiam ser adversas para os cães portadores de mastocitomas. / The Warburg effect or aerobic glycolysis is a phenomenon in which tumor cells convert glucose to lactic acid in the presence of oxygen, unlike normal cells in the body that perform the Krebs cycle and oxidative phosphorylation. Sodium dichloroacetate (DCA) activates pyruvate dehydrogenase (PDH), resulting in increased pyruvate within the mitochondria and in the reestablishment of normal metabolism of cellular respiration. Studies indicate that the association of DCA with metformin or omeprazole potentiate this effect. Canine mastocytomas are neoplasms originating from mast cells, being quite prevalent among dogs, so the importance of investigating new therapies for this disease. The general objective of this project was to investigate the effect of DCA on canine mast cell tumors, by performing in vitro tests. The treatment with dca DCA was then associated with omeprazole or merformin in canine mastocytoma cell lines. The canine mast cell tumor lines used, grade 2 and 3, were established in the Laboratory of Experimental and Comparative Oncology of FMVZ / USP and were cultured in AIM-V medium.. Treatment with DCA alone was performed with varying concentrations (0,31 mM to 100 mM). The associations were performed with 0,1; 0,5; 1,0; 5, 10 and 20 mM of DCA with 0,02; 0,2 and 2mM of metformin or with 0,02; 0,1 and 0,2 mM of omeprazole. After the treatments, an assay was performed to analyze cell viability using the crystal violet method, with readings at 3 and 5 days. Contrary to our expectations, treatment with dichloroacetate alone or with combinations increased the population of neoplastic cells mainly in the concentrations of 10 and 20mM. In an experiment with three different canine mastocytomas cell lines treated with DCA (10 to 100mM of DCA.), it was found that from 60mM the cell viability was decreased. This effect was intensified with increasing DCA concentrations. We conclude that treatment with DCA alone, at concentrations up to 60mM, or associated with metformin and omeprazole were not effective to decrease the population of canine mast cell tumors of grades 2 and 3 in vitro. The results should be disclosed and will avoid the indiscriminate use of this drug, the consequences of which could be adverse for dogs with mastocytomas.

A compreensão dos mecanismos que regulam o endométrio e suas implicações clínicas podem contribuir para melhorar as taxas de implantação do embrião humano. Apesar de muitas proteínas e moléculas influenciarem a receptividade endometrial, sua contribuição coordenada para o processo de implantação do embrião ainda é pouco compreendida. Dentre a complexa rede que guia este processo em direção à preparação de um endométrio receptivo se encontram as citocinas, das quais a interleucina-11 (IL-11) e o fator inibidor de leucemia (LIF) desempenham papel essencial. Estudos demonstram que a interrupção das vias de sinalização celular dessas citocinas prejudica ou mesmo impede a implantação, implicando diretamente na fertilidade feminina. Além disso, a hiperinsulinemia afeta negativamente a fertilidade da mulher. Dentro desse contexto, a metformina, fármaco antidiabético, pode exercer efeitos positivos sobre a expressão da IL-11 e LIF, revertendo o possível prejuízo do excesso de insulina sobre a secreção dessas citocinas. Para avaliar esse efeito, utilizou-se um modelo de cultura primária de células estromais de endométrio humano expostas aos hormônios sexuais femininos estrogênio e progesterona, divididas em grupos: controle, metformina, insulina, e associação insulina e metformina. Utilizando RT-qPCR e ensaio imunoenzimático de ELISA, foram avaliadas a expressão gênica e proteica, respectivamente, das duas citocinas. Não foram observadas diferenças entre os grupos. O ensaio de MTT para avaliar a proliferação celular permitiu a verificação da ação antiproliferativa da metformina sobre o grupo hiperinsulinêmico. Embora as hipóteses formuladas nesse estudo encontrem forte sustentação na literatura, no modelo proposto não foi possível encontrar diferenças na expressão da IL-11 e LIF. Dada a complexa regulação de todos os fatores considerados nessa pesquisa e suas múltiplas inter-relações, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos que orquestram essa complexa rede. / The understanding of the endometrium regulation and its clinical implications can help to improve implantation rates of the human embryo. Although many proteins and molecules influence the endometrial receptivity, their coordinated contribution to embryo implantation process is still poorly understood. Among the complex pathways involved in this process toward the preparation to a receptive endometrium are the cytokines, including interleukin -11 (IL- 11) and leukemia inhibitory factor (LIF) that play an essential role. It has been shown that disruption of cellular signaling pathways of these cytokines impairs or even prevents implantation, direct implications on fertility. Moreover, the hyperinsulinemia can negatively affected women's fertility. Within this context, metformin, an antidiabetic drug, may exert positive effects on the expression of IL-11 and LIF, reversing the possible effects insulin excess. To evaluate this effect, a model of primary culture of human endometrial stromal cells exposed to female sex hormones estrogen and progesterone was used. Cells were divided in groups: control, metformin, insulin, association insulin and metformin. From qRT-PCR and ELISA immunoenzymatic assay gene expression and protein, respectively, of the two cytokines were evaluated. No differences were observed between groups. Additionally, the assay to evaluate cell proliferation MTT found the important antiproliferative action of metformin on hyperinsulinemic group. In the proposed model could not find differences in the expression of IL-11 and LIF. Given the complex regulation of all factors considered in this study and their multiple interrelationships, more studies are required to unravel the mechanisms that orchestrate this complex network.

