Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-25T15:48:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1728299 bytes, checksum: 9536bb852b8406140722b5b88e410730 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-25T15:48:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1728299 bytes, checksum: 9536bb852b8406140722b5b88e410730 (MD5) Previous issue date: 2015-07-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A família Geminiviridae é composta por vírus com genoma de DNA circular de fita simples, encapsidado em partículas icosaédricas geminadas. Os vírus pertencentes ao gênero Begomovirus são transmitidos pela mosca-branca Bemisia tabaci a plantas dicotiledôneas. Os begomovírus apresentam taxas de mutação e substituição nucleotídica semelhantes às relatadas para vírus de RNA, e uma elevada taxa de recombinação. Devido ao seu rápido processo evolutivo, novas espécies de begomovírus são frequentemente encontradas no campo. Este trabalho teve como objetivos realizar a caracterização molecular de duas espécies de begomovírus infectando Pavonia sp. (Malvaceae), e quantificar a evolução do Tomato severe rugose virus (ToSRV) em um hospedeiro cultivado e um não-cultivado. Dois begomovírus foram isolados de plantas de Pavonia sp. coletadas nos municípios de Albuquerque e Corumbá, Mato Grosso do Sul. Comparação de sequências e análise filogenética indicaram tratar-se de duas novas espécies com as características de begomovírus bissegmentados das Américas. Foram propostos os nomes Pavonia mosaic virus (PavMV) e Pavonia yellow mosaic virus (PavYMV). No estudo para avaliar a dinâmica evolutiva do ToSRV, plantas de tomateiro e Nicandra physaloides foram inoculadas via biobalística com clone infeccioso do ToSRV e mantidas em casa-de-vegetação. DNA total foi extraído de folhas coletadas aos 30, 75 e 120 dias após a inoculação, e submetido a sequenciamento na plataforma Illumina HiSeq 2000. As bibliotecas de DNA foram submetidas a análise de qualidade no software FastQC. O alinhamento dos reads foi realizado no software Geneious, utilizando o clone infeccioso como sequência referência. Ambos os componentes genômicos do ToSRV apresentam taxa de substituição semelhantes a de vírus de RNA: 3,06 x 10-3 e 2,03 x 10-3 subst/sítio/ano para o DNA-A e DNA-B, respectivamente, em N. physaloides, e 1,38 x 10-3 e 8,68 x 10-4 subst/sítio/ano para o DNA-A e DNA-B, respectivamente, em tomateiro. Valores de taxa de substituição similares aos já descritos para begomovírus foram encontrados também para os genes CP, Rep, MP e NSP em ambos os hospedeiros. Foram quantificadas substituições sinônimas e não- sinônimas, transversões e transições, além de deleções e inserções nos genes CP, Rep, MP e NSP. Foi observado um decréscimo no número de variações ao longo do tempo e consequente aumento do número de sítios idênticos ao genoma referência. Nas bibliotecas provenientes de N. physaloides foi observada a supressão dos códons de terminação dos genes MP e NSP em todo decorrer da infecção, sugerindo uma estratégia adaptativa. O cálculo da entropia de Shannon identificou como hotspots de mutação a região N-terminal do gene Rep, as regiões comuns no DNA-A e DNA-B (CR-A e CR-B, respectivamente) e a região intergênica longa entre os genes MP e NSP no DNA-B (LIR-B). Estes dados sugerem que o ToSRV evolui como quasispecies, apresentando elevada variabilidade genética, o que poderia explicar em parte sua prevalência no campo. / The family Geminiviridae is comprised of viruses with a circular, single-stranded DNA genome encapsidated in twinned icosahedral particles. The viruses in the genus Begomovirus are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci to dicot plants. Begomoviruses have mutation and nucleotide substitution rates similar to those reported for RNA viruses, and a high frequency of recombination. Due to their rapid evolutionary process, new begomovirus species are often found in the field. This study aimed to perform the molecular characterization of two begomovirus species infecting Pavonia sp. (Malvaceae), and to follow and quantify the evolution of Tomato severe rugose virus (ToSRV) in a cultivated and a non-cultivated host. Two begomoviruses were isolates from Pavonia sp. plants collected in the municipalities of Albuquerque and Corumbá, Mato Groso do Sul, Brazil. Sequence comparisons and phylogenetic analysis showed that these were two novels species, with the typical features of bipartite, New World begomoviruses. The names Pavonia mosaic virus (PavMV) and Pavonia yellow mosaic virus (PavYMV) were proposed for the two new species. In the study to evaluate the evolutionary dynamics of ToSRV, tomato and Nicandra physaloides plants were inoculated via biobalistics with an infectious