Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.

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Introdução: A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo causado pela atividade deficiente da cistationina β-sintase (CβS). É caracterizada pela elevação sérica de homocisteína e metionina e redução dos níveis de cisteína. As manifestações clínicas clássicas envolvem os sistemas ocular, vascular, nervoso central e ósseo. Entretanto, observações recentes sugerem que alterações na composição corporal, especialmente a redução de tecido adiposo, também pode ser uma manifestação frequente e clinicamente relevante nesta doença. Além disso, a gravidade do fenótipo clínico parece ser influenciada por outros genes além do CβS. O objetivo deste estudo foi investigar alterações na composição corporal e detectar mutações comuns nos genes CβS, MTHFR e F5 em pacientes com homocistinúria clássica; relacionando dados clínicos, bioquímicos e genéticos. Métodos: Realizada avaliação da composição corporal em 8 pacientes através de duas técnicas: antropometria (aferição das dobras cutâneas triciptal, biciptal, subescapular e suprailíaca) e bioimpedância elétrica (BIA). A partir dos resultados obtidos, calculou-se o percentual de gordura pelas fórmulas de Siri (antropometria) e Kushner (BIA). O índice de massa corporal (IMC) também foi calculado. Os níveis de metionina, homocisteína e cisteína foram mensurados por HPLC. A avaliação genotípica foi realizada em 11 pacientes através de PCR-RFLP. Pesquisadas as mutações p.I278T, p.T191M, p.G307S e c.844ins68 no gene CβS; c.677TC>T e c.1298A>C no gene MTHFR; e p.R506Q no gene F5 (Fator V de Leiden). Resultados: Cinco pacientes apresentaram baixo percentual de gordura por pelo menos um dos métodos; o restante apresentou percentual médio. De acordo com o IMC, apenas dois pacientes foram classificados em baixo peso. O percentual de gordura total não se relacionou com os achados bioquímicos ou ósseos, mas medida isolada da dobra cutânea triciptal correlacionou-se positivamente com os níveis de cisteína (p=0,03) Além disso, os níveis de homocisteína e metionina correlacionaram-se negativamente com o IMC, enquanto que a cisteína teve associação positiva (p<0.05). Houve tendência do escore T de fêmur associar-se negativamente com homocisteína e positivamente com cisteína (p=0,09). Entre as mutações do gene CβS, a p.1278T foi a única encontrada (n= 3/9 famílias); entretanto, em 2/3 famílias estava em cis com a c.844ins68. Assim, em apenas um caso tinha caráter patogênico. Não foi possível estabelecer associação entre mutações em MTHFR e F5 e a gravidade do fenótipo. Conclusões: Os resultados sugerem que deficiência de CβS gera alterações significativas na composição corporal – observou-se redução do percentual de gordura independentemente do IMC. Este pode ser um mecanismo patogênico importante envolvido na etiologia da 2 osteoporose na homocistinúria clássica, mas estudos adicionais são necessários para demonstrar esta relação. Os achados sugerem que as mutações patogênicas no gene CBS sejam raras ou privadas nesta amostra, e não corroboram a ação dos genes MTHFR e F5 como modificadores da doença. / Introduction: Classical homocystinuria is an inborn error of metabolism caused by the deficient activity of cystathionine β-synthase (CβS). It is characterized by plasma increase in homocysteine and methionine and a decrease in cysteine levels. Its classical clinical manifestations involve the following systems: ocular, vascular, central nervous, and skeletal. However, recent observations have suggested that changes in the body composition, especially a reduction of the adipose tissue, may also be a frequent manifestation of the disease and clinically relevant to it. Moreover, the severity of its clinical phenotype may be influenced by other genes besides CβS. The objective of the present study was to investigate alterations in the body composition and to detect common mutations in CβS, MTHFR and F5 genes in patients with classical homocystinuria and to correlate them to the clinical, biochemical, and genetic data. Methods: Body composition was assessed in 8 patients using the techniques of anthropometry (measurement of the following skinfolds: triciptal, biciptal, subscapular, and suprailiac) and electrical bioimpedance (BIA). Based on the results obtained, the percentage of body fat was calculated using the formulas of Siri (anthropometry) and Kushner (BIA). The body mass index (BMI) was also calculated. The levels of methionine, homocysteine, and cysteine were measured by HPLC. The genotypic evaluation was done in 11 patients by PCR-RFLP. The following mutations were investigated: p.I278T, p.T191M, p.G307S, and c.844ins68 in the CβS gene; c.677TC>T and c.1298A>C in the MTHFR gene; and