A enzima aldeído desidrogenase 2 (ALDH2), localizada na matriz mitocondrial, é crucial na manutenção do balanço intracelular de aldeídos. Atualmente, estima-se que 8% da população mundial apresentam uma mutação pontual no gene da ALDH2 (E487K, ALDH2*2) que confere perda de até 95% na atividade enzimática. No presente projeto utilizamos camundongos knock-in ALDH2*2 para avaliar o impacto da mutação ALDH2 (E487K) na disfunção cardíaca induzida pelo infarto do miocárdio. Observamos que os animais mutantes possuem a atividade da ALDH2 reduzida e desenvolvem disfunção cardíaca e remodelamento ventricular semelhante aos animais selvagens após infarto do miocárdio. Porém, os animais com a mutação E487K possuem uma significante redução no consumo de oxigênio basal (respirometria), máximo (teste físico até a exaustão) e em mitocôndria cardíaca isolada, quando comparados aos animais selvagens. Por fim, o tratamento sustentado com Alda-1 (ativador da ALDH2) foi efetivo em restaurar a função cardíaca dos animais infartados, independente do genótipo. / Aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2), located in the mitochondrial matrix, is critical for the maintenance of cellular redox balance by removing reactive aldehydes produced during oxidative stress. It is estimated that 8% of the world population have a point mutation in the ALDH2 gene (E487K), which reduces its enzymatic activity by 95%. Here, we study the impact of the E487K variant of ALDH2 on myocardial infarction-induced heart failure, using ALDH2 E487K knock-in mice. We observed that mice carrying the ALDH2 variant have reduced ALDH2 activity and protein levels compared to WT mice. Despite of reduced oxidative metabolism, animals with ALDH2 mutation develop cardiac dysfunction and ventricular remodeling equivalent to WT animals after myocardial infarction. Finally, sustained Alda-1 treatment (ALDH2 activator) during 6 weeks improved cardiac function of infarcted animals, regardless of genotype.

A principal fonte de proteínas para alimentação humana e animal é fornecida pelas sementes de cereais e leguminosas. O conteúdo de aminoácidos solúveis em endospermas de milho normal e mutantes opaco-2 e floury foram determinadas por HPLC. A análise indicou que a concentração total de aminoácidos solúveis variou entre os mutantes e seus tipos selvagens. Nos mutantes o10, o11 e o13, as concentrações foram aumentadas significativamente quando comparadas ao tipo selvagem W22, enquanto os mutantes o1, o2, o13, fl1 e fl2 exibiram baixas concentrações em relação ao seu respectivo tipo selvagem Oh43. Resultados similares foram obtidos para os mutantes o5, o7 e fl3 em relação aos seus tipos selvagens (B79, B37 e WT3, respectivamente). Para metionina, o mutante o2 e o tipo selvagem Oh43 apresentaram as mais altas concentrações deste aminoácido. Diferenças significativas não foram observadas para os outros aminoácidos analisados, tais como lisina e treonina. Os resultados sugerem que as altas concentrações sugeridas originalmente para estes mutantes devem ser devidas aos níveis destes aminoácidos incorporados nas proteínas de reserva, mas não na forma solúvel. / For human nutrition the main source of vegetable proteins are cereal and legume seeds. The content of total soluble amino acids in mature endosperms of wildtype and maize opaque and floury mutants have been determined by HPLC. The total absolute concentration of soluble amino acids among the mutants and their wild-type counterparts varied depending on the mutant. In the o10, o11 and o13 mutants the concentrations were significantly increased when compared to their wild-type counterpart W22, whereas the mutants o1, o2, o13, fl1 and fl2 exhibited lower concentrations when compared to the wild-type Oh43, Similar results were observed for o5, o7 and fl3 in relation to their specific wild-type counterparts (B79, B37 and WT3, respectively). For soluble methionine content, o2 and Oh43 exhibited the highest concentrations. Significant differences were not observed for other amino acids such as lysine and threonine. The results suggest that the high-lysine concentrations indicated originally for these mutants must be due to the amino acids incorporated into storage proteins, but not in the soluble form.

