Orientador: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Paula Rahal / Banca: Carlos Eugênio Cavasani / Resumo: A região Amazônica apresenta extensas áreas de floresta e ecossistemas naturais, provendo condições favoráveis para a existência de muitos arbovírus. Mais de 200 arbovírus foram isolados na região Amazônica, e aproximadamente 40 estão associados a doenças humanas. Quatro dos 40 são considerados ser de importância para a saúde pública no Brasil: vírus da Dengue (sorotipos 1 a 4), Oropouche, Mayaro e Febre Amarela. Juntamente com os arbovírus, a malária é uma doença endêmica, e aproximadamente 98% dos casos estão restritos á região da Amazônia Legal. Este trabalho teve como objetivo analisar 111 amostras clínicas de soro de pacientes que residiam em Novo Repartimento (Pará), Porto Velho (Rondônia), Plácido de Castro (Acre) e Oiapoque (Amapá) previamente confirmados para malária. Para tal finalidade, foi utilizada a técnica de Multiplex-Nested-PCR e RT-Nested-PCR para a detecção e identificação dos principais arbovírus brasileiros, pertencentes aos gêneros Flavivirus, Alphavirus e Orthobunyavirus. Duas amostras de pacientes de Novo Repartimento foram positivas para Dengue sorotipo 2, e também, ambos tinham infecção por Plasmodium vivax . Apesar de dados escassos, infecções duplas por dengue e malária deveriam ser comuns em áreas onde ambas as doenças são co-endêmicas em muitas partes do mundo. Na região Amazônica Brasileira, esta situação provavelmente ocorre mais frequentemente que a detectada. Apesar de ambas as doenças causarem sintomas similares, e infecções simultâneas com dois agentes etiológicos podem resultar em uma doença com sintomas sobrepostos, e possivelmente, tanto o espectro clínico da doença e/ou o tratamento pode ser afetado. Neste contexto uma coinfecção por malaria e dengue não poderia ser descartada, e o diagnóstico deveria ser realizado concomitantemente para dengue e malária... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Amazon region has extensive forested areas and natural ecosystems, providing suitable conditions to the existence of several aboviruses. Over 200 arboviruses were isolated in the Amazon region, and about 40 are associated to human diseases. Four out of 40 are considered to be of public health importance in Brazil: dengue virus (serotypes 1-4), Oropouche, Mayaro and Yellow Fever. Along with aboviruses, malaria is an endemic disease caused by protozoans Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax and Plasmodium malariae in Brazil, and about 98% of the cases are restricted to the Legal Amazon region. The aim of this study was to test 99 serum clinical samples from patients living in Novo Repartimento (Pará), Porto Velho (Rondônia), Plácido de Castro (Acre) and 12 plasma samples from patients living in Oiapoque (Amapá), previously confirmed for malaria. For this purpose, we used Multiplex-Nested-PCR and RT-Nested-PCR assays for detection and identification of the major Brazilian arboviruses, belonging to the genus Flavivirus, Alphavirus and Orthobunyavirus. We detected Dengue virus serotype 2 in two serum samples from patients living in Novo Repartimento, and both had active Plasmodium vivax infections. Despite scant data, dual dengue and malaria dual infections should be common in areas where both diseases are co-endemic in many places of the world. In the Amazon region, this situation is likely to occur more frequently than detected. In spite of having similar clinical findings, and simultaneous infections with two etiological agents can result in a disease with overlapped symptoms, possibly either clinical spectrum of the disease or treatment can be affected. In this context, concurrent dengue and malaria could not be ruled out, and diagnosis should be made concomitantly in febrile patients living or returning from areas where both diseases are co-endemic... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Henrique M. C. da Silveira / Banca: Alexandre A. Peixoto / Resumo: Estudos recentes vêm elucidando a importância de uma diversidade de proteínas do intestino médio de insetos vetores, tanto nos processos de digestão como em respostas imunológicas e interações parasita-hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo analisar a expressão de genes do intestino médio de Anopheles aquasalis, um importante vetor de malária no Brasil, a partir de clones sequenciados de bibliotecas de cDNA de machos e fêmeas alimentados apenas com sacarose. Nas fêmeas, pôde-se notar a grande predominância de serino proteases, proteínas ligantes de quitina e fatores relacionados à imunidade. Os machos também apresentaram diversos peptídeos de defesa imune, porém apenas uma protease digestiva e uma glicosidase. Alguns genes foram selecionados das bibliotecas para estudo de suas expressões durante a vida de An. aquasalis. Tripsina 1, peritrofina 1 e quinurenina 3-monooxigense tiveram seus níveis de expressão aumentados 6h após a ingestão de sangue, analisados através de qRT-PCR. No entanto, o silenciamento desses genes não resultou em alterações na longevidade de fêmeas adulta. O gene da serpina foi expresso em todas as fases do desenvolvimento do mosquito, exceto em ovos; e o gene da cecropina foi expresso em trato digestivo e carcaça de machos e fêmeas, principalmente após alimentação de açúcar ou sangue. Considerando que a ingestão de alimentos é a principal porta de entrada a microorganismos durante a vida adulta destes mosquitos, a presença de diversos produtos antimicrobianos, bem como a precoce expressão de peritrofina, outra proteína relacionada com a proteção do trato digestivo, mostrou que An. aquasalis está bem preparado imunologicamente contra esses microorganismos. Esta proteção está envolvida com o hábito alimentar desta espécie e pode também estar associada à sua baixa capacidade vetorial com relação aos plasmódios. / Abstract: The importance of midgut proteins of Anopheles aquasalis has been elucidated both in digestion process as in immune responses and parasite-host interactions. This project targeted to analyze the midgut genes expression from An. aquasalis, an important malaria vector in Brazil, selecting clones from midgut cDNA library of female and male mosquitoes fed only on sugar. Serine proteases were predominant in females besides chitin binding proteins and immunity factors. Male mosquitoes also showed immune defense peptides, however only one digestive protease and one glucosidase. Some genes were selected from these libraries to expression study during mosquito development stages. Trypsin 1, peritrophin 1 and kynurenine 3-monoxygenase expression were up regulated at the midgut 6h after blood feeding, analyzed by real time PCR. Nevertheless, the gene silencing did not change the survivorship of adult females. Serpin gene was expressed in all mosquito development stages but eggs; cecropin gene was expressed in midgut and carcass from male and female, mainly after sugar or blood feeding. Considering the alimentation is the main entrance way of pathogens, the presence of antimicrobial peptides as the early peritrophin expression showed that An. aquasalis is immunologically adapted against these microorganisms. This protection is involved in feeding behavior of this specie and can be also related to its low Plasmodium vector capacity. / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2002. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2011-05-09T19:33:52Z No. of bitstreams: 1 2002_PedroLuizTauil.pdf: 327721 bytes, checksum: 7cc450ced9cb0da67972d1ef0120acc5 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(tempestade_b@hotmail.com) on 2011-05-10T15:42:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2002_PedroLuizTauil.pdf: 327721 bytes, checksum: 7cc450ced9cb0da67972d1ef0120acc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-10T15:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2002_PedroLuizTauil.pdf: 327721 bytes, checksum: 7cc450ced9cb0da67972d1ef0120acc5 (MD5) / INTRODUÇÃO. Desde o início da última década de 70, em decorrência da ocupação intensa e desordenada da Amazônia brasileira, a malária vem se constituindo em um dos principais problemas de saúde da região. Existem fatores favoráveis à transmissão da doença: temperatura, umidade, altitude e cobertura vegetal adequadas à proliferação do mosquito vetor e condições habitacionais e de trabalho facilitadoras do contacto deste vetor com os seres humanos. Por outro lado, existem dificuldades de seu controle: ausência total ou parcial de paredes para aplicação de inseticida, acesso difícil a muitas localidades, precariedade dos serviços permanentes de saúde. A mudança da estratégia global de luta contra a