Estudos empíricos têm mostrado que a Análise de Mutantes – um dos critérios de teste baseado em erros – é bastante eficaz em revelar a presença de erros. Entretanto, seu alto custo, decorrente principalmente do grande número de mutantes gerados, tem motivado a proposição de diversas abordagens alternativas para a sua aplicação. Um estudo relevante nesse sentido resultou na determinação de um conjunto essencial de operadores de mutação para a linguagem Fortran, mostrando-se que é possível reduzir o custo de aplicação do critério, preservando um alto grau de adequação em relação à Análise de Mutantes. Alguns estudos também têm demonstrado que a redução da eficácia não é significativa. Este trabalho tem como objetivo investigar alternativas pragmáticas para a aplicação do critério Análise de Mutantes e, nesse contexto, é proposto um procedimento para a determinação de um conjunto essencial de operadores de mutação para a linguagem C, a partir dos operadores implementados na ferramenta Proteum. Procurando aplicar e validar o procedimento proposto, dois grupos distintos de programas são utilizados. Para ambos os grupos, o conjunto essencial obtido apresenta resultados bastante significativos quanto à redução de custo, com um decréscimo muito pequeno no grau de adequação em relação à Análise de Mutantes. Estratégias para evoluir e refinar um conjunto essencial para diferentes domínios de aplicação também são investigadas. / Mutation Analysis – one of the error based criteria – has been found to be effective on revealing faults. However, its high cost, due to the high number of mutants created, has motivated the proposition of many alternative approaches for its application. In this perspective, a relevant study resulted on the determination of a sufficient mutant operator set for Fortran, indicating that it is possible to have a large cost reduction of mutation testing, preserving a high mutation score. Some studies have also shown that the reduction on the effectiveness is not significant. This work aims to investigate pragmatic alternatives for mutation analysis application and, in this context, a procedure for the determination of a sufficient mutant operators set for C is proposed, using Proteum testing tool. Aiming to apply and validate the proposed procedure, two different groups of programs are used. For both of them, the sufficient mutant operator set presents very significant results in terms of cost reduction, with a very small reduction on the mutation score. Strategies to evolve and refine an essential mutant operator set to different application domains are also investigated.

Sistemas Reativos caracterizam-se por reagir continuamente a estímulos externos e internos e controlar atividades humanas. A ocorrência de falhas nesses sistemas pode resultar em grandes prejuízos. Dessa forma, o uso de métodos e técnicas rigorosas para a especificação do comportamento desse tipo de sistema é essencial, buscando-se evitar inconsistências e ambigüidades no modelo. Redes de Petri é uma das técnicas que têm sido usadas para a especificação de sistemas reativos. Teste e validação são atividades essenciais na produção dessa classe de sistemas. Por isso, o critério Análise de Mutantes, um critério de teste baseado em erros normalmente aplicado ao teste de programas, tem sido explorado no contexto de teste de especificações de sistemas reativos. É necessário o desenvolvimento de ferramentas que apóiem sua utilização, visto que a aplicação manual do critério é impraticável. O objetivo deste trabalho é a implementação da ferramenta Proteum-RS/PN, que apóia a aplicação do critério Análise de Mutantes para validar especificações baseadas em Redes de Petri. / Reactive Systems are characterized by continuously reacting to external as well as internal stimuli and controlling human activities. In these systems, faults can result in large losses. The use of rigorous methods and techniques for the specification of their behavior is essential to avoid inconsistencies and ambiguities. Petri Nets have been used for reactive-system specification. The test and validation of the underlying model are essential activities for the production of such systems. Thus, the Mutant Analysis -- a fault-based criterion usually used for program testing -- has been explored in the context of specification testing. The development of tools to support its application is necessary, since its manual application is unrealistic. The objective of this work is the implementation of Proteum-RS/PN, a testing tool which supports the application of Mutant Analysis criterion to validate Petri-Nets based specifications.