A síndrome de Sotos (MIM 117550) é caracterizada pelo crescimento pré e pós-natal acelerado, fácies típica com testa proeminente, hipertelorismo, estrabismo, fissura palpebral antimongolóide, as orelhas grandes, o palato alto e estreito, mãos e pés grandes e possibilidade de erupção prematura dos dentes. É também freqüentemente associada com anomalias cerebrais, cardiovasculares e urinárias, e, ocasionalmente, é acompanhado por lesões malignas, como tumor de Wilms e hepatocarcinoma. Com o avanço da idade, a face gradualmente se alonga, o queixo fica mais proeminente, a altura chega próxima ao normal e a macrocefalia não é mais pronunciada. A casuística total foi de 65 pacientes com suspeita de diagnóstico clínico da síndrome de Sotos. Esses 65 pacientes foram testados por MLPA com o Kit Salsa P026B e três deleções foram encontradas: deleção total do gene FGFR4 e regiões flanqueadas, incluindo o gene FGFR4 e dois casos de deleções parciais do gene, uma com os exons 13 e 14 deletados, e outra com deleção desde o gene FGFR4 até o exon 17 do gene FGFR4, todas \"de novo\". Na nossa amostra a freqüência de deleções foi de cerca de 5%, semelhante à observada nas populações nãojaponesas. Os pacientes com as deleções apresentam a \"fácies típica\" com abaulamento frontal, o queixo proeminente, a implantação frontal do cabelo alta; a macrocefalia, a dolicocefalia, as mãos grandes; a hipotonia neonatal e a icterícia neonatal também estão presentes nos três pacientes. Entretanto, os três pacientes nasceram com o comprimento e o peso dentro dos padrões de normalidade e não acima do percentil 97 como descrito para a Sos. Para a pesquisa de mutações no gene FGFR4, foram selecionados trinta pacientes com \"fácies típica\" da síndrome de Sotos e macrocefalia. O seqüenciamento até o momento foi realizado em quatro pares de \"primers\" referentes ao exon 5 do gene FGFR4. Dois SNPs foram encontrados, um no fragmento 5B e um no fragmento 5D. Os dois SNPs ocorreram por uma substituição da base nitrogenada C-> T e são substituições sinônimas. A comparação do estudo de Tatton-Brown, et al, (2005b) que analisou as características clínicas e comportamentais de 266 pacientes com síndrome de Sotos, cujo mecanismo genético foi desvendado, com a nossa amostra de 30 pacientes nos permitiu sugerir como critérios mínimos para o diagnóstico clínico da síndrome de Sotos a \"fácies típica\" (abaulamento frontal, testa proeminente, hipertelorismo, estrabismo, fissura palpebral antimongolóide) e a macrocefalia. As alterações no gene FGFR4 (microdeleções e mutações) são essencialmente específicas para a síndrome de Sotos e, por isso, o diagnóstico genético para qualquer caso em que haja alteração do gene FGFR4, é o de síndrome de Sotos. / Sotos syndrome (MIM 117550) is autosomal dominant condition characterized by prenatal and postnatal overgrowth, macrocephaly and a typical facial gestalt with frontal bossing, hypertelorism, antimongoloid slant of the palpebral fissures, prominent jaw, large ears, high and narrow palate and large hands and feet. The syndrome is also frequently associated with brain, cardiovascular, and urinary anomalies and is occasionally accompanied by malignant lesions such Wilms tumour and hepatocarcinoma. FGFR4 microdeletions were investigated in sixty five patients with clinical diagnosis of Sotos syndrome by multiplex ligation dependent probe amplification ( MLPA, Kit Salsa P026B). We identified one patient with a total deletion of FGFR4 and FGFR4, one with FGFR4 exon13-14 deletion and another with a deletion that included FGFR4 and FGFR4 exon1-17. All deletions were \"de novo\". In our sample, the frequency of deletions was ~5%, similar to that found in non-Japanese populations. The clinical features of the three patients with microdeletions are: the typical facial gestalt with frontal bossing, prominent jaw and high anterior hairline; macrocephaly, dolichocephaly, large hands; neonatal hypotonia and jaundice. However, those three patients presented normal length and weight at birth. Clinical and behavioral features of 30 patients presenting a typical facial gestalt and macrocephaly, cardinal characteristics of Sotos syndrome were described. The comparison of the clinical and behavioral features to those described for 266 patients with a genetic diagnosis of Sotos syndrome indicates that a high clinical suspition of Sotos syndrome includes the typical facial gestalt (frontal bossing, hipertelorism, strabismus, prominent jaw, antimongoloid slant of the palpebral fissures) and macrocephaly. Other features associated with Sotos syndrome, such as overgrowth, learning disability, behavioral problems confirms the clinical diagnosis. FGFR4 microdeletion investigations detects only 5% of the Brazilian patients with Sotos syndrome. Screening for intragenic FGFR4 mutations may not be necessary in classic Sotos syndrome cases. However, identification of an FGFR4 abnormality is diagnostic of Sotos syndrome.