p.R506Q in the F5 gene (Factor V Leiden). Results: Five patients presented low percentage of body fat by at least one of the methods; the other patients presented a medium percentage. According to the BMI, only 2 patients were classified as being underweight. The percentage of total body fat was not related to either bone or biochemical findings, but the isolate measurement of the triciptal skinfold was positively correlated to the levels of cysteine (p=0.03). Also, the levels of homocysteine and methionine were negatively correlated to the BMI, while cysteine had a positive association (p<0.05). The T score of the femur tended to associate negatively with homocysteine and positively with cysteine (p=0.09). The genetic evaluation revealed only one pathogenic mutation in CβS (p.I278T). An association between mutations in MTHFR and F5 and phenotype severity could not be established. Conclusions: The present results suggest that the deficiency of CβS causes significant alterations in the body composition; a reduction of the percentage of body fat was observed independently from the BMI. This may be an important pathogenic mechanism involved in the etiology of osteoporosis in classical homocystinuria. The present findings suggest that in this sample the 4 pathogenic mutations in the CBS gene are rare or private and do not corroborate with the action of the MTHFR and F5 genes as disease modifiers. Further studies are needed.

Resumo: O gênero Potyvirus é um dos maiores dentre os vírus de planta com genoma composto por RNA. O genoma dos potyvirus codifica um único polipeptídeo que é processado por três proteinases virais que originam todas as proteínas necessárias para complementar o ciclo da infecção. A proteína HC-Pro (Helper Component proteinase) é uma dessas proteínas multifuncionais que está envolvida na amplificação do genoma, transmissão por afídeo, movimento sistêmico e local, supressão do silenciamento gênico e proteólise. Nesse trabalho, foi realizada a substituição funcional de parte da região codificadora da HC-Pro do Lettuce mosaic virus (LMV) com a porção correspondente à HC-Pro do Potato virus Y (PVY), com o objetivo de melhor compreender os papéis dessa proteína no ciclo de infecção dos potyvirus. O LMV e o PVY diferem tanto em patogenicidade quanto em círculo de hospedeiros. O LMV infecta, principalmente, espécies da família Asteraceae (alface) enquanto o PVY infecta Solanaceae. Para avaliar o efeito de tal substituição na infectividade, dois vírus quiméricos foram construídos: um clone infeccioso de LMV contendo a HC-Pro selvagem do PVY (estendendo-se dos aminoácidos 1 a 352) e um segundo clone contendo a HC-Pro de PVY com mutação no motivo conservado IGN (mutado para RPN). Os vírus recombinantes e o LMV selvagem foram inoculados via biobalística em folhas de plântulas de alface cv. Trocadero (suscetível ao LMV). A presença e a natureza das progênies virais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The genus Potyvirus is one of the largest genera of plant RNA viruses. The potyvirus genome encodes a single polypeptide that is processed by three viral proteinases to yield all viral proteins needed for the infection cycle. One of these proteins is the multifunctional helper component proteinase (HC-Pro), which is involved in genome amplification, aphid transmission, local and systemic movement, suppression of gene silencing and proteolysis. To gain further understanding of the roles of this protein in the Potyvirus life cycle, the functional replacement of the HC-Pro coding region of Lettuce mosaic virus (LMV) with its corresponding counterpart of Potato virus Y (PVY) was performed. These viruses differ both in pathogenicity and in host range. LMV infects mainly Asteraceae while PVY infects Solanaceae. To assess the functional requirement of a homologous HC-Pro in infectivity, two different chimeric viruses were constructed i. e: a full-length LMV containing a wild type PVY HC-Pro (1aa to 352aa) and a full-length LMV containing a PVY HC-Pro with a mutation in the IGN motif (exchanged to RNP). The chimeras, and wild type LMV, were inoculated by biolistic in young lettuce plants. The presence and nature of viral progenies were checked by RT-PCR amplification followed by sequencing. All recombinant viruses were infectious and displayed systemic infection although the symptoms were weak when compared to the wild type LMV. The viruses accumulation were evaluated by differential cycles in the RT-PCR. The LMV wild type was amplified by 30 cycles while the chimerics viruses needed 40 cycles. Therefore this result indicating that the chimeric viruses titer were lower than LMV wild type. The results 4 described here demonstrated that the main biological functions of HC-Pro can be accomplished by heterologous protein. / Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: José Osmar Gaspar / Banca: João Roberto Spotti Lopes / Banca: Addolorata Colariccio / Doutor