Objetivos generales: a) Evaluar los efectos <i>in vivo</i>, <i>ex vivo</i> e <i>in vitro</i> de drogas antidiabéticas (metformina y/o rosiglitazona) sobre la diferenciación de CPMO y la microarquitectura ósea de ratas control. b) Investigar el efecto <i>in vivo</i> y <i>ex vivo</i> del tratamiento con metformina sobre el tejido óseo, en un modelo de ratas diabéticas. Objetivos específicos: a) 1. Estudiar el efecto directo <i>in vitro</i> de la metformina y/o la rosiglitazona sobre la diferenciación osteoblástica y adipogenética de CPMO en cultivo. 2. Investigar el efecto <i>ex vivo</i> de metformina, rosiglitazona o su combinación, sobre el potencial osteogénico de CPMO provenientes de ratas controles. 3. Investigar el efecto <i>in vivo</i> de la metformina y/o rosiglitazona sobre la microarquitectura de fémures de ratas controles. 4. Determinar los mecanismos de transducción de señales asociadas con el compromiso osteogénico y adipogénico de las CPMO. b) 1. Analizar las alteraciones óseas a nivel del fémur asociadas al modelo de diabetes con déficit parcial de insulina. 2. Investigar el efecto <i>ex vivo</i> de la metformina, sobre el potencial osteogénico de CPMO provenientes de ratas diabéticas tratadas o no con metformina. 3. Determinar los mecanismos de transducción de señales asociadas con la diferenciación de CPMO provenientes de ratas diabéticas, así como los efectos del tratamiento con metformina.

Introducción. El Síndrome Metabólico (SM) se define como un conjunto de anormalidades fisiológicas y metabólicas que incluyen obesidad central y global, tolerancia a la glucosa alterada con insulinorresistencia, dislipidemia e hipertensión. Desde su descripción en 1988, la incidencia del SM ha aumentado dramáticamente, y se ha reportado que se presenta en más del 20% de la población adulta en los países en desarrollo. La prevalencia del SM aumenta con la edad y se asocia con alto riesgo de Diabetes mellitus y sus consecuencias cardiovasculares más importantes. Desde hace un tiempo se ha reconocido que existe una asociación entre la Diabetes mellitus y alteraciones esqueléticas, lo cual podría llevar a un mayor riesgo de fracturas en esta condición. Sin embargo, se conoce menos sobre el efecto del SM (o de sus componentes individuales) en la salud ósea. Algunos factores, como la obesidad y el sobrepeso protegerían de la excesiva pérdida ósea asociada con la edad. Otros, como la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia y bajos niveles de HDL, muestran resultados contradictorios en su asociación con la densidad mineral ósea. Existen estudios clínicos que intentan relacionar el SM con el estado de la densidad mineral ósea (DMO) y/o la predisposición a fracturas. Los resultados están lejos de ser concluyentes. En algunos trabajos se encuentran efectos nocivos del SM sobre ciertas regiones del esqueleto, mostrando DMO disminuida y/o mayor predisposición a fracturas, pero otros trabajos no llegan a las mismas conclusiones. Existe una gran cantidad de evidencia en modelos animales y estudios en humanos, demostrando que un alto consumo de fructosa en la dieta es un factor nutricional importante en el desarrollo del SM. En el modelo de ratas alimentadas con dieta rica en fructosa, los animales manifiestan las características más importantes del SM: se inducen hipertensión, hipertrigliceridemia, hiperinsulinemia, disminuida sensibilidad insulínica y tolerancia a la glucosa alterada. Los productos de glicación avanzada (AGEs) que se asocian con la hiperglucemia, son producidos por reacción no enzimática de azúcares reductores con proteínas o lípidos. Indirectamente, los AGEs desencadenan inflamación y estrés oxidativo, lo cual también podría contribuir tanto a la progresión del SM como de osteoporosis. En ratas alimentadas con fructosa se ha reportado un incremento de AGEs en varios tejidos, así como en los niveles de metiglioxal, un intermediario del metabolismo de la fructosa y potente precursor de AGEs. Esto se asocia a su vez con un incremento en la resistencia insulínica y los triglicéridos plasmáticos. En nuestro laboratorio se ha demostrado previamente que los AGEs ejercen efectos deletéreos directos sobre osteoblastos en cultivo, reduciendo su capacidad de proliferación, diferenciación y mineralización. La metformina es uno de los agentes más comúnmente usados en el tratamiento de estados patológicos asociados a insulinorresistencia como son la Diabetes mellitus tipo 2 y el SM. Esta droga es una biguanida que disminuye los niveles glucémicos sin afectar en forma directa la secreción de insulina. En nuestro grupo de trabajo se ha investigado el efecto de la metformina sobre osteoblastos en cultivo, encontrando que induce en forma directa un incremento en su proliferación, diferenciación y mineralización. Además, hemos demostrado que la