malária, por meio do seu controle integrado e não mais de sua erradicação, e a implantação do Sistema Único de Saúde (SUS) no Brasil, com descentralização das ações de assistência e controle de doenças, determinaram uma alteração nas atividades de combate à malária na Amazônia, consubstanciada no Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária na Amazônia Legal (PIACM), iniciado em julho de 2 000, promovido pela Fundação Nacional de Saúde (FUNASA), do Ministério da Saúde. OBJETIVOS. Avaliar a efetividade do plano na região como um todo e, especificamente, em dois estados onde houve diferenças temporais na sua implantação. METODOLOGIA. Estudo epidemiológico do tipo ecológico, onde a variável independente é a implantação do plano, cuja principal característica é o controle da malária integrado ao SUS. As variáveis dependentes são os indicadores malariométricos.. Os dados foram obtidos junto à FUNASA, nas oito reuniões periódicas de avaliação do PIACM, realizadas em diferentes estados da região até abril de 2001 e em visitas de supervisão realizadas por técnicos da 15 FUNASA e pelo autor deste trabalho. Dados pluviométricos foram obtidos junto ao Instituto Nacional de Meteorologia (INMET) RESULTADOS. Ao longo da fase preparatória do plano, dois estados diferenciaram- se quanto ao momento de sua implantação: o Acre rapidamente estruturou- se, implantando-o no final de 2000 e o Amapá só veio a implantá-lo no final do primeiro semestre de 2001. Os outros estados implantaram o plano ainda em 2000 ou começo de 2 001. A incidência da malária diminuiu em todos os estados da região, reduzindo-se em 38,9 %, entre 1999 e 2001. O número de casos por P.falciparum caiu 34,4 % no mesmo período. No Acre, a incidência geral caiu 67,2 % e a de P.falciparum 76,0 % neste período. No Amapá, a incidência geral caiu 14,5 % e a de P.falciparum aumentou de 106,2 %. O Acre adotou uma estratégia de descentralização estadual do controle das endemias, diferentemente de todos os outros estados da região, que optaram pela municipalização destas ações. Os dados sobre internação e óbito por malária , referentes a 2000 e 2001, são ainda preliminares e sua análise não pode ser feita com segurança, neste momento. Não houve correlação entre a variação dos índices pluviométricos e a incidência da malária na região. CONCLUSÕES. O plano mostrou-se bastante efetivo no controle da malária. A redução observada na sua incidência foi a maior registrada desde 1961, num mesmo período. A comparação simultânea dos dados malariométricos do Estado do Acre, que implantou o plano ao final de 2000, e do Estado do Amapá, que o implantou somente no final do primeiro semestre de 2001, mostra que a redução foi 4,6 vezes maior no Acre. No primeiro semestre de 2001, o Amapá teve aumento da incidência da malária, em relação a 1999. Porém, no segundo semestre, após a implantação do plano, obteve uma redução de 52,4 %.

A malária é a doença tropical com maior taxa de mortalidade global. O surgimento de resistência às terapias de primeira linha reforça a necessidade do desenvolvimento de novos candidatos a fármacos. O objetivo deste trabalho foi a descoberta de inibidores e otimização da atividade destas moléculas como candidatos a compostos líderes para o desenvolvimento de novos agentes antimaláricos. Nesse sentido, realizamos a triagem da coleção Malaria Box e identificamos 11 moléculas de diferentes classes químicas como candidatos a inibidores da enzima enolase de Plasmodium falciparum (Pfeno). Em seguida, determinamos a potência inibitória contra a enzima alvo (IC50 entre 11 – >1.000 μM), atividade antiplasmodial in vitro contra a forma eritrocítica do parasito (EC503D7 entre 5,6–1.600 nM) e citotoxicidade (MCL50 > 19 μM) do subconjunto de 11 compostos do Malaria Box (1–11). Ensaios de combinação com o antimalárico artesunato e estágio de ação foram conduzidos para avaliar o potencial de associação e qual fase do ciclo eritrocítico seria mais suscetível as moléculas desse subconjunto. Os resultados obtidos indicam que alguns compostos apresentam caráter aditivo (2 e 9) ou antagônico (1, 3–8, 10 e 11) em relação ao artesunato e ação rápida (1–3, 5, 7, 9–11) ou lenta (4, 6 e 8) no desenvolvimento do parasita. Diante desses resultados, um conjunto de critérios estruturais e de atividade biológica foi estabelecido para a seleção de um candidato