Haloferax mediterranei es un microorganismo halófilo extremo que se incluye dentro del Dominio Archaea. Es capaz de crecer utilizando carbohidratos, ácidos carboxílicos, alcoholes y aminoácidos como fuentes de carbono y energía. Además, puede crecer en medio definido en presencia de glucosa como única fuente de carbono, y con nitrato o nitrito como única fuente de nitrógeno a través de la vía de asimilación utilizando las nitrato y nitrito reductasas asimilativas. El nitrato lo utiliza reduciéndolo a amonio, el cual es incorporado a esqueletos carbonados vía glutamato deshidrogenasa (GDH) en condiciones de exceso de nitrógeno o mediante la ruta glutamina sintetasaglutamato sintasa (GS-GOGAT) bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno. La glutamina sintetasa (GS; EC 6.3.1.2) se encuentra en todos los Dominios, que participa en la asimilación del amonio y en la biosíntesis de glutamina, actuando como donador de nitrógeno para la síntesis de proteínas y de ácidos nucleicos. Esta enzima cataliza la biosíntesis de glutamina mediante la reacción biosintética dependiente de magnesio o manganeso, a partir de glutamato, ATP y amonio. En el genoma de Hfx. mediterranei se localizaron tres genes que presentaron homología con glutamina sintetasa, en base a la presencia de tres dominios conservados (COG0174: transporte y metabolismo de aminoácidos; pfam00120: dominio catalítico y pfam03951: dominio beta-Grasp) que se utilizan para identificar a las GSs. También se observó que uno de los genes mantiene conservadas las tres secuencias consenso características de GSs (glnA), mientras que los otros dos genes (glnA-2 y glnA-3) contienen parcialmente conservada una de ellas. Con el objetivo de conocer qué funciones desempeñan estas tres proteínas en la asimilación del nitrógeno, y si concretamente glnA-2 y glnA-3 ejercen un papel importante en este proceso, cada una de las tres proteínas halofílicas se clonó y expresó heterólogamente en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, utilizando el vector de expresión pET3a, obteniéndose las proteínas en forma de cuerpos de inclusión. Cada una de estas fracciones sólidas se solubilizaron utilizando urea 8 M, y posteriormente se diluyeron en un tampón conteniendo NaCl 2 M y DTT 5 mM para conseguir su renaturalización. Posteriormente, se llevó a cabo la purificación de cada una por separado mediante una única etapa a través de una cromatografía en DEAE-celulosa; obteniéndose puras cada una de las proteínas y concentradas de forma rápida y con un buen rendimiento. La caracterización de la GS (GlnA) recombinante indicó que se trataba de una enzima dependiente de metales catiónicos divalentes, regulada por los efectores 2-oxoglutarato y glutamina. La proteína fue activada por 2-oxoglutarato e inhibida por glutamina. Mediante la técnica de velocidad de sedimentación se determinó que su estructura oligomérica consistía en 12 subunidades y se clasificó como GS tipo I, incluida en la subdivisión α. Se generaron mutantes de deleción de glnA y glnA-3 en Hfx. mediterranei mediante la técnica pop-in pop-out, que permitió la sustitución de una secuencia concreta del genoma por otra modificada in vitro. Para la obtención de los mutantes se utilizó la cepa HM26 (ΔpyrE2) de Hfx. mediterranei. Primeramente, se construyó un cassette de deleción para la obtención de un producto de fusión de 1000 pb (versión incompleta del gen) que se clonó en el vector pMH101N, conteniendo una copia del gen pyrE2, el cual se utilizó como marcador genético. Los mutantes pop-in se seleccionaron en un medio carente de uracilo, ya que sólo las células que codificaron el gen pyrE2, presente en el plásmidos suicida, pudieron sintetizar de novo dicho compuesto y crecer. Posteriormente, el plásmido suicida se perdió y junto con él una de las copias del gen, delecionada u original (mutante pop-out). Finalmente se obtuvieron los mutantes de deleción para los genes glnA y glnA-3, de los cuales glnA resultó ser un gen esencial en la asimilación de amonio y en la síntesis de glutamina, puesto que aquellos mutantes que presentaron la deleción de glnA fueron incapaces de crecer en un medio definido carente de glutamina; se trató por tanto de mutantes auxótrofos para este aminoácido, que únicamente crecieron al adicionar glutamina en el medio de cultivo. Finalmente, para conocer el efecto que produce la fuente de nitrógeno sobre la expresión global de los genes en Hfx. mediterranei, se realizó un array de expresión de la cepa R4 (silvestre) y se determinó la expresión global de genes en tres medios de cultivo con diferentes fuentes de nitrógeno: cultivo con amonio como fuente de nitrógeno en fase estacionaria y exponencial de crecimiento, cultivo con nitrato en mitad de fase exponencial de crecimiento y cultivos con carencia de nitrógeno. Las principales diferencias en expresión de genes se detectaron en los medios de nitrato y carencia de nitrógeno con respecto a amonio, los resultados sugirieron que la ausencia de amonio fue el factor responsable para la expresión de genes implicados en la ruta de asimilación de nitrato. Concretamente, en carencia de nitrógeno la GS mostró una mayor expresión que en medio con amonio. Para analizar los cambios de expresión en los genes glnA-2 y glnA-3 se realizó un nuevo array de expresión de la cepa HM26-A (ΔpyrE2 ΔglnA) utilizando como control la cepa parental HM26 (ΔpyrE2). Se determinó la expresión en dos medios de cultivo, en medio complejo suplementado con glutamina 40 mM en mitad de fase exponencial de crecimiento y en medio con carencia en nitrógeno. Tanto en la cepa HM26-A con carencia en nitrógeno como en la cepa parental HM26 se detectaron cambios de expresión en los genes relacionados con la vía asimilativa del metabolismo del nitrógeno de esta arquea halófila. En la cepa HM26 en carencia de nitrógeno con respecto a medio complejo con gln 40 mM se mostró una menor expresión de los genes glnA-2 y glnA-3 y una sobreexpresión de glnA. Mientras que en la cepa HM26-A en medio complejo con glutamina frente a la cepa HM26 en medio complejo en carencia de nitrógeno, al delecionar glnA, los genes glnA-2 y glnA-3 mostraron un incremento de expresión.que en la cepa HM26-A en medio complejo con glutamina frente a la cepa HM26 en medio complejo en carencia de nitrógeno, al delecionar glnA, los genes glnA-2 y glnA-3 mostraron un incremento de expresión. En conclusión, la glutamina sintetasa de Hfx. mediterranei es una enzima de tipo GSI-α, dodecamérica, resultando ser una proteína esencial en la asimilación de amonio y en la síntesis de glutamina; siendo activa en condiciones de deficiencia de nitrógeno, a diferencia de las isoformas GlnA-2 y GlnA-3 que podrían ejercer un papel regulador de GlnA y posiblemente actúen en la célula en condiciones de abundancia de nitrógeno.