administración oral de metformina induce efectos osteogénicos in vivo y ex vivo en animales de experimentación sin alteraciones metabólicas o en un modelo de diabetes con deficiencia parcial de insulina. // Hipótesis. La inducción de Síndrome Metabólico podría asociarse con alteraciones óseas, consecutivas a cambios en el recambio óseo y en el metabolismo de las células óseas o de sus progenitores, y consecuentemente, asociarse con un mayor riesgo de fracturas y/o disminuida capacidad de regeneración del tejido esquelético. Además, se postula que estas alteraciones óseas asociadas al Síndrome Metabólico, podrían ser prevenidas en forma parcial o total por la administración oral de metformina. // Objetivos. Se planteó el objetivo general de investigar la posible asociación entre el Síndrome Metabólico y las alteraciones del tejido óseo en ratas, paro lo cual se plantearon los siguientes objetivos específicos: a) investigar in vivo las posibles alteraciones óseas, consecutivas a la inducción de resistencia insulínica, dislipidemia e hipertensión, en un modelo de ratas alimentadas con una dieta rica en fructosa; b) investigar el efecto ex vivo del SM de este modelo sobre el potencial osteogénico o adipogénico de células estromales mesenquimáticas (MSC); c) investigar el efecto in vivo del SM inducido por fructosa, sobre la regeneración del tejido óseo; y d) evaluar la posible modulación de las alteraciones óseas consecutivas a un SM inducido por fructosa, mediante una administración oral de metformina. // Materiales y métodos. Los estudios se hicieron en ratas que recibieron solución de fructosa al 10% ad libitum (grupo DRF) para generar el SM. Como control (grupo C), se usaron ratas que recibieron agua corriente ad libitum. En los ensayos en los que se evaluaron los efectos de la metformina, esta se administró en el agua de bebida en una dosis de 100 mg/kg/día (grupos CM y DRFM). Se hicieron estudios de histomorfometría estática de la metáfisis femoral proximal y distal, estudios de histomorfometría dinámica de la metáfisis femoral distal, análisis por tomografía computada cuantitativa periférica, y se estudió la capacidad de regeneración de una lesión ósea parietal. Además, se evaluó el potencial osteogénico y adipogénico de las células estromales mesenquimáticas, y se midió la expresión de factores de transcripción de cada linaje. // Resultados. La dieta rica en fructosa indujo un SM caracterizado por alteraciones en el metabolismo de hidratos de carbono y lípidos. A través de estudios histomorfométricos estáticos se observó que el SM indujo una disminución significativa en la densidad de osteocitos y en la actividad TRAP de la metáfisis femoral. No se observaron cambios inducidos por el SM a través de estudios de histomorfometría dinámica y de pQCT. Las MSC derivadas de animales con SM presentaron un menor potencial osteogénico y una mayor predisposición hacia el linaje adipocítico, probablemente por modulación de la relación en la expresión de Runx2 y PPARg. El SM se asoció con una disminución de la reparación ósea en un modelo de lesión parietal mínima. Simultáneamente, redujo la densidad osteocítica y la actividad osteoclástica en el sitio de lesión, sugiriendo una disminución concertada de la formación y remodelado óseo. El tratamiento oral con metformina previno la disminución de la densidad osteocítica metafisaria inducida por el SM, sin alterar la actividad TRAP. La metformina previno total o parcialmente los efectos antiosteogénicos del SM sobre las MSC. // Conclusión. El Síndrome Metabólico se asocia con alteraciones leves en la microarquitectura metafisaria, con un menor potencial osteogénico en las células estromales mesenquimáticas y con una importante disminución en la regeneración ósea. El tratamiento oral con metformina fue capaz de prevenir total o parcialmente la mayoría de estas alteraciones óseas.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:42Z : No. of bitstreams: 1 Publico-098.pdf: 1170886 bytes, checksum: 5f7890a7362de660ed97e9e8b000a47a (MD5) / Objetivo: Analisar os efeitos da metformina no sistema reprodutor de ratas androgenizadas no período neonatal e que desenvolveram estro-permanente. Material e Métodos: Foram utilizados 75 ratas albinas da linhagem EPM-1 Wistar, recém-natas, que foram divididas aleatoriamente, no terceiro dia de vida, em três grupos de vinte e cinco animais: Controle (GC), Androgenizado (GA) e Androgenizado + Metformina (GAmet). Os animais do GA e GAmet receberam 0,1 mL de propionato de testosterona (1,25 mg/animal), diluído em óleo de mamona (veículo) em dose única e ao Grupo Controle, apenas o veículo. O local da injeção foi a região subcutânea do dorso. Nove animais morreram durante a ministração do fármaco, ficando o total reduzido a 66. Após 90 dias, iniciou-se o tratamento por gavagem, as