para estudos de relação estrutura-atividade (SAR). O derivado de hidrazinobenzimidazol (4) foi selecionado como hit inicial e 24 derivados (12–35) foram planejados, sintetizados e tiveram a atividade de inibição enzimática (IC50 entre 44 – >200 μM), atividade antiplasmodial contra cepas sensível (EC503D7 entre 0,19–14 μM) e resistente (EC50K1 entre 0,15–2,4 μM) e citotoxicidade (MCL50 > 3,7 μM) determinadas no primeiro ciclo de SAR. Os dados obtidos sugerem que a enzima Pfeno não é o alvo principal de ação dos derivados hidrazinobenzimidazol, contudo, a atividade antiplasmodial da série indicou razoável distribuição em termos de potência e variabilidade estrutural que permitiram a construção de um modelo HQSAR (q2= 0,64 e r2 = 0,93) adequado para o planejamento e predição da atividade inibitória de oito novos derivados hidrazinobenzimidazol (36–43). Os novos derivados foram sintetizados e tiveram sua atividade antiplasmodial (EC503D7 entre 0,10–2,3μM), citotoxicidade (MCL50 > 3 μM) e seletividade (SI > 5) determinadas. Os dados de validação prospectiva do modelo indicaram boa correlação entre a atividade real e predita para os novos derivados. Além disso, neste segundo ciclo de SAR foi descoberto o composto 41 como o mais potente (EC50 = 0,1 μM) e seletivo (SI > 2.000) da série investigada neste trabalho. Nossos resultados indicam que os derivados hidrazinobenzimidazol são moléculas atrativas para a descoberta de compostos líderes para o desenvolvimento de candidatos a fármacos antimaláricos. / Malaria is the tropical disease with the highest overall mortality rate. The emergence of resistance to first-line therapies reinforces the need for the development of new drug candidates. The main goal of this work was the discovery and optimization of these molecules as lead candidates for the development of new antimalarial agents. In this sense, we screened Malaria Box collection and identified 11 molecules from different chemical classes as inhibitor candidates of Plasmodium falciparum enolase enzyme (Pfeno). Then, we determined the inhibitory potency against the target enzyme (IC50 between 11 – >1.000 μM), in vitro antiplasmodial activity against the erythrocytic form of the parasite (EC503D7 between 5,6–1.600 nM) and cytotoxicity (MCL50 > 19 μM) of the 11 compounds subset from Malaria Box (1–11). Combination with artesunate and stage of action assays were conducted to evaluate the potential of association and which erythrocytic stage would be more susceptible to the molecules of this subset. The results obtained indicate that some compounds showed additive (2 and 9) or antagonistic (1, 3–8, 10 and 11) effect with artesunate and fast (1–3, 5, 7, 9–11) or slow (4, 6 and 8) acting on parasite development. In view of these, a set of structural and biological activity criteria was established for the selection of a candidate for structure-activity relationship (SAR) studies. The hydrazinobenzimidazole derivative (4) was selected as hit and 24 derivatives (12–35) were designed, synthesized and had the enzyme inhibitory activity (IC50 between 44 – >200 μM), antiplasmodial activity against sensitive strains (EC503D7 between 0,19–14 μM) and resistant (EC50K1 between 0,15–2,4 μM) and cytotoxicity (MCL50 > 3,7 μM) determined in the first round of SAR. The collected data suggest that Pfeno is not the main target of the hydrazinobenzimidazole derivatives. However, the antiplasmodial activity of the series indicated a reasonable distribution in terms of potency and structural variability which allowed us the development of a HQSAR model (q2 = 0,64 and r2 = 0,93) suitable for the design and prediction of the inhibitory activity of eight new hydrazinobenzimidazole derivatives (36-43). The new derivatives were synthesized and had the antiplasmodial activity (EC503D7 between 0,10–2,3μM), cytotoxicity (MCL50 > 3 μM) and selectivity (SI > 5) evaluated. The prospective validation of the HQSAR model indicated good correlation between the actual and predicted activity for the new derivatives. Moreover, in the second round of SAR, compound 41 was discovered as the most potent (EC50 = 0,1 μM) and selective (SI > 2,000) in these series. Our results indicate that the hydrazinobenzimidazole derivatives are attractive molecules for the discovery of new lead compounds for the development of antimalarial drug candidates.