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-22T12:41:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_VariabilidadeAlelicaExpressao.pdf: 6674673 bytes, checksum: 0ec2d9f9a77ab69b8cf5669cccae4516 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-03-27T11:34:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_VariabilidadeAlelicaExpressao.pdf: 6674673 bytes, checksum: 0ec2d9f9a77ab69b8cf5669cccae4516 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T11:34:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_VariabilidadeAlelicaExpressao.pdf: 6674673 bytes, checksum: 0ec2d9f9a77ab69b8cf5669cccae4516 (MD5) Previous issue date: 2015-06-24 / A maculopatia autossômica recessiva de Stargardt se caracteriza pela perda progressiva simétrica da visão na região central do campo visual em indivíduos entre a primeira e segunda décadas de vida. Também fazem parte do diagnóstico clínico a presença de lesões maculares pontuais de coloração amarelo-esbranquiçadas encontradas nas regiões foveal e parafoveal, além da deposição de lipofuscina gerando hipofluorescência e atrofia córiocapilar e do epitélio pigmentado da retina. A acuidade visual dos portadores da degeneração de Stargardt decresce com o seu progresso e tende a se estabilizar entre 20/200 (1,0 logMAR) a 20/400 (1,3 logMAR). Esta tese teve como objetivos a investigação da ocorrência de associações entre as variantes alélicas (mutações) e os níveis de expressão do gene ABCA4 com a morfologia dos granulócitos periféricos e os fenótipos clínicos, eletrofisiológicos e de estrutura da retina em pacientes portadores da maculopatia de Stargardt. Nos onze sujeitos selecionados foram identificadas quatro variantes do tipo não-sinônimas e três do tipo sinônimas. A combinação alélica L1395P/D1817E foi encontrada em 64% dos 22 cromossomos analisados sugerindo a ocorrência do efeito do fundador. Não foi possível a associação entre os genótipos e os fenótipos analisados. Os valores diferenciais de expressão do gene ABCA4 obtidos entre pacientes e grupo controle, bem como a prevalência de neutrófilos bastonados na circulação sanguínea periférica sugerem a possibilidade de servirem como biomarcadores para Stargardt. As imagens retinográficas e angiográficas obtidas permitiram a classificação em estágios I, II e III de comprometimento retiniano nos sujeitos investigados. O valores de espessura da região central da mácula dos pacientes foram bem menores do que aqueles obtidos para os controles, evidenciando a perda da camada de fotorreceptores. Os achados eletrorretinográficos de campo total em função do tempo de adaptação ao claro possibilitaram a caracterização das perdas funcionais nos sujeitos investigados. / The autosomal recessive Stargardt's maculopathy is characterized by symmetrical progressive loss of central vision in patients’ first and second decades of life. It is also part of the clinical diagnosis the presence of yellowish-white color specific macular lesions found in the parafoveal and foveal regions, besides lipofuscin deposition generating hypofluorescence and atrophy of choriocapillaris and retinal pigment epithelium. Visual acuity of the Stargardt’s degeneration carriers decreases with their progress and tend to stabilize between 20/200 (1.0 logMAR) to 20/400 (1.3 logMAR). This thesis aimed to investigate the occurrence of association between allelic variants (mutations) and ABCA4 gene expression levels with the peripheral granulocytes morphology and clinical phenotypes, electrophysiological and retinal structure in patients harboring Stargardt’s maculopathy. Four non-synonymous and three synonymous allelic variants were identified among eleven selected subjects. The allelic combination L1395P/D1817E was found in 64% of the 22 chromosomes analyzed suggesting the occurrence of founder effect. There were no association between genotypes and clinical phenotypes analyzed. The differential values obtained for ABCA4 gene expression between patients and controls, as well as the prevalence of banded neutrophils in the peripheral blood circulation suggest the possibility they could serve as biomarkers for Stargardt. The eye fundus and angiographic images were used for the classification in the stages I, II and III of retinal impairment in subjects investigated. The thickness values of the central region of the macula among patients were much lower than those obtained for the controls, indicating a loss of photoreceptor layer. Full-field electroretinographic findings of light adapted eyes during the course of time enabled the characterization of the functional losses in investigated subjects.