ratas dos grupos GC e GA receberam água destilada, enquanto as do GAmet foram tratadas com metformina (dose de 50 mg/kg). O tratamento foi diário durante seis semanas. Após este período, 12 animais do GC, 10 do GA e 14 do GAmet foram anestesiados e coletados sangue para dosagem de glicose, insulina de jejum e retirado o útero e ovários.para análise histológica (experimento I). O 30 animais restantes foram acasalados para avaliação da capacidade reprodutiva (experimento II). Os dados foram analisados pelo testes de ANOVA e de Tukey. Resultados: Os valores da glicose e HOMA-IR foram superiores no GA do que nos outros grupos (p<0,01). Na análise histomorfométrica dos ovários, o GAmet apresentou o aparecimento de corpos lúteos, redução da área ocupada pelos folículos em degeneração, e das células intersticiais, e no útero redução da espessura do endométrio, diminuição do colágeno e número de eosinófilos, quando comparados ao GA (p<0.01). No experimento II, foram identificados espermatozóides na luz vaginal em todos os animais do GC (n=10) e em quatro animais do GAmet e nenhum do GA. Contudo, apenas um animal do GAmet conseguiu progredir com a gestação. Todos os animias do GC tiveram gestação a termo. Conclusão: A metformina determinou melhora da glicemia, índice de HOMA-IR e reversão parcial da função reprodutiva e das características histomorfométricas do ovário e do útero em ratas androgenizadas. / Objective: To analyze the effects of metformin on the reproductive system of neonatally androgenized female rats that developed permanent estrus. Materials and methods: A total of 75 three-day-old female albino wistar EPM-1 rats were randomized to three 25-animal groups: control (CG), androgenized (AG), and androgenized + metformin (AGmet). The animals in AG and AGmet were administered 0.1 mL of testosterone propionate (1.25 mg/animal) diluted in castor oil (vehicle), and controls were given vehicle only. The injection site was in the dorsal subcutaneous region. Nine animals died during drug administration. After 90 days a daily six-week gavage treatment was initiated with the rats in CG and AG receiving vehicle (distilled water) and those in AGmet getting metformin (50mg/kg). Afterwards, 12 animals from CG, 10 from AG, and 14 from AGmet were sacrificed. Blood was collected for biochemical measurements and the uteri and ovaries were extracted for histological analyses (experiment 1). The remaining 30 animals were mated (experiment II). Data analyses were carried out with Tukey’s test and ANOVA. Results: In terms of fasting glucose and HOMA-IR, indices were highest in AG (p<0.01) and there was no significant difference between AGmet and CG. Histomorphometric analyses of the ovaries and uteri revealed, in AGmet, reduction in the area covered by degenerating follicles, reduction in the number of interstitial cells and identified corpora lutea , diminution of endometrial thickness, and a decrease in the amount of collagen and the number of eosinophiles, typical in comparison with AG (p<0.01). After mating, spermatozoids were identified in the vaginal ring, in all of the animals in CG (n=10), four in AGmet, and none in AG. All of the animals in CG had full-term deliveries, but only one in AGmet. Conclusion: Metformin led to improvement of the fasting glucose and HOMA-IR index and to partial reversion of the histomorphometric characteristics of the ovaries and the uterus in neonatally androgenized female rats. / TEDE

Células de todos os organismos vivos restauram lesões em DNA preservando a integridade da informação genética, através de mecanismos de reparo. A não eliminação, ou o acúmulo destas lesões ou a deficiência em uma via de reparo, leva ao acúmulo de mutações em células, podendo contribuir para o câncer. Lesões no DNA podem estar associadas com Diabetes Mellitus (DM) e pouco se sabe a respeito de possíveis distúrbios no sistema de reparo, associado a esta síndrome. A metformina (MET), um sensibilizador de insulina, pode estar associado a incidência reduzida e melhora no prognóstico de certos tipos de cânceres em DM. Neste estudo, estamos sugerindo em eucariotos e procariotos, deficientes em enzimas de reparo de DNA, que a MET, age via enzimas de reparo, para proteger a célula contra os danos em DNA. Isto porque células XPD, deficientes na enzima de reparo XPD, pré-tratadas com MET (1mM) e irradiadas com UVC, tiveram sobrevivência menores, avaliadas através da viabilidade celular pela exclusão do Azul de Trypan, em comparação com controle, MRC5. O mesmo ocorrendo com as cepas bacterianas AB1885, BH20 e AB2463 deficientes nas enzimas de reparo, UvrB e Fpg e do sistema SOS, respectivamente, quando foram pré-tratadas com MET (20mg = 168mM) e irradiadas com UVC comparadas com suas sobrevivências sem UVC. Cepas AB1885 e BH20 transformadas em proficientes de todos