Tesis por compendio / [ES] La proteína quinasa GCN2 es una proteína conservada en todos los eucariotas implicada en el control de la traducción en condiciones de estrés. Está considerada un punto clave en el control de la homeostasis celular y un sensor de distintas condiciones de estrés. El estrés que inició su caracterización en levaduras y células animales es el ayuno de aminoácidos, pero recientemente se ha observado activación de este sistema ante multitud de estreses tanto bióticos como abióticos. El sistema GCN se ha descrito ampliamente en Saccharomyces cerevisiae: GCN2 se une a las proteínas GCN1 y GCN20, permitiendo la activación de la quinasa en situaciones de ayuno de aminoácidos. GCN2 se activa por tRNA no cargados, y posteriormente fosforila al factor de traducción eIF2¿, lo que conlleva una reducción de la síntesis global de proteínas, pero también una mayor traducción de mRNA específicos, como los que codifican a GCN4. Este factor de transcripción regulará la expresión de nuevos genes, lo que permite que la célula pueda iniciar una respuesta de adaptación al estrés. En plantas se desconoce con detalle como el sistema GCN contribuye a mitigar el estrés y controlar la homeostasis. Las tres proteínas conocidas de este sistema tienen homólogos en Arabidopsis. Diversos estudios indican que el mecanismo de actuación de GCN2 en plantas presenta muchas incógnitas. Mientras que la quinasa GCN2 de plantas se activa bajo diferentes situaciones de estrés, la participación de los homólogos de GCN1 y GCN20 en estos procesos es controvertida, y recientemente se ha propuesto un nuevo papel para GCN1 en la traducción, independiente de GCN2. El homólogo de GCN1 en plantas está implicado en la inmunidad innata y adquirida y sus líneas mutantes presentan fenotipos muy diferentes a los de las líneas mutantes en GCN2. La relación funcional entre estos dos genes sigue siendo difícil de definir en plantas. En esta tesis, demostramos que, aunque los genes GCN1 y GCN2 de Arabidopsis son necesarios para mediar la fosforilación de eIF2¿ tras tratamientos con glifosato, inhibidor de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, los mutantes de pérdida de función de ambas líneas desarrollan distintos fenotipos de raíz y cloroplasto. Los experimentos de microscopía electrónica revelan que los mutantes en GCN1, pero no en GCN2, se ven afectados en la biogénesis de cloroplastos, lo que explica el fenotipo macroscópico observado previamente para estos mutantes. Los mutantes en GCN1 presentan una compleja reprogramación transcripcional que afecta, entre otros, a las respuestas relacionadas con los mecanismos de defensa, fotosíntesis y al correcto plegamiento de las proteínas. Por otro lado, mostramos que ninguno de los cinco genes homólogos a GCN20 en Arabidopsis en necesario para la fosforilación de eIF2¿. Además, los fenotipos bajo estrés abiótico de plantas mutantes en los mismos, y el desarrollo de sus cloroplastos, sugiere que GCN20 está funcionalmente relacionado con GCN1, pero no con GCN2, algo que se confirma ya que los mutantes gcn1 y gcn20 comparten una reprogramación transcripcional similar, afectando a la fotosíntesis y a las respuestas frente al estrés. Identificamos la proteína quinasa GCN2 como un componente celular que fomenta la acción del glifosato en Arabidopsis. Los estudios comparativos que utilizan plántulas mutantes de pérdida de función de GCN2 muestran que el programa molecular que la planta despliega después del tratamiento con el herbicida no está teniendo lugar. Además, las plantas adultas gcn2 muestran una menor inhibición de la fotosíntesis, y acumulan menos ácido siquímico que las de tipo silvestre después del tratamiento con glifosato. Algo similar ocurre tras el tratamiento con luz ultravioleta UV-B, donde mutantes de pérdida de función son más resistentes. La activación de GCN2 ante este estrés es independiente del fotorreceptor UV-B (UVR8) y de sus componentes de señalización aguas abajo y de la vía de señalización de estrés de las MAP quinasas. / [EN] The GCN2 protein kinase is a conserved protein in all eukaryotes involved in translation control under stress conditions. It is considered a key point in the control of cellular homeostasis and a sensor for a wide variety of stress conditions. Aminoacid fasting was the stress that started its characterization in yeast and animal, but recently activation of this system has been observed in both biotic and abiotic stresses. The GCN system has been extensively described in Saccharomyces cerevisiae: GCN2 binds to GCN1 and GCN20 proteins, allowing kinase activation in aminoacid fasting situations. GCN2 is activated by uncharged tRNAs, and subsequently phosphorylates the translation factor eIF2¿, leading to a reduction in overall protein synthesis, but also a greater translation of specific mRNAs, such as those encoding GCN4. This transcription factor will regulate the expression of new genes, allowing the cell to initiate an adaptive response to stress. In plants, it is not deeply known how the GCN system helps to alleviate stress and control homeostasis. All three known proteins in this system have homologs in Arabidopsis. Some studies indicate that the mechanism of action of GCN2 in plants