A malária é uma doença infecciosa causada pelos parasitas do gênero Plasmodium e transmitida pelo mosquito Anopheles spp. Devido ao surgimento de casos de resistência aos fármacos disponíveis novos alvos e candidatos a fármacos são necessários. Recentemente, a enzima N-miristoiltransferase (NMT) foi confirmada como essencial para o parasita e validada como alvo terapêutico para o desenvolvimento de candidatos a fármacos antimaláricos. O objetivo desse trabalho foi identificar os determinantes moleculares responsáveis pela atividade inibitória de uma série de derivados benzotiofênicos frente à NMT. Nesse sentido, estudos de relação quantitativa estrutura-atividade (QSAR) 2D e 3D foram desenvolvidos para dois conjuntos de dados de derivados benzotiofênicos como inibidores da enzima do parasita (PfNMT) e a homóloga humana (HsNMT). Além disso, estudos de modelagem por homologia da PfNMT foram conduzidos. Os estudos de QSAR 2D foram desenvolvidos pelo método de Holograma QSAR (HQSAR). O modelo estrutural de PfNMT foi aplicado na construção dos modelos QSAR 3D CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis) e CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Index Analysis). Os estudos de QSAR 3D foram conduzidos com diferentes métodos de cálculo de carga parcial atômica (Gasteiger-Hückel, MMFF94 e AM1-BCC, CHELPG e Mulliken) e de alinhamento molecular (Máxima Subestrutura Comum, alinhamento flexível e baseada no alvo molecular). Os melhores modelos construídos pelos métodos de QSAR 2D e 3D foram robustos, internamente consistentes e com elevada capacidade de predição da atividade de novos compostos contra a PfNMT. Os mapas de contribuição e de contorno geraram informações importantes sobre a relação estrutura-atividade dos compostos. Os resultados permitiram a identificação das bases moleculares responsáveis pela atividade dos inibidores benzotiofênicos e são úteis para o planejamento de novos inibidores mais potentes e seletivos para a enzima do parasita. / Malaria is an infectious disease caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium and transmitted by Anopheles spp. mosquitos. Due to the emerging resistance to current available drugs, great efforts for new molecular target and drugs are required. Recently, N-myristoyltransferase (NMT) was confirmed as an essential enzyme to malaria parasites and validated as a chemically tractable target for the development of new drug candidates against malaria. This work aimed to shed light on the molecular requirements underlying the inhibitory activity of benzothiophene derivatives against NMT. Therefore, 2D and 3D quantitative structure-activity relationship (QSAR) studies were developed for two datasets of benzothiophene derivatives as P. falciparum NMT (PfNMT) and the human homologue (HsNMT) inhibitors. Also, homology modeling studies for PfNMT were developed. The 2D QSAR studies were developed by the Hologram QSAR (HQSAR) method. The PfNMT structural model was applied in the construction of 3D QSAR models CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis) and CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Index Analysis). Different molecular alignment (maximum common substructure, flexible alignment and structure based) and atomic partial charge calculation (Gasteiger-Hückel, MMFF94, AM1-BCC, CHELPG and Mulliken) methods were used to build the 3D QSAR models. The best models showed internal consistency and high predictive ability of biological activity against PfNMT. The contribution and contour maps gave important information about compounds structure-activity relationship. The results allowed the identification of the molecular requirements underlying the inhibitory activity and should be useful for the design of novel potent and selective PfNMT inhibitors as antimalarial drug candidates.

O sistema imune exerce uma contribuição fundamental na proteção contra a infecção pelo plasmódio, o agente causador da malária. Entre os mecanismos envolvidos no controle dos parasitas do sangue destacam-se aqueles mediados por anticorpos. Entretanto, outros mecanismos do sistema imune também parecem exercer papéis fundamentais, e ao mesmo tempo foram pouco estudados. O presente trabalho teve como objetivo descrever alguns dos mecanismos efetores importantes na resposta imune à malária experimental. O projeto subdivide-se em duas partes: a) verificar a relação entre o priming por IFN-g e a imunidade ao parasita durante a fase crônica da infecção sanguínea pelo Plasmodium; e b) descrever separadamente o papel de células dendríticas e macrófagos do baço na fagocitose de eritrócitos infectados durante a infecção em modelo experimental, e o subsequente papel destas células na resposta imune durante esse período. Os resultados obtidos neste projeto deverão contribuir para a compreensão dos mecanismos envolvidos na imunidade contra a malária. / The immune system is considered crucial for the protection against Plasmodium infection. Among the mechanisms involved in the control of blood-stage parasites, the ones mediated by antibodies are widely recognized. However, other mechanisms of immune system can also exert fundamental roles, being less studied. This work had the objective of describing some of the effector mechanisms important in the immune response to blood-stage experimental malaria. This work was subdivided in two main branches: a) to verify the relation between the IFN-g-induced priming and the protective immunity to the parasite during the chronic phase of blood-stage infection; and b) to describe separately the role of dendritic cells and splenic macrophages as phagocytic cells during acute Plasmodium chabaudi infection, and the subsequent role of these cells in the immune responses during this period. The results obtained in this project may contribute for the comprehension of the mechanisms involved in the immunity against malaria.