A mutação espontânea tremor (tr) , autossômica recessiva, foi identificada na colônia de camundongos Swiss no Biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Os mutantes apresentaram como principais características fenotípicas tremores, ataxia e convulsões tônicas audiogênicas. Por meio de dez retrocruzamentos essa mutação foi transferida para a linhagem congênica C57BL/6 (N10). O mapeamento genético com marcadores microssatélites distribuídos pelo genoma do camundongo indicou que a mutação tr encontra-se no cromossomo 14, na região entre 33,21 e 38,21 cM, tendo como possível candidato o gene Egr3 (Early Growth Response 3). O presente estudo teve como objetivo caracterizar o fenótipo comportamental do camundongo mutante tremor. A caracterização do fenótipo dos camundongos mutantes Swiss foi realizada a partir do nascimento até a idade adulta. Os parâmetros do desenvolvimento físico analisados foram: desdobramento das orelhas, erupção dos dentes incisivos, abertura dos olhos, surgimento da pelagem completa, ganho de peso e comprimento dos filhotes e desenvolvimento sexual. No desenvolvimento reflexológico foram analisados: preensão palmar, geotaxia negativa, endireitamento de postura e sobressalto. No 21&ordem; dia de vida foi realizado o teste de campo aberto para analisar a atividade geral dos animais, e no 60&ordem; dia esse teste foi repetido, juntamente com testes para analisar parâmetros comportamentais. Os testes realizados em campo aberto foram ordenados por parâmetro avaliado; 1) atividade geral dos animais e sistema sensorial: frêmito vocal, irritabilidade, reflexo auricular, aperto de cauda, reflexo corneal e resposta ao toque; 2) testes psicomotores: trem posterior, reflexo de endireitamento, tônus corporal e força de agarrar; 3) avaliação do sistema nervoso central: tremores, cauda em pé, micção e defecação. Demais testes realizados analisaram: comportamento em labirinto em cruz elevada, coordenação motora em trave elevada, memória espacial no labirinto em T, e respostas comportamentais nos testes de natação forçada e de suspensão pela cauda. Exceto pelo menor peso no desmame, os parâmetros de desenvolvimento analisados não apresentaram diferenças significativas entre os mutantes e controles, o que confirmou a hipótese de que as alterações fenotípicas somente são perceptíveis a partir de 3 semanas de vida. A caracterização comportamental do fenótipo também foi realizada nos mutantes em fundo genético C57BL/6, de ambos os sexos, com 8 semanas de idade. Em relação aos camundongos controle, nos mutantes houve aumento da presença de cauda em pé, da ataxia e do tremor; menor frequência de levantar e de limpeza do corpo (grooming); redução da coordenação motora, indicando evidente prejuízo motor. Também foram observadas respostas negativas à ansiedade e hiperatividade, mas não houve alteração na memória espacial dos mutantes. Os resultados indicaram que o mutante tremor apresentou prejuízos de origem no sistema nervoso central; demostraram também que o fenótipo observado coincide com as alterações descritas na literatura, sugerindo o gene Egr3 como possível candidato para a mutação. A caracterização fenotípica desse animal é importante no entendimento das alterações causadas pela mutação e se essa apresenta potencial como modelo para doenças neurológicas. / The autosomal recessive spontaneous mutation tremor (tr) was identified in the Swiss mice colony of the laboratory animal facility of the Department of Pathology, from Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Universidade de São Paulo. The mutants presented tremors, ataxia and audiogenic tonic convulsions as the main expressive characteristics. This mutation was moved from Swiss onto C57BL/6 by ten backcrosses (N10). Genetic mapping with microsatellite markers distributed through the mouse genome showed that the mutation is on 14 chromosome, between 33.21 and 