clone of ToSRV and maintained in a greenhouse. Total DNA was extrated from leaves collected at 30, 75 and 120 days after inoculation, and was sequenced in the Illumina HiSeq 2000 platform. The DNA libraries from each of the two hosts were submitted to quality control analysis with FastQC software. The genome assembly was performed with the program Geneious using the infectious clone as reference. Both genomic components of ToSRV showed substitution rates similar to those of RNA viruses: 3.06 x 10-3 and 2.03 x 10-3 sub/site/year for the DNA-A and DNA-B, respectively, in N. physaloides, and 1.38 x 10-3 and 8.68 x 10-4 sub/site/year for the DNA-A and DNA-B, respectively, in tomato. Substitution rates in the range of those already described for other begomoviruses were found also for the CP, Rep, MP and NSP genes in both hosts. We quantified synonymous and non-synonymous substitutions, transversions and transitions, as well as deletions and insertions in the CP, Rep, MP and NSP genes. A decrease in the number of variable sites was observed during the course of the experiment, with a corresponding increase in the number of identical sites to the reference genome. Suppression of the stop codons of the MP and NSP genes was observed in the N. physaloides libraries, suggesting an adaptive strategy. Determination of Shannon entropy indicated mutation hotspots in the N-terminal region of the Rep gene, the intergenic common region in the DNA-A and DNA-B (CR-A and CR-B, respectively) and the long intergenic region between the MP and NSP genes in the DNA-B (LIR-B). Overall, the results indicate that ToSRV evolves as a quasispecies, with a high degree of genetic variability which could be partly responsible for its prevalence in the field.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica / Las infecciones fúngicas o micosis son infecciones producidas por hongos oportunistas y/o patógenos que pueden ser superficiales o sistémicas. El agente etiológico más importante a nivel mundial de estas infecciones es Candida albicans, una levadura comensal que coloniza entre un 30-60% de los humanos; sin embargo, frente a cambios en las condiciones locales o en la inmunidad del hospedero es capaz de causar una infección. Los antifúngicos son agentes naturales o sintéticos que eliminan y/o inhiben la proliferación de hongos. Sus principales mecanismos de acción son la inhibición de la formación de la pared celular y la disrupción de la membrana celular. Se han estudiado varios mecanismos de resistencia a antifúngicos en C. albicans. Los principales apuntan a mutaciones y sobreexpresión de los genes ERG11 (azoles) y FKS1 (equinocandinas) y/o a la sobreexpresión de las bombas de eflujo CDR1, CDR2 y MDR1; sin embargo, su contribución real a la generación de resistencia no está del todo dilucidada. El objetivo de este trabajo fue caracterizar los mecanismos de resistencia a azoles y equinocandinas en cepas clínicas chilenas, estableciendo los mecanismos de resistencia más prevalentes. Se estudiaron 10 cepas de aislados chilenos resistentes a azoles y 10 cepas resistentes a equinocandinas de C. albicans de origen clínico, buscando mecanismos de resistencia mediante el análisis de genes candidatos por técnicas de secuenciación, q-PCR y además mediante ensayos de funcionalidad de bombas de eflujo. Se encontró que en las cepas resistentes, tanto a azoles como a equinocandinas, no existe un mecanismo de resistencia único. Sin embargo, el mecanismo de resistencia más prevalente a azoles fue la sobreexpresión de bombas de eflujo, encontrándose en el 60% de las cepas ensayadas. Por otra parte, en las cepas resistentes a equinocandinas el mecanismo predominante fueron mutaciones en el gen FKS1, principalmente en la región HS1, encontrándose mutaciones de interés en un 20% del total de cepas resistentes estudiadas. Estos resultados entregan información importante acerca de los mecanismos predominantes para dos familias de antifúngicos en aislados clínicos chilenos de C. albicans. Es necesario un estudio multicéntrico con un mayor número de cepas para conocer con más detalle la realidad nacional de la resistencia a agentes antifúngicos en C. albicans. / Fungal infections or mycoses are infections caused by opportunistic and/or pathogenic fungi that may be superficial or systemic. The most important etiologic agent globally of these infections is Candida albicans, a commensal yeast that colonizes 30-60% of humans. Changes in local conditions or host immunity can produce a switch from a harmless colonizing commensal to causing a pathogen infection. Antifungal agents are natural or synthetic agents that eliminate and/or inhibit the growth of fungi; their main mechanism of action is the inhibition of cell wall formation