presents many gaps. While plant GCN2 kinase is activated under different stress situations, the involvement of GCN1 and GCN20 homologs in these processes is controversial, and recently it has been proposed a new role for GCN1 in translation, independent from GCN2. The GCN1 homolog in plants is involved in innate and acquired immunity and its mutant lines present very different phenotypes from those of the GCN2 mutant lines. The functional relationship between these two genes is difficult to define in plants. In this thesis, we prove that, although the Arabidopsis GCN1 and GCN2 genes are necessary to mediate in the phosphorylation of eIF2¿ after treatments with glyphosate, an inhibitor of aromatic aminoacid biosynthesis, the loss of function mutants of both lines develop different phenotypes of root and chloroplast. Electron microscopy experiments reveal that the mutants in GCN1, but not in GCN2, are affected in chloroplast biogenesis, which explains the macroscopic phenotype previously observed for these mutants. The mutants in GCN1 present a complex transcriptional reprogramming that affects, among others, the responses related to defense mechanisms, photosynthesis and the correct folding of proteins. On the other hand, we show that none of the five GCN20 homologous genes in Arabidopsis is necessary for the phosphorylation of eIF2¿. Furthermore, the phenotypes under abiotic stress of mutant plants in them, and the development of their chloroplasts, suggest that GCN20 is functionally related to GCN1, but not to GCN2, which is confirmed because the gcn1 and gcn20 mutants share a similar transcriptional reprogramming and affects photosynthesis and stress responses. We identify the GCN2 protein kinase as a cellular component that promotes the action of glyphosate in Arabidopsis. Comparative studies using GCN2 loss-of-function mutant seedlings show that the molecular program that the plant develops after the treatment with the herbicide is not taking place. Furthermore, adult gcn2 plants show less inhibition of photosynthesis, and accumulate less shikimic acid than wild-type ones after glyphosate treatment. Something similar happens after treatment with UV-B ultraviolet light, where loss-of-function mutants are more resistant. Activation of GCN2 in the face of this stress is independent of the UV-B photoreceptor and its downstream signaling components and the stress signaling pathway of MAP kinases. / [CA] La proteína quinasa GCN2 és una proteïna conservada en tots els organismes eucariotes implicada en el control de la traducció en condicions d'estrés. Està considerada un punt clau en el control de l'homeòstasis cel.lular i es un sensor de diferents i variades condicions d'estrés. L' estrés que va iniciar la seua caracterització en llevats i cèl.lules animals és el dejuni d' aminoàcids, però recentment s'ha observat l'activació d'aquest sistema davant de multitud d'estressos tant biòtics com abiòtics. El sistema GCN ha segut descrit ampliament en Saccharomyces cerevisiae: GCN2 s'uneix a les proteïnes GCN1 y GCN20, permitint l'activació de la quinasa en situacions de dejuni d'aminoàcids. GCN2 s'activa per tRNA no carregats, i posteriorment fosforila el factor de traducció eIF2¿, donant lloc a una reducció de la síntesi global de proteïnes, però també una major traducció de mRNA específics, com els que codifiquen a GCN4. Aquest factor de transcripció regularà l'expressió de nous gens, el que permet que la cèl·lula puga iniciar una resposta d'adaptació a l'estrés. En plantes es desconeix amb detall com el sistema GCN contribueix a mitigar l'estrés i controlar l'homeòstasi. Les tres proteïnes conegudes d'aquest sistema tenen homòlegs en Arabidopsis. Diversos estudis indiquen que el mecanismo d'actuació de GCN2 en plantes presenta moltes incògnites. Mentres que la quinasa GCN2 de plantes es activada en diferents situacions d'estrés, la participació dels homòlegs de GCN1 i GCN20 en aquests processos és controvertida, i recentment s'ha proposat un nou paper per a GCN1 en la traducció, independent de GCN2. L'homòleg de GCN1 en plantes està implicat en la inmunidad innata i adquirida i les seues línies mutants presenten fenotips molt diferents als de les línies mutants en GCN2. La relació funcional entre estos dos gens continua sent difícil de definir en plantes. En esta tesi, demostrem que, encara que els gens GCN1 i GCN2 d' Arabidopsis són necessaris per a donar lloc a la fosforilació d'eIF2¿ després de ser tractada amb glifosato, inhibidor de la biosíntesi d' aminoàcids aromàtics, els mutants de pèrdua de funció d'ambes línies desenvolupen distints fenotips d'arrel i cloroplast. Els experiments de microscòpia electrònica revelen que els mutants en GCN1, però no en GCN2, es veuen afectats en la biogènesis de cloroplastos, el que explica el fenotip macroscòpic observat prèviament per a estos mutants. Els mutants en GCN1 presenten una complexa reprogramació transcripcional que afecta, entre d'altres, a les respostes relacionadaes amb els mecanismes de defensa, fotosíntesi i al correcte plegament de les proteïnes. D'altra banda, demostrem que ningun dels cinc gens homòlegs a GCN20 en Arabidopsis és necessari per a la fosforilació d' eIF2¿. Ademés, els fenotips baix