Agamaglobulinemia ligada ao X (XLA) é uma imunodeficiência primária caracterizada por ausência ou número reduzido de células B maduras em sangue periférico, de todos os isotipos de imunoglobulina e um aumento da susceptibilidade a infecções bacterianas e enterovirais graves. XLA é causada por mutações no gene Bruton\'s tirosino quinase, que codifica um membro da proteína da família das tirosino quinases citoplasmáticas que tem papel vital na modulação de muitos processos celulares. Neste estudo foram analisados trinta e três pacientes quanto à presença de mutações de BTK, por SSCP/HA e seqüenciamento. A análise da expressão foi realizada pela técnica por PCR em tempo real. Foram encontradas mutações do tipo stop codons, substituições de aminoácido, defeitos de splicing, pequenas deleções/inserções e frameshift nestes pacientes afetando os domínios PH, SH3, SH2 e o domínio da quinase da proteína. A análise da expressão mostrou níveis baixos nos pacientes com mutação do tipo stop codon, e nas outras mutações, os níveis de expressão foram de aproximadamente 15% e se correlacionaram com os tipos de mutação. / X-linked Agammaglobulinemia (XLA) is a primary immunodeficiency characterized by the absence or decreased numbers of mature B cells in peripheral blood, and by a lack of all immunoglobulin isotypes, leading to an increased susceptibility to severe bacterial and enteroviral infections. XLA is caused by mutations in the gene encoding for Bruton\'s tyrosine kinase (BTK), a protein member of the Tec family of cytoplasmic tyrosine kinases and plays a vital modulation role in many cellular processes. In this study thirty-three patients were analyzed for the presence of BTK mutations by SSCP/HA and sequencing. The expression analysis was carried out by the technique of Real-Time PCR. It was found mutations of the stop codons type, amino acid substitutions, splice defects, small deletions/insertions and frameshift in these patients affecting the PH, SH3, SH2 and tyrosine kinase domains of protein. The expression levels were very low in the patients with stop codon mutations, and in the other mutations, the expression levels were about 15% and were correlated with the mutation types.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Denis Leandro Freitas.pdf: 2460536 bytes, checksum: 9c33d2a38cc2aba90b9f27c476e8d2c5 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / The urinary tract infections (UTI) have high incidence in the population, mainly affecting women, the elderly and pregnant women. In most cases an UTI is caused by Enterobacteriaceae, especially Escherichia coli. The main antimicrobials used in the treatment of UTIs, are the quinolones and fluoroquinolones. Since its discovery in the 60s, such antimicrobials were improved and increasing its spectrum of activity, but also the micro-organisms has evolved to develop resistance to these drugs. The resistance comes down to two mechanisms: changes in targets of quinolones or decreased concentration of the drug within the cell. Quinolones are antimicrobial agents that target two enzymes involved in transcription and replication of bacterial DNA, DNA Gyrase, consisting of two subunits GyrA and two GyrB products of the genes gyrA and gyrB respectively and Topoisomerase IV, also composed of two ParC and two ParE subunits, encoded from genes parC and parE. Mutations in these genes can confer high-level resistance to these antimicrobials. Other mechanisms involve genes carried in plasmids such as qnr's, responsible for the production of proteins that protect the target enzymes of quinolones. The gene aac (6 ')-Ib-cr also present in plasmids can alter the chemical structure of certain fluoroquinolones interfering efficiency. The association of resistance to quinolones and β-lactams due to the presence of Extended Spectrum β-lactamases (ESBL) has been widely reported in the literature. The main objective of this study was to evaluate the patterns of resistance to quinolones and fluoroquinolones in 55 samples of uropathogenic E. coli collected in Curitiba, PR, Brazil. The resistance to nalidixic acid, norfloxacin, ciprofloxacin and ofloxacin was observed in 69.1% of the samples. Molecular analysis of the resistant strains showed mutations in gyrA (codons 83 and 87) and parC (codon 80). Also investigated was the presence of genes qnr's and aac (6 ')-Ib-cr and their association with ESBLs. Two of the 55 samples were positive for aac (6 ')-Ib-cr. The presence of this gene in Brazil was first reported in 2012 in Belo Horizonte, MG. No samples were positive for the qnr's genes. These results show a high incidence of resistance to quinolones and the ability to horizontally spread of acquired resistance between the bacterial strains. / As infecções do trato urinário (ITU) apresentam grande