Os receptores do tipo toll (toll-like receptors ou TLRs) são uma família de receptores na primeira linha de defesa do sistema imune inato que são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), dentre os patógenos mais importantes encontra-se Plasmodium. Variações genéticas nesses receptores estão associadas à resistência ou suscetibilidade a uma variedade de doenças infecciosas. Sabe-se que as freqüências destas mutações também podem variar de acordo com a ancestralidade biogeográfica dos indivíduos. Este trabalho avaliou a relação entre 24 polimorfismos em TLRs, ancestralidade e malária em 195 indivíduos residentes em área de Mata Atlântica do Estado de São Paulo. A ancestralidade genômica individual foi estimada usando marcadores autossômicos de inserção/deleção (INDELs) e os polimorfismos em TLR foram genotipados por PCR-RFLP, sequenciamento e eletroforese capilar. Dados prévios de malária presente ou pregressa obtidos por métodos moleculares e sorológicos foram utilizados para avaliar a relação dos polimorfismos em TLRs e malária nesses indivíduos. Os resultados mostraram que: (i) nove SNPs e um microssatélite foram polimórficos; (ii) a maior parte dos indivíduos analisados apresentou maior proporção de ancestralidade europeia; (iii) as proporções médias de ancestralidade europeia diferiram significantemente nos genótipos de TLR1 (I602S) e TLR6 (P249S); (iv) a probabilidade de ter o alelo variante G em TLR1 aumenta com o aumento da ancestralidade européia assim como aumenta a probabilidade de ter o alelo variante T no TLR6; (v) o polimorfismo em TLR9 -1237T/C foi fortemente relacionado à malária, sendo demonstrado que a presença de pelo menos um alelo C nessa posição aumentou o risco para malária 2,3 vezes; e (vi) TLR9 -1486T/C em associação com o TLR6 foi protetor, pois a associação dos alelos variantes reduziu o risco de malária em 4,4 vezes. O alelo G em TLR1 tem sido relacionado a uma resposta imune diminuída, o que poderia explicar a alta prevalência de casos de malária assintomática em áreas do sudeste brasileiro. O TLR9 tem sido relacionado com a patogênese da malária em estudos em animais e em humanos, sendo possivelmente modulado por polimorfismos na região promotora. Nossos dados também reforçam a necessidade de incluir marcadores de ancestralidade em estudos de associação genética para evitar resultados enviesados. Por fim, este é o primeiro estudo a associar polimorfismos em genes de imunidade inata e malária em amostras de Mata Atlântica. / Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors in the first line of defense of the innate immune system and they are able to recognize molecular patterns associated with pathogens (PAMPs), among the most important pathogens is Plasmodium. Genetic variations in these receptors are associated with resistance or susceptibility to a variety of infectious diseases. It is known that the frequencies of these mutations can also vary according to the biogeographic ancestry of the individuals. This work evaluated the relationship among 24 polymorphisms in TLRs, ancestry and malaria in 195 individuals living in the Atlantic Forest area of the São Paulo State. Individual genomic ancestry was estimated using autosomal insertion/deletion markers (INDELs) and TLR polymorphisms were genotyped by PCR-RFLP, sequencing and capillary electrophoresis. Previous data about present or previous malaria were obtained by molecular and serological methods and were used to evaluate the relationship of polymorphisms in TLRs and malaria in these individuals. The results showed that: (i) nine SNPs and one microsatellite were polymorphic; (ii) the majority of the individuals analyzed presented a greater proportion of European ancestry; (iii) the average proportions of European ancestry differed significantly in the genotypes of TLR1 (I602S) and TLR6 (P249S); (iv) the probability of having the variant G allele in TLR1 increases with increasing European ancestry as well as increases the probability of having the T allele variant in TLR6; (v) the TLR9 -1237T/C polymorphism was strongly related to malaria, and the presence of at least one C allele in this position was shown to increase the risk for malaria 2.3 times; and (vi) TLR9-1486T/C in combination with TLR6 was protective, since the association of variant alleles reduced the risk of malaria by 4.4 times. The G allele in TLR1 has been related to a decreased immune response, which could explain the high prevalence of cases of asymptomatic malaria in areas of southeastern Brazil. TLR9 has been linked to the pathogenesis of malaria in animal and human studies, possibly being modulated by polymorphisms in the promoter region. Our data also reinforce the need to include ancestral markers in genetic association studies to avoid biased results. Finally, this is the first study to associate polymorphisms in genes of innate immunity and malaria in Atlantic Forest samples.