and disruption of the cell membrane. Several mechanisms of antifungal resistance of C. albicans have been studied. The most common are mutations and overexpression of the ERG11 and FKS1 genes, involved in resistance to azoles and echinocandins, respectively, and/or the overexpression of efflux pumps CDR1, CDR2 and MDR1. However the real contribution of each resistance mechanism in Chilean clinical isolates has not been elucidated. The aim of this work was to characterize the resistance mechanisms to azoles and echinocandins in Chilean clinical isolates, in order to establish the most prevalent resistance mechanism. We studied 10 strains of C. albicans resistant to azoles and 10 strains resistant to echinocandins, and evaluated their resistance mechanisms using sequencing, q-PCR and functional assays of efflux pumps. We found that several resistance mechanisms are present in the azole and echinocandin resistant strains. However, the most prevalent mechanism of azole resistance was the overexpression of an efflux pump, present in 60% of the tested strains. Resistance to echinocandins can be ascribed predominantly to mutations in the FKS1 gene, mainly in the HS1 region. Mutations of interest were found in 20% of the resistant strains tested. These results provide important information about the predominant resistance mechanisms against two families of antifungals in Chilean strains of C. albicans. A multicenter study, with a greater number of isolates, will be necessary to know the national status of antifungal resistance in C. albicans / Conicyt, Fondecyt

Manifiesta que el Acinetobacter baumannii es una bacteria responsable de infecciones nosocomiales con alta mortalidad en humanos, elevada tasa de resistencia a los antibióticos y con presentaciones reportadas en animales cada vez más frecuentes. Un gato doméstico pelo corto de 7 meses de edad y 4,4 kgs es llevado a la veterinaria por vómitos y decaimiento, al día siguiente regresa con temperatura de 40.1 °C, Posteriormente presenta linfadenomegalia únicamente de lado izquierdo (pre escapular, axilar, inguinal), además se hace evidente lesión cutánea alopécica en miembro anterior izquierdo, la lesión se extendió abarcando antebrazo y hombro y posteriormente el otro hombro. A la evaluación histopatológica de una muestra lesional de la piel, se evidenció epidermitis supurativa necrótica y leve dermatitis linfocítica perivascular, el tratamiento con cefalosporinas (ceftriaxona y cefovecin sódico) y fluoroquinolonas fue infructuoso, se realizó un cultivo aislándose Acinetobacter baumannii complex. Los propietarios deciden la eutanasia del paciente. No se conocen reportes previos en Perú acerca de esta bacteria como causante de procesos infecciosos en animales. / Trabajo académico

Orientador: Ana Maria Centola Vidal / Banca: Vera Letticie de Azevedo Ruiz / Banca: Rachel Zoccal Saba / Banca: Andréia Cristina Nakashima Vaz / Banca: Karina Paes Bürguer / Resumo: A segurança alimentar é um assunto que tem sido debatido em todo o mundo, sendo de responsabilidade de todos envolvidos na cadeia produtiva, desde os agricultores, produtores, transportadores, fabricantes, manipuladores, o Estado, e, todas suas esferas governamentais, e os consumidores. Com esse conceito e com a necessidade da descentralização na esfera governamental dos serviços de inspeção para um melhor controle higiênico-sanitário dos estabelecimentos produtores de alimentos de origem animal, assim, sendo, o Serviço de Inspeção Municipal (SIM) é responsável por controlar a qualidade dos produtos de origem animal comercializados no município, e combater a clandestinidade, com isso diminuir os riscos de agravos à saúde transmitidos por microrganismos patogênicos veiculados através destes alimentos. Sendo Rio Verde, GO, o primeiro município goiano a implantar o Serviço de Inspeção Municipal no estado, o presente trabalho realizou um diagnóstico da implantação do SIM no município e da incidência de microrganismos patogênicos em produtos cárneos produzidos no município (quibe e cortes de frango temperado). Concluindo que o serviço de inspeção se encontra em fase de implantação apresentando falhas e necessidades de adequações técnicas, como adequação na legislação vigente à realidade do município, definir padrões e regimentar a profissão do responsável técnico, realizar fiscalizações com maior rigor nas áreas de manipulação e sobre os manipuladores. No diagnóstico de microrganismos patogênicos, foram encontradas prevalências inaceitáveis de Salmonella spp., Bacillus cereus e Listeria spp., comprovando as falhas presentes na manipulação, uma má aplicação dos Manuais de Boas Práticas de Fabricação, demostrando a necessidade de um maior compromisso por parte dos estabelecimentos e