ocorrência na população, afetando principalmente mulheres, idosos e gestantes. Na maioria dos casos uma ITU é causada por enterobactérias, especialmente Escherichia coli. A principal escolha no tratamento das ITUs são as quinolonas e fluorquinolonas. Desde sua descoberta na década de 60, tais antimicrobianos foram aperfeiçoados aumentando seu espectro de ação, porém os micro-organismos também evoluíram desenvolvendo resistência a tais fármacos. A resistência se resume a alterações nos alvos das quinolonas e ou a diminuição da concentração da droga no interior da célula. Quinolonas são antimicrobianos que têm como alvo duas enzimas envolvidas na replicação e transcrição do DNA bacteriano, a DNA Girase, formada por duas subunidades GyrA e duas GyrB, produtos dos genes gyrA e gyrB respectivamente e a Topoisomerase IV, também composta de duas subunidades ParC e duas ParE, codificadas a partir dos genes parC e parE. Mutações nesses genes podem conferir alto nível de resistência a estes antimicrobianos. Outros mecanismos envolvem genes transportados em plasmídeos, como os qnr’s, responsáveis pela produção de proteínas capazes de proteger as enzimas alvo das quinolonas. O gene aac(6’)-ib-cr, também presente em plasmídeos, é capaz de alterar a estrutura química de certas fluorquinolonas interferindo na sua eficiência. A associação de resistência a quinolonas e β-lactâmicos devido à presença de β-lactamases de espectro ampliado (ESBLs), tem sido amplamente relatada na literatura. O principal objetivo desse trabalho foi avaliar os padrões de resistência a quinolonas e fluorquinolonas em 55 amostras de E. coli uropatogênica coletadas em Curitiba, PR. A resistência ao ácido nalidíxico, a norfloxacina, ciprofloxacina e ofloxacina, foi observada em 69,1% das amostras. A análise molecular das cepas resistentes revelou mutações em gyrA (códons 83 e 87) e em parC (códon 80). Também foi pesquisada a presença dos genes qnr’s e aac(6’)-ib-cr e a associação destes com ESBLs. Duas das 55 amostras foram positivas para aac(6’)-ib-cr. A presença desse gene no Brasil foi relatada pela primeira vez em 2012, em Belo Horizonte, MG. Nenhuma amostra foi positiva para os genes qnr’s. Estes resultados mostram uma elevada incidência de resistência às quinolonas e a capacidade de transferência horizontal de resistência adquirida entre as cepas bacterianas.

Submitted by Filipe dos Santos (fsantos@pucsp.br) on 2017-01-10T11:31:04Z No. of bitstreams: 1 Andréa Mancine Cortucci.pdf: 1458002 bytes, checksum: 4a00784598ad7480b9d66a32e0fae9f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-10T11:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andréa Mancine Cortucci.pdf: 1458002 bytes, checksum: 4a00784598ad7480b9d66a32e0fae9f3 (MD5) Previous issue date: 2016-12-15 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The present dissertation, based on the fact that the Constitution is in a constant dialectical process with the reality underlying it, reflects on the mutability of constitutional norms, especially in view of the numerous formal reforms (constitutional amendments) of the brazilian Constitution which are responsible not only for its desprestige, but also for the weakening of its normative force. This reflection is important for the understanding of the informal mechanisms of change of the Constitution (constitutional mutations), especially those promoted through interpretation, as the adequate and privileged way to adapt the current brazilian Constitution to the fact-concrete dynamics, guaranteeing its relevance in today's world. Assuming hermeneutic references, mainly Hans-Georg GADAMER's philosophical hermeneutics and Ronald DWORKIN's theory of constructive legal interpretation, parameters are defined to the constitutional mutation consistent with the preservation of normative force and constitutional integrity. It is demonstrated with this, within the parameterization of the phenomenon, that the interpretation of the Constitution, although exercised to update it, is not rooted in the discretion of its many different interpreters, especially its final interpreter, the Constitutional Court. It is also proposed to understand the newly acquired role of the Constitutional Court - and the objections that accompany it - in the contemporary constitutional reality and its relation to constitutional mutations. Once the traditional criticisms of the judicial institution (offense to the democratic principle, violation of Parliament's sovereignty and breach of the separation of Powers) have been dismantled and the procedural and substantive dimensions of its functional performance have been explored, it remains clear that the active and substantive role of Constitutional Court, based on the mutational interpretation of the constitutional norm, is the appropriate way