os sistemas de reparo e submetidas ao mesmo tratamento com MET, mas com a dose de UVC igual à administrada para a cepa selvagem (AB1157), observou-se um aumento de sobrevivência. E ao se utilizar a cepa GY4765 (SOS+), proficiente da atividade autocatalítica do sistema SOS, nas mesmas condições de tratamento, houve também aumento da sobrevivência em relação ao controle, sendo também o sistema testado através do SOS Cromoteste onde a MET expressou este sistema. Através do ensaio da eletroforese alcalina em gel de agarose, onde se avaliou a atividade de reparo da cepa bacteriana AB1157, após o prétratamento com MET e irradiação com UVC, confirmou-se a ação da MET em ativar sistemas de reparo do DNA. Demonstrou-se, também, a existência de uma ação conjunta da MET com a insulina, quando em células provenientes de pacientes portadores de câncer de mama MCF7, transfectada com o gene BRCA1(HRR), o tratamento com MET (168mM) não expressou este gene, mas o fez, em ação conjunta com a insulina (10nM) quando avaliadas no ensaio de luciferase. Quando células MRC5 foram submetidas ao pré-tratamento com MET(168mM) e insulina(10nM) e após irradiada com UVC, tiveram sua sobrevivência maiores do aquelas irradiadas sem insulina. Já nas células XPD, esta ação conjunta MET e insulina, não protegeu a célula contra a ação do UVC. Conclui-se que a MET em procariotos, ativa reparo de DNA, necessita das enzimas de reparo UvrB (NER) e fpg (BER) e do sistema SOS para proteger a célula contra os efeitos deletérios do UVC. Em eucariotos, a MET, necessita da enzima de reparo de DNA, XPD (NER) para promover a mesma proteção contra a ação do UVC, que é exacerbada, quando associada à insulina. Possivelmente, a MET, também expressa o gene BRCA1 (HRR) quando associada à insulina. / Cells prevent the formation of injuries in DNA preserving integrity of the genetic information, through repair mechanisms. The accumulation of these injuries or the deficiency in one repair mechanism can produce mutations in cells, leading to neoplasic transformation. Injuries in the DNA can be associated with Diabetes Mellitus (DM) and little is known regarding possible disturbance in the repair system, associated with this syndrome. The use of metformin (MET), a insulin sensitizer, can be associated with reduced incidence and improvement in the prognostic of certain types of cancer in DM. In this study, we are suggesting in prokaryotes and eukaryotes deficient in repair enzymes that MET acts through these enzymes, to protect against the damages in DNA. Cells XPD, deficient in the enzyme of repair XPD, pre-treated with MET (1mM) and radiated with UVC, showed lower survival, evaluated through Trypan Blue test of cell viability in comparison with MRC5 control cells. The same occurring with bacterial strains AB1885, BH20 and AB2463 deficient in repair enzymes UvrB and Fpg and the SOS system, respectively, when pre-treated with MET (20mg/ml=168mM) and radiated with UVC compared with its survival without UVC. Strains AB1885 and BH20 transformed into proficient of all the repair systems through, and submitted to the same treatment with MET and equal dose of UVC the used in the wild strain (AB1157), we observed an increase of its survival. Studying the strains GY4765 (SOS+) proficient on the autocatalytic activity of the SOS system, using the same conditions of treatment, also had increase of its survival in relation to the control, being also this system tested through Chromotest SOS where the MET expressed the SOS genes. Through alkaline electroforese in agarose gel to evaluate the repair activity on the bacterial strain AB1157 (proficient of all repair systems) the pre-treatment with MET and irradiation with UVC, confirmed the action of MET in activating repair systems. It was demonstrated, also, the existence of a synergic action of MET and insulin, when cells from patients with of breast cancer of (MCF7), transfected with BRCA1 gene (HRR). The treatment with MET (20mg/ml) did not increase the expression of this gene, but when combined with insulin (10nM) we observed an increase in the expression of this gene, evaluated in the Luciferase assay. When MRC5cells has been submitted to the pre-treatment with MET and insulin and exposed with UVC, had its higher survival of those radiated without insulin. XPD cells, treated with MET and insulin, did not show any protection agains UVC exposure. In conclusion MET treatment in prokaryotes active DNA repair, but needs UvrB enzymes (NER), fpg (BER) and SOS system to protect the cell against the deleterious effect of the UVC. In eukaryotes, MET needs XPD repair enzyme, (NER) to promote the same protection against the action of the UVC that is bigger when associated with insulin. Possibly, MET also increases the expression of BRCA1gene (HRR) when associated with insulin.