responsáveis técnicos com a saúde pública, de se... / Abstract: Food safety is an issue that has been debated worldwide, being the responsibility of all involved in the production chain, from farmers, producers, carriers, manufacturers, handlers, the state, and all its spheres of government, and consumers . With this concept and the need for decentralization in the government sphere of inspection services for a better hygienic and sanitary control of establishments producing food of animal origin, thus being the Municipal Inspection Service (SIM) is responsible for controlling the quality of animal products marketed in the city, and combat illegal immigration, thereby decreasing the risk of health problems transmitted by pathogenic microorganisms conveyed by these foods. And Rio Verde Go, the first municipality Goias to implement the Municipal Inspection Service in the state, this paper carried out a diagnosis of SIM deployment in the city and the incidence of pathogens in meat products produced in the municipality (kebab and seasoned chicken cuts ). Concluding that the inspection service is under implementation had shortcomings and needs of technical adaptations, such as adequacy in the current legislation the municipal reality, define standards and regiment the profession's technical manager, perform inspections more closely in the areas of handling and on the handlers. In the diagnosis of pathogenic microorganisms, unacceptable prevalence of Salmonella spp. were found., Bacillus cereus and Listeria spp., Proving the flaws present in the handling, incorrect application of Good Manufacturing Practices Manuals, demonstrating the need for a greater commitment by establishments and technicians in charge of public health, to take responsibility for changes needed to reduce the risks of harm to health / Doutor

Geóloga / La región de Atacama presenta sectores que poseen condiciones sumamente hostiles para la vida, la combinación entre un clima extremadamente árido con la alta radiación UV que recibe, lo ha instalado dentro de la comunidad científica como un potencial análogo terrestre a la superficie marciana, en el que además, se han reportado microorganismos y componentes orgánicos. Bajo este contexto se desarrolla este estudio, el cual analiza al salar Azufrera y a un sistema hidrotermal en sus cercanías, ambos ubicados en la parte noreste de la región, específicamente en el sector más cordillerano, donde si bien las condiciones imperantes no son tan adversas como las que se encuentran en el desierto de Atacama como tal, sí lo son para el desarrollo de la vida. El objetivo de este trabajo es caracterizar los fluidos que permiten la posible existencia de microorganismos en estos depósitos, intentar bosquejar su evolución y compararlos con fluidos que eventualmente podrían existir en la superficie marciana. Para esto se requiere una recopilación representativa de las zonas a estudiar, luego una caracterización petrográfica de los minerales de la zona y de las inclusiones fluidas primarias y secundarias que hayan albergado idealmente microorganismos. Con los datos obtenidos de estos procedimientos se realiza un análisis microtermométrico para determinar la composición de los fluidos. Se identificaron en las muestras del salar Azufrera diatomeas, coccis, algas y componentes orgánicos. Sin embargo, las inclusiones que aportan información válida para este estudio, lamentablemente no contienen ni microorganismos ni materia orgánica. Además un gran porcentaje de las inclusiones resultaron ser metaestables, lo cual imposibilitó la obtención de datos de un gran número de FIAs. En el sistema hidrotermal se encontraron filamentos, diatomeas e insectos alados afuera de las inclusiones desafortunadamente, por lo tanto no fue posible caracterizar los fluidos que permitieron su existencia en este sistema. Con el software Frezchem se modelaron los fluidos primarios del salar Azufrera y se intentó estimar la concentración de estos en un ambiente similar a Marte. Las condiciones ambientales fueron modeladas con pH 7.7 y 3.0. El pH neutro prevalece en el suelo marciano (Marion et al. (2010)) y en la mayoría de los salares de la zona de estudio; el pH ácido se justifica por la presencia de jarosita en Marte y la presencia de alteraciones hidrotermales en la tierra. Los resultados indican que las composiciones iónicas son tres órdenes de magnitud diferentes y por lo tanto poco comparables, además las variaciones en el pH no tendrían repercusiones en las concentraciones iónicas, no obstante, bajo ambos escenarios podría precipitar yeso, mineral con propiedades que permiten la preservación adecuada de microorganismos bajo condiciones adversas. Dado lo anterior no es posible concluir tajantemente al respecto.