Plasmodium malariae é um parasita protozoário que causa malária em humanos e é geneticamente indistinguível de P. brasilianum, um parasita que infecta macacos do Novo Mundo nas Américas do Sul e Central. P. malariae possui uma ampla distribuição mundial em regiões tropicais e subtropicais, porém de forma pontual, sendo encontrado na América do Sul, Ásia e África. Entretanto, pouco se sabe sobre a genética destes parasitas e a similaridade entre eles pode devido ao pequeno número de sequências genômicas disponíveis para essas espécies de Plasmodium. Recentemente, seis marcadores microssatélites e a sequencia completa do gene que codifica a proteína de superfície do merozoíta 1 (MSP1) foram descritos para estes parasitas. Neste estudo, o polimorfismo genético de 24 isolados brasileiros de P. malariae e P. brasilianum obtidos de diferentes hospedeiros foi analisado através da utilização desses marcadores microssatélites e da região correspondente ao oitavo bloco da MSP1. Os dados epidemiológicos moleculares foram explorados em relação à origem geográfica e hospedeiros. Para todos os marcadores estudados, as amostras de símios apresentaram um polimorfismo mais elevado que as amostras humanas. Na análise de microssatélites, as amostras humanas foram polimórficas em apenas dois alelos, enquanto as amostras de símios foram polimórficas em cinco alelos. O alelo Pm42- 331 foi monomórfico em todas as amostras analisadas. Na análise do bloco 8 da MSP1, as amostras símias foram altamente polimórficas e as amostras humanas apresentaram quatro tipos alélicos, sendo que dois tipos alélicos (A5 e A7) foram encontrados em alta frequência (90%). Em ambas as análises, a amostra de mosquito foi mais similar a amostras simianas. Nossos dados também mostram que há uma possível ausência de dimorfismo alélico na MSP1 de P. malariae e P. brasilianum, ao contrário de outras espécies de Plasmodium. Pela primeira vez, amostras de humanos, símios e mosquito foram analisadas em conjunto e utilizadas para o primeiro estudo de polimorfismos genéticos de isolados de P. malariae e P. brasilianum do Brasil. / Plasmodium malariae is a protozoan parasite that causes malaria in humans and is genetically indistinguishable from P. brasilianum, a parasite infecting New World monkeys in Central and South America. P. malariae has a wide and patchy global distribution in tropical and subtropical regions, being found in South America, Asia, and Africa. However, little is known regarding the genetics of these parasites and the similarity between them could be because until now there are only a very few genomic sequences available from these Plasmodium species. Recently, six microsatellite markers and the complete sequence of the merozoite surface protein 1 (MSP1) gene have been described for these parasites. In this study, the genetic polymorphism of 24 P. malariae and P. brasilianum isolates obtained from different hosts was analyzed using these microsatellite markers and the corresponding region on the block 8 of MSP1. The molecular epidemiological data were explored in relation to geographical origin and hosts. For all markers studied, the simian samples showed a higher polymorphism than human samples. In microsatellite analysis, the human samples were polymorphic only in two alleles, while simian samples were polymorphic in five alleles. The allele Pm42-331 was monomorphic in all samples analyzed. In the analysis of Block 8 of MSP1, the simian samples were highly polymorphic and human samples showed four allele types with two allelic types (A5 and A7) frequently found (90%). In both analyzes, the mosquito sample was more similar to simian samples. Our data also show that there is a likely absence of allelic dimorphism of MSP1 from P. malariae and P. brasilianum, as opposed to other Plasmodium species. For the first time, samples of humans, monkeys and mosquito were analyzed together and used for the first study of genetic polymorphisms in P. malariae and P. brasilianum isolates from Brazil.

O rompimento eritrocítico característico do ciclo de vida do Plasmodium resulta na liberação de ATP, o qual é reconhecido pelo receptor P2X7. Este estudo da malária experimental causada pelo P. chabaudi em camundongos P2X7-/- mostraram que estes animais são mais suscetíveis à infecção. Tanto in vitro, como ex vivo, as populações celulares fagocíticas mostraram-se sensíveis ao ATP extracelular, de uma forma P2X7 dependente, e a infecção pelo P. chabaudi mostrou ser um fator que aumenta esta sensibilidade. Estudos fenotípicos do baço e do fígado dos animais P2X7-/- indicaram que, com exceção da população CD11b+ Ly6G+, estes animais apresentam número inferior de células fagocíticas quando comparados aos animais C57BL/6. Além disso, há uma leve deficiência na ativação dos fagócitos, na produção de IFN-g e no número de células produtoras de IFN-g, TNF-a e IL-10 no baço dos animais P2X7-/- em relação aos C57BL/6. A maior suscetibilidade dos camundongos P2X7-/- à infecção pelo P. chabaudi deve-se, portanto, a uma resposta imunológica deficiente nestes animais. / The erythrocyte rupture is a step of the life cycle of Plasmodium in which ATP is released and is recognized by the P2X7. This study of experimental malaria caused by P. chabaudi in P2X7-/- mice showed that these mice are more susceptible to the infection. Either in vitro or ex vivo, the phagocyte cell populations were sensible to extracellular ATP in a P2X7-dependent way and the P. chabaudi infection acted as a component that increases this sensitivity. Phenotypic analysis of the spleen and liver from P2X7-/- mice showed that, excepted for the CD11b+ Ly6G+ population, these mice have a lower number of phagocyte cells when compared to C57BL/6 mice. Furthermore, there was a slight deficiency in phagocyte activation, IFN-g production and number of cells that produce important cytokines as IFN-g, IL-10 and TNF-a in P2X7-/- mice in comparison with C57BL/6 mice. The increased susceptibility of P2X7-/- mice to the P. chabaudi infection is due to a deficient immune response.