Resumo: Para o ano de 2025 estima-se que mais de 380 milhões de pessoas no mundo sejam diabéticas, sendo mais de 90% delas de diabetes mellitus tipo 2. Recentemente, está disponível no mercado um tratamento com a associação farmacêutica metformina (MET) e vildagliptina (VIL) que além de reduzir os níveis de glicose sanguínea e hemoglobina glicada diminui os eventos hipoglicêmicos e não promove aumento de peso ou retenção hídrica. A associação de fármacos é importante para a adesão ao tratamento, porém constitui-se em um desafio para o controle de qualidade. Por este motivo, este trabalho teve por objetivo desenvolver e validar métodos para a quantificação de VIL e MET por meio de duas técnicas distintas: CLAE-EM/EM e espectroscopia de infravermelho aliada à calibração multivariada usando PLS (IV-PLS). A primeira técnica é sensível e seletiva, ideal para quantificação simultânea dos fármacos e impurezas. A segunda é ecologicamente correta, sem uso de solventes orgânicos, não destrutiva, rápida e de baixo custo. As análises CLAE-EM/EM foram operadas com interface electrospray, no modo positivo de ionização através de um detector do tipo quadrupolo. A cromatografia foi realizada em coluna C8 (4,6x150 mm; 5 ?m) à temperatura ambiente. A fase móvel consistiu em água:acetonitrila:ácido fórmico (80:20:0,1 v/v/v), fluxo de 800 ?L/min em modo de eluição isocrática. Na validação o método mostrou-se seletivo, preciso (DPR<5%), linear (r>0,99) e exato (recuperação entre 98 e 108%). O ensaio de robustez mostrou que pequenas variações de fluxo, temperatura e proporção de ácido fórmico podem comprometer a exatidão dos resultados. O método foi aplicado com sucesso na determinação de teor em amostras adquiridas no comércio local que apresentaram teor de metformina e vildagliptina variando entre 102 e 104%. Em nenhuma das amostras foi detectada a presença das impurezas da metformina. As análises IV-PLS foram realizadas em modo de refletância difusa, na região de 400 a 4000 cm-1, com uma resolução de 4 cm-1, 32 scans e temperatura e umidade controladas. Os dados foram tratados no software PLS-Toolbox 6.5 que opera em ambiente Matlab 7.13. O melhor modelo foi obtido por meio do algoritmo siPLS com intervalos de 50 variáveis, com préprocessamento SNV mais dados centrados na média, com 7 e 6 VLs para VIL e MET, respectivamente. Após a detecção de outliers, o conjunto de calibração de VIL e MET consistiu em 42 e 38 amostras e o de validação 23 e 20 amostras, respectivamente. Os valores de RMSEC e RMSEP para VIL foram 0,16 e 0,27 mg/0,1 g e para MET 1,44 e 3,95 mg/0,1 g. Na validação o método mostrou-se linear, preciso, com inverso da sensibilidade analítica de 0,003 mg/0,1 g para VIL e 0,004 mg/0,1 g MET e com erros sistemáticos desprezíveis e insignificantes. Os modelos apresentaram boa capacidade preditiva da concentração dos fármacos nas amostras reais de comprimidos, sendo de 80 a 90% das amostras analisadas estatisticamente semelhantes às analisadas por CLAE-EM/EM (p>0,05). Por fim, os métodos desenvolvidos podem ser considerados rápidos e eficientes para o controle de qualidade de VIL e MET em sua forma farmacêutica.

Células de todos os organismos vivos restauram lesões em DNA preservando a integridade da informação genética, através de mecanismos de reparo. A não eliminação, ou o acúmulo destas lesões ou a deficiência em uma via de reparo, leva ao acúmulo de mutações em células, podendo contribuir para o câncer. Lesões no DNA podem estar associadas com Diabetes Mellitus (DM) e pouco se sabe a respeito de possíveis distúrbios no sistema de reparo, associado a esta síndrome. A metformina (MET), um sensibilizador de insulina, pode estar associado a incidência reduzida e melhora no prognóstico de certos tipos de cânceres em DM. Neste estudo, estamos sugerindo em eucariotos e procariotos, deficientes em enzimas de reparo de DNA, que a MET, age via enzimas de reparo, para proteger a célula contra os danos em DNA. Isto porque células XPD, deficientes na enzima de reparo XPD, pré-tratadas com MET (1mM) e irradiadas com UVC, tiveram sobrevivência menores, avaliadas através da viabilidade celular pela exclusão do Azul de Trypan, em comparação com controle, MRC5. O mesmo ocorrendo com as cepas bacterianas AB1885, BH20 e AB2463 deficientes nas enzimas de reparo, UvrB e Fpg e do sistema SOS, respectivamente, quando foram pré-tratadas com MET (20mg = 168mM) e irradiadas com UVC comparadas com suas sobrevivências sem UVC. Cepas AB1885 e BH20 transformadas em proficientes de todos os sistemas de reparo e submetidas ao mesmo tratamento com MET, mas com a dose de UVC igual à administrada para a cepa selvagem (AB1157), observou-se