Desarrolla una ecuación que describe el crecimiento en biomasa de Pseudomonas putida utilizando glicerol como fuente de sustrato, asumiendo desde el principio, una serie de reacciones bioquímicas que en conjunto, establecen un mecanismo que detalla la fenomenología de crecimiento del microorganismo en cuestión almacenando un biopolímero en su interior. Desde el punto de vista biológico, el crecimiento de los microorganismos se da en etapas perfectamente diferenciables, por lo que la matemática detalla todo este proceso por medio de ecuaciones empíricas. Estas ecuaciones carecen de sustento bioquímico, por lo que un análisis fenomenológico (empleando la cinética química) de lo que sucede dentro del sistema explicaría (con mejor aproximación) los procesos involucrados. Los resultados del cultivo de Pseudomonas putida con glicerol como sustrato revelaron que al variar su concentración entre 10 y 30 g/l en el medio, el crecimiento de la bacteria es muy variable; esto fue corroborado mediante el ajuste de los datos obtenidos experimentalmente con los modelos cinéticos logístico, de Gompertz, de Baranyi y el obtenido al desarrollar el mecanismo cinético propuesto. El modelo que mejor describe el crecimiento de la bacteria es el de Baranyi; esto se evidenció gracias a la desviación estándar entre los valores experimentales y los ajustados. Asimismo, el modelo logístico y experimental mostraron los mismos parámetros cinéticos; esto sugiere que la cinética planteada en el mecanismo sustenta el modelo logístico. Ambos modelos fueron comparados utilizando la serie de Taylor y evaluadas con un nivel de significancia p=0.05; aun así, no reflejaron diferencias significativas. En conclusión, la ecuación resultante del mecanismo cinético propuesto representa a la del modelo logístico, motivo por el cual otorga sustento bioquímico a una ecuación empírica, resultante de suposiciones netamente matemáticas. / Tesis

El cianuro es una sustancia química que se utiliza en el ámbito industrial y minero. No obstante, también es considerado un toxico potencialmente letal. El cianuro es potente inhibidor del metabolismo celular y uno de los gases que contamina el ambiente atmosférico. La mayoría de tratamientos fisicoquímicos empleados para mitigar los efluentes cianurados son caros y/o insuficientes, por esta razón la utilización de microorganismos capaces de biodegradar el cianuro es una buena alternativa por los bajos costos operativos y alta eficiencia que presenta. El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad biodegradativa de cianuro por bacterias alcalófilas. Se recolectaron 7 muestras de relave procedentes de la Planta Concentradora Mesapata (Cátac – Ancash). Se lograron aislar 25 cepas de las cuales tres (P-CIAN 2, P-NUT 1 y P-KING 2), obtuvieron los mejores rendimientos en las pruebas de selección, tolerando concentraciones de hasta 100 mg/L de CN‾ a pH 11,0. Las cepas P-CIAN 2, P-NUT 1 y P-KING 2 obtuvieron velocidades de crecimiento de 0,063 h-1; 0,039 h-1 y 0,082 h-1; y tasas de biodegradación de 0,472 mg L-1 h-1, 0,688 mg L-1 h-1 y 0,875 mg L-1 h-1, respectivamente. P-CIAN 2, P-NUT 1 y P-KING 2 fueron capaces de biodegradar una concentración de 100 mg/L de CN‾ hasta en 77, 85 y 91%, respectivamente. Solo las cepas P-NUT 1 y P-KING 2 pudieron ser identificadas como Pseudomonas pseudoalcaligenes y Chromobacterium violaceum, respectivamente. / Tesis

Los ecosistemas son comunidades complejas y dinámicas que cumplen funciones de gran importancia a escala planetaria, sirven como reservorios de recursos y alojan una gran diversidad de especies biológicas. Sin embargo, estas comunidades sufren variaciones a lo largo del espacio y tiempo, dichas variaciones pueden ser seguidas y estudiadas durante los procesos de sucesión ecológica, los cuales involucran procesos de extinción y repoblación en los ecosistemas. En este contexto, el cambio climático es un problema actual cuyas consecuencias afectan la diversidad biológica de los ecosistemas pudiendo desencadenar procesos de sucesión continua y dinámica. Estas consecuencias pueden ser notadas a un nivel macro como la alteración o destrucción de ecosistemas, pérdidas en la diversidad de especies en áreas determinadas, entre otros. Estos cambios macro se ven representados y pueden ser estudiados a un nivel micro por el análisis de microbiota de suelos. Esta microbiota es vital en los ecosistemas pues participa en los ciclos biogeoquímicos de los elementos necesarios para el desarrollo de la comunidad como lo son el nitrógeno, fósforo y carbono. Para su análisis, el presente trabajo presenta tres estrategias que proveen información de naturaleza complementaria y que, en su conjunto, permiten evaluar dinámicas sucesionales de una manera más precisa y con potencial predictivo.