38.21 cM, making Egr3 (Early Growth Response 3) a candidate gene. This study aimed to characterize the behavior phenotype of the tremor mice. Phenotypic characterization of the Swiss mutant mice was performed from birth to adulthood. The physical development points analyzed were: unfolding of the ears, eruption of the incisor teeth, opening the eyes, complete fur, weight gain and length, and sexual development. The reflexology development ones were: palmar grip, negative geotaxia, posture straightening and reaction to sound. On the 21day-old the open field test was performed to analyze the activity of the animals, and on the 60-day-old this task was repeated along with tests to analyze behavioral parameters. The tests performed in the open field were evaluated by parameters; 1) general activity and sensory system: vocalization, irritability, auricular reflex, tail flick, corneal reflex and response to touch; 2) psychomotor tests: hindquarter fall, surface-rightingreflex, body tone and grasping strength; 3) evaluation of the central nervous system: tremors, straub tail, micturitionand defecation. Other tests analyzed: behavior in elevated plus maze, motor coordination in balance beam test, spatial memory in T maze alternation test, and behavioral responses in forced swing and tail suspension tests. Except for the lower weight at weaning, the development parameters analyzed did not show significant differences between the mutants and controls, which confirmed the hypothesis that phenotypic changes are only perceptible after 3weeks-old. The behavioral characterization of the phenotype was also performed on 8-week-old C57BL/6 mutants of both sexes. In comparison to the control mice, in the mutants there were an increase in the presence of straub tail, ataxia and tremor; less frequent rearing and grooming; less motor coordination, indicating evident motor impairment. Negative responses to anxiety and hyperactivity were also observed, but there was no change in the spatial memory of the mutants. The results indicated that the tremor mutant presented damages in the central nervous system; also showed that the phenotype coincides with the changes described in the literature, suggesting the Egr3 gene as a possible candidate for the mutation. The phenotypic characterization of this animal is important to clarify impairments caused by the genetic mutation, and also identify if this potential model could be useful to study neurological diseases.

Chromobacterium violaceum tem sido muito estudada a fim de explorar seu potencial biotecnológico, especialmente, a violaceína. Este trabalho teve por objetivo estabelecer estratégias para obtenção de mutantes. Linhagens mutantes foram obtidas por transposição com o mini-Tn5 e por recombinação homóloga (mutantes vioB e ubiB). O vioB em fase estacionária demonstrou ser mais resistente a UVC e aos sais metálicos FeCl2 e CdCl2. Com H2O2 não houve uma diferença significativa entre as taxas de sobrevivência exibidas pela linhagem vioB. Análise por microscopia demonstrou maior agregação das células do mutante vioB e uma maior formação de biofilme. O mutante ubiB apresentou crescimento deficiente na presença de 0.4 mg/mL de fenol. / Chromobacterium violaceum has been extensively studied for its biotechnological potential, especially what concerns violacein. In this work we have as goal to establish strategies for obtaining mutant strains. Mutant strains were obtained by transposition using mini-Tn5 and employing homologous recombination (mutant vioB and ubiB). vioB was shown to be more resistant in stationary phase to UVC and the metallic salts FeCl2 and CdCl2. With H2O2, there was no significant difference in survival rates exhibited by vioB. Microscopy analyses demonstrated a higher cell aggregation by the vioB mutant and a higher formation of biofilm. ubiB mutant presented growth defects in presence 0.4 mg/mL phenol.