estrés abiòtic de plantes mutants en ells mateix, i el desenvolupament dels seus cloroplasts, sugereixen que GCN20 està funcionalment relacionat amb GCN1, però no amb GCN2, cosa que es confirma ja que els mutants gcn1 i gcn20 compartixen una reprogramació transcripcional similar, afectant a la fotosíntesi i les respostes davant l'estrés. Identifiquem la proteïna quinasa GCN2 com un component cel.lular que fomenta l'acció del glifosato en Arabidopsis. Els estudis comparatius que utilitzen plántules mutants de pèrdua de funció de GCN2 mostren que el programa mol.lecular que la planta desplega després del tractament amb herbicida no está ocorreguent. Ademés, les plantes adultes gcn2 presenten una menor inhibició de la fotosíntesi, i acumulen menys àcid siquímic que les de tipus silvestre després de ser tractades amb glifosato. S'obté un resultat semblant després del tractament amb llum ultravioleta UV-B, on els mutants de pèrdua funció són més resistents. La activación de GCN2 ante este estrés es independiente del fotorreceptor UV-B (UVR8) y de sus componentes de señalización aguas abajo y de la vía de señalización de estrés de las MAP quinasas. / Faus Ferrer, MI. (2020). Caracterización del sistema GCN en plantas mediante la utilización de mutantes de pérdida de función [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/153809 / Compendio

A destruição funcional das vias de controle do ciclo celular constituem um evento comuns em todos os tumores humanos. Muitos estudos associam mutações em p53 com mau prognostico no tratamento do câncer. Nesse trabalho, visamos a geração e caracterização de linhagens isogênicas portando diferentes mutantes de p53 como modelo de estudo para remediação simultânea de p53 e p16 na presença de mutantes hotspots específicos. Os mutantes R175H e R248Q não geraram alterações na cinética de proliferação da linhagem H358, mas levaram a um aumento de 27,5% na eficiência de plaqueamento e, no caso de R248Q, ao dobro de eficiência na formação de colônias em suspensão. Os resultados do tratamento das linhagens isogênicas com adenovírus Adp16 e Adp53 mostraram que os mutantes não interferiram no parada do ciclo celular em G1 induzida por p16. / Alterations of the cell cycle pathway are a common event in all human tumors. Several studies have shown a correlation between hotspot mutations and an unfavorable profile for cancer therapies. Hence, this study aims the generation and characterization of isogenic cell lines, harboring p53 mutants, as model to investigate the replacement of p53 and p16 genes on these mutant H358 cell lines. Our data identified that neither p53R175H nor p53R248Q mutants accelerated cell cycle progression. However, both leads to a 27,5% increased plate efficiency while R248Q leads to a two-fold increases in the number of colonies formed in soft agar. Our data also showed that the mutants did not affect the efficiency of p16 replacement.

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In the Chapter 2 of this thesis, the compound IQG-607 is presented, which is a metal complex that has been reported as a promising anti-TB molecule against isoniazid (INH)-resistant strains of M. tuberculosis. Previous studies suggested that the compound inhibits both the wild-type NADH-dependent trans-2-enoyl-[ACP] reductase (InhA) enzyme and some of its structural mutants in the absence of NAD+ or NADH and without requiring KatG enzyme. IQG-607 has also shown a favorable toxicological profile in vivo, with a considerable lesser toxicity compared to INH. However, there is still a gap regarding the activity of IQG-607 against strains carrying mutations in the katG gene, which are the most common genetic alterations in clinical isolates resistant to INH. Therefore, this study focused in elucidating the mechanism of resistance (MOR) of the Mycobacterium tuberculosis, the main causative agent of TB, to compound IQG-607. First the minimum inhibitory concentration (MIC) of IQG-607 was established against eight multi-drug resistant (MDR) clinical isolates, which were resistant to our compound. Then spontaneous mutants were selected using high concentrations of compound in 7H10 agar medium, and their whole genomes were sequenced; the results revealed alterations in the katG gene. A laboratory strain carrying the mutant katG(S315T) gene was developed to assess the effect of this single mutation in the compound activity both by MIC determination and by a macrophage infection model. Results showed that this mutation was indeed sufficient to confer resistance to IQG-607. Finally, the resistance observed for a strain expressing a mutant InhA(S94A) protein suggested that IQG-607 has this enzyme as its molecular target. In the Chapter 3, two new compounds, called Labio-16 and Labio-17, are presented, which were previously selected to interact and inhibit the InhA enzyme and that had already shown to be active against M. tuberculosis H37Rv strain. A set of experiments were conducted to elucidate their mechanism of action (MOA) and to understand the MOR of the M. tuberculosis against them, similar to those carried for studying IQG-607. So far, results suggested that the InhA is not the molecular target of these compounds. Other experiments are