Esta Tesis estudia al receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) de Torpedo californica, una proteína integral de membrana compuesta por cinco subunidades homólogas organizadas en forma pseudosimétrica formando un poro de canal central, con una estequiometria α2βγδ. Cada subunidad contiene un dominio extracelular amino terminal, cuatro segmentos hidrofóbicos transmembrana (M1-M4) conectados por lazos de longitud variable, y un pequeño dominio carboxilo terminal. Los segmentos transmembrana de cada subunidad están organizados en tres anillos concéntricos. Los segmentos M2 forman las paredes del canal, los segmentos M1 y M3 constituyen el anillo medio, y los segmentos M4 forman el anillo externo, en íntimo contacto con los lípidos de membrana. La función del AChR es modulada por distintos compuestos que actúan como inhibidores. Los inhibidores competitivos se unen a los mismos sitios que el agonista; los no competitivos lo hacen en sitios diferentes. La interfase lípido-proteína ha sido foco de gran interés como potencial sitio de acción de un grupo de inhibidores no competitivos (NCI) de baja afinidad que comparten la característica de ser altamente hidrofóbicos. Se ha demostrado que distintos ácidos grasos libres (AGL) y esteroides modulan la funcionalidad del AChR a través de un mecanismo de inhibición no competitiva. Dos posibles hipótesis han sido propuestas para explicar tal mecanismo de acción. Una propone un efecto indirecto, considerando que la presencia de estos compuestos en el micro-ambiente lipídico del AChR perturba las propiedades biofísicas de la membrana, lo cual a su vez conduciría a cambios conformacionales de la proteína AChR. La otra hipótesis propone una acción directa: la interacción del compuesto exógeno con el AChR resultaría en forma directa en cambios conformacionales del AChR o en el desplazamiento de lípidos esenciales de su micro-entorno, esenciales para su correcta función. En el Capítulo I de esta Tesis se utilizó espectroscopía de fluorescencia, particularmente la técnica de transferencia de energía resonante de tipo Förster (FRET). Se evaluaron cambios en la eficiencia del proceso de FRET (E) entre el AChR, que actúa como donante de fluorescencia, y la sonda fluorescente Laurdan, que actúa como aceptor: la disminución de la E sugirió que el aceptor es desplazado del micro-entorno lipídico del AChR por la presencia de moléculas lipídicas exógenas. De esta manera, se pudo demostrar la localización de diferentes esteroides y AGL en el micro-ambiente lipídico del AChR. En el Capítulo II de esta Tesis se utilizó la sonda fluorescente cristal violeta, que posee mayor afinidad por el estado desensibilizado del AChR que por su estado de reposo. Se concluyó que el mecanismo de inhibición del AChR de distintos esteroides y de los AGL involucra una perturbación en el equilibrio conformacional del AChR. Además, utilizando la sonda fluorescente Laurdan, y calculando la denominada "polarización generalizada" de esta sonda, pudo relacionarse los efectos que estos compuestos ejercen sobre las características biofísicas de la membrana con el estado conformacional del AChR. / This Thesis concerns the study of the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica, an integral membrane protein composed by five homologous subunits pseudo-symmetrically organized around a central pore with the stoichiometry α2βγδ. Each subunit contains an extracellular amino-terminal domain, four hydrophobic transmembrane segments (M1-M4) connected by loops of varying length, and a short extracellular carboxyl terminal domain. The transmembrane segments of each subunit are arranged in three concentric rings. The M2 segments form the walls of the ion channel, the segments M1 and M3 constitute the middle ring, and the M4 segments form the outer ring, in close contact with the membrane lipids. The AChR function is modulated by different compounds that act as inhibitors. Competitive inhibitors bind to the same sites to which agonist bind; non-competitive inhibitors bind to different sites. The lipid-protein interface