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With the elucidation of metabolic pathways essential for some of the malaria parasite development, new molecular targets have been proposed for the development of new drugs, among which can be cited Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyltransferase (HGPRT) Chorismate synthase, enoyl-ACP reductase and purine nucleoside phosphorylase (PNP). Objective: The objective of this study was the identification of compounds as potential inhibitors of beta-ketoacyl-ACP reductase enzyme - OAR Plasmodium falciparum. Results: The 28kDa enzyme was expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Searches of new molecules through Sceenning by Virtual Docking were able to find 30 molecules of which was selected Skyrin molecule due to its higher affinity for the enzyme OAR. Analysis of enzyme activity by spectrophotometry using NADPH and acetoacetyl-CoA substrates the enzyme showed activity OAR reducing NADPH in the various substrates concentrations, and was shown to be inhibited by Skyrin. It was also possible to show by surface plasmon resonance (SPR) Skyrin that the molecule binds to the enzyme OAR but dissociates easily.In tests using cell cultures infected with P. falciparum this molecule showed antimalarial activity with IC50 8,88μg / ml, and is not toxic to HepG2 cell line. Conclusion:This new approach has significant advantages compared to traditional methods, since it establishes in advance the specific bioactive and its mechanism of action. Ideal targets for the development of antimalarial drugs against infectious agents must be essential to the survival of the pathogen and the host is absent. / A Malária é a doença parasitária com maior número de internações e mortes por ano em todo o mundo, sendo um dos maiores problemas de saúde pública na África, América do Sul e Ásia Oriental. Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde, 198 milhões de pessoas ficaram doentes em 2014. Essas evidências levaram ao desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento da malária a fim de minimizar o crescente problema da resistência do parasita aos medicamentos de uso corrente. Com a elucidação de algumas Vias Metabólicas essenciais para do desenvolvimento do parasita da malária, novos alvos moleculares foram propostos para o desenvolvimento de novas drogas, entre eles pode-se citar a Hipoxantina Guanina Fosforribosiltransferase (HGPRT), Corismato sintase, Enoil –ACP redutase e a Fosforilase de nucleosídeos purínicos (PNP). Objetivo: O objetivo desse estudo foi a identificação de compostos como possíveis inibidores contra a enzima Beta-cetoacil- ACP- redutase - OAR de Plasmodium falciparum. Resultados: A enzima de 28kDa, foi expressa em Escherichia coli e purificada através de cromatografia de afinidade. Buscas de novas moléculas através de Sceenning Virtual por Docking foram capazes de encontrar 30 moléculas das quais foi selecionada a molécula Skyrin por apresentar maior afinidade pela enzima OAR. Análise da atividade enzimática por espectrofotometria utilizando os substratos NADPH e Acetoacetil-COA a enzima OAR apresentou atividade reduzindo NADPH, em concentrações dos substratos variadas, e mostrou ser inibida por Skyrin. Foi possível mostrar também por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) que a Skyrin liga-se à enzima OAR porém dissocia-se facilmente. Em testes utilizando-se culturas celulares infectadas com P. falciparum essa molécula apresentou atividade antimalárica com IC50 de 8,88μg/mL, não sendo tóxica para a linhagem celular HepG2. Conclusão: Esta nova abordagem apresenta vantagens significativas quando comparada aos métodos tradicionais, uma vez que se estabelece antecipadamente a especificidade do bioativo e respectivo mecanismo de ação. Alvos ideais para o desenvolvimento de fármacos contra agentes infecciosos antimaláricos devem ser essencial para a sobrevivência do patógeno e estar ausente no hospedeiro.