Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2015-05-14T16:59:10Z : No. of bitstreams: 1 000822140.pdf: 1942626 bytes, checksum: f2001c67bc6e7163aba1a6ffbdbcc496 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Staphylococcus aureus juntamente com outras espécies de estafilococos coagulase-negativa são importantes patógenos responsáveis por infecções nosocomiais associadas ao uso de dispositivos implantáveis. O fator mais importante na patogênese de infecções estafilocócicas associadas a estes dispositivos é a habilidade do patógeno de formar biofilme, que confere proteção contra o sistema imunológico do hospedeiro e da ação de antimicrobianos, sendo o Polissacarídeo de Adesão Intercelular (PIA) codificado pelo operon icaADBC o principal componente do biofilme estafilocócico. Esse estudo objetivou estudar a estrutura do biofilme de diferentes espécies de Staphylococcus, avaliar a antibioticoterapia utilizada para tratamento dessas infecções em células livres e em biofilme e alternativas para prevenção da formação de biofilme. Foram estudadas 200 amostras de Staphylococcus spp. sendo 50 da espécie S. aureus e 150 do grupo dos estafilococos coagulase-negativa (ECN), incluindo 50 amostras de S. epidermidis, 20 S. haemolyticus, 20 S. warneri, 20 S. hominis, 20 S. lugdunensis e 20 amostras de S. saprophyticus isoladas de pacientes do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB). As amostras foram submetidas à pesquisa dos genes icaADBC pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e à expressão pela técnica de Transcriptase Reversa-PCR (RT-PCR). A produção de biofilme foi verificada através dos métodos fenotípicos de aderência ao tubo de borossilicato e na placa de poliestireno. A determinação da concentração inibitória mínima em células planctônicas e em biofilme foi testada para as drogas oxacilina, vancomicina, eritromicina, gentamicina, linezolida e sulfametoxazol-trimetropim pelo método de microdiluição em caldo. O teste do peptídeo (RIP) na prevenção da formação de biofilme foi realizado com cultura de bactérias em TSB glicose 2% com pontas de cateteres e ... / Staphylococcus aureus, together with other coagulase-negative staphylococci (CoNS), is an important pathogen that causes nosocomial infections associated with the use of implantable devices. The most important factor in the pathogenesis of staphylococcal infections associated with these devices is the ability of the pathogen to form a biofilm, which protects bacteria against the host immune system and against the action of antimicrobial drugs. The main component of staphylococcal biofilms is polysaccharide intercellular adhesin (PIA), which is encoded by the icaADBC operon. The objectives of this study were to investigate the structure of biofilms of different Staphylococcus species, to evaluate the effect of antibiotics used to treat these infections on planktonic and biofilm cels, and to identify alternatives for the prevention of biofilm formation. A total of 200 Staphylococcus spp., including 50 S. aureus and 150 CoNS strains (50 S. epidermidis, 20 S. haemolyticus, 20 S. warneri, 20 S. hominis, 20 S. lugdunensis and 20 S. saprophyticus), isolated from patients seen at the University Hospital of the Botucatu School of Medicine (HC-FMB), were studied. The presence of the icaADBC genes was investigated by the polymerase chain reaction (PCR) and their expression was determined by reverse transcriptase-PCR (RT-PCR). Biofilm formation was evaluated using the phenotypic method of adherence to borosilicate tubes and polystyrene plates. The minimum inhibitory concentration (MIC) of oxacillin, vancomycin, erythromycin, gentamicin, linezolid and sulfamethoxazole-trimethoprim for planktonic and biofilm cells was determined by the broth microdilution method. The effect of RNA-inhibiting peptide (RIP) on the prevention of biofilm formation was tested using bacterial cultures grown in TSB-2% glucose containing catheter tips and visualization by scanning electron microscopy and on polystyrene plates. The icaA gene was detected by PCR in 97 (48.5%) ... / FAPESP: 11/07285-5

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / El Sistema Nacional de Áreas Silvestres Protegidas del Estado de Chile (SNASPE), administrado por la Corporación Nacional Forestal (CONAF), representa el 20% de la superficie de Chile y cobija al 87% de las especies de fauna vertebrada del país, asumiendo gran importancia en el ámbito de la conservación in situ de fauna endémica y nativa del territorio nacional. Una de las amenazas de importancia para la fauna silvestre es la presencia de enfermedades transmisibles y transmisión de patógenos, los cuales provienen posiblemente de la interacción con animales domésticos y/o introducción de especies exóticas invasoras a las Áreas Silvestres Protegidas (ASP), entre otros factores. Existen diversas investigaciones científicas que dan cuenta de patógenos presentes en fauna silvestre, sin embargo, ninguna que reúna todos estos reportes en un sólo documento. Es por esto que el objetivo del presente estudio es generar un