A regeneração in vitro é bastante utilizada em processos biotecnológicos. No entanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos na aquisição de competência para formação de novos órgãos. Em tomateiro (S. lycopersicum), a alta capacidade de regeneração in vitro é atribuída ao alelo Rg1, vinda de Solanum peruvianum, e que está presente na cv MsK (S. lycopersicum x S. peruvianum). Os genes de nanismo da cv Micro-Tom (MT) foram passados para MsK, obtendo-se, após 8 gerações de autofecundação (F8), a cv Micro-MsK. No presente estudo, após 6 gerações de retrocruzamentos (BC6Fn), criou-se MT-Rg1, com Rg1 isogênico a MT. Testes de regeneração in vitro mostraram que a formação de gemas caulinares adventícias para MT-Rg1 e Micro-MsK são equivalentes, evidenciando que a alta capacidade de regeneração de Micro-MsK é basicamente devido ao Rg1. Plantas MTRg1 apresentam freqüente formação de 3 cotilédones, excesso de ramificações caulinares e senescência atrasada, características ausentes nos parentais. Esses efeitos pleiotrópicos de Rg1 coincidem com aqueles descritos para alterações no hormônio citocinina. Testes de sensibilidade à citocinina e de tempo de senescência realizados por nós, bem como dosagem desse hormônio feita por outras equipes, descartaram essa hipótese. Enxertias recíprocas evidenciaram que a promoção da ramificação caulinar por Rg1 não é um sinal translocável, mas parece ser uma característica intrínseca do tecido. Rg1 também promoveu uma maior formação de raízes adventícias em estacas ex vitro, sugerindo que ele afeta o processo de competência para formação de órgãos em geral, e não somente a indução específica de gemas caulinares. Duplos mutantes entre Rg1 e mutantes com alteração na sensibilidade/metabolismo hormonal (dgt, brt e pro), ausência de ramificações caulinares (ls) e senescência acelerada (l) foram obtidos e testados quanto ao padrão de ramificações e à capacidade de regeneração in vitro. Além desses parâmetros, a presença de Rg1 suprimiu o fenótipo de folhas pouco recortadas do mutante hipersensível a giberelina (pro) e recuperou o sistema radicular pouco desenvolvido do mutante com baixa sensibilidade à auxina (dgt). Rg1 também foi capaz de reverter a ausência de ramificações laterais de ls, sendo que a mutação Me, o qual representa uma superexpressão de um gene do tipo KNOX, não foi capaz. Esse resultado sugere que Rg1 não é um gene do tipo KNOX, embora esses genes sejam considerados os principais controladores da competência. Analisando diferentes tipos de explantes em experimentos independentes, contatou-se que, em geral, as mutações brt (baixa sensibilidade a citocinina), dgt e ls diminuíram a capacidade de regeneração de Rg1, enquanto l aumentou. Rg1 mostrou-se particularmente epistático à mutação pro, revertendo o fenótipo de baixa formação de gemas caulinares desse mutante. Surpreendentemente, Rg1 provou ser mais sensível à auxina em testes de alongamento de segmentos de hipocótilos, sendo capaz de reverter o fenótipo do mutante dgt nesse mesmo teste. Em conjunto, esses resultados confirmam o papel de Rg1 na fase de aquisição da competência e sugerem uma interação dos hormônios giberelina e auxina nesse processo. / The In vitro regeneration process is widely used in plant biotechnology. However, the mechanisms involved in the acquisition of competence for organ formation are hitherto unknown. In tomato (S. lycopersicum), the high capacity for in vitro regeneration is attributed to the Rg1 allele from S. peruvianum, which is present in the cv MsK (S. lycopersicum x S. peruvianum). The dwarfism genes of the cv Micro-Tom (MT) were transferred to MsK, and, after 8 generations of selfing (F8), the cv Micro-Msk was obtained. Here, after 6 generations of backcrosses (BC6Fn), we created the MT-Rg1, which has Rg1 isogenic to MT. Tests of in vitro regeneration showed that shoot formation in MT-Rg1 and Micro-MsK are equivalent, suggesting that the high capacity of regeneration of Micro-MsK is basically due to Rg1. Comparing MT-Rg1 with the control MT, we noticed a high frequency of 3 cotyledon formation, increased shoot branching and late senescence, which are absent in the parentals. These pleiotropic effects of Rg1 coincide with those described for plants with alterations in the hormone cytokinin. Tests of sensitivity for cytokinin and senescence behavior carried out by us, as well as dosage of that hormone made by other researches, discarded that hypothesis. Reciprocal grafting showed that the promotion of