to alleviate the serious differences and deficiencies still manifested in the brazilian social sphere / A presente dissertação partindo da constatação de que a Constituição está em constante processo dialético com a realidade a ela subjacente, reflete acerca do tema da mutabilidade das normas constitucionais, sobretudo diante das numerosas reformas formais (emendas constitucionais) à Lei Fundamental pátria que são responsáveis não apenas pelo seu desprestígio, mas também pelo enfraquecimento de sua força normativa. Essa reflexão mostra-se importante para a compreensão dos mecanismos informais de mudança da Constituição (mutações constitucionais), especialmente aqueles promovidos por meio da interpretação, como a via adequada e privilegiada para a adaptação do Texto Maior vigente à dinâmica fático-concreta, garantindo a sua relevância no mundo hodierno. Assumindo referenciais hermenêuticos, principalmente a hermenêutica filosófica de Hans-Georg GADAMER e a teoria da interpretação construtiva do Direito de Ronald DWORKIN, definem-se parâmetros à mutação constitucional condizentes com a preservação da força normativa e da integridade constitucionais. Demonstra-se com isso, vale dizer, com a parametrização do fenômeno, que a interpretação da Constituição, conquanto exercida para atualizála, não é radicada na discricionariedade de seus mais distintos intérpretes, mormente da sua intérprete derradeira, a Justiça Constitucional. Propõe-se também compreender o recém-adquirido papel do órgão exercente da jurisdição constitucional - e as objeções que o acompanham - na contemporânea realidade constitucional e a sua relação com as mutações constitucionais. Uma vez descontruídas as críticas tradicionais à instituição judiciária (ofensa ao princípio democrático, violação da soberania do Parlamento e quebra da separação dos Poderes) e ainda exploradas as dimensões processuais e substantivas referentes à sua atuação funcional, resta manifesto que a função ativa e substantiva da Judicatura Constitucional, fulcrada na interpretação mutativa da norma constitucional, é o caminho apropriado para minorar as graves diferenças e deficiências ainda manifestadas no seio social nacional

Made available in DSpace on 2016-04-26T20:23:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcio Ortiz Meinberg.pdf: 895788 bytes, checksum: 210eb1d6c596360ce75646f8fed2a7b2 (MD5) Previous issue date: 2014-09-29 / The purpose of this work is to analyze the relationship between the Fundamental Rights and the informal constitutional alterations. These alterations on the sense of the Constitution, without changing its text, are known by the doctrine as the Constitutional Mutation. It is a phenomena arising from a set of features found into the Brazilian Constitution of 88 and its norms (supremacy, normative strength and flexibility of the norms). The Fundamental Rights norms also feature some characteristics (structured as Principles, openness and language full of non-legal concepts, whose meanings are quite inaccurate, its synthetic character and the gaps and omissions) which boost the incidence of the constitutional mutation. Beyond that, the Fundamental Rights play a important role related to some situations similar to informal changes to the Constitution, but different from them, as the natural pliability of the Fundamental Rights norms; the influence of the Fundamental Rights the determination of the others constitutional norms (setting the original meaning of these constitutional normative statements); and the transformations performed by the Fundamental Rights into the legal system: by setting the meaning of a non-constitutional norm, the sense change of a non-constitutional norm and the exclusion of the non-constitutional norm from the system / O presente trabalho tem por objeto estudar a relação entre os Direitos Fundamentais e as alterações informais da Constituição. Tais alterações no sentido da Constituição, sem que ocorra qualquer alteração formal no texto da Carta Magna, são em geral conhecidas na doutrina como Mutação Constitucional. Trata-se de um fenômeno decorrente de um conjunto de características da Constituição de 88 (supremacia, força normativa e maleabilidade de suas normas) e suas normas. Dentre elas, as normas de Direitos Fundamentais também apresentam algumas características (estrutura como normas-princípio, abertura e linguagem rica em conceitos não-jurídicos, cujos significados são bastante imprecisos, seu caráter sintético e suas lacunas e omissões) que impulsionam a ocorrência de Mutação Constitucional. Além de impulsionarem casos de Mutação Constitucional, os Direitos Fundamentais também têm relevante papel em fenômenos similares, mas que não se confundem com a mutação: a maleabilidade natural das normas de Direitos Fundamentais; a influência dos Direitos Fundamentais na determinação das demais normas constitucionais; e as transformações realizadas pelos Direitos Fundamentais no restante do ordenamento jurídico, como a determinação de sentido das normas infraconstitucionais, a alteração do sentido das normas infraconstitucionais e a sua exclusão das normas inconstitucionais do sistema