um aumento de sobrevivência. E ao se utilizar a cepa GY4765 (SOS+), proficiente da atividade autocatalítica do sistema SOS, nas mesmas condições de tratamento, houve também aumento da sobrevivência em relação ao controle, sendo também o sistema testado através do SOS Cromoteste onde a MET expressou este sistema. Através do ensaio da eletroforese alcalina em gel de agarose, onde se avaliou a atividade de reparo da cepa bacteriana AB1157, após o prétratamento com MET e irradiação com UVC, confirmou-se a ação da MET em ativar sistemas de reparo do DNA. Demonstrou-se, também, a existência de uma ação conjunta da MET com a insulina, quando em células provenientes de pacientes portadores de câncer de mama MCF7, transfectada com o gene BRCA1(HRR), o tratamento com MET (168mM) não expressou este gene, mas o fez, em ação conjunta com a insulina (10nM) quando avaliadas no ensaio de luciferase. Quando células MRC5 foram submetidas ao pré-tratamento com MET(168mM) e insulina(10nM) e após irradiada com UVC, tiveram sua sobrevivência maiores do aquelas irradiadas sem insulina. Já nas células XPD, esta ação conjunta MET e insulina, não protegeu a célula contra a ação do UVC. Conclui-se que a MET em procariotos, ativa reparo de DNA, necessita das enzimas de reparo UvrB (NER) e fpg (BER) e do sistema SOS para proteger a célula contra os efeitos deletérios do UVC. Em eucariotos, a MET, necessita da enzima de reparo de DNA, XPD (NER) para promover a mesma proteção contra a ação do UVC, que é exacerbada, quando associada à insulina. Possivelmente, a MET, também expressa o gene BRCA1 (HRR) quando associada à insulina. / Cells prevent the formation of injuries in DNA preserving integrity of the genetic information, through repair mechanisms. The accumulation of these injuries or the deficiency in one repair mechanism can produce mutations in cells, leading to neoplasic transformation. Injuries in the DNA can be associated with Diabetes Mellitus (DM) and little is known regarding possible disturbance in the repair system, associated with this syndrome. The use of metformin (MET), a insulin sensitizer, can be associated with reduced incidence and improvement in the prognostic of certain types of cancer in DM. In this study, we are suggesting in prokaryotes and eukaryotes deficient in repair enzymes that MET acts through these enzymes, to protect against the damages in DNA. Cells XPD, deficient in the enzyme of repair XPD, pre-treated with MET (1mM) and radiated with UVC, showed lower survival, evaluated through Trypan Blue test of cell viability in comparison with MRC5 control cells. The same occurring with bacterial strains AB1885, BH20 and AB2463 deficient in repair enzymes UvrB and Fpg and the SOS system, respectively, when pre-treated with MET (20mg/ml=168mM) and radiated with UVC compared with its survival without UVC. Strains AB1885 and BH20 transformed into proficient of all the repair systems through, and submitted to the same treatment with MET and equal dose of UVC the used in the wild strain (AB1157), we observed an increase of its survival. Studying the strains GY4765 (SOS+) proficient on the autocatalytic activity of the SOS system, using the same conditions of treatment, also had increase of its survival in relation to the control, being also this system tested through Chromotest SOS where the MET expressed the SOS genes. Through alkaline electroforese in agarose gel to evaluate the repair activity on the bacterial strain AB1157 (proficient of all repair systems) the pre-treatment with MET and irradiation with UVC, confirmed the action of MET in activating repair systems. It was demonstrated, also, the existence of a synergic action of MET and insulin, when cells from patients with of breast cancer of (MCF7), transfected with BRCA1 gene (HRR). The treatment with MET (20mg/ml) did not increase the expression of this gene, but when combined with insulin (10nM) we observed an increase in the expression of this gene, evaluated in the Luciferase assay. When MRC5cells has been submitted to the pre-treatment with MET and insulin and exposed with UVC, had its higher survival of those radiated without insulin. XPD cells, treated with MET and insulin, did not show any protection agains UVC exposure. In conclusion MET treatment in prokaryotes active DNA repair, but needs UvrB enzymes (NER), fpg (BER) and SOS system to protect the cell against the deleterious effect of the UVC. In eukaryotes, MET needs XPD repair enzyme, (NER) to promote the same protection against the action of the UVC that is bigger when associated with insulin. Possibly, MET also increases the expression of BRCA1gene (HRR) when associated with insulin.