shoot branching by Rg1 is not a transmissible signal, but seems to be an inherent characteristic of the tissue. Rg1 also increases adventitious roots formation of ex vitro cuttings, suggesting that it affects the process of competence, which is common for shoots and roots, instead of the specific induction of shoots. Double mutants between Rg1 and mutants with alteration in the sensitivity/metabolism of plant hormones (dgt, brt and pro), as well as mutants with absence of shoot branching (ls) and accelerated senescence (l) were obtained and tested for the capacity of in vitro regeneration. The presence of Rg1 suppressed the phenotype of less dissected leaves of the mutant hypersensitive to gibberrellin (pro) and rescued the phenotype of poor developed root system of the mutant with low auxin sensitivity (dgt). Rg1 was also able to revert the absence of axillary shoot formation in ls, whereas the mutant Me, which represents an over expression of a KNOX gene was not. This result suggests that Rg1 is not a KNOX gene, although those genes are considered the main controllers of the competence. Analyzing different types of explants in independent experiments, it was verified that, in general, the mutations brt (low sensibility to cytokinin), dgt and ls decreased the regeneration capacity of Rg1, while l increased it. Rg1 was particularly epistatic to the pro mutation, reverting the phenotype of little shoot formation of that mutant. Surprisingly, Rg1 proved to be more sensitive to auxin in the hypocotyl segment elongation test, being able to revert the phenotype of the mutant dgt in the same test. Together, these results confirm the role of the Rg1 in the process of acquisition of the competence and suggest an interaction of the hormones gibberellin and auxin in this process.

Sabe-se que dentre os principais contaminantes ambientais estão os metais pesados, decorrentes da intensa atividade agroindustrial das últimas décadas. Em especial, o cádmio (Cd) é um elemento não essencial que está entre os poluentes ambientais mais tóxicos a humanos, animais e plantas, mesmo em baixas concentrações. Considerando a relevância da problemática da toxicidade por Cd, a caracterização da resposta de um sistema modelo largamente usado como o Micro-Tom, é essencial para o maior conhecimento dos processos fisiológicos, bioquímicos e genéticos envolvendo a toxicidade e a resistência ao Cd. Outro fator a ser considerado é a importância econômica do tomate para a agricultura mundial, aliando as perdas de produtividade à falta de conhecimento sobre os mecanismos de toxicidade. A proposta do projeto foi o estudo do comportamento de plantas de Micro-Tom expostas ao Cd, através do processo de estresse oxidativo decorrente da exposição ao metal. Por meio de todos os parâmetros analisados ao longo do projeto, foi possível caracterizar o modelo Micro-Tom quanto à toxicidade por Cd. Após toda esta parte exploratória de caracterização dos níveis de atividade antioxidativa, foi possível a inclusão de mutantes hormonais (auxina, etileno) já introduzidos nesse cultivar, tornando o estudo mais investigativo com novas perspectivas da relação hormonal com os mecanismos de toxicidade e resistência a fatores de estresse em geral. / It is known that among the main environmental contaminants are included the heavy metals, a result of the intense industrialized activity. Cadmium (Cd) is a non essential element that is among the most dangerous heavy metals, leading to considerable losses in plant productivity and hazardous health effects, even in low concentrations. Considering the high Cd toxicity, the characterization of the responses by a model system like Micro-Tom may be essential to understanding about physiological, biochemistry and genetic processes involved with the toxicity and resistance to Cd. Another major aspect to be considered is the economical importance of tomato in world agriculture and the possible losses of productivity caused by Cd. The main objective of this part of the work was to study Cd-induced oxidative stress in Micro- Tom plants. Through the parameters analysed, it was possible to characterize the Micro-Tom model related to Cd toxicity. After this initial characterization based mainly on antioxidative activities, it was possible to include in the study hormonal mutants (auxin, ethylene, introduced into the Micro-Tom line), in order to investigate whether these mutants respond differently from the wild-type when Cd-induced oxidative stress is concerned.