Uma série de 205 casos de lesões nodulares da tireóide foi revista morfologicamente de acordo com a nova classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS, 2004) e analisada quanto à imuno-expressão das citoqueratinas 14 (CK 14) e 19 (CK19) e de citocromo-oxidase. Especial ênfase foi dada à avaliação da oxifilia nos nódulos, valorizando não só a oxifilia clássica (mais de 75% de células oncocíticas), mas também o que aqui chamamos de oxifilia parcial, e ao diagnóstico dos tumores foliculares de potencial incerto de malignidade. Amostras parafinadas dissecadas de carcinomas foram analisados para mutações dos genes BRAF e RAS (H-RAS, KRAS e N-RAS) mediante PCR, SSCP e seqüenciamento e para rearranjo dos genes PAX8-PPARg mediante FISH e RT-PCR. A oxifilia esteve presente, com freqüência variável, em todos os subtipos de nódulos da tireóide, benignos e malignos: 20,7 a 69,7% dos nódulos exibiram oxifilia clássica e 58,6 a 90,6% oxifilia de qualquer intensidade (clássica ou parcial). A imuno-expressão de citocromo-oxidase mostrouse associada ao achado morfológico de oxifilia, principalmente nos nódulos benignos e nos carcinomas foliculares. A CK 19 apresentou reatividade intensa apenas nos carcinoma papilíferos e em um caso de carcinoma folicular com áreas sugestivas de evolução para carcinoma pouco diferenciado. Houve associação significativa entre o diagnóstico de carcinoma papilífero e expressão de CK19 (p<0.001), mas a associação entre oxifilia e expressão de CK 19 não foi significativa. Nos carcinomas papilíferos, a oxifilia ausente ou parcial associou-se a maior freqüência de multicentricidade e a oxifilia clássica à maior idade média dos pacientes. A mutação do gene BRAF (V600E) esteve presente apenas nos carcinomas papilíferos e não teve influência nas variáveis clínico-patológicas. O rearranjo PAX8-PPARg teve incidência nas lesões foliculares oncocíticas (22,2%) bem superior à relatada na literatura. Associou-se a menor idade média dos pacientes e menor diâmetro tumoral nos carcinomas foliculares. A presença de mutações do RAS nas lesões foliculares associou-se significativamente com invasão capsular e oxifilia parcial. Todas os padrões de alterações moleculares, embora presentes, foram menos freqüentes nos tumores oncocíticos. Nossos resultados evidenciam que a oxifilia é muito freqüente em todos os subtipos de nódulos da tireóide, inclusive nos recém-descritos tumores foliculares de potencial incerto de malignidade. Merece destaque o fato de, nas lesões foliculares, a presença de oxifilia, especialmente em sua forma clássica, ter sido significativamente mais freqüente nos carcinomas, seguidos dos tumores foliculares de potencial incerto, sendo menos prevalente nos adenomas foliculares. Embora a oxifilia tenha sido associada com menor freqüência de mutações nos genes BRAF, RAS e rearranjo PAX8-PPARg, a detecção de sua coexistência com estas mutações e a presença freqüente de oxifilia em todos os tipos de nódulos da tireóide favorecem o conceito de que a oxifilia e a tumorigênese possam ser eventos distintos, muitas vezes paralelos. / A series of 205 thyroid nodules was morphologically reviewed according to the new World Health Organization (WHO, 2004) classification and analyzed regarding the immunoexpression of cytokeratins 14 (CK14) and 19 (CK19) and mitochondrial enzyme cytochrome oxidase. Special emphasis was given to the oxyphilia evaluation in the nodules, concerning not only the classical oxyphilia (more than 75% of oncocytic cells) but also the presence of smaller amounts of oncocytic cells, named herein partial oxyphilia, and to the recently purposed diagnosis of follicular tumours of unknown malignancy potential. Dissected paraffin-embedded samples of carcinomas were screened for BRAF and RAS mutations (H-RAS, K-RAS and NRAS) by PCR, SSCP and direct sequencing, whereas FISH and RT-PCR were used for assessment of PAX8-PPARg rearrangement. The oxyphilia was present, with heterogeneous frequence, in all subtypes of thyroid nodules: 20.7 to 69.7% of the nodules showed classical oxyphilia and 58.6 to 90.6% of them, oxyphilia of any intensity (classical or partial). The immunoexpression of cytochrome-oxidase was associated to the morphological finding of oxyphilia, especially in benign nodules and in follicular carcinomas. CK19 showed intense reactivity only in papillary carcinomas and in one case of follicular carcinoma with areas that could be already poorly