catastro y registro de la distribución de patógenos identificados en mamíferos nativos amenazados de Chile, asociándolos al Sistema Nacional de Áreas Silvestres Protegidas del Estado. La metodología se llevó a cabo en cuatro etapas: 1) Selección de especies de mamíferos nativos presentes en ASP, que presenten algún grado de amenaza, según su categoría de conservación e importantes dentro de la conservación de la fauna chilena al ser también consideras especies icónicas, 2) Catastro y sistematización de los patógenos identificados en los mamíferos nativos seleccionados, según criterios específicos, 3) Georreferenciación de los patógenos identificados en mamíferos nativos seleccionados, asociando cada registro a la ASP más cercana, y 4) Generación de mapas cartográficos de la presencia de los patógenos identificados por especie. Se recopilaron un total de 135 reportes de patógenos en 10 especies de mamíferos, registrando 41 tipos diferentes de patógenos, asociados a 21 ASP. Los patógenos de mayor relevancia en las especies estudiadas fueron: Corynebacterium pseudotuberculosis en Hippocamelus bisulcus, Mycobacterium avium, susp. paratuberculosis en Pudu pudu y Lama guanicoe, Parvovirus Canino y Virus Distémper Canino en Lycalopex sp., Sarcoptes scabiei en Vicugna vicugna y Virus de la leucemia felina y Virus de la inmunodeficiencia felina en Leopardus guigna, entre otros. La mayoría de los patógenos registrados también se encuentran en animales domésticos, pudiendo sugerir que estos cumplen un rol importante en la persistencia de estos patógenos en las poblaciones de animales silvestres. Se concluye que más estudios son necesarios para comprender mejor la epidemiologia de los patógenos presentes en fauna silvestre y el real efecto e influencia de los animales domésticos sobre la salud en los espacios naturales, pudiendo ser potentes factores que están alterando paulatinamente el normal equilibrio de los ecosistemas y, en consecuencia, la salud y conservación de especies animales silvestres nativas del país / The National System of Protected Wild Areas of the State of Chile (SNASPE), administered by the National Forestry Corporation (CONAF), represents 20% of the The National System of Protected Wild Areas of the State of Chile (SNASPE), the administrator of the National Forestry Corporation (CONAF), represents 20% of the surface of Chile and 87% of the species of vertebrate fauna of the country, assuming great importance in the field of in situ conservation of the endemic and native fauna of the national territory. One of the threats of importance to wildlife is the presence of transmissible diseases and transmission of pathogens, information on the relationships of animals and/or the introduction of invasive exotic species to the Protected Wildlife Areas (ASP), among others. Factors There are numerous scientific investigations that account for pathogens present in wildlife, however, not all of these reports are gathered in a single document. The objective of this study is to generate a cadastre and a register of the distribution of pathogens in the threatened native animals of Chile, associating them with the National System of Protected Wild Areas of the State. The methodology was carried out in four stages: 1) Selection of species of native animals present in ASP, which will be presented in some degree of threat, according to their category of life care services, 2) Cadastre and systematization of the pathogens in the selected native mammals, according to the specific criteria, 3) Georeferencing of the pathogens in the selected native mammals, associating each record in the closest ASP, and 4) Generation of cartographic maps of the presence of pathogens by species. A total of 135 reports of pathogens in 10 mammal species will be collected, recording 41 different types of pathogens, associated with 21 ASPs. The most relevant pathogens in the species studied were: Corynebacterium pseudotuberculosis in Hippocamelus bisulcus, Mycobacterium avium, susp. paratuberculosis in Pudu pudu and Lama guanicoe, Canine Parvovirus and Canine Distemper Virus in Lycalopex sp., Sarcoptes scabiei in Vicugna vicugna and Feline Leukemia Virus and Feline Immunodeficiency Virus in Leopardus guigna, among others. Most of the registered pathogens are also found in domestic animals, which may suggest that they play an important role in the persistence of these pathogens in wild animal populations. It is concluded that more studies are necessary to better understand the epidemiology of pathogens present in wildlife and the real effect and influence of domestic animals on health in natural spaces, being able to be powerful factors that are gradually altering the normal equilibrium of the ecosystems and, consequently, the health and conservation of wild animal species native to the country / Financiamiento: Convenio Favet-Conaf