INTRODUÇÃO: O carcinoma escamoso (CEC) de vulva é um tumor ginecológico de baixa frequência, cuja incidência aumenta com o passar dos anos. Entre as vias patogenéticas, destaca-se a neoplasia intraepitelial vulvar (NIV) diferenciada, que está relacionada com o líquen escleroso (LE). A maioria dos estudos publicados comparou o CEC vulvar com LE no âmbito morfológico apenas. Poucos avaliaram estas afecções em relação à biologia molecular, e nenhum avaliou o papel da junção intercelular (TJ). Nosso objetivo foi analisar a expressão de claudinas (proteínas atuantes na TJ) e do p53 nestas doenças. CASUÍSTICA E MÉTODOS: avaliamos o produto do oncogene TP53 e a expressão das claudinas 1, 2, 3, 4, 5, 7 e 11 em amostras de tecido vulvar humano de três grupos de pacientes: LE, CEC isolado (ICEC) e grupo controle. RESULTADOS: As claudinas 1, 2, 3 e 4 foram expressas igualmente nos três grupos. As claudinas 5, 7 e 11 não foram expressas nos grupos LE e ICEC, estando presentes apenas no grupo controle. Esta diferença foi significativa apenas para as claudinas 7 (p=0,013) e 11 (p=0,001). A proteína p53 foi mais expressa no grupo ICEC, seguida pelo LE e pelo grupo controle (p=0,017). CONCLUSÕES: As claudinas 5, 7 e 11 não se expressaram nos casos de LE e/ou ICEC. As claudinas 7 e 11 foram expressas apenas no grupo controle. Houve perda da expressão das claudinas 7 e 11 nos grupos com doença (LE e ICEC), em comparação ao grupo controle. Não houve diferença na expressão de claudinas entre os grupos LE e ICEC. Observou-se presença de p53 nos grupos estudados, cuja distribuição variou conforme o grupo analisado. Esta expressão foi maior no grupo ICEC, seguido pelo LE e, menor, no grupo controle / AIMS: Vulvar squamous cell carcinoma (SCC) is a rare gynaecologic cancer. Vulvar SCC has been shown to develop from vulvar intraepithelial neoplasias (VINs), which are related to lichen sclerosus (LS). Most studies to date have compared vulvar SCC to LS only morphologically, but no detailed molecular analysis has been performed. Our objective was to compare claudin and p53 expression in these diseases and determine if there was an association with expression and vulvar SCC progression. METHODS: Immunohistochemical analysis was performed in order to determine expression of p53 and claudin 1, 2, 3, 4, 5, 7, and 11 in human vulvar tissue samples from LS, SCC, and control patients. RESULTS: Claudin 1, 2, 3, 4, and 5 were expressed comparably in the three groups. Claudin 7 and 11 expression was significantly decreased in LS and SCC samples (p=0,013 and 0,001, respectively) compared with the control group. Expression of p53 was significantly increased in SCC and LS patient samples compared with the control group (p=0,017). CONCLUSIONS: Claudins 7 and 11 were expressed only in control group. There was loss of expression of claudins 7 and 11 in the disease groups (LS and/or SCC), comparing to control group. However, there was no significant difference in expression of any of the claudins between the LS and SCC samples. Furthermore, p53 expression is higher in SCC patients and lower in control group. However, expression of p53 did not vary between samples from isolated LS (ILS) and LS associated with SCC (ALSSCC) patients