undergoing in our laboratory to evaluate in a murine model of TB infection their potential as anti-TB drug candidates. / Os dados epidemiol?gicos relacionados ? tuberculose (TB) indicam que ainda existe uma carga elevada desta doen?a no mundo todo. Al?m disso, o surgimento de cepas resistentes aos f?rmacos imp?e uma nova amea?a na preven??o da propaga??o da TB. Portanto, ? fundamental buscar continuamente novos candidatos para o desenvolvimento de medicamentos. No Cap?tulo 2 desta tese ? apresentado o composto IQG-607, que ? um complexo met?lico que tem sido reportado como uma mol?cula anti-TB promissora contra cepas de M. tuberculosis resistentes ? isoniazida (INH). Estudos pr?vios sugeriram que o composto inibe a enzima selvagem trans-2-enoil-[ACP] redutase dependente de NADH (InhA) e algumas das suas mutantes estruturais, na aus?ncia de NAD+ ou NADH e sem necessitar da enzima KatG. O IQG-607 tamb?m mostrou um perfil toxicol?gico favor?vel in vivo, com uma menor toxicidade em compara??o ? INH. No entanto, ainda existe uma lacuna em rela??o ? atividade do IQG-607 contra cepas que carregam muta??es no gene katG, as quais s?o as altera??es gen?ticas mais comuns em isolados cl?nicos resistentes ? INH. Sendo assim, este estudo focou em elucidar o mecanismo de resist?ncia (MOR) do Mycobacterium tuberculosis, o principal agente causador da TB, ao composto IQG-607. Primeiramente, a concentra??o inibit?ria m?nima (MIC) do IQG-607 foi estabelecida contra oito isolados cl?nicos multirresistentes a f?rmacos (MDR), os quais foram resistentes ao nosso composto. Ent?o, mutantes espont?neos foram selecionados, usando-se altas concentra??es do composto em meio ?gar 7H10, e seus genomas completos foram sequenciados; os resultados revelaram altera??es no gene katG. Uma cepa laboratorial, carregando o gene katG(S315T) mutante, foi desenvolvida para acessar o efeito desta ?nica muta??o na atividade do composto, atrav?s da determina??o de MIC e por meio de um modelo de infec??o de macr?fagos. Os resultados mostraram que essa muta??o de fato foi suficiente para conferir resist?ncia ao IQG-607. Finalmente, a resist?ncia observada para a cepa que expressa a prote?na InhA(S94A) mutante sugeriu que o IQG-607 tem esta enzima como seu alvo molecular. No Cap?tulo 3, dois novos compostos, denominados Labio-16 e Labio-17, s?o apresentados, os quais foram previamente selecionados para interagir e inibir a enzima InhA, e que j? tinham mostrado ser ativos contra a cepa H37Rv de M. tuberculosis. Um conjunto de experimentos foi conduzido para elucidar os seus mecanismos de a??o (MOA) e para compreender o MOR do M. tuberculosis contra eles, similar ?quele usado para estudar o IQG-607. At? o momento, os resultados sugerem que a InhA n?o ? o alvo molecular desses compostos. Outros experimentos est?o em andamento em nosso laborat?rio, para avaliar em um modelo murino da infec??o da TB os seus potenciais como candidatos a f?rmacos anti-TB.

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Le système endocannabinoïde est un important modulateur des fonctions physiologiques. Dans le cerveau, son contrôle s’exerce essentiellement par les récepteurs cannabinoïdes de type 1 (CB1). Les récepteurs CB1 sont abondamment exprimés sur les neurones excitateurs glutamatergiques et les interneurones inhibiteurs GABAergiques et leur stimulation inhibe la libération du glutamate et du GABA. Récemment, l’activité des récepteurs CB1 sur les astrocytes a été proposée comme facilitant la transmission excitatrice. Par ce contrôle général de la neurotransmission, l’activité des récepteurs CB1 induit différents phénomènes de plasticté synaptique associés aux processus de mémoire. Les récepteurs CB1 jouent un rôle complexe dans les fonctions de mémoire. En particulier, la stimulation exogène des récepteurs CB1 perturbe la mémoire de travail. D’autre part, la signalisation endogène des récepteurs CB1 est nécessaire à l’adaptation des réponses de peur apprises. Cependant, les mécanismes par lesquels les récepteurs CB1 régulent ces processus de mémoire n’ont été que peu analysés. L’objectif de ce travail fut de caractériser les mécanismes cellulaires par lesquels les récepteurs CB1 contrôlent la mémoire de travail et les réponses de peur apprises. Nous avons utilisé les modèles de mutation constitutive et conditionnelle des récepteurs CB1 chez la souris afin d’analyser les conséquences de la délétion de ces récepteurs sur des types cellulaires particuliers. Dans une première étude, nous avons montré que les cannabinoïdes exogènes tels que le Δ9-tetrahydocannabinol (THC, principal composé psychoactif du cannabis) induisent des déficits de mémoire de travail spatiale par la stimulation des récepteurs CB1 exprimés sur les astrocytes. Les cannabinoides induisent une forme de dépression à long-terme dans l’hippocampe dont plusieurs mécanismes cellulaires sont similaires à ceux supportant les déficits de mémoire mis en évidence par l’analyse comportementale. Ces résultats suggèrent que les cannabinoïdes altèrent la mémoire de travail spatiale par une modification de la plasticité synaptique de l’hippocampe induite par la stimulation des récepteurs CB1 astrogliaux. Dans une seconde étude, nous avons mis en évidence que les