Em condições de normalidade o cemento e o esmalte atuam como barreira protetora da dentina e do tecido pulpar. Entretanto fatores etiológicos mecânicos, químicos e microbianos podem determinar a perda dessa proteção, conseqüentemente expondo a dentina e, eventualmente, o tecido pulpar ao ambiente bucal, viabilizando sua contaminação. O complexo dentino-pulpar pode reagir de diversas formas a presença de microorganismos, entretanto, quando alterações inflamatórias irreversíveis enfim sucedem-se provocam uma desordem tecidual na região periapical denominada de periodontite apical. A terapia das periodontites apicais deriva de um correto diagnóstico, o qual se encontra na dependência do conhecimento da natureza e complexidade das infecções endodônticas. Inúmeras pesquisas delinearam o tipo de microbiota presente em condição de periodontite apical crônica nos dentes completamente formados. Todavia nenhum estudo investigou os tipos de microorganismos presentes em canais radiculares de dentes jovens portadores de periodontite apical crônica, onde diferenças anatômicas, histológicas e morfofuncionais poderiam afetar as características do processo infeccioso. O presente estudo tem por objetivo delinear a característica microbiológica de canais radiculares de dentes permanentes jovens portadores de infecção primária. Foram selecionados 12 pacientes com necessidade de tratamento endodôntico em um ou mais dentes unirradiculares, portadores de rizogênese incompleta, diagnóstico clínico de necrose pulpar, em decorrência de injúria traumática, e condição de infecção endodôntica primária. Após o acesso, dezenove espécimes microbiológicos foram obtidos do interior dos canais radiculares com auxílio de cones de papel, os quais foram transferidos, imediatamente, para frascos contendo 2 mL de meio de transporte pré-reduzido VMGA III. As amostras foram diluídas e semeadas em placas do tipo Petri contendo meios de cultura seletivos para detecção de espécies de enterococos, de espécies de leveduras e para crescimento de bactérias totais. As placas semeadas foram incubadas em tempo e temperatura adequados ao crescimento dos microorganismos alvo. Ao final do período de incubação foi realizada uma análise quantitativa do crescimento microbiano presente segundo a contagem das unidades formadoras de colônias. Microorganismos anaeróbios foram recuperados de todos os canais e o número médio de células por canal foi de 5,7 x 106. Quatro amostras (21,05%) evidenciaram o crescimento de Bacteroides produtores de pigmento negro e número médio de células por canal foi de 6,5 x 105. Um espécime (5,25%) exibiu o crescimento de espécies de enterococos e o número médio de células neste canal foi de 1,5 x 104. / Normally cement and enamel act as protective barrier to the dentin and the pulp. However, mechanical, chemical and microbial factors should destroy this protection and display the dentin and, even the pulp, to the oral environment, making possible their contamination. The pulpo-dentin complex reacts in different forms at the presence of microorganisms. However, when irreversible inflammatory alterations are succeeded, they occasion a tecidual clutter on periradicular region. The therapy of periradicular pathosis results from a correct diagnostic, which depends on the knowledge of the nature and complexity of endodontic infections. Several studies have been conducted to disclose microorganisms in the root canal system and/or to investigate the structure of the root canal microbiota in chronic periodontits in teeth completely formed. However there is no information on the microbiology of primary endodontic infection in young teeth where anatomic, histologic and morfologic differences could affect the characteristics of the infectious process. The aim of the current study was to investigate the microbiological status of the root canals from permanent young teeth with primary endodontic infection. Twelve patients with the need for endodontic treatment participated in the study. The selected teeth (one or more tooth per patient) were uniradicular, containing a single root canal and an incomplete root formation, their pulp chamber was without visual communication with the oral fluid, they presented with untreated necrotic pulp, and showed radiographic evidence of periapical periodontits. After the access, nineteen microbiological samples were obtained from the root canals with sterile paper points. Afterwards, the paper points were pooled in a sterile tube containing 2mL of pre-reduced transport fluid (VMGA III). The samples were diluted and spread onto plates with selective medium for enterococcus (agar m-Enterococcus) and for yeast species (agar Sabouraud-dextrose) and onto plates with nonselective medium (agar Brucellasangue). A quantitative analysis was performed. The mean number of cultivable bacterial cells in the root canals was 5,7 x 106. In four samples (21.05%) Black Pigmented Bacteroides species were recovered and the mean number of cells was 6,5 x 105. One specimen (5.25%) showed the growth of enterococos species and the mean number of cells in this case was of 1,5 x 104.

Orientador: Juliane Araújo Greinert Goulart. / Dissertação (Mestrado em Engenharia Ambiental) - Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Centro de Ciências Tecnológicas.

O Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais prevalente na América Latina. Este trabalho teve como objetivo atenuar a forma leveduriforme do P. brasiliensis por irradiação gama para estudos posteriores na pesquisa de vacina. Atualmente não há nenhuma vacina eficaz. As culturas do P.brasiliensis (cepa Pb-18) foram irradiadas com doses entre 0,5 e 8,0kGy. Depois de cada dose os fungos foram plaqueados e após 10 dias as unidades formadoras de colônias (UFC) contadas. A viabilidade das células irradiadas foi avaliada utilizando-se os corantes verde Janus e azul de metileno. A síntese de proteína foi analisada pela incorporação 35S- Metionina. A comparação entre o perfil antigênico das leveduras controle e irradiadas foi feita através do Western blot e a atenuação da virulência foi analisada através da inoculação dessas leveduras em camundongos C57Bl/J6 and Balb/c. Mudanças morfológicas nas leveduras irradiadas foram avaliadas por microscopia eletrônica (transmissão e varredura), e a integridade do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose. Na dose de 6,5kGy as leveduras perderam a capacidade reprodutiva. A viabilidade e a incorporação de 35S- Metionina foi similar nos controles e nas células irradiadas com 6,5kGy, mas nesta dose as leveduras secretaram 40% menos proteína. O DNA apresentou-se degradado e esse dano não foi reparado O perfil do Western blot das leveduras controle, foi idêntico aos das leveduras irradiadas com 6,5kGy. Nenhuma UFC foi recuperada dos tecidos dos camundongos infectados com a levedura radioatenuada. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou significativas alterações no núcleo das células irradiadas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que duas horas após a irradiação as células apresentavam-se colapsadas e com dobras profundas na superfície das células, entretanto esses danos foram reversíveis. Concluiu-se que para as células leveduriformes do P. brasiliensis foi possível encontrar uma dose na qual o patógeno perdeu sua capacidade reprodutiva e virulência, enquanto reteve sua viabilidade, atividade metabólica e perfil antigênico. / Paracoccidioides brasiliensis is the agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent mycosis in Latin America, and currently there is no effective vaccine. The aim of this work was to attenuate the yeast form of P. brasiliensis by gamma irradiation for further studies on vaccine research. P. brasiliensis (strain Pb-18) cultures were irradiated at doses between 0.5 and 8.0kGy. After each dose the fungal cells were plated and after 10 days the colony forming units (CFU) counted. The viability of the irradiated cells was measured using the dyes Janus green and methylene blue, and protein synthesis by incorporation of L 35S methionine. The comparison between the antigenic profile of irradiated and control yeast was made by Western blot and the virulence evaluated by the inoculation in C57Bl/J6 and Balb/c mice. Morphological changes in irradiated yeast were evaluated by electronic microscopy and DNA integrity by electrophoresis in agarose gel. At 6.5kGy the yeast lost the reproductive capacity. The viability and the incorporation of L-35S methionine were the same in control and up to 6.5kGy irradiated cells, but 6.5kGy irradiated yeast secreted 40% less proteins. The Western blot profile was clearly similar in control and 6.5kGy irradiated yeast. No CFU could be recovered from the tissues of the mice infected with the radioattenuated yeast. At the dose of 6.5kGy the DNA was degraded and this damage was not repaired. The transmission electronic microscopy showed significant alterations in the nucleus of the irradiated cells. The scanning electronic microscopy showed that two hours after the irradiation the cells were collapsed or presented deep folds in the surface, however these injury were reversible. We concluded that for P. brasiliensis yeastcells it was possible to find a dose in which the pathogen loses its reproductive ability and virulence, while retaining its viability, metabolic activity and the antigenic profile.

A contagem celular é uma técnica empregada para se monitorar a reprodução de células em meios de cultivo de interesse em ensaios biológicos. Um sistema de análise por injeção em fluxo foi desenvolvido para a contagem de células como uma alternativa ao sistema convencional, câmara de Neubauer. O método é baseado na proporcionalidade entre o sinal de sulfato de bário e das células. Apesar das diferenças nas propriedades físicas, foi possível estabelecer uma relação entre os sistemas de fluxo. No sistema FIA para determinação de sulfato, foi obtida a seguinte equação para curva analítica: S = 0,0087Csulfato + 0,000458. Para o Saccharomyces cerevisiae a curva analítica obtida foi S = 4,01 x 10-11CS.cerevisiae + 0,0018 e a relação entre os sistemas foi CS.cerevisiae = 2,17 x 108CSulfato + 0,002258. Os limites de detecção e quantificação foram, respectivamente, 2,37 x 108 células L-1 e 7,90 x 108 células L-1. O método foi comparado com os resultados obtidos na câmara de Neubauer e não existiram diferenças significativas a um nível de confiança de 95% (teste-t pareado). A determinação com a câmara de Neubauer apresentou menor precisão que o sistema FIA. Além