differentiated. There was a significant association between the diagnosis of papillary carcinoma and CK 19 expression (p<0.001), but the association between oxyphilia and CK 19 expression was not statistically significant. Papillary carcinomas without or with partial oxyphilia were associated to a higher frequency of multicentricity and those with classical oxyphilia to older mean ages of patients. The BRAF gene mutation (V600E) was present only in papillary carcinomas and had no influence on clinical-pathological variables. The PAX8-PPARg rearrangement rates in oncocytic follicular lesions were higher than those previously reported. This rearrangement was associated to a younger mean age of patients and to smaller follicular carcinomas. The presence of RAS mutations in follicular lesions was significantly associated to capsular invasion and partial oxyphilia. All patterns of molecular alterations assessed herein, although present, were less frequent in oncocytic tumours. Our study further demonstrates the prevalence of classical and partial oxyphilia within all subtypes of thyroid nodules, including the recently described follicular tumours of unknown malignancy potential. A remarkable finding is that, among follicular neoplasms, oxyphilia, especially in classical pattern was significantly more prevalent in carcinomas, intermediate in follicular tumours of unknown malignancy potential and less common in adenomas. The absence of a significative relationship between oxyphilia and malignancy in most nodules is noteworthy. However, an association between oxyphilia and malignancy was observed in follicular neoplasms. Although oxyphilia has been associated with a lower mutation frequency in BRAF and RAS genes and PAX8- PPARgrearrangement, it can coexist with these mutations. This finding and the high prevalence of oxyphilia in all subtypes of thyroid nodules support the concept that oxyphilia and tumourigenesis can be distinct, and many times, parallel events.

O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito que a alteração na sensibilidade ou metabolismo hormonal em uma planta hospedeira poderia ter sobre o desenvolvimento de micorrizas arbusculares (MAs). Para tal, uma coleção de mutantes hormonais de tomateiro (Lycopersicon esculentum) introgredidos na cultivar miniatura Micro-Tom foi inoculada com o fungo Glomus clarum, em dos níveis de P no substrato. Foram realizados 3 experimentos, com os genótipos Never ripe (parcialmente insensível ao etileno), epinastic (superprodutor de etileno), bushy root (parcialmente insensível a citocinina), diageotropica (parcialmente insensível a auxina), procera (supersensível a giberelina) e notabilis (deficiente em ABA). Os parâmetros avaliados foram: porcentagem de colonização micorrízica, massa seca da parte aérea e massa seca da raiz em condições de P suficiente e insuficiente. Com os genótipos que apresentaram maiores alterações no desenvolvimento de MAs, Never ripe e epinastic , foram conduzidas análises morfológicas por meio de microscopia de luz, dosagem de P na parte aérea e estudos de expressão gênica através da técnica de PCR em tempo real (PCR Real-Time). Concluiu-se que, nas condições do presente trabalho, o grupo hormonal que mostrou a maior influencia sobre a formação de MAs foi o etileno, sendo que o seu efeito parece ser tanto estimulatório quanto inibitório. Contudo, os resultados de expressão de genes de defesa não permitem explicar as diferenças observadas. / The aim of the present work was to study the effect that alterations in hormonal sensitivity and metabolism in a host plant could have in the development of arbuscular mycorrhizae (AM). In this regard, a series of hormone-related mutants introgressed in the tomato (Lycopersicon esculentum) cultivar Micro-Tom were inoculated with the fungus Glomus clarum, in two different levels of substrate P. Three experiments were performed, using the genotypes Never ripe (partially insensitive to ethylene), epinastic (ethylene overproducer), bushy root (partially insensitive to cytokinin), diageotropica (partially insensitive to auxin), procera (gibberellin hypersensitive) and notabilis (ABA-deficient). The following parameters were assessed: mycorrhizal colonization percentage, shoot and root dry mass, under conditions of either sufficient or insufficient P on the substrate. Further analyses, such as root morphology, P dosage and gene expression quantification (through Real-Time PCR), were performed on the genotypes which presented the most alterations in mycorrhizal development, namely Never ripe and epinastic. It was concluded that the hormone showing most influence on AM formation was ethylene. Its effect appears to be either stimulatory o inhibitory. In any case, defense gene expression alone could account for the observed differences.