récepteurs CB1 localisés sur les neurones GABAergiques et glutamatergiques exercent un contrôle opposé sur le type de réponse élicité par un stimulus conditioné aversif. La ré-expression sélective des récepteurs CB1 dans l’amygdale des souris mutantes constitutives a permis de préciser l’implication de cette structure dans la régulation des réponses de peur conditionnées par les récepteurs CB1.L’ensemble de ces travaux indiquent que le système endocannabinoïde contrôle les fonctions de mémoire par une régulation de l’activité de cellules spécifiques dans le cerveau. L’implication des astrocytes dans les effets des cannabinoïdes sur la mémoire souligne l’importance de ces cellules dans les processus cognitifs et suggère que les récepteurs CB1 astrogliaux jouent un rôle dans d’autres fonctions cérébrales. Nos résulats révèlent également l’importance de l’évaluation de différents comportements dans le cadre des modèles expérimentaux d’adaptation à la peur. / The endocannabinoid system is an important regulator of physiological functions. In the brain, this control is mainly exerted through the type-1-cannabinoid (CB1) receptors. CB1 receptors are abundant at excitatory glutamatergic and inhibitory GABAergic neuron terminals where their stimulation inhibits neurotransmitter release. The activity of CB1 receptors on astrocytes has been recently proposed as facilitating excitatory transmission. Through this general control on brain neurotransmission, CB1 receptors mediate distinct forms of synaptic plasticity that are associated with memory processing. Indeed, CB1 receptors control memory functions. In particular, the exogenous stimulation of CB1 receptors impairs working memory. Moreover, the endogenous CB1 receptor signalling ensures the adaptation of learned fear responses. However, the brain mechanisms of this CB1-mediated control of memory functions are poorly characterized. The goals of this research work were to dissect the cellular mechanisms by which CB1 receptors control both working memory and learned fear responses. We used constitutive and conditional mutagenesis in mice to address the roles of CB1 receptors on particular cell types in these functions. We first showed that exogenous cannabinoids, including Δ9-tetrahydocannabinol (THC, the main psychoactive constituent of cannabis), impairs spatial working memory through the stimulation of astroglial CB1 receptors. Cannabinoids also induce a form of in vivo long-term depression in the hippocampus that shares several cellular mechanisms with the cannabinoid-induced working memory impairments. These results suggest that cannabinoids disrupt spatial working memory by altering hippocampal synaptic plasticity through astroglial CB1 receptor stimulation. We then showed that CB1 receptors expressed on GABAergic and glutamatergic neurons oppositely control fear coping strategies in the presence of fear conditioned stimuli. The selective and local re-expression of CB1 receptors in the amygdala of constitutive CB1 mutant mice allowed to precise the involvement of this brain structure in the regulation of conditioned fear responses by CB1 receptors. Altogether, these studies indicate that the endocannabinoid system differentially controls memory functions through its distinct modulation of the activity of specific brain cells. The involvement of astrocytes in the effects of cannabinoids on memory highlights their key roles in cognitive processes and further suggests that astroglial CB1 receptors might play a role in other high order brain functions. Our results also point the importance of performing thorough behavioral analyses in the experimental models of fear adaptation.

A destruição funcional das vias de controle do ciclo celular constituem um evento comuns em todos os tumores humanos. Muitos estudos associam mutações em p53 com mau prognostico no tratamento do câncer. Nesse trabalho, visamos a geração e caracterização de linhagens isogênicas portando diferentes mutantes de p53 como modelo de estudo para remediação simultânea de p53 e p16 na presença de mutantes hotspots específicos. Os mutantes R175H e R248Q não geraram alterações na cinética de proliferação da linhagem H358, mas levaram a um aumento de 27,5% na eficiência de plaqueamento e, no caso de R248Q, ao dobro de eficiência na formação de colônias em suspensão. Os resultados do tratamento das linhagens isogênicas com adenovírus Adp16 e Adp53 mostraram que os mutantes não interferiram no parada do ciclo celular em G1 induzida por p16. / Alterations of the cell cycle pathway are a common event in all human tumors. Several studies have shown a correlation between hotspot mutations and an unfavorable profile for cancer therapies. Hence, this study aims the generation and characterization of isogenic cell lines, harboring p53 mutants, as model to investigate the replacement of p53 and p16 genes on these mutant H358 cell lines. Our data identified that neither p53R175H nor p53R248Q mutants accelerated cell cycle progression. However, both leads to a 27,5% increased plate efficiency while R248Q leads to a two-fold increases in the number of colonies formed in soft agar. Our data also showed that the mutants did not affect the efficiency of p16 replacement.