disso, o método permite a monitoração do crescimento microbiano. As principais vantagens do sistema FIA foram a alta freqüência, a seletividade, exatidão e repetibilidade satisfatórias / Cell count is a procedure that has been used in screening of cell reproduction in different types of inquiry and science areas. A system of flow injection analysis (FIA) was developed for cell counting how an alternative to conventional system, the Neubauer Chamber. The method is based on the proportionality between the barium sulfate and the cell signals. In spite of differences in the physical properties, it was possible to establish a relationship among the flow systems. In the sulfate FIA system, it was obtained the following equation for calibration curve: (S 0.0087Csulfate + 0.000458). The Saccharomyces cerevisiae calibration curve obtained was: S = 4,01 x 10-11CS.cerevisiae + 0.0018 and the relationship between the systems was: CS.cerevisiae = 2,17 x 108CSulfate + 0.002258. The limits of detection and quantification was respectively equal to 2.37 x 108 cells L-1 and 7.90 x 108 cells L-1. The method was compared with results obtained in the Neubauer chamber and there was no significant difference at confidence level of 95% (paired t-test). The determination with classical Neubauer chamber presented lower precision than the FIA system. Besides this, the method has permitted the screening of microbial proliferation. The main advantages of FIA system were the high analytical frequency, the selectivity, accuracy and repeatability satisfactory

Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno humano oportunista que causa graves infecções em pacientes imunocomprometidos e em pacientes portadores de fibrose cística (FC). O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de nanopartículas de albumina sérica bovina associadas aos antígenos totais de P. aeruginosa em proteger camundongos do desafio pela via nasal por este patógeno. Camundongos foram imunizados pela via subcutânea usando antígenos totais de P. aeruginosa, nanopartículas vazias ou nanopartículas associadas aos antígenos totais de P. aeruginosa nos dias 0, 7 e 14. A produção de anticorpos IgG total e os subtipos IgG1 e IgG2a foram avaliados por ELISA. Os camundongos imunizados foram desafiados com P. aeruginosa e os pulmões foram coletados para estudos histopatológicos e detecção da bactéria no pulmão. Nossos resultados mostram que camundongos imunizados com nanopartículas associadas aos antígenos totais de P. aeruginosa produziram altos títulos de anticorpos IgG1 anti-P. aeruginosa e títulos significativos de IgG2a. Os dados também mostram que camundongos imunizados com nanopartículas associadas aos antígenos totais de P. aeruginosa e desafiados com a bactéria apresentaram diminuição dos sinais inflamatórios, com uma redução significativa na intensidade e concentração de células inflamatórias, diminuição da hemorragia, sinais de edema e hiperemia nos pulmões se comparado aos outros grupos. A bactéria não foi detectada nos pulmões dos animais imunizados e infectados nos tempos analisados. Portanto, essa formulação é capaz de induzir uma resposta protetora nos animais infectados, sendo portanto, uma promissora plataforma para vacinas contra P. aeruginosa. / Pseudomonas aeruginosa is an important opportunistic human pathogen that causes severe infections in immunocompromised patients and also in cystic fibrosis patients. The aim of this work was to evaluate the ability of bovine serum albumin nanoparticles with entrapped antigens extracted from P. aeruginosa to protect mice from intranasal challenge with this pathogen. Mice were immunized via the subcutaneous route using P. aeruginosa antigens, empty nanoparticles or nanoparticles with entrapped P. aeruginosa antigens on days 0, 7 and 14. The total IgG antibody production and specific IgG1 and IgG2a titer were measured by ELISA. Immunized mice were challenged with live P. aeruginosa and their lungs were collected for histopathology studies and for detection of bacteria in their lungs. Our data showed that NPPa-vaccinated mice presented a high anti-Pseudomonas IgG1 and a low IgG2a antibody titles and decreased inflammatory signs, with significant reduction in intensity and concentration of inflammatory cells, lower hemorrhagic, edema and hyperemia signs in the lungs of challenge mice with live P. aeruginosa if compared to the other groups. The bacteria was not detected in the lungs from infected mice in the analyzed time. Therefore, this formulation is able to induce a functional response in an animal model of infection and thereby it is a promising platform for P. aeruginosa vaccines. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