has been the focus of great interest as a potential site of action of a group of low-affinity non-competitive inhibitors (NCI) that share the property of being highly hydrophobic. It has been demonstrated that free fatty acids (FFA) and different steroids modulate the AChR functionality by a non-competitive inhibition mechanism. Two possible hypotheses have been proposed to explain the mechanism of action of these NCI on the AChR. One proposes an indirect mechanism, suggesting that the presence of exogenous compounds at the AChR lipid microenvironment perturbs the biophysical properties of the membrane, which, in turn, leads to conformational changes of the AChR protein. The other hypothesis proposed a direct action: the interaction of the exogenous compound with the AChR would result in AChR conformational changes or cause the displacement of essential lipids from the AChR microenvironment, which are necessary for its correct functionality. In the first Chapter of this Thesis, use was made of fluorescence spectroscopy, in particular Förster-type resonance energy transfer (FRET). Changes of the energy transfer efficiency (E) between the AChR, the fluorescence donor, and the fluorescent probe Laurdan, the acceptor, were evaluated: The diminution of E suggested that the acceptor is displaced from the AChR lipid micro-environment by the presence of the exogenous lipid molecules. Thus, the localization of different steroids and FFA could be established at the AChR lipid micro-environment. In the second Chapter of this Thesis, use was made of the fluorescent probe crystal violet, which exhibits higher affinity for the AChR desensitized state than for the AChR resting state. The conclusion was reached that the inhibitory mechanism of different steroids and FFA involves a perturbation of the conformational equilibrium of the AChR. Furthermore, by using the probe Laurdan and by calculating the so-called "generalized polarization" of this probe, it was possible to correlate the effects of these compounds on the biophysical properties of the membrane with the conformational state of the AChR.

En este trabajo de Tesis se investigaron los efectos de la hormona paratiroidea (PTH) en enterocitos de duodeno de ratas jóvenes (3 meses) y seniles (24 meses) y de adenosina trifosfato (ATP) en células Caco-2 derivadas de adenocarcinoma de colon, sobre las cascadas de señalización de las MAP quinasas (MAPKs) y su participación en la proliferación de estas células. Los resultados demuestran que PTH estimula, en forma rápida y transitoria, igual que a ERK1/2 (estudios previos), la fosforilación y actividad de JNK1/2 en células intestinales de ratas jóvenes, siendo los efectos de la hormona dependientes del Ca2+ intra y extracelular. Con el envejecimiento los efectos de PTH sobre JNK1/2 disminuyen significativamente. La expresión proteica basal de JNK1/2 no difiere entre enterocitos de ratas jóvenes y seniles, no obstante su fosforilación basal es mucho más elevada en células intestinales de seniles explicando la menor activación de JNK1/2 en respuesta a la hormona con el envejecimiento. PTH no modifica ni la actividad ni la fosforilación basal de p38 MAPK en enterocitos de ratas jóvenes. Sin embargo, en seniles indujo la fosforilación de esta quinasa de manera dependiente del tiempo, siendo máxima a los 5 minutos de tratamiento. PTH incrementa la síntesis de ADN, siendo mayor la magnitud en enterocitos de ratas jóvenes (+30%) que en seniles (+18%). ERK1/2 y JNK1/2 participan en el efecto proliferativo de la hormona en enterocitos de ratas jóvenes. En seniles, además de estas dos vías, también participa p38 MAPK. En la línea celular Caco-2, el ATP induce la rápida fosforilación de ERK1/2, p46 JNK y p38 MAPK. Una vez activadas, ERK1/2 y JNK translocan al núcleo. La estimulación de las quinasas también se observó en presencia de UTP, UDP y ATPS sugiriendo la participación de los subtipos de receptores P2Y2, P2Y4, P2Y6 y probablemente P2Y11 en la activación purinérgica. Estudios de RT-PCR y la secuenciación de sus productos confirmaron la expresión de