Resumo: A glucoamilase é uma enzima hidrolítica que catalisa a liberação sucessiva de β-D-glicose a partir do amido e oligossacarídeos relacionados. Neste trabalho foram estudadas as glucoamilases de Aspergillus awamori expressas em levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram utilizadas duas linhagens alteradas denominadas M1 e M2, e uma linhagem selvagem (WT), utilizada como parâmetros na comparação dos resultados. As enzimas foram produzidas em fermentação submersa, e amidos de diferentes origens vegetais foram utilizados como uma fonte extra de carbono na produção das enzimas. O melhor substrato para a produção da glucoamilase selvagem e da mutante M2 foi o amido de batata com 8,2 e 6,6 U/mL, respectivamente. Para a linhagem M1 foi o amido de mandioca com atividade enzimática de 5,9 U/mL. O amido de milho mostrou ser um substrato menos indicado para a produção destas enzimas. Para a purificação foi preparada uma coluna de afinidade com resina sepharoseTM 6B epóxi ativada ligada a acarbose, onde diferentes concentrações do ligante foram avaliadas. A coluna apresentou boa eficiência no processo de purificação conforme análise por eletroforese SDS-PAGE, com massas moleculares estimada em 100 kDa. A temperatura ótima de atividade das enzimas M1 e M2 foi 65 °C, enquanto que a selvagem teve sua atividade máxima em 60 °C. O pH ótimo de atuação das enzimas foi 4,5. As glucoamilases mutantes apresentaram maior termoestabilidade que a glucoamilase selvagem durante o processo de termoinativação, destacando principalmente a glucoamilase M2. A meia vida a 70 °C foi de 8,1 minutos para a enzima mutante M2, 4,1 minutos para a M1 e 3,0 minutos para a enzima selvagem. A energia de ativação para a desnaturação (Ead) foi de 252,9 e 262,8 KJ mol-1 para as enzimas M1 e M2 respectivamente, e de 234,3 KJ mol-1 para a selvagem. A maior energia dos mutantes indica maior resistência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glucoamylase is a hydrolytic enzyme that catalyzes the consecutive liberation of β-D-glucose from starch and related oligosaccharides. In this work glucoamylases from Aspergillus awamori expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae were studied. Two mutant strains, denominated M1 and M2, were used and one wild strain (WS) was used as parameter to compare the results. The enzymes were produced in submerged fermentation and starches from different botanical origins were used as extra carbon source for enzyme production. The best substrate for the production of wild glucoamylase and of mutant M2 was potato starch with 8.2 and 6.6 U/mL, respectively. For strain M1 the best substrate was cassava starch with enzymatic activity of 5.9 U/mL. Corn starch revealed to be a less indicated starch for the production of these enzymes. For purification, an affinity column was prepared with activated SepharoseTM 6B epoxy linked to acarbose, and different concentrations of ligand were evaluated. The column exhibited good efficiency during the purification process according to SDS-PAGE analysis, with molecular masses estimated in 100 kDa. Optimum temperature for activities of M1 and M2 enzymes was 65°C, while the wild one exhibited maximum activity at 60°C. Optimum pH for enzyme action was 4.5. Mutant glucoamylases presented higher thermostability than wild glucoamylase during the thermoinactivation process, with M2 standing out. Half life at 70°C was of 8.1 minutes for mutant enzyme M2, 4.1 minutes for M1 and 3.0 minutes for wild enzyme. Activation energy for denaturation (Ead) was 252.9 and 262.8 KJ mol-1 for enzymes M1 and M2 respectively, and 234.3 KJ mol-1 for the wild one. The higher energy of the mutants indicates higher resistance of the protein structure, since more energy is required for the molecule to enter a transition and unfolding state. Thermodynamic parameter ΔG was higher... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Roberto da Silva / Coorientador: Heloiza Ferreira Alves-Prado / Banca: Maria de Lourdes T. de M. Polizeli / Banca: Fernando Araripe Gonçalves Torres / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Eleonora Cano Carmona / Doutor