A dengue é um dos principais problemas de saúde publica do mundo, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais. Apesar da magnitude do problema, ainda existem limitações relacionadas ao diagnóstico, devido à presença de resultados falsos negativos, muitas vezes apresentados nos laudos laboratoriais. Estudos com a proteína do envelope são extremamente importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e testes de diagnóstico. Os métodos sorológicos são importantes para o diagnóstico das infecções por dengue, entre eles, o imunoensaio enzimático para detecção de IgM contra o vírus da dengue. Neste estudo, 82 amostras de soro de pacientes com suspeita de dengue foram classificadas como positivas ou negativas utilizando o kit comercial Panbio ELISA de Captura Dengue IgM. O desempenho do ensaio do kit comercial foi comparado com os novos ensaios ELISA indireto usando três peptídeos sintéticos derivados da proteína E como substrato. De um total de 82 amostras de soro, (52,4%) foram positivas pelo kit comercial Panbio Dengue IgM ELISA de Captura, 18 (21,9%) apresentaram reatividade contra Pep1, 40 (48,7%) contra o Pep2 e 66 (80,4%) contra Pep3. Entre as amostras de soro classificadas como positivas pelo kit comercial (42), 11 (26%), também foram classificadas como positivas usando o peptídeo Pep1. Vinte e duas (52,3%), utilizando o Pep2 e 40 (95,23%) utilizando Pep3. Entre as amostras classificadas como negativas por meio do kit comercial (40), 28 (70%) foram classificadas como negativas usando como substrato o Pep1, vinte 20 (50%) utilizando como substrato o Pep2 e 13 (32,5%), utilizando como substrato Pep3. Os resultados demonstram que os peptídeos sintéticos podem ter potencial biotecnológico para o desenvolvimento de novas vacinas, tratamentos e testes de diagnósticos. / Dengue is a major public health problem worldwide, especially in the tropical and subtropical regions of the world. Despite the magnitude of the problem, there are still limitations related to the diagnosis, due to the presence of false negative results often presented in the laboratory reports. Studies using the envelope protein are extremely important for the development of new vaccines and new diagnostic tests. Serological methods are important for the diagnosis of dengue infections, and among them, the enzyme linked immunoassay that detects IgM against Dengue virus is very employed. In this study, a panel of 82 serum samples from dengue suspected patients was classified as positive and negative using the commercial ELISA kit Panbio Capture Dengue IgM. Assay performance of the commercial kit was compared with the new indirect ELISA assays using synthetic peptides derived from E protein (Pep1, Pep2 and Pep3) as substrate. Of a total of 82 serum samples, (52.4%) were positive by the commercial ELISA kit Panbio Capture Dengue IgM, 18 (21,95%) showed reactivity against Pep1; 40 (48,78%) against Pep2 and 66 (80,48%) against Pep3. Among the serum samples classified as positive by the commercial kit (42), 11 (26%) are also classified by positive using Pep1 as substrate, 22 (52,3%) using Pep2 as substrate and 40 (95,23%) using Pep3 as substrate. Among the samples classified as negative by the commercial kit (40), 28 (70%) were also classified as negative using Pep1 as substrate, 20 (50%) using Pep2 as substrate and 13 (32.5%) using Pep3 as substrate. The results showed that the synthetic peptides can have biotechnological potential for the development of new vaccines and treatments and diagnostic tests. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o principal causador da tuberculose (TB), continua a representar um grave problema de saúde pública, principalmente em países de baixa e média renda. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mtb, com aproximadamente oito milhões de casos novos e quase três milhões de mortes anualmente por TB. Após a infecção pelo Mtb, a resposta imune desempenha papel preponderante para impedir o inicio da doença infecciosa, a TB, bem como de seu curso. Assim, os oxidantes (espécies reativas do oxigênio/nitrogênio [EROs/ERNs]) gerados no burst oxidativo de células fagocíticas como, os neutrófilos, são essenciais para uma efetiva resposta ao patógeno. O uso indiscriminado de suplementação antioxidante, atualmente muito comum entre a população, ou o uso terapêutico durante o tratamento da TB, poderia comprometer a resposta imune frente às micobactérias, portanto, predispondo a uma maior susceptibilidade ao Mtb e/ou TB. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar ex vivo a influência do antioxidante sintético da classe dos nitróxidos, o 4-Hidroxi-2,2´,6,6´-tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol), sobre a resposta microbicida de neutrófilos contra M. tuberculosis. Neutrófilos humanos foram isolados por gradiente de densidade a partir de sangue total de voluntários saudáveis. Para avaliar o burst oxidativo na ausência ou presença do Tempol, M. tuberculosis H37Ra (ATCC 35177) foi incubado a 37 ºC com neutrófilos a multiplicidades de infecções (MOI) variando de 1 a 100. A liberação de anions superóxido (O2•-) pelos neutrófilos foi avaliada através do ensaio de redução do citocromo c. O ensaio de quimioluminescência amplificada com o Luminol foi utilizado para avaliar EROs/ERNs total e com Isoluminol para extracelular. Complementarmente, o ensaio de killing foi realizado para verificar a capacidade microbicida total dos neutrófilos tratados ou não com Tempol. Neste teste, foi adotado o protocolo "dois passos", em que, Mtb foi incubado com neutrófilos (por 10, 30 e 90 min a 37 ºC) e, através de uma centrifugação diferencial (100 x g, 5 min) e lise dos neutrófilos com H2O pH 11, as micobactérias intracelular e extracelular foram quantificadas e os resultados reportados em Unidades