P2Y2 y P2Y4 en estas células. Se comprobó que el ATP aumenta la concentración de Ca2+ intracelular y, que en el mecanismo de activación de las MAPKs participan el Ca2+, Src, y en menor grado las vías AMPc/ PKA y PKC, y la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR). La activación de las MAPKs por ATP en las células Caco-2, contribuye a la fosforilación de los factores de transcripción ATF-1, ATF-2 y JunD e induce la expresión de c-Fos y miembros de la familia de Jun. Además las MAPKs participan en la inducción y en la fosforilación de la fosfatasa dual MKP-1, capaz de inactivar a ERK1/2, JNK1/2 y p38 MAPK mediante la desfosforilación de dos residuos críticos en el loop de activación. Finalmente, el ATP a través de las cascadas de señalización de las MAPKs estimula la proliferación (+27%) de las células Caco-2. En conjunto, estos estudios son aportes originales al conocimiento de los mecanismos de acción de PTH y ATP en células intestinales. La comprensión del deterioro de las funciones de PTH con el envejecimiento, y de las modificaciones inducidas por el ATP en células tumorales, nos permiten ampliar las bases moleculares de la regulación de la fisiología intestinal. / In the present study, we investigated the effects of parathyroid hormone (PTH) on duodenal enterocytes from young (3 months) and aged rats (24 months), and the role of adenosine triphosphate (ATP) on Caco-2 cells derived from colon adenocarcioma, on MAP kinases signaling cascades (MAPKs) and their involvement in cell proliferation. Our results show that, in intestinal cells from young rats, PTH induces a transient and rapid increment, as happens with ERK1/2 (previous studies), in JNK1/2 phosphorylation and activity, effects that depend on intra and extracellular calcium. PTH actions on JNK1/2 are significantly diminished with ageing. JNK1/2 basal protein expression is not different in the enterocytes from young and aged rats, however basal protein phosphorylation increases with ageing explaining the lower JNK1/2 activation in response to PTH in aged rats. The hormone does not change the basal phosphorylation and activity of p38 MAPK in young enterocytes. However, in cells from aged rats, it induced the phosphorylation of p38 MAPK in a time dependent manner, peaking at 5 min. PTH increased intestinal cells DNA synthesis, being the effect on young enterocytes (+30%) more pronounced than in aged ones (+18%). ERK1/2 and JNK1/2 participate in the proliferative role of the hormone in duodenal cells from young rats. In aged enterocytes, besides these two pathways, p38 MAPK is also involved. ATP induces the rapid phosphorylation of ERK1/2, p46 JNK and p38 MAPK in Caco-2 cells, which is followed by traslocation of active ERK1/2 and JNK into the nucleous. UTP, UDP and ATPS induce MAPKs phosphorylation, suggesting the involvement of P2Y2, P2Y4, P2Y6 and probably P2Y11 subtypes receptors in purinergic actions. ART-PCR studies and PCR product sequencing supported the expression of P2Y2 and P2Y4 in this cell line. ATP increases the intracellular calcium concentration. In addition ATP-induced phosphorylation of MAPKs in Caco-2 cells was dependent on calcium influx and intracellular calcium release, Src and partially dependent on the cAMP/PKA and PKC pathways and EGFR transactivation. MAPKs activation by ATP is involved in ATF-1, ATF-2 and JunD transcription factors phosphorylation and in c-Fos and Jun family members induction. Moreover, MAPKs participate in the induction and phosphorylation of the dual MKP-1 phosphatase, capable of inactivating ERK1/2, JNK1/2 and p38 MAPK through the dephosphorylation of two critical residues in the activation loop. Finally, ATP through MAPKs signaling cascades stimulates the proliferation (+27%) of Caco-2 cells. In summary, these studies are originals contributions to the knowledge of PTH and ATP mechanisms actions on intestinal cells. The comprehension of PTH functions deterioration with ageing, and of the modifications induced by ATP on tumoral cells, let us amplified the molecular bases of the regulation of intestinal physiology.