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Atualmente tem se discutido uma possível relação entre obesidade e câncer de próstata. No entanto, a obesidade está associada a desordens multifatoriais (hiperglicemia, hiperinsulinemia, dislipidemia, inflamação) e avaliar o impacto delas em células normais e tumorais é de grande relevância para a elaboração de estratégias terapêuticas. A metformina é uma droga antidiabética que apresenta efeitos antiproliferativos e tem sido apontada como tratamento para o câncer. Entretanto, sua eficiência em condições de intenso estímulo proliferativo ainda é desconhecida. Assim, este estudo objetivou analisar o efeito de altas concentrações de ácido graxo e/ou insulina, com ou sem metformina,em células normais e tumorais de próstata, com ênfase no perfil de proliferação e migração destas células. Foram utilizadas duas linhagens de células epiteliais humanas de próstata, sendo elas normais (PNT1A) e tumorais (PC3). Estas células foram tratadas com altas concentrações de ácido graxo saturado (100 gM palmitato, HF), e/ou insulina (50gU), na presença ou ausência de metformina (100 gM), por 24hrs ou 48hrs. Posteriormente, estas células foram submetidas às análises de apoptose, viabilidade/proliferação celular (MTT), migração e imunofluorescência para vimentina. Os resultados mostram que, de maneira geral, os tratamentos nas concentrações usadas não causaram morte celular nas células estudadas. O MTT revelou que as células PNT1A e PC3 proliferaram em maior quantidade quando tratadas com altas concentrações de ácido graxos (HF) e de insulina (HI) após as primeiras horas de tratamento. O mesmo resultado não foi observado para o grupo HFI. A metformina por si só estimulou a proliferação celular, mas em associação à HF foi capaz de reduzi-la em ambas as linhagens. Contudo, ela não inibiu a proliferação celular desencadeada por HI nas células normais.As análises de migração mostraram que PNT1A foram estimuladas a migrar para todos os tratamentos, enquanto PC3 foi influenciada somente por HF. A metformina inibiu a migração estimulada por todos eles. Em paralelo à migração, foi observado que os tratamentos HF e HI para PNT1A e HF para PC3 estimularam a maior expressão de vimentina, demonstrando maior transição epitélio mesenquima nessas células, e, consequentemente, estimulando a migração celular. A metformina inibiu a expressão de vimentina estimulada pelos meios tanto nas células normais como nas tumorais. Assim, conclui-se que as altas concentrações de ácido graxo saturado e insulina interferem nas células prostáticas estimulando atividades celulares que sabidamente influenciam na carcinogênese, tais como proliferação e migração celular.A metformina foi capaz de reverter boa parte das alterações estimuladas por esses meios, se mostrando uma boa ferramenta no controle da proliferação e migração celular em situações de hiperlipidemia e hiperinsulinemia. Assim, o potencial dessa droga para a terapia de pacientes obesos que sabidamente apresentam maior risco para câncer de próstata deverá ser investigado. / A potential association between obesity and prostate cancer has been proposed by several studies. Obesity is related with multifactorial disorders, such as hyperglycemia, hyperinsulinaemia, dyslipidemia, and inflammation. Regarding the impact of such disorders on normal and tumor cells is of great relevance for the development of therapeutic strategies. Metformin, an antidiabetic drug, has antiproliferative effects, being proposed as a cancer treatment. However, under intense proliferative stimulation conditions, its efficiency is still uncertain. The main objective of the present study was to analyze the effects of fatty acid and/or insulin under high concentrations, in the presence or not of metformin, on normal and prostate tumor cells, regarding their proliferation and migration profile. Two human prostate epithelial cell lines were used: non cancer (PNT1A) and tumor (PC3). These cells were treated with high concentrations of saturated fatty acid (100 gM palmitate, HF), and/or insulin (50 gU) in the presence or absence of metformin (100 gM) for 24 or 48 hours. After treatments we performed analyzes for caspase, cell viability/proliferation (MTT), migration and immunofluorescence for vimentin. The results showed that the concentration of all treatments was not cytotoxic. MTT revealed that PNT1A and PC3 cells had higher proliferation when treated with HF and HI after the first few hours of treatment. Similar results were not found for the HFI group. Metformin alone has stimulated cell proliferation, but in association with HF, has reduced it in both cell lines. However it did not inhibit the proliferative action of HI in PNT1A cells. Migration analyzes showed that PNT1A were stimulated to migrate after all treatments, whilst PC3 was influenced only by HF and that metformin inhibited the migration stimulated by all of them. Both HF and HI treatments in PNT1A and HF in PC3 stimulated greater vimentin expression, resulting in a larger epithelium-mesenchymal transition in these cells, which, in turns, has stimulated cell migration. Metformin inhibited vimentin expression in both normal and tumor cells. It is possible to conclude that higher concentrations of saturated fatty acid and insulin influence prostatic cells, stimulating cellular activities that could trigger carcinogenesis and/or sustain cancer progression, such as cell proliferation and migration. Most of these stimuli were inhibited by using Metformin, being efficient in the control of cell proliferation and migration in conditions of hyperlipidemia and hyperinsulinemia. Thus, the efficiency of this drug for obese patients therapy, which is a potential group for prostrate cancer risk, should be investigated. / Dissertação (Mestrado)