Formadoras de Colônia (UFC), após uma incubação das micobactérias por 21 dias a 37 ºC. Através deste protocolo, as taxas de fagocitose (Kp) e morte intracelular (Kk) do Mtb foram calculadas. Paralelamente foi avaliada a possível atividade tóxica do Tempol sobre neutrófilos, tendo sido observado que Tempol a uma concentração de 500 µM não foi citotóxico. O burst oxidativo dos neutrófilos contra Mtb foi significativamente diminuído na presença do Tempol (450 µM, p < 0,05) para todos os oxidantes avaliados. Esta concentração também foi capaz de diminuir a capacidade microbicida dos neutrófilos, em que o número de UFC de M. tuberculosis no grupo tratado com Tempol foi significativamente maior que no grupo controle (p < 0,05). Curiosamente, Tempol diminuiu o KK dos neutrófilos, mas não teve nenhum efeito sobre a seu Kp. Este estudo fornece informações sobre a influência de antioxidantes sobre a resposta imune contra o M. tuberculosis, de modo que as implicações clínicas para a prevenção e tratamento da tuberculose deve levar em conta estes achados. / Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the main cause of tuberculosis (TB), remains as a serious public health problem, chiefly in low- to middle-income countries. It is estimated that about one-third of the world's population has latent TB, with about eight million new cases and roughly three million deaths each year from TB. The innate immune response following Mtb infection plays a crucial role in preventing the onset of active TB, as well as its course. Thus, phagocytes-derived reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) during the oxidative burst (e.g., generated by neutrophils) are essential to an effective response to the pathogen. The indiscriminate use of antioxidant supplements, currently very common among the population, or their use as adjuvant therapy during TB treatment, could compromise the immune response to Mtb accordingly potentially increasing the host's susceptibility to Mtb/TB. In this context, the aim of this study was to investigate the ex vivo effect of the cyclic nitroxide tempol (4-hydroxy-2,2,6,6-tetra-methyl-1-piperidinyloxy), an antioxidant with superoxide dismutase mimetic properties, on the microbicide response of neutrophils against M. tuberculosis. Human neutrophils were isolated from venous blood of healthy volunteers by Ficoll density gradient centrifugation. To assess the oxidative burst in the absence or presence of Tempol, M. tuberculosis H37Ra (ATCC 35177) was incubated at 37 ° C with neutrophils at multiplicity of infection (MOI) ranging from 1 to 100. ROS generation (O2•-) by neutrophils was evaluated by using the cytochrome c reduction assay. The total and extracellular ROS were determined using the luminol- and Isoluminol-amplified chemiluminescence assay. Complementarily, the killing assay was performed to check the total microbicide capacity of neutrophils treated or not with Tempol. In this test, the "two-step" protocol was adopted in which, Mtb was incubated with neutrophils (for 10, 30, and 90 min at 37 °C) and, by differential centrifugation (100 x g 5 min) and lysis of neutrophils with H2O pH 11, the intracellular and extracellular mycobacteria were incubated for 21 days at 37 ° C and, mycobacteria were quantified and results the ensuing reported as number of Colony Forming Units (CFU). Through this protocol, were calculated the phagocytosis (Kp) and intracellular killing (Kk) rates for M. tuberculosis. The possible toxic activity of Tempol was evaluated on neutrophils and, was observed that 500 µM tempol was not cytotoxic. The oxidative burst of neutrophils against Mtb was significantly decreased in the presence of 450 µM Tempol, for all evaluated oxidants (p < 0.05). Treatment of neutrophils with 450 µM Tempol decreased the total microbicidal activity against M. tuberculosis, since colony-forming units of these mycobacteria in the treated group were significantly higher than those for the untreated group (p < 0.05). Strikingly, Tempol (450 µM) decreased the kk of neutrophils, but had no effect on their kp. This study provides insights of the influence of antioxidants on the immune response to M. tuberculosis, so that clinical implications for the prevention and treatment of TB should take into account these findings. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

As infecções fúngicas se tornaram um grande problema de saúde pública, especialmente em ambientes hospitalares. Candida spp. são os principais patógenos em infecções fúngicas invasivas. A produção de aspartato proteases secretadas (Sapp) por Candida spp. pode estar relacionado com o aumento do número de infecções e resistência aos medicamentos. A produção de proteases é codificada por uma família de 10 genes SAP1-10, sendo SAP2 o gene mais comumente expresso em Candida albicans. A expressão de SAP4 está associada à produção de enzimas Sap4p e formação de hifas que podem contribuir para a invasão dos tecidos hospedeiros e destruição de macrófagos em processos infecciosos. Este trabalho avaliou a expressão dos genes SAP2 e SAP4 em C. albicans ATCC 10231 cultivadas na presença ou ausência de macrófagos e expostas a concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. Candida albicans foi