A Síndrome de Marfan (SMF) é a enfermidade hereditária mais comum dentre as que afetam o sistema conjuntivo, causada por mutações da glicoproteína fibrilina-1, o principal componente estrutural das microfibrilas elásticas da matriz extracelular. As manifestações fenotípicas da SMF são sistêmicas e acometem tipicamente os sistemas ocular, esquelético e cardiovascular, este uma importante causa de morbi-mortalidade. Entretanto, não está claro como a mutação induz a doença. Estudos anteriores sugerem anomalias morfológicas do retículo endoplasmático (RE) ou retenção intracelular da fibrilina-1 nos estágios avançados da SMF. Entretanto, a contribuição do enovelamento da fibrilina-1 mutada e do estresse do RE na fisiopatologia celular da SMF não é conhecida. Proteínas mal-enoveladas podem levar à retenção intracelular e/ou aumento da degradação através da via de degradação associada ao RE (ERAD), além da indução da resposta a proteínas mal-enoveladas (UPR), ambas com potencial contribuição à fisiopatologia de doenças, incluindo a SMF. Assim, estudamos em fibroblastos embrionários isolados de camundongos (MEFs) com SMF se a fibrilina-1 mutada é reconhecida pelo controle de qualidade do RE pelo seu mal- enovelamento e induz estresse do RE por sua retenção intracelular. Demonstramos que a mutação na fibrilina-1 per se não promoveu chaperonas marcadoras de UPR ou geração de oxidantes. Além disso, não levou a uma maior sensibilização das células à indução exógena de estresse do RE, nem promoveu maior morte celular após inibição do proteassoma. Além disso, não foi observada retenção intracelular da fibrilina-1 nas células SMF, e mesmo após inibição da via secretora ou indução de estresse do RE, a inibição da secreção da fibrilina-1 foi similar nos MEFs SMF e wild-type (WT). A dissulfeto isomerase proteica (PDI), uma importante chaperona redox do RE, interage com fibrilina-1, e seu silenciamento levou a um aumento na secreção da fibrilina-1 pelos MEFs WT, mas não SMF. Além disso, o silenciamento da PDI promoveu a desorganização da matriz extracelular depositada de fibrilina-1 nos MEFs WT, enquanto nos MEFs SMF, a desorganização basal da matriz não foi adicionalmente alterada. Em paralelo, investigações in vivo mostraram que o estresse do RE não é induzido em camundongos SMF com 1 ou 3 meses de idade, apesar de manifestações fenotípicas evidentes. Entretanto, concomitante à progressão da doença, detectamos a ocorrência de estresse do RE nas aortas ascendentes dos camundongos aos 6 meses. Esta detecção foi exclusiva desta região da aorta e não ocorreu em outros órgãos afetados ou não afetados pela SMF. Assim, a manifestação do fenótipo clássico da SMF não requer uma perda da homeostase do RE diretamente induzida pela fibrilina-1 mutada. Ao contrário, esta é capaz de evadir mecanismos de controle de qualidade mediados pela PDI, sendo secretada normalmente. Assim, esta evasão do controle de qualidade pela PDI é uma condição permissiva essencial para o fenótipo da SMF. Por outro lado, o estresse do RE é uma característica evolutiva do aneurisma da aorta ascendente na SMF concomitante ao agravamento do fenótipo neste tecido / Marfan syndrome (MFS) is the most common connective tissue hereditary disease, caused by mutations in the glycoprotein fibrillin-1, the main structural component of extracellular matrix elastic microfibrils. MFS phenotypic manifestations are systemic and typically involve the ocular, skeletal and cardiovascular systems, the latter a major cause of morbidity/mortality. However, how gene mutation induxes disease is yet unclear. Previous studies suggest endoplasmic reticulum (ER) morphological abnormalities or fibrillin-1 intracellular retention in advanced MFS stages. However, the contribution of mutated fibrillin-1 folding and ER stress to MFS cellular pathophysiology is unknown. Un/misfolded proteins may associate with their intracellular retention and/or increased degradation through ER-associated degradation (ERAD), in addition to inducing the unfolded protein response (UPR), both sharing potential contributions to disease pathophysiology, including MFS. Thus, we studied in embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from WT and MFS mice, if mutated fibrillin-1 can be recognized by ER quality control as a misfolded protein, able to induce ER stress due to its intracellular retention. We showed that fibrillin-1 mutation by itself did not promote UPR chaperone markers or oxidant generation. Moreover, it did not sensitize cells to exogenous ER stress nor affected cell survival curves after proteasome inhibition. Furthermore, no intracellular retention of fibrillin-1 was observed in MFS cells, and even after secretory pathway inhibition or ER stress induction, fibrillin-1 secretion inhibition was similar in MFS and wild-type (WT) MEFs. Protein disulfide isomerase (PDI), an important ER redox chaperone, interacts with fibrillin-1 and its silencing induced an increased fibrillin-1 secretion in WT, but not MFS MEFs. Besides, PDI silencing promoted fibrillin-1 extracellular matrix disorganization in WT MEFs, whereas in MFS MEFs, the basal matrix disorganization was not further modified. Parallel in vivo evaluations demonstrated that ER stress is also not induced in 1 and 3 month-old mice MFS, despite evident phenotypical manifestations. However, concomitant to accelerated disease progression at 6 months, ER stress was detectable in ascendant aorta, but not in other disease-affected or unaffected organs. Thus, classic MFS phenotype manifestations do not require loss of ER homeostasis directly induced by mutated fibrillin-1. Contrarily, the latter can evade a PDI-mediated quality control mechanism to be normally secreted. Therefore, evading such PDI-mediated quality control is an essential permissive condition for enabling the MFS phenotype. On the other hand, ER stress is an evolutive feature of MFS ascendant aorta aneurysm concomitant to phenotype progression in this tissue