cultivada em ágar Sabouraud Dextrose a 37ºC por 24 h, e posteriormente em caldo carbono levedura base enriquecido com soro-albumina bovina (YCB-BSA), e na ausência ou presença de concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. A linhagem celular monocítica humana de origem leucemia (THP-1) foi cultivada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml) a 37ºC, sob atmosfera de 5% de CO2 durante 10 dias. Para a indução da diferenciação das células, 106 monócitos foram cultivados em meio RPMI-1640 suplementado e forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) 100 nM durante 48 h. Foram utilizadas amostras de 5x106 C. albicans cultivadas na presença ou ausência de 106 macrófagos e expostas ou não a concentrações subinibitórias de antifúngicos. A amostras foram cultivadas em placas de cultura celular com 6 poços por 1 h a 37 °C, sob atmosfera de 5% de CO2. O RNA total foi extraído das amostras utilizando o reagente TRIzol®, após a purificação do RNA com DNase I, este foi convertido em cDNA, e, em seguida, a quantificação do gene SAP4 foi realizada por Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa (qPCR) utilizando ACT1 como gene normalizador. Candida albicans cultivada na presença de macrófagos apresentou regulação positiva na expressão de SAP2 e SAP4 (p < 0,01), respectivamente, na ordem de 4,83 e 10,34 vezes maior se comparada com amostras da levedura cultivada sem contato com macrófagos. E ainda, a exposição de C. albicans a concentrações subinibitórias de fluconazol aumentou a expressão de SAP2 e diminuiu a expressão de SAP4, já a exposição da levedura a concentrações subinibitórias de anfotericina B diminuiu a expressão de SAP2 e SAP4. Os genes SAP2 e SAP4 são relacionados como fatores de virulência de C. albicans e sua expressão pode ser regulada pelo contato com fagócitos ou exposição a antifúngicos. Portanto, compreender a expressão desses genes na patogênese fúngica pode ajudar na pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento da candidíase, contribuindo assim para a redução da incidência de morbidade e mortalidade associada a infecções fúngicas. / Fungal infections have become a major public health problem especially in hospital settings. Candida spp. are considered the main pathogen in invasive fungal infections. The production of secreted aspartic proteinases (Sapp) by Candida spp. can be related to the increase in the number of infections and drug resistance. The production of proteinases is encoded by a family of 10 genes known as SAP1-10, of which, SAP2 is the most commonly expressed gene in Candida albicans. The expression of SAP4-6 is associated to the production of Sap4-6p enzymes and hyphae formation which can contribute to the invasion of host tissues and destruction of macrophages during infectious processes. This study evaluates SAP2 and SAP4 gene expression in C. albicans ATCC 10231 grown in the presence or absence of macrophages and exposed to subinibitory concentrations of fluconazole and amphotericin B. C. albicans was grown in Sabouraud Dextrose Agar for 24 h at 37ºC and after in yeast carbon base more 0.2% bovine serum albumin (YCB-BSA) in the absence or presence of subinibitory concentrations of Fluconazole and Amphotericin B. The human monocytic leukemia cell line (THP-1) was grown in RPMI-1640 Medium supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin (100U/ml) and streptomycin (100μg/ml) at 37 °C and atmosphere of 5% CO2 during 10 days. For the induction of cell differentiation, 106 cells were seeded in RPMI-1640 medium supplemented and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 100 nM for 48 h. The samples of 5x106 C. albicans were cultured in the presence or absence of 106 macrophages and these was exposed or not to subinibitory concentrations of antifungals. All samples were incubated in culture test plates with 6 flat-botton wells for 1 h at 37 °C and atmosphere of 5% CO2. Total RNA was extracted from the samples using TRIzol® reagent, after RNA purification with DNaseI it was converted to cDNA, and then, the relative quantification of the SAP4 gene was performed by Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) using ACT1 gene as normalizing endogenous gene. Candida albicans grown in the presence of macrophages showed upregulation in the expression of SAP2 and SAP4 (p < 0.01), respectively, in the order of 4.83 and 10.34 fold higher as compared to yeast samples grown without contact with macrophages. Concerning exposure to antifungal agents, C. albicans exposed to subinhibitory concentrations of amphotericin B showed downregulation in expression of SAP2 and SAP4. However, the yeast's exposure to subinhibitory concentrations of fluconazole caused upregulation in SAP2 expression and downregulation in SAP4 expression. SAP2 and SAP4 genes are related to virulence factors of C. albicans and its expression can be regulated by contact with phagocytes or exposure to antifungals. Therefore, understanding the expression of these genes in fungal pathogenesis may aid in research and development of new drugs for treating candidiasis, thus contributing to reducing the incidence of morbidity and mortality associated with fungal infections. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES